Содержание к диссертации
Введение
Глава 1 Обзор литературы 13
1.1 Этиология и эпидемиология хронической обструктивной болезни легких 13
1.2 Патогенез хронической обструктивной болезни легких 16
1.2.1 Роль стволовых и прогениторных клеток в патогенезе, ремодуляции и регенерации при эмфиземе легких 22
1.3 Современные экспериментальные подходы к изучению эмфиземы легких 26
1.4 Подходы к лечению эмфиземы ХОБЛ 32
1.4.1 Фармакологическая коррекция 32
1.4.2 Хирургическое лечение 38
1.4.3 Новые подходы к терапии, применение цитокинов и стволовых клеток 40
1.5 Роль катехоламинов в развитии ХОБЛ 46
1.6 Фармакологические эффекты резерпина и его механизм действия 49
1.7 Заключение 52
Глава 2 Материалы и методы исследования 54
2.1 Материал исследования 54
2.2 Реагенты 56
2.3 Экспериментальная модель 56
2.4 Дизайн исследования 57
2.5 Методы исследования 58
Глава 3 Результаты собственных наблюдений 63
3.1 Фармакологические эффекты и механизмы действия резерпина в условиях эмфиземы легких, вызванной эластазой 63
3.1.1 Гистологическое исследование легочной ткани 63
3.1.2 Иммуногистохимическое исследование клеток воспаления, эндотелиальных и эпителиальных клеток 67
3.1.3 Изучение содержания медиаторов воспаления и белков внеклеточного матрикса в крови и легочной ткани 69
3.2 Фармакологические эффекты и механизмы действия резерпина в условиях эмфиземы легких, индуцированной липополисахаридом и экстрактом сигаретного дыма 79
3.2.1 Гистологическое исследование легочной ткани 79
3.2.2 Иммуногистохимическое исследование клеток воспаления, эндотелиальных и эпителиальных клеток 83
3.2.3 Изучение экспрессии мембранных рецепторов стволовых и прогениторных клеток 84
Глава 4 Обсуждение полученных результатов 92
Выводы 111
Список сокращений 113
Список литературы 115
- Патогенез хронической обструктивной болезни легких
- Новые подходы к терапии, применение цитокинов и стволовых клеток
- Изучение содержания медиаторов воспаления и белков внеклеточного матрикса в крови и легочной ткани
- Изучение экспрессии мембранных рецепторов стволовых и прогениторных клеток
Патогенез хронической обструктивной болезни легких
По современным представлениям патогенез ХОБЛ представляет собой сложный многофакторный процесс, включающий в себя нарушение баланса между протеолитическими и антипротеолитическими ферментами, воспаление, воздействие факторов внешней среды, а также генетическую предрасположенность [154].
Патологические изменения в легких при этом заболевании представляют собой сочетание эмфиземы легких, различные нарушения структуры в мелких дыхательных путях, воспаление, фиброз, образование рубцов, гипертрофия гладкой мускулатуры, окружающей мелкие дыхательные пути, гиперсекреция слизи и патологические изменения микроциркуляции и эндотелиальные нарушения и дисфункция. Эти нарушения оказывают действие на большие и малые бронхи, и паренхиму легких, приводя к уменьшению эластичности легочной ткани и спаданию малых бронхов во время экспирации [27].
Согласно ранним исследованиям 2006 г. примерно у 10-15% курильщиков развивается ХОБЛ, но поскольку на ранних стадиях заболевание может протекать бессимптомно, принято считать, что этот показатель значительно недооценивается [189]. Понимание того, что у людей со сходным стажем курения заболевание может проявиться или нет, привел, к активным исследованиям генетических факторов ХОБЛ. Одним из первых выявленных генов, связанных с развитием болезни, был ген, кодирующий 1-антитрипсин. У курящих людей с гомозиготной мутацией данного гена тяжелая степень ХОБЛ развивается очень быстро. Вследствие дефицита 1-антитрипсина, нарушается протеазно-/антипротеазный баланс. Из всех больных ХОБЛ лишь 1-2% имеют генетически опосредованный дефицит 1-антитрипсина. Существуют другие гены, связанные с развитием ХОБЛ. Это гены, кодирующие матриксные металлопротеиназы 9 и 12 (MMP9, MMP12), гены окислительного стресса (EPHX1, HMOX1, GSTP1), гены, участвующие в иммунном ответе (TNF-, GC), а также гены, регулирующие апоптоз (TGF-) [235]. Генетические аномалии указанных генов повышают риск возникновения ХОБЛ.
Кроме генетической предрасположенности на развитие ХОБЛ может оказывать влияние и эпигенетическое изменение экспрессии генов. Исследования в данном направлении являются относительно новыми. Между тем уже существуют факты, подтверждающие участие эпигенетических изменений в ХОБЛ. Так, ацетилирование гистонов приводит к усилению транскрипции генов в свою очередь ацетилирование контролируется ферментом гистон-деацетилазой, удаляющим ацетильные группы. С увеличением степени тяжести заболевания происходит снижение активности гистон-деацетилазы и, как следствие, увеличение ацетилированных гистонов в легких больных ХОБЛ [114]. Увеличение ацетилирования и транскрипционной активности может приводить к увеличению экспрессии генов провоспалительных цитокинов. У больных ХОБЛ одновременно с повышением ацетилирования, наблюдается повышение экспрессии гена IL-8 [114]. Эти данные также подтверждаются исследованиями на животных: у крыс, подвергнутых воздействию сигаретного дыма, наблюдалось снижение активности гистон-деацетилазы и усиление связывания транскрипционного фактора NF-B [160]. Считается,что после воздействия сигаретным дымом активность гистон-деацетилазы снижается за счет убиквитинирования и деградации [16].
Курение способно приводить к эпигенетическим изменениям в бронхиальном эпителии опосредовано через эпигенетические механизмы оказывать воздействие на воспалительные процессы в дыхательных путях [36]. Можно предположить, что регуляция эпигенетических механизмов способна оказать терапевтическое действие при ХОБЛ.
В настоящее время выявлено 349 CpG сайтов, которые связаны с различной тяжестью ХОБЛ и снижением легочных функций [186]. Сигаретный дым в малых бронхах и бронхиальных эпителиальных клетках способен воздействовать на различные CpG сайты ДНК приводя к гипо- или гиперметилированию. Обнаружена корреляция курения с увеличением метилирования промотора белка р16 и репрессора рецептора AhR. Сигаретный дым вызывает изменение метилирования ядерного фактора NRF2 и связанного с G-белком рецептора 15 в клетках мелких бронхов и лейкоцитах периферической крови. Локус cg03636183 расположенный в гене F2RL2 имеет более низкое метилирование у курильщиков. У больных ХОБЛ ген 1-антитрипсина (A1AT) имеет низкий уровень метилирования [203].
В одной порции сигаретного дыма содержится около 1017 молекул окислителей, активных форм кислорода и азота [152]. Больные ХОБЛ имеют повышенный уровень выдыхаемых H2O2, 8-изопростана и NO. Дополнительно наблюдается снижение антиоксидантов и увеличение количества окислительных липидов и белков в плазме крови и тканях пациентов [153]. Эти молекулы выступают косвенными маркерами окислительного стресса.
Окислительный стресс имеет несколько важных механизмов в развитии ХОБЛ. Так, ингибирование 1-антитрипсина происходит за счет окисления. Снижение его активности можно наблюдать в жидкости бронхоальвеолярного лаважа (БАЛ), полученной после воздействия сигаретного дыма [153]. Поэтому принято считать, что окислительный стресс способен приводить к нарушению протеазно-/антипротеазного баланса.
Метаболиты оксидативного стресса способны вызывать гиперсекрецию слизи в клетках дыхательных путей при ХОБЛ. Прямая гибель клеток от окислительного стресса выступает важным звеном в развитии эмфиземы. Кроме этого окислительный стресс индуцирует экспрессию провоспалительных цитокинов у больных ХОБЛ [153].
Наиболее полно изученным механизмом ХОБЛ является нарушение баланса между протеазами и антипротеазами. Как выше указывалось у курильщиков с генетически опосредованным пониженным уровнем 1-антитрипсина эмфизема легких развивается наиболее быстро. У большинства пациентов протеазо-/антипротеазный баланс нарушается за счет гиперэкспрессии протеолитических ферментов нейтрофилами и макрофагами [27]. Кроме разрушения клеток, нейтрофильная эластаза вовлечена в хоминг клеток воспаления и продукции слизи в легочной ткани. Химическое ингибирование нейтрофильной эластазы предупреждало развитие воспаления и эмфиземы у морских свинок, подвергнутых воздействию сигаретного дыма [247]. Кроме нейтрофильной эластазы в патогенезе ХОБЛ могут принимать участие катепсины и матриксные металлопротеиназы [27].
Воспалительный процесс является врожденным защитным ответом иммунной системы, обеспечивающей первичную защиту организма при длительном вдыхании различных токсичных газов или частиц. Первой линией защиты являются система мукоцилиарного клиренса и макрофаги, которые осуществляют очистку нижних дыхательных путей от инородных частиц. При ХОБЛ оба этих механизма в значительной мере являются ослабленными. Второй линией защиты служит экссудация плазмы и циркулирующих клеток в большие и малые бронхи, данный процесс контролируется множеством провоспалительных цитокинов [154].
В воспалительном процессе при ХОЛБ задействованы различные клетки воспаления. До сих пор сохраняется ограниченное понимание взаимосвязей между различными популяциями клеток воспаления при ХОБЛ. В мокроте и бронхоальвеолярном лаваже больных ХОБЛ обнаружено значительное увеличение числа нейтрофилов [22]. Однако в дыхательных путях и легочной паренхиме эта популяция клеток возрастала незначительно. Такое распределение нейтрофилов объясняется быстрой миграцией через дыхательные пути и легочную паренхиму. Нейтрофилы выделяют сериновые протеазы, такие как нейтрофильная эластаза, катепсин G, протеаза-3, а также матриксные металлопротеиназы 8 и 9. Эти ферменты способны разрушать эластический каркас легочной ткани [79]. Исходя из этого, нейтрофилы могут иметь решающую роль в смещении протеазно-/антипротеазного баланса в сторону усиления протеолиза. Это подтверждается тем, что нокаутные по гену нейтрофильной эластазы мыши частично защищены от развития ХОБЛ при воздействии сигаретным дымом на легкие [210]. Немаловажную роль в патогенезе ХОБЛ играют макрофаги. У больных ХОБЛ наблюдается увеличение макрофагов в дыхательных путях, паренхиме легких, бронхоальвеолярном лаваже (БАЛ) и мокроте в 5-10 раз. Клинические исследования показали 25 кратное увеличение числа макрофагов в тканях и альвеолярном пространстве больных ХОБЛ по сравнению с курящими людьми, не страдающими ХОБЛ [190]. Кроме того, у больных ХОБЛ макрофаги чаще всего локализуются на участках разрушения альвеолярных стенок, и выявленна корреляция между количеством макрофагов и тяжестью ХОБЛ [79]. В ответ на воздействие сигаретного дыма альвеолярные макрофаги секретируют медиаторы воспаления, эластолитические ферменты, такие как матриксные металлопротеиназы 2, 9, 12, катепсины К, L и S и ранее поглощенную нейтрофильную эластазу [198]. Синтез большинства воспалительных белков макрофагов регулируется ядерным фактором транскрипции - B (NF- B). NF- B активируется в альвеолярных макрофагах у больных ХОБЛ, и особенно значительно во время обострений [69].
Кортикостероиды ингибируют In vitro высвобождение IL-8, TNF- и MMP-9 макрофагами БАЛ у здоровых курящих и не курящих людей. Однако у больных ХОБЛ кортикостероиды мало эффективны в подавлении воспалительного процесса в легочной ткани [65]. Причина устойчивости к кортикостероидам при ХОБЛ, вероятнее всего, кроется в снижении активности гистон-деацетилазы (HDAC), которая взаимодействует с активными провоспалительными генами под воздействием глюкортикоидных рецепторов. Снижение активности HDAC в макрофагах коррелирует с повышенной секрецией цитокинов TNF- и IL-8 и снижением реакции на кортикостероиды [113].
Новые подходы к терапии, применение цитокинов и стволовых клеток
Разработка, новых лекарственных средств и подходов для лечения ХОБЛ, является весьма актуальной задачей, поскольку применяемая терапия, в настоящий момент, не уменьшает прогрессирование эмфиземы. По сравнению с успехами, достигнутыми в лечении астмы, в терапии ХОБЛ прогресс относительно мал по причине гораздо худшего понимания процессов, протекающих при ХОБЛ. Более того, в основе современной медикаментозной терапии ХОБЛ лежат препараты, разработанные для лечения астмы, что является не уместным, поскольку воспалительный процесс при ХОБЛ имеет значительные отличия от воспалительного процесса при астме [26]. Отсутствие эффективных методов лечения и растущая распространенность ХОБЛ привели к тому, что в настоящее время ведется разработка новых методик в лечении ХОБЛ, направленных на контроль воспалительных и деструктивных процессов, лежащих в основе заболевания, восстановление легочной ткани и её функций. Одной из основных причин ХОБЛ во всем мире является курение. На данный момент отказ от него является единственным способом надежно замедлить прогрессирование заболевания. Никотиновая зависимость при данном подходе является основным фактором, препятствующим отказу от курения, поэтому одним из основных направлений терапии является борьба с никотиновой зависимостью. Так поведенческие подходы и никотин заместительная терапия являются наиболее изученными, однако они имеют малую эффективность [140]. Важным открытием в лечении никотиновой зависимости стало то, что антидепрессант бупропион при курсе в 6-9 недель проявляет большую эффективность по сравнению с никотин заместительной терапией [122].
Хроническое воспаление в дыхательных путях больных ХОБЛ опосредовано нарушением регуляции воспалительных хемокинов, цитокинов, молекул клеточной адгезии и клеточных рецепторов [66]. Ключевым фактором, способствующим прогрессированию обструкции дыхательных путей, является накопление экссудатов, слизи, ремоделирование тканей и постоянная миграция иммунокомпетентных клеток [66]. Поскольку ХОБЛ характеризуется нейтрофильным воспалением и увеличением роли активных форм кислорода, то особое внимание при поиске новых подходов лечения уделяется сигнальным молекулам, участвующим в привлечении и активации нейтрофилов или восстановлении окислительно-восстановительного баланса в легочной ткани больных [233].
Некоторые хемокины участвуют в нейтрофильном хемотаксисе. В основном они принадлежат к семейству CXC хемокинов, наиболее известным из которых является интерлейкин 8 (IL-8). У больных ХОБЛ уровень IL-8 является повышенным и коррелирует с тяжестью заболевания [126]. Блокирующие IL-8 антитела, способны ингибировать некоторые типы нейтрофильного воспаления в экспериментальных моделях и снижать хемотаксический ответ нейтрофилов в мокроте больных ХОБЛ [102]. IL-8 активирует нейтрофилы через специфический низкоаффинный рецептор CXCR1, однако он также действует и через высокоаффиный рецептор CXCR2 [197]. Уровень других хемокинов семейства CXC, имеющих аффинитет к рецептору CXCR2, также является повышенным при ХОБЛ. В связи с чем ингибиторы CXCR2 предположительно более эффективны, чем ингибиторы CXCR1 [232]. Хемокины других семейств так же играют важную роль в воспалительном процессе при ХОБЛ. У больных ХОБЛ наблюдается повышенная экспрессия моноцитарного хемотаксического белка-1 (MCP-1), относящегося к семейству CC-хемокинов, и его рецептора CCR2 макрофагами и эпителиальными клетками. Взаимодействие MCP-1 и CCR2 – это механизм привлечения в легочную ткань моноцитов из крови [45]. Как видно, низкомолекулярные ингибиторы могли бы быть крайне полезны в противовоспалительной терапии ХОБЛ и в настоящее время ведётся разработка ни их основе лекарственных средств.
Фактор некроза опухолей- (TNF-) является одним из ключевых медиаторов нейтрофильного воспаления при ХОБЛ, поэтому его ингибиторы имеют представляют, как возможные противовоспалительные средства. Однако такой ингибитор TNF- как инфликсимаб оказал слабый эффект на уровни воспалительных медиаторов в бронхоальвеолярном лаваже и сыворотке крови у 16 больных со степенью тяжести ХОБЛ от лёгкой до тяжелой [32]. Низкая эфективность и повышенный риск развития рака не позволяют применять инфликсимаб при ХОБЛ. Ингибирование других провоспалительных цитокинов, как например IL-1, IL-6 и IL-17, может оказаться перспективным. Так, придставляет интерес ингибитор IL-6 тоцилизумаб, используемый для лечения ревматоидного артрита. При ХОБЛ тоцилизумаб возможно может оказывать влияние на аутоиммунный компонент заболевания, который наблюдается у больных с тяжелой формой ХОБЛ [131].
IL-10 является цитокином, имеющим широкий спектр противовоспалительных эффектов. Он ингибирует секрецию TNF- и IL-8 макрофагами, уменьшает экспрессию матричных металлопротеиназ, сдвигая баланс в сторону антипротеаз [138]. В настоящее время IL-10 находится на стадии клинических испытаний для лечения хронических воспалительных заболеваний, в том числе у пациентов с ХОБЛ, устойчивых к терапии глюкокортекоидами [24]. Известно, что сигаретный дым индуцирует экспрессию толлподобных рецепторов (Toll-like receptor – TLR) в бронхиальных эпителиальных клетках. Ингибиторы TLR рецепторов, особенно TLR2, TLR4 и TLR9, являются привлекательными для использования в противовоспалительной терапии при эмфиземе легких [172]. Ряд антагонистов TLR рецепторов, как например OPN-305 (ингибитор TLR2) и NI-0101 (ингибитор TLR4), в настоящее время находятся на стадии клинических исследований для лечения острого и хронического воспаления, однако ни один из агонистовне рассматривается в качестве потенциального терапевтического агента при ХОБЛ [34]. Возможно это связанно с тем обстоятельством, что применение данного класса молекул для ингибирования воспаления, вызванного сигаретным дымом, может усилить прогрессирование заболевания в случае присутствия бактериальной инфекции [42].
Важную роль в формировании и прогрессировании эмфизематозных повреждений легочной ткани при ХОБЛ играет нарушение протеазно /антипротеазного баланса в сторону протеаз, которые разрушают эластин и другие структурные белки. Ингибирование протеолитических ферментов или увеличение активности антипротеаз, защищающих эластин, может препятствовать дальнейшей обструкции дыхательных путей [24]. На сегодняшний день выявлены основные протеолитические ферменты, участвующие в формировании эмфиземы легких, а также несколько эндогенных антипротеаз, которые могут противодействовать этому процессу [218]. Нейтрофильная эластаза является одним из основных ферментов, участвующих в эластолитической активности легких, стимулирует секрецию слизи и индуцирует высвобождение IL-8 из эпителиальных клеток легких, что приводит к усилению воспалительного процесса в ткани. На сегодняшний день разработано несколько ингибиторов нейтрофильной эластазы, обладающих высокой эффективностью на экспериментальных моделях (ICI 200355, ONO-5046) [125, 243]. Данные средства могут быть избирательно эффективны у пациентов с ХОБЛ, имеющих недостаток 1-антитрипсина. Матриксные металлопротеиназы (ММР) могут быть другой группой ферментов, представляющей интерес для разработчиков лекарств для ХОБЛ. Эта группа состоит из более чем 20 различных эндопептидаз, способных разрушать все компоненты внеклеточного матрикса легочной паренхимы, включая, эластин, колаген, протеогликаны, и др. Они продуцируются нейтрофилами, альвеолярными макрофагами и эпителиальными клетками дыхательных путей. У пациентов с ХОБЛ альвеолярные макрофаги экспрессируют ММР-9 и ММР-1 [80]. Кроме этого, альвеолярные макрофаги способны экспрессировать металлоэластазу-12 (ММР-12) [208]. Важность ММР-12 показана на мышах с нокаутной MMP-12. У этих мышей не эмфизема легких не развивается даже после длительного воздействия сигаретного дыма [98]. Существует несколько подходов к ингибированию металлопротеиназ. Один из них — это усиление секреции тканевых ингибиторов металлопротениназ, а другой – подавление экспрессии самих ММР [49]. Тетрациклины и гидроксаматы, такие как батимастат (BB-94) и пероральный активный маримастат (BB-2516), являются неселективными ингибиторами ММР. Однако побочные эффекты таких препаратов могут быть проблемой при долгосрочном использовании при терапии ХОБЛ. Селективные ингибиторы отдельных ММР, таких как MMP-9 и MMP-12, в настоящее время находятся в разработке, и скорее всего, будут лучше переноситься при длительной терапии [24].
Изучение содержания медиаторов воспаления и белков внеклеточного матрикса в крови и легочной ткани
Данные иммуноферментного анализа позволили оценить изменения в содержании белков внеклеточного матрикса в гомогенате легочной ткани в условиях моделирования эмфиземы, индуцированной эластазой. На 7-е сутки после введения эластазы уровень коллагена I типа и гидроксипролина повышался в 1,7 раза и 2,3 раза по сравнению с интактным контролем (р 0,05). К 14 суткам уровни этих белков внеклеточного матрикса снижался и практически не отличался от такового в интактном контроле, при этом наблюдалось возрастание содержания фактора роста соединительной ткани (р 0,05) (таблица 6).
Исследование концентрации медиаторов воспаления в биологических средах показало, что на 7 и 14 сутки после введения эластазы значительно повышался уровень про-воспалительных цитокинов IL-2, IL-5 и IL-13 в сыворотке крови животных патологического контроля 1 в 4,3, 4,9 и 67,0 раз соответственно выше интактного контроля (р 0,05). Кроме этого, на 14 сутки было отмечено повышение уровня противовоспалительного медиатора IL-10 в сыворотке крови животных патологического контроля 1 в 4,5 раза выше интактного контроля (р 0,05) (таблица 7).
На 7 и 14-е сутки после введения эластазы выявлена гиперэкспрессия медиаторов воспаления IL-2, IL-5 и IL-17 и противовоспалительного IL-10 в гомогенате легких (р 0,05) (таблица 8).
На 14 сутки эксперимента в общей массе эпителиальных клеток методом проточной цитометрии были оценены отдельные субпопуляции зрелых эпителиальных клеток и эпителиальных прекурсоров. По нашим данным эластаза уменьшала число всех исследованных популяций эпителиальных клеток в легких мышей патологического контроля 1 по сравнению с интактным контролем (р 0,05): CD45ER119-CD49f+CD326+, CD326+CD45-CD49f+, CD326+, CD326hiCD49f+CD45-, CD45-CD117+. Исключение составляла популяция эпителиальных прекурсоров с фенотипом CD45ER119-CD49f+, на которую нарушение баланса протеаз/ антипротеаз не оказало влияния. Между тем, число эпителиальных прекурсоров с фенотипом CD45ER119-CD49f+ в крови животных патологического контроля 1 уменьшалось (р 0,05). Кроме этого, в крови мы регистрировали возрастание числа эпителиальных клеток с фенотипами CD45-CD326+ и CD326+ (р 0,05), а также количества мультипотентных эпителиальных прогениторных клеток (CD326hi CD49f+CD45-) (р 0,05) по сравнению с интактом (таблица 9-10).
Резерпин увеличивал содержание многих популяций эпителиальных клеток в легочной ткани мышей опытной группы 1 по сравнению с патологическим контролем на 14-сутки эксперимента (р 0,05): мультипотентные эпителиальные прогениторные клетки (CD326hi CD49f+CD45-), эпителиальные прекурсоры с фенотипом CD45ER119-CD49f+CD326+ и CD326+CD45-CD49f+, стволовых клеток легких (CD45-CD117+), зрелых эпителиальных клеток с фенотипом CD326+ и CD45-CD326+ (таблица 9).
В ответ на моделирование эмфиземы легких введением эластазы наблюдалось сокращение циркулирующей в крови популяции эпителиальных прекурсоров с фенотипом CD45ER119-CD49f+, при этом число зрелых эпителиальных клеток и мультипотентных эпителиальных прогениторных клеток, напротив, возрастало (таблица 10).
Таким образом, в условиях введения эластазы резерпин способствовал накоплению зрелых и незрелых эпителиальных клеток в легких и сокращению их содержания в крови, что указывало на активацию процессов миграции эпителиальных клеток из кровеносного русла в легочную ткань.
Эндотелиальные клетки
При изучении эндотелиальных клеток был выявлен ряд закономерностей. Так на 14 сутки после введения эластазы отмечалось уменьшение числа эндотелиальных прогениторных клеток с фенотипом CD45-CD31+CD34+ и CD45-CD31+CD34+CD73-CD90- (р 0,05) в крови по отношению к интактному контролю (р 0,05). При этом в легочной ткани число CD45-CD31+CD34+ ЭПК достоверно увеличивалась, а популяция клеток с рецептором VEGF CD45-CD309+, напротив, сокращалась (таблица 11-12).
Введение резерпина оказывало ингибирующее влияние на легочные эндотелиальные прогениторные клетки (CD45-CD31+CD34+) мышей с эмфиземой легких на 14-е сутки эксперимента (таблица 11). В противоположность этому, циркулирующая в крови фракция ЭПК (CD45-CD31+CD34+, CD45 CD31+CD34+CD73-СD90-) расширялась и значительно превосходила таковую в патологическом контроле (р 0,05) (таблица. 12).
Таким образом, в условиях эластазой индуцированной эмфиземы легких резерпин нарушал миграцию в легкие эндотелиальных прогениторных клеток, которые накапливались в кровеносном русле.
Мезенхимальные клетки
Отдельный интерес представляют клетки мезенхимального происхождения (мезенхимальные стволовые клетки (МСК), прогениторные фибробластные клетки и фиброциты), так как они участвуют в регенерации эластинового матрикса. По полученным нами данным эластаза увеличивала число МСК с фенотипом CD45-CD31-CD34-CD73+CD90+ и прогениторных фибробластных клеток с фенотипом CD45-CD31-CD34+СD90+ в эмфизематозно расширенной легочной ткани по отношению к интактному контролю на 14 сутки эксперимента (р 0,05) (таблица 13-14). При этом количество фиброцитов миелоидного происхождения уменьшалось. Одновременно с этими изменениями мы наблюдали достоверное увеличение популяции циркулирующих в крови фиброцитов немиелоидного происхождения CD31-CD34-CD45+.
Изучение экспрессии мембранных рецепторов стволовых и прогениторных клеток
Эпителиальные клетки
Влияние комбинации таких повреждающих факторов как ЛПС и ЭСД на СК и прогениторные клетки отличалось от действия эластазы. Так, на 16 сутки эксперимента наблюдалось увеличение целого ряда зрелых эпителиальных клеток (CD326+; CD45-CD326+) и не зрелых клеток, включая эпителиальные прекурсоры (CD45ER119-CD49f+CD326+; CD326+CD45-CD49f+) и мультипотентные эпителиальные прогениторные клеток (CD326hiCD49f+CD45-) (р 0,05) (таблица 18). Исключение составили эпителиальные прекурсоры с фенотипом CD45ER119-CD49f+, количество которых значительно было меньше, чем в интактном контроле (р 0,05).
После введения резерпина отмечалось достоверное увеличение числа эпителиальных прогениторных клеток всех представленных в таблице 18 фенотипов и зрелых эпителиальных клеток в легочной ткани мышей опытной группы 2 по сравнению с животными патологического контроля 2.
При моделировании эмфиземы легких назначением ЛПС и ЭСД наблюдалось повышение числа зрелых эпителиальных клеток (CD326+, CD45-CD326+) и эпителиальных прекурсоров (CD326+CD45-CD49f+, CD45ER119-CD49f+CD326+) в крови по сравнению с интактным контролем (таблица 19).
В опытной группе 2 группе резерпин дополнительно увеличивал количество циркулирующих в крови эпителиальных прекурсоров с фенотипом CD326+CD45-CD49f+ и стволовых клеток легких CD45-CD117+ в сравнении с патологическим контролем 2 (р 0,05) (таблица 19).
Таким образом, при эмфиземе легких, вызванной введением ЛПС и экстракта сигаретного дыма, наблюдалась мобилизация в кровь и миграция в легкие зрелых эпителиальных клеток и эпителиальных предшественников.
Резерпин способствовал этим процессам и дополнительно оказывал стимулирующее действие на стволовые клетки легких (CD45-CD117+). Эндотелиальные клетки
Комбинация липополисахарида и экстракта сигаретного дыма не оказывало влияние на популяцию легочных предшественников эндотелиальных клеток (таблица 20). Исключение составили CD31+ эндотелиальные клетки: их число в патологическом контроле на 31,5% (р 0,05) превосходило таковое в интактном контроле. Между тем, в крови животных с эмфиземой легких, индуцированной ЛПС и ЭСД, мы обнаружили достоверно меньшее число предшественников ангиогенеза с фенотипом CD45-CD309+CD117+ (более чем в 2,5 раза, р 0,05) и эндотелиальных прогениторных клеток с фенотипом CD45-CD31+CD34+CD73-СD90- (в 2 раза, р 0,05), чем в интактном контроле (таблица 21).
В условиях развития эмфиземы легких, вызванной ЛПС и экстрактом сигаретного дыма, резерпин вызывал увеличение числа предшественников ангиогенеза CD45-CD309+CD117+ и VEGF+ эндотелиальные клетки в легочной ткани в сравнении с патологическим контролем 2 на 16-е сутки эксперимента (р 0,05) (таблица 20). В крови мышей опытной группы 2 мы наблюдали накопление VEGF+ эндотелиальных клеток и эндотелиальных прогениторных клеток CD45-CD31+CD34+CD73-СD90- в сравнении с животными патологического контроля 2 (таблица 21). При этом число предшественников ангиогенеза после лечения было меньше на 36%, чем у не леченных животных (р 0,05) (таблица 21).
Таким образом, в условиях эмфиземы легких, вызванной ЛПС и ЭСД, резерпин увеличивал количетсво предшественников ангиогенеза и VEGF+ эндотелиальных клеток в легких, и число циркулирующих в крови VEGF эндотелиальных клеток и эндотелиальных прогениторных клеток. Мезенхимальные клетки
Действие ЛПС и экстракта сигаретного дыма на легочные МСК было ингибирующим. Как видно из Таблицы 22 число МСК с фенотипами CD45-CD31-CD34-CD73+CD90+ и CD45-CD106+CD44+CD73+CD90+ в патологическом контроле 2 достоверно было ниже, чем в интактном контроле. В крови наблюдалось увеличение популяции МСК CD45-CD31-CD34-CD73+CD90+ (р 0,05) (таблица 23). Кроме этого, ЛПС и ЭСД оказывал стимулирующее действие на фиброциты, о чем свидетельствовало их увеличение в крови и легких.
Резерпин увеличивал количество МСК с фенотипом CD45-CD31-CD34-CD73+СD90+ в легких животных опытной группы 2 в сравнении с группой патологического контроля (р 0,05) (таблица 22). При этом циркулирующая в крови фракция МСК сокращалась (р 0,05) (таблица 23). На легочные МСК с фенотипом CD45-CD106+CD44+CD73+СD90+ и прогениторные фибробластные клетки CD45-CD31-СD34+СD90+ резерпин влияния не оказал.
Таким образом, в условиях введения ЛПС и экстракта сигаретного дыма резерпин усиливал мобилизацию МСК и фиброцитов в кровь и миграцию МСК с фенотипом CD45-CD31-CD34-CD73+СD90+ в легочную ткань.
Клетки воспаления
Исследование мононуклеаров крови и легких на 16-е сутки эксперимента методом проточной цитометрии показало, что моделирование эмфиземы легких не оказывало существенного влияния на пан-гемопоэтические клетки и клетки СМФ (таблица 24). Применение резерпина в условиях эмфиземы легких, индуцированной ЭСД и ЛПС, увеличивало содержание пан-гемопоэтических клеток в кровеносном русле в 4,5 раза (р 0,05) в сравнении с патологическим контролем 2 (таблица 24). Изменений в содержании моноцитов-макрофагов крови и легких в ответ на введение резерпина зарегистрировано не было.