Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Морфологические корреляты ишемии. фармакологическая коррекция ишемических расстройств (обзор литературы) 14
1.1 Гемодинамические нарушения при формировании острой фокальной ишемии мозга и зоны «ишемической полутени» 14
1.2 Современное представление о каскаде биохимических реакций как основном механизме ишемического повреждения мозга 20
1.3 Стратегия терапии ишемического повреждения мозга и пер -спектива морфологической оценки эффективности его коррекции нейропротектором ропреном 34
1.4 Морфо-функциональные особенности клеток головного мозга, важные для понимания их постишемической реактивности 36
1.5 Реактивные изменения клеточных элементов головного мозга в ядерной зоне ишемии и в зоне «ишемической полутени» 43
1.6 Изучение пластичности клеток мозга, методические приемы увеличения чувствительности морфологической диагностики ишемического инфаркта 48
1.7 Выбор отделов головного мозга для морфологического исследования последствий переднемозговой ишемии 51
Глава 2. Материал и методы исследования 55
2.1. Моделирование острой неполной ишемии переднего мозга 55
2.2. Выбор животных и группы исследования 57
2.3. Оценка неврологического статуса крыс 58
2.4. Методы биохимических исследований 59
2.5. Фармакологические средства для анализа неврологических и биохимических последствий ишемии головного мозга у крыс
2.6. Статистическая обработка поведенческих и биохимических результатов 62
2.7. Гистологические исследования головного мозга крыс 62
Глава 3. Результаты собственных исследований 67
3.1 Характеристика экспериментальной модели ишемии головного мозга. Оценка влияния полипренолов на выживаемость и неврологический статус крыс с ишемией головного мозга 67
3.2. Влияние полипренолов на показатели энергетического обмена в головном мозге крыс с ишемией головного мозга 69
3.3. Количественная, морфологическая и линейная характеристика клеточных элементов глубоких слоев передней цингулярной коры
и переднего медиального подотдела паранигрального ядра в норме 72
3.3.1. Характеристика клеточных элементов переднего медиального подотдела паранигрального ядра 72
3.3.2. Характеристика клеточных элементов глубоких слоев прегенуального цингулярного поля 81
3.4. Постишемические изменения клеточных элементов глубоких слоев передней цингулярной коры (фокус частичной ишемии) 85
3.5. Постишемические изменения клеточных элементов передней медиальной части паранигрального ядра (область ненарушенного кровотока) 90
3.6. Фармакологическая коррекция полипренолами постишемических изменений клеточных элементов глубоких слоев передней цингулярной коры (фокус частичной ишемии) 98
3.7. Фармакологическая коррекция полипренолами постишемических изменений клеточных элементов передней медиальной части паранигрального ядра (область ненарушенного кровотока) 106
Глава 4. Обсуждение полученных результатов 113
4.1. Фармакологическая коррекция ишемических повреждений головного мозга 113
4.2. Морфологические корреляты фармакологической коррекции ишемических нарушений 115
Выводы 120
Практические рекомендации 122
Список литературы 1
- Стратегия терапии ишемического повреждения мозга и пер -спектива морфологической оценки эффективности его коррекции нейропротектором ропреном
- Фармакологические средства для анализа неврологических и биохимических последствий ишемии головного мозга у крыс
- Характеристика клеточных элементов переднего медиального подотдела паранигрального ядра
- Морфологические корреляты фармакологической коррекции ишемических нарушений
Введение к работе
Актуальность выбранной темы исследования
В последние годы проблема острого инсульта приобретает все большую значимость из-за серьезных изменений в структуре инвалидизации и смертности от сердечно-сосудистых заболеваний, где он выходит на первое место, вытесняя ишемическую болезнь сердца (Гусев Е.И., Скворцова В.И., 2013). В связи с этим создание и изучение адекватных экспериментальных моделей данной патологии остается актуальной и важной проблемой современной медицинской науки.
Эффективность антиишемических препаратов до настоящего времени изучалась на модели ишемии переднего мозга способом перевязки обеих общих сонных артерий у крыс (Зарубина И.В. и др., 2010). Результаты фармакологической коррекции традиционно оценивались на основании подсчета числа выживших животных, их биохимического и функционального тестирования в течение 2 недель после операции. Однако информативность данной методики могла бы стать значительно большей благодаря установлению по-стишемических изменений клеточных элементов головного мозга.
Арсенал противогипоксических и противоишемических средств в настоящее время достаточно широк. В то же время современная фармакология требует открытия и изучения новых антигипоксантов и противоишемических средств, в том числе растительного происхождения. К их числу может быть отнесен и ропрен, содержащий полипренолы, полученные из нейтральной части хвои ели. И хотя ропрен зарегистрирован и позиционирован, прежде всего, как гепатопротектор, у него обнаружены выраженные психоактиви-рующие свойства, антидепрессантная активность, способность влиять на обмен дофамина в структурах мозга (Шабанов П.Д. и др., 2010; Лебедев В.А., 2014).
Центральные эффекты полипренолов изучены недостаточно. Более того, нет точных сведений об интимных механизмах действия полипренолов на центральную нервную систему (ЦНС) и высшие функции мозга. Не изучено влияние ропрена на энергетические процессы в клетках головного мозга, по-видимому, определяющих психоактивирующее действие препарата.
Степень разработанности темы исследования
Практически единичными являются морфологические исследования глобальной ишемии мозга; большей частью эти исследования связаны с зоной ишемического инфаркта и прилегающей области (zona penumbra), образовавшимися в результате фокальной циркуляторной гипоксии. В этих зонах процесс развития постгипоксических изменений строения различных клеток мозга исследован достаточно подробно (Васильев Ю.Г., Берестов Д.С., 2011). Однако в большинстве экспериментальных работ подобного рода отсутствует системное описание реактивных изменений всех основных клеточных элементов, находящихся как в фокусе ишемии, так и в зоне пенумбра.
Объектом для изучения различий в реактивности нервных и сосудистых компонентов головного мозга крыс, обусловленных спецификой эксперимента с моделированием ишемии головного мозга, могут быть крупноклеточные подотделы мезокортикальной дофаминергической системы (МДС): дофаминергические ядра среднего мозга и глубокие слои прегенуальной цин-гулярной коры (Дробленков А.В. и др., 2009; А.В. Дробленков, 2011). Они же, как правило, и являются структурными мишенями действия нейропро-текторных средств. В качестве последних интересны полипренолы, линейные природные полимеры, участвующие в транспорте сахаров через клеточные мембраны (в процессах гликирования). Полипренолы изучены мало, особенно их центральные эффекты. Это и определило цель и дизайн настоящего исследования.
Цель и задачи исследования
Цель исследования – фармакологическая коррекция постишемических повреждений лимбических структур головного мозга с помощью полипренолов по данным морфологического анализа.
Задачи исследования:
-
Изучить нейропротекторные и энергостабилизирующие эффекты по-липренолов при ишемии головного мозга у крыс.
-
Определить морфологические параметры нормы для клеточных элементов паранигрального ядра и глубоких слоев передней цингулярной коры.
-
Установить структурные, пространственные и количественные изменения клеточных элементов в глубоких слоях переднего цингулярного поля (область частичной ишемии переднего мозга) и в паранигральном ядре среднего мозга (область головного мозга с ненарушенным кровотоком) через 7 суток после острой ишемии головного мозга у крыс, оцениваемые как морфологические мишени для действия антиишемических средств.
-
Выявить морфологические эквиваленты церебропротекторного влияния полипренолов на клеточные элементы паранигрального ядра среднего мозга и переднего цингулярного поля конечного мозга, находящиеся в различных условиях циркуляторной гипоксии.
Научная новизна исследования
В модельных экспериментах на крысах показано, что окклюзия общих сонных артерий, приводящая к частичной ишемии переднего мозга, вызывает высокую смертность крыс (более 50% в течение первой недели), выраженные неврологические нарушения у выживших животных и сопровождается значимым энергодефицитом в полушариях переднего мозга и лактацидозом. При этом типичным проявлением ишемии полушарий переднего мозга является изменение содержания адениловых нуклеотидов в тканях мозга (снижение АТФ и креатинфосфата, повышение уровней АДФ, АМФ и лактата) и уменьшение энергетического заряда, характеризующего общий энергетический статус тканей. Хроническое введение полипренолов в дозе 12 мг/кг после окклюзии общих сонных артерий увеличивает их выживаемость в по-стишемическом периоде и снижает выраженность неврологических наруше-
ний, что связано с нормализацией энергетического обмена в головном мозге. Морфологическим эквивалентом нейропротекторного действия полипрено-лов является повышение концентрации жизнеспособных нейронов и астро-цитов вблизи кровеносных капилляров, а также рост числа сателлитных форм глии, происходящий как в фокусе частичной ишемии (передняя цингу-лярная кора) так и в области ненарушенного кровотока (передняя медиальная часть среднего мозга). При этом в фокусе ограниченного кровотока полипре-нолы в десятки раз увеличивают долю малоизмененных нейронов, способствуют гипертрофии тел астроцитов и сохранению периваскулярных глиаль-ных астроцитарных мембран, стимулируют пролиферацию эндотелиоцитов капилляров мозга. За пределами фокуса ишемии (паранигральное ядро) по-липренолы индуцируют выраженные защитно-приспособительные реакции в системе «капилляр-астроцит-нейрон», заключающиеся в подавлении набухания ядер эндотелиоцитов, гипертрофии астроцитов, миграции тел астроцитов и нейронов в направлении сосудистой стенки, стимулировании размножения астроцитов, нейроно-глиальных взаимоотношений, значительном сокращении доли различных форм поврежденных нейронов, развитии слабо выраженного сморщивания тел малоизмененных нейронов.
Основные положения, выносимые на защиту:
-
В эксперименте на крысах моделируется ишемия переднего мозга вследствие перевязки обеих сонных артерий. Она сопровождается высокой смертностью, типичными неврологическими нарушениями по типу инсульта, а биохимически – энергодефицитом и лактацидозом. Данная модель может быть использована как адекватная для оценки нейропротекторного действия фармакологических средств.
-
Морфологически можно выделить две зоны повреждений при ишемии: фокус частичной ишемии головного мозга, включающий переднюю цингулярную кору, и область ненарушенного кровотока область (передняя медиальная часть среднего мозга). Реакция клеточных элементов обеих зон на действие полипренолов различна.
-
В фокусе ограниченного кровотока полипренолы в десятки раз увеличивают долю малоизмененных нейронов, способствуют гипертрофии тел астроцитов и сохранению периваскулярных глиальных астроцитарных мембран, стимулируют пролиферацию эндотелиоцитов капилляров мозга.
-
За пределами фокуса ишемии (паранигральное ядро) полипренолы индуцируют выраженные защитно-приспособительные реакции в системе «капилляр-астроцит-нейрон», заключающиеся в подавлении набухания ядер эндотелиоцитов, гипертрофии астроцитов, миграции тел астроцитов и нейронов в направлении сосудистой стенки, стимулировании размножения астро-цитов, нейроно-глиальных взаимоотношений, значительном сокращении доли различных форм поврежденных нейронов, развитии слабо выраженного сморщивания тел малоизмененных нейронов.
-
Полипренолы оказывает системное нейропротекторное (защитное) действие на нейроны, астроциты, эндотелиоциты, расположенные как в об-
ласти частичной ишемии переднего мозга, так и в области не нарушенного кровотока, не изменяя постишемической активации микроглии в исследованных структурах мозга.
Теоретическая и практическая значимость исследования
Практическое значение работы состоит в доказательстве нейропротек-торного действия полипренолов при экспериментальной ишемии головного мозга, подтвержденное данными неврологического, биохимического и морфологического анализа. В терапевтических дозах (12 мг/кг, 7 дней) полипре-нолы оказывают дифференцированное действие на зоны относительной ишемии и неповрежденные зоны лимбических структур головного мозга. Наибольший нейропротекторный эффект полипренолов проявляется в зоне ограничения кровотока (передняя цингулярная кора), где они в десятки раз увеличивают долю малоизмененных нейронов, способствуют гипертрофии тел астроцитов и сохранению периваскулярных глиальных астроцитарных мембран, стимулируют пролиферацию эндотелиоцитов капилляров мозга. Это сопровождается нормализацией энергодефицита в головном мозге. За пределами выраженных ишемических повреждений (паранигральное ядро) полипренолы запускают четкие защитно-приспособительные реакции в системе «капилляр-астроцит-нейрон», заключающиеся в подавлении набухания ядер эндотелиоцитов, гипертрофии астроцитов, миграции тел астроцитов и нейронов в направлении сосудистой стенки, стимулировании размножения астроцитов, нейроно-глиальных взаимоотношений, значительном сокращении доли различных форм поврежденных нейронов, развитии слабо выраженного сморщивания тел малоизмененных нейронов. Следовательно, поли-пренолы оказывает системное нейропротекторное (защитное) действие на нейроны, астроциты и эндотелиоциты, расположенные как в области частичной ишемии переднего мозга, так и в области ненарушенного кровотока, существенно не меняя постишемической активации микроглии в исследованных структурах мозга. Полученные данные являются важным доказательством вовлечения разных структурных элементов головного мозга в осуществление системных нейропротекторных/нейрореставрационных реакций поли-пренолов.
Методология и методы исследования
Методология исследования состояла в изучении последствий перевязки обеих сонных артерий у грызунов (крыс) методами физиологического, биохимического и морфологического анализа. Фармакологическую коррекцию возникающих вследствие перевязки ишемических нарушений проводили с помощью полипренолов, улучшающих гликирование (перенос сахаров через мембраны клеток). Оценку нейропротекторного действия полипренолов осуществляли определением неврологического статуса животных (крыс), показателей энергетического обмена крови и мозга, а также детального гистологического анализа зон повреждения и областей, граничащих с ними. Исследования выполнены с соблюдением всех принципов доказательной биологии
и медицины и одобрены локальным комитетом по этике при Военно-медицинской академии им. С.М. Кирова МО РФ.
Степень достоверности и апробация материалов исследования Статистическая обработка результатов
Выборка для каждой группы животных составила не менее 10-12 крыс. Результаты обрабатывали статистически с использованием t-критерия Стью-дента, непараметрического критерия U Вилкоксона-Манна-Уитни, дисперсионного анализа по методу ANOVA на персональном компьютере.
Реализация результатов работы
Полученные результаты используются в учебном процессе кафедры фармакологии ФБГВОУ ВПО «Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова» МО РФ, кафедры гистологии ГБОУ ВПО «Санкт-Петербургский государственный медицинский педиатрический университет» МЗ РФ, кафедры специализированной терапии Института медицинского образования ФГБОУ ВПО «Новгородский государственный университет имени Ярослава Мудрого» Минобрнауки РФ. Работа выполнена в соответствии с плановыми научно-исследовательскими разработками Военно-медицинской академии им. С.М. Кирова МО РФ. Материал диссертации вошел в грантовые разработки Российского фонда фундаментальных исследований при РАН (РФФИ №13-04-00186).
Апробация и публикация материалов исследования
Результаты и основные положения диссертации доложены и обсуждены на Всероссийской научной конференции «Физиологические проблемы адаптации» (Ставрополь, 2013); Всероссийской молодежной конференции «Ней-робиология интегративных функций мозга» (Санкт-Петербург, 2013), Всероссийской научной конференции «Фармакологическая нейропротекция» (Санкт-Петербург, 2013).
Апробация работы прошла на совместном научном заседании кафедр фармакологии и гистологии Военно-медицинской академии им. С.М. Кирова МО РФ, кафедры гистологии Санкт-Петербургского государственного медицинского педиатрического университета МЗ РФ и отдела нейрофармакологии им. С.В. Аничкова ФГБУ «Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины» СЗО РАМН.
Публикации
По теме диссертации опубликовано 8 печатных работ, из них 3 статьи в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК, и 5 тезисов.
Личный вклад автора
Личный вклад автора осуществлялся на всех этапах работы и состоял в планировании экспериментов (95%), их непосредственном выполнении (95%), обработке полученных результатов (100%), обсуждении результатов, написании статей и тезисов (85%), написании диссертации и автореферата (95%).
Объем и структура диссертации
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, главы собственных исследований, обсуждения результатов, заключения, выводов, научно-практических рекомендаций и списка литературы. Диссертация изложена на 138 страницах и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, материал и методы исследования, результаты собственных исследований, обсуждение полученных результатов, выводы и список литературы, содержащий 150 источников (40 отечественных и 110 иностранных). Диссертация иллюстрирована 23 рисунками и 13 таблицами.
Стратегия терапии ишемического повреждения мозга и пер -спектива морфологической оценки эффективности его коррекции нейропротектором ропреном
Последствия острой фокальной церебральной ишемии, степень ее повреждающего действия определяются, прежде всего, тяжестью и длительностью снижения мозгового кровотока. В результате экспериментальных работ, проведенных в последние десятилетия, установлен алгоритм метаболических реакций ткани мозга на снижение мозгового кровотока [7].
При снижении уровня кровотока до 70-80 % (менее 50-55 мл на 100 г ткани мозга в 1 мин - первый критический уровень) возникает первая реакция в виде торможения белкового синтеза. С увеличением времени экспериментальной фокальной ишемии и степени нарушения кровотока отмечено снижение молекулярной массы синтезируемых белков [85]. Последними перестают синтезироваться полипептиды из фракции белков теплового шока, которые, как известно, придают частичную защиту от аноксии.
Дальнейшее снижение кровотока до 50 % от нормальной величины (до 35 мл/100 г в 1 мин - второй критический уровень) сопровождается активацией анаэробного гликолиза, увеличением концентрации лактата, развитием лактат-ацидоза и цитотоксического отека.
Нарастающая ишемия (снижение кровотока до 20 мл/100 г в 1 мин -третий критический уровень) приводит к снижению синтеза аденозин-трифосфата (АТФ), формированию энергетической недостаточности и как следствие к дисфункции каналов активного ионного транспорта, дестабилизации клеточных мембран и избыточному выбросу возбуждающих ВАК-ергических нейротрансмиттеров. Отмечены стадийность и взаимообусловленность снижения концентрации АТФ, белкового синтеза и скорости кровотока через 1, 6, и 12 ч после экспериментальной окклюзии средней мозговой артерии [101].
Когда мозговой кровоток достигает 20 % от нормальной величины (10-15 мл/100 г в 1 мин), нейроны начинают терять ионные градиенты и развивается аноксическая деполяризация мембран [80]. Автором установлено, что недостаток кислорода инициирует сначала обратимую потерю функции, обусловленную увеличением К+-проводимости мембраны, что приводит к уменьшению сопротивления мембраны и гиперполяризации. Через несколько минут аноксии происходит неселективное увеличение проницаемости мембран, приводящее к накоплению Са2+ внутри клеток, необратимому повреждению и гибели нейронов.
Более поздние исследования позволили сформулировать концепцию порогов жизнеспособности клеток при гипоксии мозга [82], которая до настоящего времени используется для наиболее исчерпывающего объяснения необратимого повреждения нейронов и других клеток. Согласно этой концепции сначала (при пороге 55 мл/100 г в 1 мин) ингибируется синтез белка, затем (при 35 мл/100 г в 1 мин), в клетках устанавливается анаэробный гликолиз, далее высвобождаются медиаторы и развиваются нарушения энергетического метаболизма (при скорости кровотока, равном 20 мл/100 г в 1 мин), и, наконец, бескислородная деполяризация ( 15 мл/100 г в 1 мин).
Уменьшение объема мозгового кровотока влечет за собой значительное ограничение поступления в ткань мозга кислорода и глюкозы. Установлено, что метаболизм кислорода и глюкозы в наибольшей мере страдает в центральной зоне ишемизированной территории и в меньшей - в демаркационной зоне [124]. Область мозга с наиболее выраженным снижением кровотока (менее 10 мл/100 г в 1 мин) становится необратимо поврежденной очень быстро, в течение 6-8 мин с момента развития острого нарушения мозгового кровотока. В ней образуется «сердцевина», или «ядерная» зона, ишемии [70]. В течение нескольких часов центральный «точечный» инфаркт окружен ишемизированной, но живой тканью (с уровнем кровотока выше 20 мл/100 г в 1 мин) - так называемой зоной «ишемической полутени», или пенумбры (penumbra). В области пенумбры в целом сохранен энергетический метаболизм и присутствуют лишь функциональные, но не структурные изменения. Это область «критической», или «нищей», перфузии, где нейрональная функция снижена потому, что не обеспечиваются метаболические запросы ткани, но клетки остаются жизнеспособными с сохранным ионным гомеостазисом снаружи и внутри клеточной мембраны [142].
Вследствие того, что резерв локальной перфузии исчерпан, нейроны в области пенумбры становятся чувствительны к любому дальнейшему падению перфузионного давления, вызванному, например, вторичной гиповолемией (после дегидратации), неадекватной гипотензивной терапией, ортостатическим падением артериального давления в ответ на быстрое вставание больного. За счет зоны пенумбры происходит постепенное увеличение размеров инфаркта. Зона «ишемической полутени» может быть спасена восстановлением адекватной перфузии ткани мозга и применением нейропротективных средств. Поэтому именно пенумбра является главной мишенью терапии в первые часы и дни после развития инсульта.
Если артериальная окклюзия носит временный характер или компенсаторно включается коллатеральная сеть, то в ишемизированном участке мозговой кровоток полностью или частично восстанавливается [136]. Однако восстановление мозгового кровотока позже, чем через 2 мин после устранения окклюзии, на фоне уже запущенных ишемических процессов, не означает его нормализации. Развиваются поэтапные нарушения перфузии мозга: начальная стадия постишемическои гиперемии сменяется стадией постишемическои гипоперфузии.
Возникновение постишемическои гиперемии [134], или «роскошной перфузии», связано не только с обильным поступлением крови через коллатерали или реканализацией закупоренной артерии, но и с высвобождением из ишеми-зированной части мозга вазоактивных и провоспалительных метаболитов, снижением вязкости крови [83; 135], изменением нейрогенных вазодилататорных механизмов [95]. Наблюдающийся при этом избыток кровотока не соответствует метаболическим потребностям ткани мозга, что проявляется уменьшением фракции экстрагированного кислорода.
Вслед за стадией гиперемии происходит снижение мозгового кровотока ниже ишемического уровня (постишемическая гипоперфузия), что также является результатом отсроченных метаболических изменений в ишемизирован-ной ткани, вызванных активацией микроглии. Активированные микроглиоциты синтезируют провоспалительные факторы, увеличивающие проницаемость сосудистой стенки, что вызывает отек периваскулярного нейропиля, астроглии и обструкцию просвета сосудов [79; 83; 84; 135]. Таким образом, восстановление артериального кровотока сопровождается неполной реперфу-зией ранее ишемизированной ткани. Данный феномен получил название «невосстановленный кровоток» (no-reflow).
Фармакологические средства для анализа неврологических и биохимических последствий ишемии головного мозга у крыс
Опыты выполнены на 178 крысах самцах Вистар массой 200-220 г, выращенных в группе по 5 особей в стандартных пластмассовых клетках в условиях вивария. Животных содержали при свободном доступе к воде и пище. Эксперименты проводили с соблюдением принципов гуманного отношения к лабораторным животным в соответствии с «Руководящими методическими материалами по экспериментальному и клиническому изучению новых лекарственных средств» (1984), «Международными рекомендациями по проведению медико-биологических исследований с использованием животных (1985) и «Правилами лабораторной практики в Российской Федерации (приказ МЗ РФ от 2003 г. № 267).
Выживаемость, неврологический статус и биохимические изменения в фокусе частичной ишемии исследовались у 3 групп крыс - ложнооперирован-ных (20 особей), после частичной ишемии (18 особей) и после ишемии на фоне терапии полипренолами 12 мг/кг/сут (24 особи).
Клеточные элементы переднего цингулярного поля (область ограниченного кровотока) и паранигрального ядра среднего мозга (область не нарушенного кровотока) были исследованы у четырех групп крыс через 3 мин после декапитации. Первая группа (4 интактные крысы) представляла собой основной контроль (контроль 1). У крыс первой экспериментальной группы (4 особи) воспроизводили ограничение кровотока в переднем мозге. У животных второй экспериментальной группы (4 особи) после воспроизведения острой ишемии мозга ежедневно внутрибрюшинно вводили полипренолы в дозе 12 мг/кг/сут и объеме до 1,2 мл/крысу.
Контролем для крыс экспериментальных групп служили ложноопери-рованные животные, у которых воспроизводили все этапы операции без перевязки сонных артерий (4 особи, контроль 2). Экспериментальных и ложно-оперированных животных умерщвляли через 7 суток опыта.
Неврологический статус у крыс после окклюзии общих сонных артерий оценивали по шкале Stroke-index McGraw [138]. Тяжесть состояния определяли по сумме соответствующих баллов [18].
По окончании экспериментов на 7-е сутки крыс умерщвляли, погружая в жидкий азот. Охлажденным инструментом извлекали большие полушария головного мозга, после чего ткань головного мозга гомогенизировали в жидком азоте и определяли в ней биохимические показатели, характеризующие энергетический обмен - содержание лактата и пирувата, креатинфосфата, АТФ, АДФ и АМФ [20; 47; 96]. Общее количество выполненных биохимических анализов - 400.
Содержание молочной и пировиноградной кислот определяли в 10% гомогенате ткани мозга, приготовленном на 6N хлорной кислоте, энзиматическим методом по Е. Marbach и М. Weil (1967) в модификации И.В. Зарубиной и соавторов [18].
Свободные адениннуклеотиды определяли с помощью восходящей тонкослойной хроматографии на пластинах «силуфол» и последующим сканированием на спектрофлуориметре MPF-4 «Hitachi», Япония [18]. Свободные адениловые нуклеотиды экстрагировали из 10% гомогенатов замороженной в жидком азоте ткани головного мозга и приготовленных на 6N хлорной кислоте. Стандарты нуклеотидов (АТФ, АДФ и АМФ) фирмы Sigma (США) и исследуемые пробы наносили на пластины «силуфол» в виде пятен на расстоний 15 мм от нижнего края в конечном объеме 10 мкл. Разделение нуклеотидов проводили в хроматографической камере, насыщенной парами растворителей диоксан-изопропанол-аммиак-вода в соотношении 4:2:1:4. После развития хроматограммы локализацию пятен нуклеотидов осуществляли УФ-облучением. Прямое фотометрирование в отраженном свете проводили на сканирующем устройстве флуориметра при длине волны 260 нм. Апертуру сканирующего устройства настраивали с учетом диаметра пятен определяемых веществ. Скорость сканирования составляла 30 мм/мин, направление сканирования - вдоль оси хроматограммы. Расчет содержания нуклеотидов проводили с учетом калибровочных кривых зависимости площадей пиков пятен от конц ентрации хроматографически чистых стандартов.
Показатели всех компонентов адениловой системы позволяют судить о направленности обменных процессов в ткани. Информативным является соотношение их молярных концентраций. Такой интегративной величиной, объединяющей три компонента адениловой системы в единую формулу, служит энергетический заряд [42].
Характеристика клеточных элементов переднего медиального подотдела паранигрального ядра
Расстояние между телами астроцитов и стенкой капилляров, установленное как при окраске по Нисслю, так и в срезах, окрашенных на GFAP, по сравнению с контрольной группой было сокращено в 3-4 раза (р 0,05). Различия в этом расстоянии между двумя экспериментальными группами были незначительными.
Реакция олигодендроглии в глубоких слоях передней цингулярной коры через 7 суток переднемозговой ишемии и терапии полипренолами выразилась в увеличении сателлитной формы данных клеток (см. рис. 18). Большинство жизнеспособных нейронов (в основном малоизмененных) было окружено олигодендроцитами и астроцитами. Строение олигодендроглиоцитов в результате данного эксперимента, ишемии без медикаментозной коррекции и в норме не различалось.
Глиоцито-нейрональный индекс в глубокой части передней цингулярной коры, по сравнению с индексом при ишемии без медикаментозной коррекции не различался, но он был значительно выше, чем в группах контроля (табл. 13).
Изменения количества и морфометрических параметров олигодендроцитов, микроглиоцитов исследованных формаций головного мозга через 7 сут. экспериментальной ишемии при коррекции полипренолами на площади 0,01 мм2 (X+S-) Исследованные формации мозга Группа животных Олигодендроциты Микроглиоциты Эндотелиоциты количество глиоцито-нейрональный индекс количество площадь тел, мкм2 Количество Площадь ядер, мкм2
Микроглиоциты в глцбокой цингулярной коре при терапии переднемозговой ишемии ропреном приобрели фенотип активированных амебоидных клеток, как и после данного способа ишемии без введения препарата. Эти клетки визуально были крупнее, чем в группах контроля, обладали округлой, овальной и вытянутой формой и часто располагались на удалении от стенки кровеносных капилляров. Некоторые их микроглиоцитов
106 располагались вблизи теневидных нейронов. Количество микроглиоцитов в данном эксперименте и в опыте без фармакологической терапии значительно не отличалось от их числа в контроле (см. табл. 13). Площадь тел этих клеток при ишемии переднего мозга как в сочетании с воздействием полипренолов, так и без влияния препарата оказалась в 1,1-1,5 раз больше, чем в контроле (р 0,05).
Кровеносные капилляры глубоких слоев передней цингулярной коры после медикаментозной коррекции ишемии имели вид удлиненных полых трубчатых структур с расширенным просветом. Многие из них располагались параллельно друг другу на некотором расстоянии друг от друга. Вблизи стенки этих микрососудов концентрировались нейроны и астроциты.
Эндотелиоциты были более многочисленными и обладали более крупными и светлыми ядрами, чем в контроле. По внешнему виду эти клетки были похожи на эндотелиоциты переднего цингулярного поля после не коррегируемой гипоксии. Количество эндотелиоцитов в передней цингулярной коре после ишемии и терапии полипренолами было больше, чем после ишемии без коррекции в 1,6 раз (р 0,05) и в 2,7 раз больше, чем у ложнооперированных крыс (р 0,05). Площадь ядер эндотелиоцитов после медикаментозной коррекции ишемии была в 2,3 раза больше, чем в контроле (р 0,05) и значительно не различалась от этого параметра при ишемии переднего мозга без коррекции препаратом.
Фармакологическая коррекция полипренолами постишемических изменений клеточных элементов передней медиальной части паранигрального ядра (область ненарушенного кровотока) Через 7 суток после лигирования обеих сонных артерий и ежедневного внутрибрюшинного введения полипренолами в исследуемых ядрах среднего мозга были установлены следующие реактивные изменения клеточных элементов. Среди нейроцитов паранигрального ядра преобладали клетки, имевшие правильную звездчатую, овальную или округлую форму тел со слегка выпуклым рельефом поверхности (рис. 19). v Чь.
Изменения клеточных элементов переднего медиального подотдела паранигрального ядра вентральной области покрышки среднего мозга крыс через 7 сут экспериментальной ишемии на фоне терапии полипренолами Окраска методом Ниссля. Ок. х10, об. хбЗ. Обозначения: дистрофически измененные нейроны: Д - гипохромные, П - пикноморфные гиперхромные; Т -теневидные нейроны; олигодендропиты - черные стрелки, астропиты - красные стрелки, микроглиопиты - звездочки; Э - эндотелиопиты. Квадратной рамкой (пунктир) ограничена площадь исследования, равная 0,01 мм2. Центр окружности (пунктир) радиусом 20 мкм совмещен со стенкой кровеносного капилляра, ближайшей к телу нейрона. Малоизмененные нейроны не обозначены.
Они содержали овальное светлое ядро, отчетливое крупное ядрышко, расположенное, чаще всего, эксцентрично и компактное скопление мелкодисперсных глыбок хроматофильной субстанции. Последняя заполняла значительную часть цитоплазмы нейронов, у части клеток она определялась в основании отростков, иногда оставляла свободным ободок перикариона вблизи ядра или наружной поверхности. Данные нейроны по строению соответствовали неизмененным или малоизмененным, однако, многие из них были визуально мельче неизмененных клеток среднего мозга у интактных
108 животных. Малоизмененные нейроны составили 61,0±5,1% от общего числа нейронов паранигрального ядра, их доля существенно не отличалась от контроля и была в 21,8 раза больше, чем после гипоксии без медикаментозной коррекции (см. табл. 11). Площадь малоизмененных клеток, в сравнении с контролем, уменьшилась в 1,2 раза (р 0,05).
Тела малочисленных гипохромных нейронов имели просветленную цитоплазму и ядро, глыбки хроматофильной субстанции были распылены или, чаще, отсутствовали. Контуры ядерной и клеточной поверхности гипохромных клеток выглядели менее четкими, чем у малоизмененных клеток, и слегка размытыми. Рельеф некоторых гипохромных клеток на небольших участках поверхности ядра и цитоплазмы был стерт. Многие гипохромные клетки выглядели сморщенными, контуры некоторых других гипохромных клеток были ровными или несколько выпуклыми. Площадь гипохромных нейронов значительно не отличалась от контроля, но оказалась в 2,4 раза меньше, чем после гипоксии без медикаментозной коррекции. Доля нейронов этой субпопуляции (9,4±2,8%) также не различалась с контролем, но была значительно меньше, чем после гипоксии, проводимой без терапии полипренолами (в 5,3 раза).
Среди нейронов паранигрального ядра отмечались также единичные гиперхромные сморщенные и немногочисленные теневидные клеточные формы, в том числе имевшие вид фрагментов (апоптозные тельца), строение которых в контроле и экспериментальных группах не различалось. Доля гиперхромных сморщенных нейронов составила всего 4,9±2,3%; она значимо не различалась с долей этих клеток в контроле и у крыс после гипоксии без коррекции полипренолами. Доля теневидных клеток в ядрах среднего мозга у крыс после гипоксии и получения препарата была ниже удельного числа «клеток-теней» у животных после гипоксии без медикаментозной терапии в 1,6-5,7 раза (р 0,05).
Распределение нейронов паранигрального ядра после переднемозговой ишемии на фоне коррекции полипренолами было менее равномерным, чем в
109 обеих контрольных группах, но значительно более равномерным, чем после гипоксии без медикаментозной коррекции. Отдельные малоизмененные и гипохромные нейроны были объединены в небольшие группы, или располагались вблизи стенки кровеносных капилляров. Расстояние между телами этих жизнеспособных нейронов и стенкой капилляров по сравнению с данным расстоянием в контроле значимо не различалось (р 0,05).
Тела астроцитов паранигрального ядра через 7 суток переднемозговой ишемии и терапии полипренолами выглядели более крупными, чем в контроле и часто располагались попарно (см. рис. 19 и 20а). Ядра клеток тесно прилежали друг к другу в паре, часто обладали ровным рельефом сближенных поверхностей, благодаря чему выглядели зеркально отраженными. Ядрышки большинства клеток были крупными, отчетливо окрашенными и располагались слегка эксцентрично или в центре ядер. Ядерный хроматин, отчетливо различимый в ядрах наиболее крупных сечениях клеток, был, преимущественно в деспирализованной форме.
Отростки астроцитов и сплошные периваскулярные астроцитарные мембраны выглядели разволокненными. GFAP+ материал клеток был сконцентрирован в области основания осевых отростков и в одном из участков цитоплазмы. У многих астроцитов, объединенных в пары, GFAP концентрировался в соседних участках цитоплазмы и имел вид общей утолщенной сети.
Астроциты паранигрального ядра после медикаментозной коррекции ишемии были значительно увеличены в количестве (по сравнению с обеими контрольными группами и с их количеством после гипоксии без данной коррекции; см. табл. 11). Астроциты, редко располагавшиеся в составе компактной части черного вещества и в норме, при данных условиях опыта значительно увеличены в числе не были.
Морфологические корреляты фармакологической коррекции ишемических нарушений
Приступая к обсуждению полученных результатов, следует отметить, что основные направления центрального действия полипренолов и, тем более, интимные механизмы этого действия до настоящего времени не выяснены. Предыдущими исследованиями [36; 37] показано, что полипренолы (ропрен) обладают умеренными психоактивирующими свойствами, антидепрессантной активностью, способностью изменять подкрепляющие свойства головного мозга. Указанные особенности действия ропрена на головной мозг связаны, по-видимому, с изменением обмена моноаминов, в частности дофамина, в головном мозге. Так, ропрен в дозах 2,15-4,3-11,6 мг/кг/сут активировал мезолим-бическую дофаминергическую систему, главным образом, в прилежащем ядре (ответственно за подкрепление), и угнетал обмен дофамина в нигростриатной дофаминергической системе (ответственна за двигательную активность) [37].
Следовательно, в действии препарата можно выделить, по крайней мере, два направления: первое связано с эффектами на эмоциональную сферу (депрессивность, подкрепление), второе - с двигательными эффектами препарата (в основном, нормализация разных видов двигательной активности, сниженной вследствие токсических воздействий на мозг). Традиционно эти виды фармакологической активности связывают с влиянием на медиаторные системы мозга. В действительности, это не совсем так. Ведущим звеном обеспечения как двигательных компонентов поведения, так и эмоциональных форм выражения является энергетический метаболизм, прежде всего, тканей головного мозга. Если нет достаточного (оптимального) уровня гликоли-тических реакций или альтернативных форм образования энергии в важнейших органах (головной мозг, миокард, печень, почки, легкие), ни один вид поведенческой активности не будет выражен в оптимальном варианте (кроме реакций агрессии и бегства, направленных на спасение при угрозе жизни особи) [19]. Все это создало предпосылки для настоящего исследования, направленного на выяснение действия полипренолов в дозе 12 мг/кг/сут как потенциальных нейропротекторов и энергостабилизаторов.
В модельных опытах на крысах, у которых воспроизводили ишемию головного мозга перевязкой обеих сонных артерий, показано, что полипренолы (ропрен) в исследованной дозе (12 мг/кг/сут) улучшают неврологический статус животных, повышают их выживаемость и уменьшают нейрохимические последствия ишемии в тканях головного мозга.
Важно отметить, что ишемия головного мозга и, как следствие, его гипоксия приводят к значительному истощению его энергетических запасов, и без того скудных. Резко снижается содержание макроэргов (АТФ, креатин-фосфата), возрастает количество недоокисленных продуктов (АДФ, АМФ, лактат), снижается энергетический заряд системы, развивается лактацидоз. Последний обусловлен 5-кратным повышением уровня молочной кислоты в мозге. На этом фоне полипренолы в дозе 12 мг/кг на 62% (то есть почти на две трети) снижали лактацидоз. В этой же дозе полипренолы на 73% повышали содержание креатинфосфата и на 173% содержание АТФ в тканях головного мозга. На уровень АДФ полипренолы действовали приблизительно одинаково, на 40-43% снижая его. При этом полипренолы восстанавливали до нормы энергетический заряд, характеризующий общее состояние энергетического обмена в мозге.
Следует подчеркнуть, что получены достаточно убедительные данные центрального действия полипренолы, в целом они положительные, но эти результаты не суммированы в направлении «полипренолы как ноотропные средства». По определению, ноотропы представляют собой средства, улучшающие высшие функции мозга (внимание, память, мышление) и повышающие устойчивость организма и специально центральной нервной системы к по 115 вреждающему действию агрессивных факторов внешней среды, будь то инфекция, интоксикация, травма мозга, шок или иное повреждение.
Имеются все необходимые экспериментальные и клинические доказательства ноотропного действия полипренолов и наиболее известного из них - ропрена. Однако он позиционирован как гепатопротектор, и это мешает восприятию препарата как центрально действующего, с нооотропной и нейро-протекторной направленностью. Хотя мы забываем, что тот же классический ноотроп пирацетам прекрасно действует как гастро- и гепатопротектор при соответствующих заболеваниях (язвенная болезнь, хронические гепатиты), хотя никто специально это, как правило, не подчеркивает. По-видимому, следует предпринять ряд усилий, чтобы доисследовать ропрен (или его аналоги) в направлении специального изучения нейропротекторного действия. Часть этих исследований уже начата при хронической алкогольной зависимости, болезни Альцгеймера и другой патологии ЦНС [35]. Все же требуются дальнейшие систематические экспериментальные и клинические исследования обсуждаемых свойств (нейропротекторных, ноотропных, антидепрессантных) у ропрена.
Несмотря на то, что в настоящем исследовании была использована модель фокальной гипоксии переднего мозга, выключающая его основные функции (75), полученные нами данные свидетельствуют о значительном спектре нарушений клеточных элементов не только в фокусе ограниченного кровотока (передняя цингулярная кора переднего мозга), но и в параниграль-ном ядре среднего мозга, получающем кровь из действующего капиллярного русла срединных среднемозговых артерий. Изменения нейронов в виде острого набухания, лизиса и образование «клеток-теней» в паранигральном ядре через 116 суток опыта не могут не быть отсроченным проявлением глютамат-кальциевого каскада как результата взаимодействия системы «нейрон-астроцит-капилляр-нейрон». В ходе гуморального варианта этой реакции, распространяясь вширь от зоны пенумбры (рис. 21), у нейронов происходит активация кальмодулин-зависимых клеточных ферментов, оксидантный стресс, избыточная выработка токсичного оксида азота и накопление низкомолекулярных цитотоксичных соединений [7]. Нейроны в передней цингулярной коре, переживающие, кроме реакций глутамат-кальциевого каскада, состояние выраженной гипоксии отмирают, реже сморщиваются, по-видимому, вследствие конденсации органелл либо набухают.