Содержание к диссертации
Введение
1 Обзор литературы 13
1.1 Общая характеристика лекарственного растения – пижмы обыкновенной 13
1.2 Классификация полисахаридов. Характеристика, структура, физико-химические свойства растительных полисахаридов 16
1.3 Фармакологическая активность растительных полисахаридов 24
1.3.1 Влияние полисахаридов на состояние органов
желудочно-кишечного тракта и микрофлоры 25
1.3.2 Влияние полисахаридов на всасывание радионуклидов и катионов тяжелых металлов 28
1.3.3 Влияние полисахаридов на обмен веществ и систему крови .29
1.3.4 Влияние полисахаридов на развитие воспалительного процесса 32
1.3.5 Антибактериальная, противовирусная и иммуномодулирующая активность полисахаридов 33
1.3.6 Перспективы применения полисахаридов в онкологической практике 35
1.3.7 Антиоксидантная активность растительных полисахаридов .36
1.3.8 Нейропротективная активность сульфатированных полисахаридов 38
1.3.9 Влияние полисахаридов на проницаемость клеточных мембран 40
2 Материалы и методы исследования .42
2.1 Выделение полисахаридного комплекса цветков пижмы
обыкновенной из лекарственного растительного сырья 42 2.2 Изучение физико-химических свойств полисахаридного комплекса цветков пижмы обыкновенной .42
2.3 Экспериментальные животные 50
2.4 Исследование острой токсичности .51
2.5 Исследование субхронической токсичности .52
2.6 Модель язвенного поражения желудка 57
2.7 Модель экспериментального экссудативного воспаления 58
2.8 Модель острого токсического поражения печени 59
2.9 Определение маркеров состояния перекисного окисления липидов и антиоксидантной защиты клетки 59
2.10 Статистическая обработка результатов опытов 63
3 Результаты исследования 64
3.1 Выделение, определение состава и стандартизация полисахаридного комплекса 64
3.2 Определение токсичности полисахаридного комплекса цветков пижмы обыкновенной 73
3.2.1 Определение острой токсичности .73
3.2.2 Определение субхронической токсичности .77
3.3 Гастропротекторное действие полисахаридного комплекса цветков пижмы обыкновенной на модели язвы желудка, вызванной введением индометацина 86
3.4 Влияние полисахаридного комплекса цветков пижмы обыкновенной на развитие экспериментального экссудативного воспаления 91
3.5 Влияние полисахаридного комплекса цветков пижмы обыкновенной в условиях острого токсического поражения печени . 95
3.6 Антиоксидантная активность полисахаридного комплекса цветков пижмы обыкновенной 97
3.6.1 Влияние полисахаридного комплекса цветков пижмы обыкновенной на антиоксидантную активность в условиях острого токсического поражения печени .98
3.6.2 Влияние полисахаридного комплекса цветков пижмы обыкновенной на антиоксидантную активность в условиях экспериментального экссудативного воспаления .101
Заключение 107
Выводы .118
Список сокращений и условных обозначений .120
Список литературы
- Классификация полисахаридов. Характеристика, структура, физико-химические свойства растительных полисахаридов
- Перспективы применения полисахаридов в онкологической практике
- Модель язвенного поражения желудка
- Влияние полисахаридного комплекса цветков пижмы обыкновенной в условиях острого токсического поражения печени .
Введение к работе
Актуальность темы исследования. Перспективным направлением развития фармакологии является разработка и исследование новых источников лекарственных средств, в том числе из лекарственных растений. Лекарственные растительные препараты при условии рационального использования имеют ряд преимуществ: они обладают разносторонней фармакологической активностью и достаточно большой широтой терапевтического действия, но в то же время более мягким эффектом по сравнению с синтетическими средствами, что важно при длительном применении; являются относительно безопасными, практически не вызывают аллергических реакций (Криштанова Н.А. и соавт., 2005).
В настоящее время наиболее перспективными растительными лекарственными средствами считаются препараты индивидуальных веществ, относящихся к различным классам химических соединений, таких как алкалоиды (атропина сульфат, кодеина фосфат, пилокарпина гидрохлорид), гликозиды (дигоксин, строфантин К), флавоноиды (рутин, кверцетин). Полисахариды используются в медицинской практике в основном в виде галеновых препаратов. Однако в настоящее время проводится активный скрининг некрахмальных полисахаридов высших растений и водорослей с целью разработки эффективных препаратов на основе индивидуальных веществ (Злобин А.А., 2011; Крыжановский С.П. и соавт., 2014).
Некрахмальные полисахариды оказывают разностороннее влияние на организм в норме и при различных патологических состояниях. Они обладают адаптогенным действием (Сигенова С.С. и соавт., 2012; Jing B. et al., 2015), стимулируют физическую работоспособность (Лаксаева Е.А., 2010) и иммунную систему организма (Хобракова В.Б., 2012; Фомина А.А., 2014), усиливают фагоцитоз, повышают продукцию антител, увеличивают количество лимфоцитов в крови, проявляют противовоспалительную активность (Хайпин Л. и соавт., 2008; Ефимова Л.А. и соавт., 2010; Марков П.А. и соавт., 2010). На поверхности слизистой оболочки желудка и кишечника полисахариды образуют гель, оказывая обволакивающее и протективное действие (Хотимченко Ю.С. и соавт., 2005; Крылова С.Г. и соавт., 2006), кроме того, за счет набухания они изменяют транзит химуса по желудочно-кишечному тракту (Plaami S.P., 1997), обладают пребиотической активностью (Валышев А.В., 2012; Мельников В.А. и соавт., 2012), являются перспективными энтеросорбентами (Савченко О.В., 2002; Хотимченко М.Ю. и соавт., 2005).
Степень разработанности проблемы. Несмотря на достаточно большое количество сведений о биологической активности полисахаридных комплексов растений, практически отсутствуют публикации, отражающие взаимосвязь между особенностями структуры конкретных полимеров и наличием и степенью выраженности их фармакологического действия. Кроме того, одним из наиболее важных вопросов остается выяснение и уточнение возможных
механизмов действия полисахаридов и их комплексов при лечении и профилактике различных видов патологий.
Пижма обыкновенная – официнальное лекарственное растение (ГФ XIII, Т. 3., 2015), используемое в медицине как желчегонное средство. В медицинской практике применяют настой из цветков, а также сухой экстракт – препарат «Танацехол». Цветки пижмы обыкновенной имеют сложный химический состав, представленный такими группами биологически активных веществ как флавоноиды, эфирные масла, гидроксикоричные кислоты, дубильные вещества, полисахариды (Куркина А.В., 2011).
Цель исследования: выделить полисахаридный комплекс из цветков пижмы обыкновенной, изучить его состав, токсичность и фармакологическую активность.
Задачи исследования:
-
Разработать методику выделения и очистки полисахаридного комплекса из цветков пижмы обыкновенной, исследовать некоторые его физико-химические свойства. Определить качественный и количественный состав выделенного полисахаридного комплекса и предложить методы его стандартизации.
-
Изучить острую и субхроническую токсичность выделенного полисахаридного комплекса.
-
Изучить гастропротекторную активность полисахаридного комплекса цветков пижмы обыкновенной в сравнительном аспекте.
-
Изучить противовоспалительную активность полисахаридного комплекса цветков пижмы обыкновенной в сравнительном аспекте.
-
Изучить гепатопротекторную активность полисахаридного комплекса цветков пижмы обыкновенной в сравнительном аспекте.
-
Изучить антиоксидантную активность полисахаридного комплекса цветков пижмы обыкновенной в сравнительном аспекте.
Научная новизна. В работе впервые:
-
предложена методика выделения и стандартизации полисахаридного комплекса цветков пижмы обыкновенной;
-
изучена солюбилизирующая способность полисахаридного комплекса цветков пижмы обыкновенной;
-
показано отсутствие токсического действия полисахаридного комплекса цветков пижмы обыкновенной при однократном введении в максимально возможной дозе, а также при курсовом введении в терапевтической дозе в течение 30 суток;
-
установлена гастропротекторная активность полисахаридного комплекса цветков пижмы обыкновенной при профилактическом введении;
-
выявлено противовоспалительное и антиоксидантное действие полисахаридного комплекса цветков пижмы обыкновенной при экссудативном воспалении, вызванном введением формалина под апоневроз стопы задней конечности животного;
6. установлена гепатопротекторная и антиоксидантная активность полисахаридного комплекса цветков пижмы обыкновенной при токсическом поражении печени четыреххлористым углеродом.
По материалам диссертационной работы получен патент РФ и оформлено рационализаторское предложение.
Теоретическая и практическая значимость работы. В работе установлен состав полисахаридного комплекса цветков пижмы обыкновенной, изучены некоторые его физико-химические свойства, солюбилизирующая активность, предложена методика стандартизации. Продемонстрирована безопасность полисахаридного комплекса цветков пижмы обыкновенной при исследовании как острой, так и субхронической токсичности. Полисахарид не оказывает местно-раздражающего действия и не вызывает нарушения структуры и функционального состояния основных органов и систем, а также метаболических процессов. Гастропротекторная активность полисахаридного комплекса цветков пижмы обыкновенной в эксперименте превосходит эффективность ранитидина и сравнима с омепразолом. Противовоспалительная активность полисахаридного комплекса цветков пижмы обыкновенной сравнима с эффектом диклофенака-натрия. По гепатопротекторной активности полисахаридный комплекс цветков пижмы обыкновенной уступает силимарину, однако превосходит его по антиоксидантному действию. Полученные результаты позволяют рекомендовать полисахаридный комплекс цветков пижмы обыкновенной для дальнейшего изучения в доклинических исследованиях, а также в клинической практике в целях комплексной терапии эрозивно-язвенных поражений желудочно-кишечного тракта, токсических гепатитов, патологий, сопровождающихся оксидативным стрессом, а также хронических воспалительных заболеваний для снижения побочных эффектов нестероидных противовоспалительных препаратов.
Методология и методы диссертационного исследования. Выделение, физико-химическое исследование и стандартизация полисахаридного комплекса цветков пижмы обыкновенной выполнены согласно требованиям ГФ XIII. Изучение токсичности и фармакологической активности полисахарида проведено на аутбредных крысах линии SD согласно действующему руководству по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Диссертационное исследование выполнено на кафедрах фармакологии с курсом фармации ФДПО, общей химии с курсом биоорганической и органической химии, а также в центральной научно-исследовательской лаборатории федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего образования «Рязанский государственный медицинский университет имени академика И.П. Павлова» Министерства здравоохранения Российской Федерации.
Положения, выносимые на защиту:
1. Полисахаридный комплекс цветков пижмы обыкновенной относится к классу гликуроногликанов типа пектиновых веществ и состоит из остатков глюкозы, галактозы, ксилозы, арабинозы и маннозы. Стандартизация
полисахаридного комплекса проведена по содержанию восстанавливающих моносахаридов.
-
Полисахаридный комплекс цветков пижмы обыкновенной относится к III классу токсичности или к малотоксичным соединениям и не вызывает органотоксических эффектов при субхроническом введении.
-
Полисахаридный комплекс цветков пижмы обыкновенной оказывает выраженное гастропротекторное действие, снижает количество деструктивных эрозивно-язвенных поражений, вызванных введением индометацина, по противоязвенной активности превосходит эффективность ранитидина и сравним с омепразолом.
-
Полисахаридный комплекс цветков пижмы обыкновенной оказывает выраженное тормозящее действие на развитие экссудативного компонента воспалительной реакции, снижает лейкоцитоз и уровень СОЭ, по противовоспалительной активности сравним с диклофенаком-натрия.
-
Полисахаридный комплекс цветков пижмы обыкновенной оказывает гепатопротекторное действие, уменьшает цитолиз, снижает активность аспартатаминтрансферазы, уступая по эффекту силимарину.
-
Полисахаридный комплекс цветков пижмы обыкновенной проявляет выраженное антиоксидантное действие, вызывая снижение концентрации ТБК-реактивных продуктов, повышение содержания безбелковых тиоловых групп и активности глутатион-S-трансферазы и глутатионпероксидазы при оксидативном стрессе, вызванным как введением четыреххлористого углерода, так и воспалительной реакцией. Полисахаридный комплекс превосходит силимарин по антиоксидантной активности, а также уменьшает прооксидантное действие диклофенака-натрия при совместном применении в раннем периоде воспалительной реакции.
Степень достоверности и апробация результатов. Достаточный объем экспериментальных исследований, проведенных с использованием современных инструментальных и лабораторных методик, последующая систематизация и статистическая обработка первичных данных обеспечивают высокую степень достоверности полученных результатов.
Основные материалы диссертационного исследования были изложены и обсуждены на: Межрегиональной научной конференции Рязанского государственного медицинского университета имени академика И.П. Павлова (Рязань, 2011); Всероссийской научно-практической конференции «Биохимические научные чтения памяти академика РАН Е.А. Строева» (Рязань, 2012); XIX Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2012); Всероссийской научной конференции с международным участием «Успехи синтеза и комплексообразования» (Москва, 2012); Всероссийской конференции с международным участием, посвящённой 75-летию со дня рождения В.В. Кормачева «Современные проблемы химической науки и образования» (Чебоксары, 2012); Всероссийской конференции, посвященной 90-летию со дня рождения профессора А.А. Никулина (Рязань, 2013); Межрегиональной научной конференции Рязанского государственного медицинского университета имени
академика И.П. Павлова с международным участием (Рязань, 2014); Всероссийской конференции молодых ученых с международным участием «Достижения современной фармакологической науки», посвященной 150-летию со дня рождения академика Н.П. Кравкова (Рязань, 2015).
Апробация диссертации проведена на межкафедральном совещании кафедр фармакологии с курсом фармации ФДПО, патофизиологии, сердечнососудистой, рентгенэндоваскулярной, оперативной хирургии и топографической анатомии, гистологии и биологии, биологической химии с курсом клинической лабораторной диагностики ФДПО, общей химии с курсом биоорганической и органической химии, фармацевтической и токсикологической химии федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего образования «Рязанский государственный медицинский университет имени академика И.П. Павлова» Министерства здравоохранения Российской Федерации.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 17 печатных работ, из них 4 в журналах, включенных в перечень российских рецензируемых научных изданий и журналов, рекомендованных ВАК Минобрнауки России, 1 патент на изобретение РФ, оформлено рационализаторское предложение.
Личный вклад автора. Личный вклад автора состоит в подготовке аналитического обзора литературы, непосредственном участии в составлении программы исследований, проведении экспериментов, обработке и интерпретации данных, подготовке публикаций по диссертационной работе.
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 143 страницах. Работа состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы (глава 1), материалы и методы исследования (глава 2), результаты исследования (глава 3), заключение, выводы, список сокращений и условных обозначений, список литературы.
Диссертация иллюстрирована 14 рисунками и 23 таблицами. Список литературы включает 208 источников, из которых 142 отечественных и 66 работ иностранных авторов.
Классификация полисахаридов. Характеристика, структура, физико-химические свойства растительных полисахаридов
Пижма обыкновенная (Tanacetum vulgare L.) относится к семейству Астровые (Asteraceae). Является многолетним травянистым растением, достигающем высоты 50 - 150 см. Пижма обыкновенная имеет евразийский ареал, встречается почти на всей территории европейской части СНГ (кроме восточных районов Предкавказья, нижнего течения рек Урала и Волги, Закавказья), а также на севере Казахстана и в Западной Сибири. На Дальнем Востоке, в Восточной Сибири и Восточном Казахстане, Киргизии встречается в качестве заносного растения.
Растение имеет очерёдные, дваждыперисторассечённые, продолговато-яйцевидные листья, с 5 - 12 парами заострённых, пильчатых продолговато-ланцетных листочков, изредка почти цельнокрайних. Цвет с верхней стороны тёмно-зелёный, с нижней стороны листочки желёзистые, с точками. Большинство листьев - сидячие, жёсткие, только самые нижние - черешковые. Цветки жёлтые, мелкие, правильные, обоеполые, трубчатые, собраны в корзинки. Щитковидные соцветия расположены на верхушке стебля. Обёртка многорядная, полушаровидная, черепитчатая, с зелёными листочками и сухоплёнчатым краем; цветоложе голое, срединные цветки обоеполые, периферические цветки женские, изредка короткоязычковые [44]. Формула цветка: А С& Л& %) Плодом пижмы обыкновенной является продолговатая пятигранная семянка с короткой, мелко зазубренной окраиной. Растение цветёт с июля по сентябрь. Созревание плодов наступает в августе - сентябре [31].
В настоящее время потребности в сырье пижмы обыкновенной значительно уступают ее природным запасам. В промышленных масштабах цветки пижмы заготавливают в центральных областях Европейской части России: Республике Башкортостан и в Ростовской области, а также на Украине. При необходимости массовый сбор возможен в Западной Сибири [1]. Однако, помимо сбора дикорастущего сырья, в настоящее время возникла потребность возделывания пижмы обыкновенной в культуре, так как в природе она зачастую произрастает в сильно загрязненной местности [31].
В медицинской практике используют цветки пижмы (Flores Tanaceti). Сбор соцветий производят в начале цветения. Заготавливают части сложных щитковидных соцветий с цветоносом длиной не более 4 см и корзинки. Сушат сырье под навесами, на воздухе или в тепловых сушилках при температуре не выше 40C. Сырье раскладывают тонким слоем. Высушенное сырье представляет собой части сложного щитковидного соцветия и отдельные цветочные корзинки. Корзинки полушаровидной формы имеют в поперечнике диаметр 6 – 8 мм. Цветоложе голое, окруженное обверткой, которая состоит из серо-зеленых, ланцетных черепицеобразно расположенных листочков с пленчатым краем. Сырье имеет своеобразный камфорный запах, усиливающийся при растирании. Вкус пряный, горький [29].
Цветки пижмы обыкновенной имеют сложный химический состав. В сырье содержатся флавоноиды – лютеолин, апигенин, акацетин, кверцетин, изорамнетин и их гликозиды. Во время цветения содержатся также алкалоиды (0,04 – 0,5 %), полисахариды, органические кислоты (галлусовая и танацетовая), гликозиды, белки, дубильные и горькие вещества, витамины и провитамины (рутин, каротин, аскорбиновая кислота); в семенах присутствует жирное масло. Пижма накапливает марганец [31, 61].
Содержание эфирного масла в цветках и листьях зависит от места произрастания и от времени сбора. Наибольшим (около 0,1 – 0,2%) оно является в период цветения. Основной компонент эфирного масла - -туйон, в нем содержится также -туйон, L-камфора, пинен, борнеол, диоксилактонтанацетин. Вследствие наличия туйона пижма обыкновенная является токсичным растением [68, 137]. Пижма обыкновенная является официнальным растением. Она входит в Государственную фармакопею РФ [29], включена в фармакопеи Бельгии, Португалии, Финляндии, Украины и Белоруссии [52]. Согласно государственному реестру в медицинской практике пижму обыкновенную используют как желчегонное и антигельминтное средство [30].
Применяют настой цветков пижмы, который оказывает желчегонное действие [60], понижает содержание слизи в желчи, тонизирует мускулатуру и усиливает секрецию желудочно-кишечного тракта [37], обладает также потогонным, антисептическим, противовоспалительным, антигельминтным, спазмолитическим действием [60]. Он применяется в комплексной терапии язвы желудка и двенадцатиперстной кишки, в качестве гепатопротектора, используется при гастритах с пониженной кислотностью, запорах, метеоризме, желудочных коликах [53], энтероколитах, аскаридозе, лямблиозе [37]. Наружно настой цветков пижмы применяют при вывихах, ранах и фурункулезе. Считается, что пижма обыкновенная обладает потогонным, противолихорадочным, противовоспалительным и противомикробным свойствами [107].
Желчегонное действие растения обусловлено присутствием флавоноидов. Цветки пижмы обыкновенной входят в состав желчегонного сбора №3 и сбора М.Н. Здренко [71].
В Российской Федерации выпускается препарат «Танацехол» (ЗАО «Фармцентр ВИЛАР»), представляющий собой сухой экстракт цветков пижмы, содержащий сумму флавоноидов. «Танацехол» усиливает образование и выделение желчи и нормализует ее биохимический состав; снижая содержание общего холестерина и увеличивая суммарное количество желчных кислот. Кроме того, «Танацехол» оказывает спазмолитическое действие на мускулатуру кишечника, желчного пузыря и желчных протоков, положительно влияет на симптомы желудочной и кишечной диспепсии, вызывая исчезновение тошноты, горечи во рту, нормализацию стула [71].
Перспективы применения полисахаридов в онкологической практике
Количественное определение уроновых кислот и свободных карбоксильных групп Для определения содержания уроновых кислот использовали метод, основанный на гидролизе пектинов и осаждении в виде кальция пектата полученной полигалактуроновой кислоты [129].
Около 1,3 г полисахарида (точная навеска) растворили в 15 мл воды очищенной. К полученному раствору добавляли 100 мл 0,1%-ного раствора натрия гидроксида. Оставляли на 30 минут для омыления пектина, переходящего в натрия пектат. Затем добавляли 50 мл 1%-ного раствора уксусной кислоты и получали свободную пектовую (полигалактуроновую) кислоту. К пектовой кислоте через 5 минут прибавляли 50 мл 2%-ного раствора кальция хлорида и оставляли на 1 час. В это время выпал осадок кальция пектата. Осадок промывали горячей водой очищенной на предварительно многократно обработанном водой очищенной и высушенном до постоянной массы взвешенном фильтре до тех пор, пока не стала отрицательной реакция на хлорид-ион с раствором серебра нитрата. Осадок вместе с фильтром помещали в чашку Петри и высушивали в эксикаторе над серной кислотой.
По разнице между первоначальной массой фильтра и его массой с кальция пектатом находили содержание последнего в 1,3 г пектина цветков пижмы. Содержание пектовой кислоты вычисляли по формуле: С – содержание уроновых кислот; х – масса пектата кальция; V –объем раствора пектина; VI - объем раствора полисахарида; – коэффициент пересчета.
Для определения свободных карбоксильных групп около 0,15 г полисахарида (точная навеска) помещали в стакан, смачивали 96%-ным этанолом (во избежание комкования), и растворяли в 80 мл воды очищенной при периодическом перемешивании на магнитной мешалке. Раствор количественно переносили в мерную колбу объемом 100 мл, доводили объем в колбе водой до метки. Аликвотную часть (50 мл) приготовленного раствора помещали в колбу для титрования. Титровали 0,01 моль/л раствором натрия гидроксида до появления не исчезающего в течение минуты розового окрашивания (индикатор фенолфталеин).
Для количественного определения полисахаридов, выделенных из цветков пижмы обыкновенной, мы использовали спектрофотометрический метод. Выбранный метод основан на измерении оптической плотности продуктов взаимодействия моносахаридов, образующихся после гидролиза полисахарида, с кислотой пикриновой.
При восстановлении в мягких условиях (например, при кипячении с глюкозой и натрия карбонатом) одна нитрогруппа пикриновой кислоты (тринитрофенол) восстанавливается в аминогруппу, в результате чего пикриновая кислота превращается в пикраминовую кислоту, имеющую оранжевое окрашивание. Условия проведения цветной реакции глюкозы с пикриновой кислотой описаны в литературе [87, 104]. Закон Бугера – Ламберта – Бера соблюдается в интервале от 0,003 до 0,03%. Чувствительность метода составляет 0,03 мг/л, в пересчете на глюкозу.
Выбор светофильтра и последующие измерения оптической плотности проводили на фотометре марки КФК–3 в кюветах с толщиной оптического слоя 1 см относительно раствора сравнения. 0,1 г (точная навеска) полисахарида помещали в плоскодонную колбу на 50 мл, добавляли 10 мл разведенной (8,3%-ной) кислоты хлороводородной и кипятили с обратным холодильником в течение часа.
Колбу с содержимым охлаждали и добавляли по каплям 40%-ный раствор натрия гидроксида до получения раствора с рН = 4,0 – 4,5 (для определения рН использовали лабораторный рН – метр). Раствор количественно переносили в мерную колбу на 100 мл, доводили объем раствора водой очищенной до метки, перемешивали. Фильтровали экстракт через бумажный фильтр, первые 10 – 15 мл фильтрата отбрасывали (раствор А).
В коническую колбу на 50 мл помещали 1 мл 1%-ного раствора кислоты пикриновой, 3 мл 20%-ного раствора натрия карбоната и 5 мл анализируемого раствора А. Колбу с содержимым нагревали на кипящей водяной бане 10 минут, затем охлаждали до комнатной температуры. Содержимое колбы количественно переносили в мерную колбу на 25 мл и доводили объем раствора до метки водой очищенной.
Проводили измерение оптической плотности полученного раствора на фотометре КФК–3 при разных светофильтрах, относящихся к видимой области спектра, в кювете с толщиной слоя 10 мм.
Параллельно измеряли оптическую плотность 5 мл стандартного образца глюкозы, обработанного аналогично испытуемому раствору.
В качестве раствора сравнения применяли смесь, состоящую из 1 мл 1%-ного раствора кислоты пикриновой, 3 мл 20%-ного раствора натрия карбоната и 5 мл воды очищенной. Смесь нагревали на кипящей водяной бане 10 минут, охлаждали и доводили объем раствора водой очищенной до 25 мл.
Для изучения свойств окрашенного продукта взаимодействия гидролизата полисахарида с пикриновой кислотой, измеряли оптическую плотность окрашенного раствора в кювете с толщиной оптического слоя 10 мм относительно раствора сравнения. Измерения оптической плотности проводили каждые 5 минут в течение 30 минут.
Содержание восстанавливающих сахаров в препарате в процентах (Х) вычисляли по формуле: а – навеска препарата в граммах; А х – оптическая плотность испытуемого раствора; Аст – оптическая плотность стандартного образца глюкозы; Сст – концентрация раствора глюкозы, в г/мл; Р – разведение. На способ стандартизации ЛРС цветков пижмы обыкновенной по содержанию восстанавливающих моносахаридов полисахаридного комплекса получено рационализаторское предложение №1312 от 14 января 2011 г. 2.3 Экспериментальные животные Для изучения токсичности и фармакологической активности полисахаридного комплекса цветков пижмы обыкновенной были проведены исследования на 170 аутбредных крысах линии SD (Sprague Dawley), массой 150-200 г. Животные получены из питомника «Столбовая», содержались в стандартных условиях вивария. Исследования выполнены в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» (приказ МЗ РФ 708н от 23.08.2010).
Модель язвенного поражения желудка
Патоморфологическое исследование внутренних органов
По данным вскрытия и макроскопического исследования изучаемых органов, различий между животными, получавшими полисахарид цветков пижмы обыкновенной и животными контрольной группы не установлено.
При осмотре брюшной и грудной полостей нарушений в расположении внутренних органов не наблюдалось. Величина и форма сердца, печени, почек, легких, мозга, желудка, селезенки, надпочечников, семенников, яичников не отличались от контроля. При осмотре слизистой оболочки желудка и кишечника признаков местно-раздражающего действия препарата не отмечалось.
Внутренние органы взвешивали и рассчитывали весовые коэффициенты как отношение массы органа к массе животного (таблица 3.13). Выявлено статистически достоверное (р 0,05) уменьшение массы почки у самцов на 16,33%, и увеличение массы надпочечников на 78,09% у самцов и на 44,83% самок. Однако при микроскопическом исследовании данных органов структурной патологии не обнаружено.
При микроскопическом исследовании проводили сравнительную оценку гистопатологической картины органов и тканей животных, получавших ПСП в дозе 0,3 г/кг в течение 30 дней и животных контрольной группы. При анализе у животных обеих групп были выявлены отдельные патологические изменения, в основном в легких. В контрольной группе наблюдались признаки воспаления респираторного отдела легкого: отек межальвеолярных перегородок, полнокровие гемокапилляров и инфильтрация лимфоцитами. У животных, получавших ПСП, степень выраженности этих проявлений была значительно ниже, наблюдались небольшие редкие очаги воспаления. Наиболее вероятной причиной появления данных изменений является индивидуальная реакция на общую анестезию диэтиловым эфиром. Учитывая, что степень проявления этих симптомов в опытной группе была ниже, можно сделать вывод об отсутствии их индуцирования полисахаридом, поэтому изменения рассматривали как фоновые. Таблица 3.13 – Весовые коэффициенты внутренних органов крыс контрольной группы и при курсовом введении полисахаридного комплекса цветков пижмы обыкновенной в течение 30 суток Внутренний орган Контрольная группа ПСП M, n=6 F, n=6 M, n=6 F, n=6 Печень 27,92±2,13 29,57±2,10 25,02±2,59 28,35±3,00 Почка правая 3,06±0,15 3,28±0,26 2,56±0,17 3,58±0,03 Почка левая 3,14±0,22 3,18±0,15 3,03±0,27 3,41±0,07 Желудок 5,74±0,27 5,39±0,61 4,96±0,51 5,83±0,66 Сердце 2,69±0,17 3,18±0,37 2,63±0,38 2,96±0,14 Селезенка 3,18±0,48 4,10±0,25 3,05±0,75 4,22±0,83 Мозг 5,42±0,63 7,17±0,66 5,36±0,28 7,32±0,95 Легкие 4,20±0,60 5,31±0,35 3,95±0,78 4,67±0,52 Надпочечник 0,105±0,018 0,174±0,013 0,187±0,036 0,252±0,053 Яичники 0,487±0,153 0,443±0,061 Семенники 4,20±0,19 4,71±0,52 Примечание: - р 0,05 – сравнение с данными животных контрольной группы
Структура коры больших полушарий у животных, получавших ПСП в дозе 0,3 г/кг массы в течение тридцати суток, не была изменена, очагов выпадения нейронов выявлено не было. Признаков нарушения функции нейронов не обнаружено.
При гистологическом исследовании сердца животных структурных изменений ткани миокарда выявлено не было, мышечные волокна были плотно расположены, равномерно окрашены эозином, во всех отделах наблюдалась четкая поперечная исчерченность миофибрилл, ядерная оболочка кардиомиоцитов была тонкой, ядра содержали нормальное количество хроматина. Структурная организация классических долек печени подопытных животных соответствовала норме, границы гепатоцитов были отчетливыми, цитоплазма клеток – зернистой, синусоиды – полнокровными. При гистологическом исследовании почек животных, получавших ПСП, видимых морфологических изменений в почечных тельцах, проксимальных и дистальных канальцах выявлено не было.
Кора надпочечников имела четко выраженные зоны, ядра клеток содержали достаточное количество хроматина. Мозговое вещество состояло из крупных клеток овальной формы. Сосуды надпочечников были полнокровны.
При гистологическом исследовании селезенки наблюдали хорошо выраженную белую пульпу с крупными фолликулами. В красной пульпе и венозных синусах присутствовали очаги кроветворения.
Гистологическая картина слизистой оболочки дна желудка подопытных животных соответствовала норме, видимых структурных изменений клеточного состава собственных желез выявлено не было. Таким образом, можно сделать вывод об отсутствие местно-раздражающего действия на слизистую оболочку желудка полисахаридного комплекса цветков пижмы обыкновенной при его курсовом введении.
Гистологическая картина семенников крыс-самцов, получавших ПСП, соответствовала норме, изменения в эпителии семенных канальцев и интерстициальных клетках отсутствовали.
Видимых структурных изменений яичников крыс-самок подопытной группы не выявлено, корковое вещество состояло из фолликулов различной степени зрелости, структура мозгового вещества соответствовала норме.
Изменение гемограммы и биохимических показателей плазмы крови крыс после курсового введения ПСП
Данные гематологического исследования представлены в таблице 3.14. Прием полисахарида цветков пижмы обыкновенной в течение 30 дней достоверно увеличивал уровень гемоглобина на 33% (р 0,05), возрастало также количество эритроцитов (на 5,96%) и гематокрит (на 6,39%), однако эти показатели изменялись недостоверно. Таблица 3.14 – Морфологический состав крови крыс контрольной группы и при курсовом введении полисахаридного комплекса цветков пижмы обыкновенной в течение 30 суток
У крыс опытной группы курсовое введение ПСП приводило к недостоверному увеличения уровня лейкоцитов на 106,01%. Наблюдались изменения в лейкограмме: содержание лимфоцитов и моноцитов по сравнению с данными животных контрольной группы снижалось на 17,47% (р 0,05) и 3,2% (р 0,05) соответственно, количество гранулоцитов увеличивалось на 23,34% (р 0,05). Данные изменения статистически значимыми не являлись.
Анализ основных биохимических показателей крови не выявил токсического влияния ПСП при субхроническом введении на функции печени и почек, отрицательного влияния на метаболические процессы (таблица 3.15). Содержание общего белка снижалось недостоверно и у самцов (на 4,51%) и у самок (на 3,56%), уровни АсАТ, ЩФ, креатинина и мочевины статистически значимо не изменялись. Введение полисахарида цветков пижмы обыкновенной недостоверно снижало содержание глюкозы у самок на 26,87% (р 0,05), что может быть связано с более высоким (в пределах нормы) показателем уровня глюкозы в контроле именно в данной группе. Уровень холестерина и триацилглицеридов изменялся незначительно и оставался в пределах физиологической нормы у животных обоего пола.
Влияние полисахаридного комплекса цветков пижмы обыкновенной в условиях острого токсического поражения печени .
Введение ПСП в дозе 0,3 г/кг массы курсом 30 суток приводило к достоверному снижению уровня АлАТ у крыс-самцов и прямого билирубина у самок, что свидетельствует об улучшении функционального состояния печени и послужило предпосылкой для дальнейшего изучения возможного гепатопротекторного действия полисахаридного комплекса цветков пижмы обыкновенной.
Исследование гастропротекторной активности полисахаридного комплекса цветков пижмы обыкновенной проводили на модели индометациновой язвы желудка. При профилактическом введении в дозе 0,3 г/кг массы курсом 4 дня ПСП значительно снижал общее число деструкций в слизистой оболочке желудка крыс, предотвращал появление полосовидных язв, количество крупных и точечных изъязвлений достоверно снижалось по сравнению с данными животных группы контроль патологии. В качестве препаратов сравнения были выбраны наиболее эффективные и широко применяемые антисекреторные лекарственные средства с различными механизмами действия – омепразол и ранитидин [10, 13, 51, 119]. Индекс Паулса, рассчитываемый как отношение произведения среднего количества язв и процента животных, имеющих язвы, к 100%, у животных, получавших ПСП был равен 10,00, у животных, получавших омепразол и ранитидин – 9,28 и 10,29 соответственно. В то же время противоязвенная активность, рассчитываемая как отношение индекса Паулса в группе контроля патологии к индексу Паулса в опытной группе, для ПСП составила 2,31, для ранитидина – 2,25, для омепразола – 2,49.
Таким образом, на модели индометациновой язвы было установлено, что полисахаридный комплекс цветков пижмы обыкновенной при профилактическом приеме оказывает выраженное гастропротекторное действие, снижая количество деструкций. Сравнительная оценка эффективности по коэффициенту противоязвенной активности показала, что ПСП превосходит ранитидин, однако уступает омепразолу.
Известно, что наиболее распространенным побочным эффектом НПВП является их повреждающее действие на желудочно-кишечный тракт. Механизм ульцерогенного действия связан с неизбирательной блокадой циклооксигеназы-1 (ЦОГ-1) наряду с циклооксигеназой-2 (ЦОГ-2). Следствием этого является ингибирование синтеза простагландинов, простациклина и тромбоксана А2 в слизистой оболочке желудка, что снижает продукцию слизи и гидрокарбонатов, замедляет местный кровоток и пролиферацию клеток. Кроме того, нестероидные противовоспалительные препараты (НПВП) являются прооксидантами и стимулируют ПОЛ, продукты которого способствуют поражению слизистой оболочки желудка и разрушению мукополисахаридов. В результате этих процессов преобладает действие агрессивных факторов на слизистую оболочку желудка, что в конечном итоге приводит к развитию язвы [38, 50]. 3%-ный раствор полисахаридного комплекса цветков пижмы обыкновенной, используемый в ходе экспериментов, обладает высокой кинетической вязкостью, и при введении в желудок обволакивает его стенки, препятствуя разрушающему действию хлороводородной кислоты на слизистую оболочку. Пектиновые полисахариды являются поверхностно-активными веществами [47] и могут определенным образом ориентироваться на поверхности раздела фаз гидрофильной среды желудка и гидрофобной мембраны клеток слизистой оболочки. За счет этого возможно образование на поверхности явз защитной пленки из молекул полисахарида, что препятствует воздействию агрессивных факторов среды.
ПСП, как и другие пектины, является слабым электролитом, при этом он содержит 15,66±4,79 % свободных карбоксильных групп. В кислой среде желудка их диссоциация подавляется и образуется молекулярная форма, при этом концентрация хлороводородной кислоты снижается. Таким образом, возможный антацидный эффект является еще одним компонентом, обеспечивающим гастропротекторное действие. Полисахариды растений оказывают ранозаживляющее действие и стимулируют регенерацию тканей [20, 56]. Пектат кальция в эксперименте увеличивает содержание протеолитических ферментов и концентрацию нуклеиновых кислот [16], что по мнению авторов приводит к активации синтеза добавочных клеток желудка по принципу обратной связи. В связи со схожестью структуры можно предположить наличие подобного действия и у пектинового полисахарида цветков пижмы обыкновенной. Кроме того, ПСП обладает антиоксидантным действием, что снижает повреждение мукополисахаридов слизистой оболочки свободными радикалами, образующимися в результате усиления ПОЛ под действие индометацина.
Исследование противовоспалительной активности полисахаридного комплекса цветков пижмы обыкновенной проводили на модели экссудативного воспаления, вызванного введением раствора формалина под апоневроз задней конечности животных. Введение ПСП в дозе 0,3 г/кг массы курсом 7 суток приводило к выраженному торможению развития отека и снижению экссудации, уменьшало лейкоцитоз и нормализовало СОЭ. В качестве препарата сравнения использовали наиболее широко применяемый НПВП – диклофенак-натрия. Противовоспалительная активность полисахаридного комплекса цветков пижмы обыкновенной в эксперименте оказалась сопоставима с эффектом диклофенака-натрия. Однако, он, как и другие НПВП, являясь прооксидантом оказывает повреждающее действие на слизистую оболочку желудка. В связи с этим представляло интерес изучить возможность совместного введения препаратов, с целью выявления возможного усиления противовоспалительной активности и предотвращения побочных эффектов диклофенака-натрия.
Одновременное введение ПСП и диклофенака-натрия существенно не изменяло динамику развития отека конечности по сравнению с раздельным назначением. Уровень лейкоцитов и СОЭ достоверно не отличался от показателей животных, получавших полисахарид и НПВП раздельно. Таким образом, можно сделать вывод об отсутствии потенцирования противовоспалительного эффекта при введении комбинации препаратов. Однако применение подобного сочетания частично устраняет прооксидантное действие диклофенака-натрия в раннем периоде развития воспалительной реакции, что подтверждается повышением содержания свободных сульфгидрильных групп и активности глутатионпероксидазы в гемолизате эритроцитов. Механизм противовоспалительного действия полисахаридного комплекса цветков пижмы обыкновенной, так же, как и других пектинов, возможно, связан с активацией системы моноцитов-макрофагов, продуцирующих протеогликаны, гликопротеины и глюкозамины, что приводит к ускорению созревания предшественников Т- и В-лимфоцитов. В свою очередь вырабатывающиеся лимфоциты повышают активность процесса фагоцитоза. Под действием пектинов ряда растений происходит увеличение числа плазматических клеток селезенки и усиление синтеза -глобулинов, что также ведет к активации фагоцитоза [124]. За счет наличия поверхностной активности полисахариды могут взаимодействовать с мембранами клеток, увеличивая перекисную резистентность [64]. Кроме того, ПСП проявляет антиоксидантную активность, что позволяет уменьшать повреждающее действие свободных радикалов, образующихся в очаге воспаления. Это согласуется с данными нашего исследования: снижением уровня ТБК-РП, повышением количества свободных сульфгидрильных групп и активности глутатион-S-трансферазы и глутатиорпероксидазы при использовании ПСП для лечения экссудативного воспаления. Комплексное действие способствует снижению отека ткани, нормализации уровня лейкоцитов и СОЭ.