Содержание к диссертации
Введение
Глава 1 Обзор литературы 14
1.1 Поджелудочная железа 14
1.2 Сахарный диабет 1-го типа 17
1.3 Эпидемиология сахарного диабета 1-го типа 19
1.4 Этиология сахарного диабета 1-го типа 21
1.5 Патогенез сахарного диабета 1-го типа 23
1.6 Лечение сахарного диабета 1-го типа 25
1.7 Эффекты глюкагоноподобного пептида 1 30
1.8 Пегилирование – технология создания новых лекарственных препаратов 34
1.8.1 Общее представление о пегилировании, свойства и целесообразность использования в терапии модифицированных фармакологически активных молекул 34
1.8.2 Перспективы использования пегилированных аналогов глюкагоноподобного пептида 1 при гипергликемии 41
1.9 Заключение 44
Глава 2 Материал и методы исследования 47
2.1 Материалы исследования 47
2.2 Реагенты 49
2.3 Экспериментальная модель 51
2.4 Введение препаратов 52
2.5 Дизайн исследования 52
2.6 Методы исследования 53
Глава 3 Результаты собственных наблюдений 65
3.1 Получение и краткая характеристика пегилированной формы аналога глюкагоноподобного пептида 65
3.2 Влияние пегилированной формы аналога глюкагоноподобного пептида на концентрацию ГПП-1 в сыворотке крови у мышей C57BL/6 в условиях оптимальной жизнедеятельности и при экспериментальном сахарном диабете 66
3.3 Влияние пегилированной формы аналога глюкагоноподобного пептида на концентрацию глюкозы в сыворотке крови у мышей C57BL/6 при сахарном диабете 68
3.4 Влияние пегилированной формы аналога глюкагоноподобного пептида на концентрацию инсулина в сыворотке крови у мышей C57BL/6 при сахарном диабете 72
3.5 Гистологическое исследование поджелудочной железы у мышей C57BL/6 при сахарном диабете, леченных пегилированной формы аналога глюкагоноподобного пептида 73
3.6 Иммуногистохимическое исследование инсулина в поджелудочной железе у мышей C57BL/6 при сахарном диабете, леченных пегилированной формы аналога глюкагоноподобного пептида 75
3.7 Исследование влияния пегилированной формы аналога глюкагоноподобного пептида на содержание предшественников бета-клеток в поджелудочной железе у мышей C57BL/6 при сахарном диабете 77
3.8 Исследование влияние пегилированной формы аналога глюкагоноподобного пептида на самоподдержание панкреатических предшественников бета-клеток поджелудочной железы in vitro 78
3.9 Исследование влияния пегилированной формы аналога глюкагоноподобного пептида на дифференцировку панкреатических предшественников бета-клеток в продуцирующие и секретирующие инсулин бета-клетки in vitro 80
Заключение 83
Выводы 100
Список сокращений 101
Список литературы 103
- Эпидемиология сахарного диабета 1-го типа
- Перспективы использования пегилированных аналогов глюкагоноподобного пептида 1 при гипергликемии
- Влияние пегилированной формы аналога глюкагоноподобного пептида на концентрацию глюкозы в сыворотке крови у мышей C57BL/6 при сахарном диабете
- Исследование влияния пегилированной формы аналога глюкагоноподобного пептида на дифференцировку панкреатических предшественников бета-клеток в продуцирующие и секретирующие инсулин бета-клетки in vitro
Эпидемиология сахарного диабета 1-го типа
Сегодня диабетом страдают более 7% взрослого населения в мире. Ряд исследований [Evans J.M. et al., 2000; Bruno G. et al., 2005; Holman N. et al., 2015], показал, что примерно 87% – 91% случаев заболевания приходится на долю СД2, 7%-12% – на долю СД1 и 1%-3% – на долю других типов сахарного диабета. IDF опубликовала рейтинг стран по числу больных диабетом людей, в котором на первом месте стоит Индия (50,8 млн. человек). Остальные страны распределились в ранговом порядке следующим образом: Китай (43,2 млн. человек), Соединенные Штаты (26,8 млн. человек), Россия (9,6 млн.), Бразилия (7,6 млн. человек), Германия (7,5 млн. человек), Пакистан (7,1 млн. человек), Япония (7,1 млн. человек), Индонезия (7 млн. человек), Мексика (6,8 млн. человек) [International Diabetes Federation. IDF Diabetes Atlas, 6th edn. Brussels, Belgiu, 2015].
Вместе с тем, по данным ВОЗ эти значения сильно занижены. Несмотря на то, что проблема сахарного диабета сегодня стоит на повестке дня во многих странах мира, по оценкам IDF, около 175 миллионов случаев не диагностированы. Уровень заболеваемости СД в Российской Федерации, сегодня ниже, чем в ведущих страна мира. Однако ученые уже сигнализируют о том, что Россия вплотную подошла к эпидемиологическому порогу [Аметов А.С. и др., 2013].
Средний показатель заболеваемости детей по РФ 11,2 на 100 тыс. детского населения [Дедов И.И. и др., 2017]. Заболевание проявляется в любом возрасте (существует врожденный диабет), но наиболее часто дети заболевают в периоды интенсивного роста (4–6 лет, 8–12 лет, пубертатный период). Дети грудного возраста поражаются в 0,5% случаев СД. По данным IDF, в начале 2014 г. в России диагноз СД был поставлен 3,96 млн. человек, при этом истинная распространенность заболевания, согласно данным эпидемиологических исследований, значительно выше – количество больных составляет более 9 млн. человек [IDF, Diabetes Atlas Eighth Edition, 2015]. По данным ряда исследований, в мире насчитывается более 33 млн., а в России в 2015 г. зарегистрировано более 340 тысяч больных сахарным диабетом 1-го типа, что составляет около 8,5% общего количества больных СД [Дедов И.И. и др., 2016], из них более 18 тыс. детей и более 9,5 тыс. подростков, страдающих сахарным диабетом 1-го типа [Дедов И. И. и др., 2010].
За последние два десятилетия заболеваемость СД1 среди детей неуклонно увеличивается. Четверть больных приходится на возраст до четырех лет жизни. Ежегодно в мире около 96 000 детей младше 15 лет заболевает СД1. При этом самые высокие показатели заболеваемости зафиксированы в Финляндии, Швеции и Кувейте. Впервые количество детей и подростков до 20 лет с СД1 в мире превысило миллион (1 106 200). Более четверти (28,4%) дети и подростки с диабетом 1-го типа живут в Европе и более одной пятой (21,5%) живут в Северной Америке и странах Карибского бассейна. Соединенные Штаты, Индия и Бразилия имеют самую высокую заболеваемость и распространенность детей с СД1 [IDF, Diabetes Atlas Eighth Edition, 2017].
По данным Государственного регистра РФ больных сахарным диабетом (ГРСД) распространенность СД1 за 10 лет у детей выросла на 35,7%, у подростков на 68,9%, у взрослых на 2,36% [Шуплецова В.В. и др., 2016].
Перспективы использования пегилированных аналогов глюкагоноподобного пептида 1 при гипергликемии
Благодаря своей уникальной глюкозо-зависимой стимуляции секреции инсулина глюкагоноподобный пептид 1 считается весьма желательным и перспективным противодиабетическим средством. На рынке стали появляться сообщения о перспективности использования агонистов ГПП-1 для лечения гипергликемии [Chowdhury A.I. et al., 2016; Janzen K.M. et al., 2016]. В некоторых публикациях сообщается, что введение ГПП-1 приводит к нормогликемии и способствует нормализации эндотелиальной функции у больных с сахарным диабетом 1-го типа [Dupre J., 2005; Ceriello A. et al., 2016]. Разработка лекарственных препаратов на основе ГПП-1 имеет ограничение в силу короткого периода полураспада в плазме [Чазова Т.Е., 2013]. Деградацию ГПП-1 можно ограничить или предотвратить, создавая устойчивые к DPP-IV конъюгаты, используя при этом такие носители как полиэтиленгликоль (ПЭГ).
Действительно, пегилирование и модифицирование улучшает фармакологические профили ГПП-1. Так, Lee S.H. с коллегами предложил два монопегилированных полиэтиленгликолем конъюгата глюкагоноподобного пептида-1: PEG(2k)-N(ter)-GLP-1 и PEG(2k)-Lys-GLP-1 [Lee S.H. et al., 2005]. PEG(2k)-Lys-GLP-1 показал сравнимую стимуляцию секреции инсулина в изолированных островках Лангерганса поджелудочной железы крысы с нативной формой инкретина, при этом эффект PEG(2k)-N(ter)-GLP-1 уступал таковому при исследовании нативного инкретина. Между тем, PEG(2k)-N(ter)-GLP-1 был значительно более устойчив к DPP-IV по сравнению с немодифицированным ГПП-1. При исследовании PEG(2k)-N(ter)-GLP-1 in vivo оказалось, что при внутривенном и подкожном введении крысам время полувыведения конъюгата из организма значительно превосходило над таковым у нативного инкретина. По мнению Lee S.H. et al. (2005) конъюгированные формы ГПП-1 могут служить потенциальными кандидатами в качестве противодиабетических средств для избирательного лечения пациентов с сахарным диабетом 2 типа.
Пероральное введение лекарственных средств имеет существенные преимущества в лечении заболеваний по сравнению с подходами терапии, основанных на инъекциях препаратов. По своим природным характеристикам кишечная абсорбция ГПП-1 ограничена. Для её улучшения Chae S.Y. et al. (2008) разработали оригинальные аналоги инкретина посредством сайт-специфической конъюгации biotin-NHS и / или biotin-poly(ethylene glycol)-NHS) на Lys 26 и Lys 34 глюкагоноподобного пептида 1 (7-36) соответственно: Lys 26,34-DiBiotin-GLP-1 (DB-GLP-1) и Lys 26-Biotin-Lys 34-(Biotin-PEG)-GLP-1 (DBP-GLP-1). В экспериментах in vitro DBP-GLP-1 демонстрировал высокую стабильность против протеолитического действия трипсина, кишечной жидкости и DPP-IV по сравнению с нативным GLP-1 и DB-GLP-1. Дополнительно биотинилированный и биотин-пегилированный аналоги стимулировали секрецию инсулина в изолированных островках Лангерганса крыс. У мышей линии db/db с возникающим спонтанно диабетом DB-GLP-1 и DBP-GLP-1 оказывали положительное влияние на глюкозотолерантный тест, при этом аналоги активно проникали через кишечный барьер. Биотинилированный и биотин пегилированный ГПП-1 рассматриваются авторами в качестве потенциального перорального сахароснижающего агента [Chae S.Y. et al., 2008].
Для связывания с ГПП-1-рецептором важны N-терминальные остатки глюкагоноподобного пептида 1, аминокислота в -helix структурах N терминальной области ГПП-1 определяет гипогликемический эффект [Adelhorst K. et al., 1994; Underwood C.R. et al., 2010]. С этих позиций изменение структуры N-терминальных областей инкретина при создании пегилированных аналогов ГПП-1 не желательно, так как воможно значительное изменение биологической активности конъюгатов. Для сайт специфического пегилирования в целях поддержания глюкозогликемической активности ГПП-1 M. Gao с коллегами (2013) выбрали C-терминальную область. При этом в качестве пептидного субстрата использовался не сам нативный инкрертин, а его мутированный аналог (A2G, K26R) – PEG20K-mGLP-1. Как известно, мутация делает ГПП-1 резистентным к ферментативному разложению [Deacon C.F. et al., 1998]. M. Gao с соавт. показал, что пегилирование полиэтиленгиколем препятствует энзиматической деградации и увеличивает время циркуляции в организме PEG20K-mGLP-1. Установлено, что PEG20K-mGLP-1 является агонистом ГПП-1-рецепторов и оказывает противодиабетическое действие: частично защищает от повреждения стрептозотоцином островки Лангерганса поджелудочной железы экспериментальных животных, повышает уровень инсулина крови и улучшает гомеостаз глюкозы [Gao M. et al., 2013]. Дополнительно лечение PEG20K-mGLP-1 задерживает эвакуацию пищи из желудка и уменьшает поглащение глюкозы из пищевых продуктов. Не исключается, что PEG20K-mGLP-1, подобно нативному ГПП-1, может подавлять глюконеогенез в печени, уменьшать секрецию глюкагона из панкреатических бета-клеток и ускорять поглощение глюкозы тканями, включая мышцы и жировую ткань [Holst J.J., 2007]. Представленные данные свидетельствуют о том, что PEG20K-mGLP-1 может рассматриваться как перспективная молекула для создания препарата в целях лечения гипергликемических проявлений приемущественно при сахарном диабете 2 типа.
Влияние пегилированной формы аналога глюкагоноподобного пептида на концентрацию глюкозы в сыворотке крови у мышей C57BL/6 при сахарном диабете
Моделирование сахарного диабета стрептозотоцином приводило к стойкому увеличению уровня глюкозы в крови у мышей, начиная с 4-х суток по 29-е сутки эксперимента (таблица 8). Максимальные значения показателя выявлены на 21, 27 и 29-е сутки. При курсовом введении ГПП-1 наблюдалась тенденция к снижению уровня глюкозы у диабетических мышей на 27 сутки эксперимента. ПегГПП-1 оказывала выраженное гипогликемическое действие: на 27 и 29-е сутки регистрировалось снижение концентрации глюкозы в 2,1 и 1,79 раза соответственно по сравнению с группой нелеченных мышей с СД1 (таблица 8).
Критерием выраженности нарушения метаболизма глюкозы является глюкозотолерантный тест (ГТТ). У животных интактного контроля и у мышей с СД1 был проведен ГТТ. В ответ на внутривенную инъекцию глюкозы (доза 2 г/кг) у интактных животных регистрировалось достоверное повышение уровня глюкозы в крови на протяжении 60 мин (таблица 8). Далее на 90, 120, 150 мин наблюдения, отмечалось поступательное снижение концентрации глюкозы.
Как уже было продемонстрировано выше, у животных с сахарным диабетом 1-го типа отмечалась гипергликемия: на 27-е сутки эксперимента концентрация глюкозы в крови была максимальная (таблица 8). В этой связи у мышей с СД1 ГТТ проводился на 27-е сутки. Так, из результатов ГТТ следует, что высокая концентрации глюкозы у диабетических мышей сохранялась с 30 мин по 150 мин (таблица 9). Курсовое введение ГПП-1 не влияло на результаты ГТТ у мышей с СД1. Исключение составила 150 мин, когда уровень глюкозы снижался относительно патологического контроля на 26%, при этом изменения не носили достоверный характер. В свою очередь назначение пегГПП-1 вызывало достоверное снижение уровня глюкозы на 120 мин (на 78%) и 150 мин (на 41%) наблюдения по сравнению с нелеченными мышами в условиях СД1.
На 27 сутки эксперимента производился расчет площади под кривой для содержания глюкозы в крови (AUC). По нашим данным у мышей в условиях введения стрептозотоцина (патологический контроль) отмечалось увеличение AUC на 120% (Р 0,05) по сравнению с интактным контролем (таблица 9). Назначение ГПП-1 не влияло на площадь под кривой у диабетических мышей. В тоже время пегГПП-1 достоверно уменьшала AUC более чем на 17,4% по отношению к патологическому контролю.
Таким образом, при моделировании сахарного диабета введение пегилированной формы аналога глюкагоноподобного пептида вызывало гипогликемический эффект и снижало уровень глюкозы при проведении орального глюкозотолерантного теста, при этом нижалась площадь под кривой для содержания глюкозы в крови. Выраженность эффектов пегГПП-1 значительно превосходила активность нативной формы инкретина ГПП-1.
Исследование влияния пегилированной формы аналога глюкагоноподобного пептида на дифференцировку панкреатических предшественников бета-клеток в продуцирующие и секретирующие инсулин бета-клетки in vitro
У полученных в результате культивирования мультипотентных предшественников бета-клеток (CD45–TER119–c-kit–Flk-1–) и олигопотентных предшественников бета-клеток (CD45–TER119–CD133+CD49flow) изучали способность дифференцироваться в инсулин-продуцирующие клетки (окрашивание дитизоном) в присутствии ГПП-1 или пегГПП-1 in vitro. Концентрация ГПП-1 или пегГПП-1 в культуре составляла 10-7 М. Забор мононуклеаров поджелудочной железы для исследования проводили на 27-е сутки эксперимента. Полученные данные указывали на то, что по окончании цикла дифференцировки предшественников бета-клеток в соответствующей среде без соединений (спонтанная дифференцировка) появлялись единичные дитизон-положительные клетки в группах интактного и патологического контроля. При внесении в культуру интактных предшественников бета-клеток ГПП-1 или пегГПП-1 наблюдался прирост дитизон-положительных клеток до n=100 и n=87 соответственно. В культуре предшественников бета-клеток диабетического контроля увеличение числа дитизон-положительных клеток после внесения в культуру препаратов ГПП-1 или пегГПП-1 было более значительно: на 105 клеток выявлено n=329 и n=284 дитизон-положительных клеток соответственно.
В супернатантах дитизон-положительных клеток, полученных в результате дифференцировки предшественников, ИФА оценивали уровень инсулина. В культуральной среде моделировали базальный уровень глюкозы (концентрация глюкозы 3 ммоль/л) и глюкозную нагрузку (концентрация глюкозы 20 ммоль/л). Из результатов, представленных в таблице 12, следовало, что инсулин определялся только в супернатантах от дитизон-положительных клеток, полученных в результате ГПП-1 или пегГПП-1-индуцированной дифференцировки предшественников бета-клеток.
Обращал на себя внимание, во-первых, тот факт, что уровень инсулина при моделировании глюкозной нагрузки значительно превосходил таковой в условиях базального уровня глюкозы. Во-вторых, то обстоятельство, что уровень глюкозы в группе патологического контроля значительно превосходил уровень глюкозы в интактном контроле (таблица 15).
Таким образом, пегилированная форма модифицированного аналога глюкагоноподобного пептида 1 подобно нативной форме ГПП-1 стимулировала дифференцировку олигопотентных предшественников бета-клеток мышей интактного контроля и мышей с сахарным диабетом в продуцирующие инсулин бета-клетки in vitro. Достоверных различий в эффектах пегГПП-1 и ГПП-1 in vitro не выявлено.