Содержание к диссертации
Введение
2. Обзор литературы
2.1. Сахарный диабет: распространенность и классификация 11
2.2. Окислительный стресс в патогенезе диабета 13
2.3. Генотоксические эффекты окислительного стресса 19
2.3.1. Поврежденность ДНК при диабете 22
2.4. Тератогенный потенциал генотоксикантов 23
2.5. Диабет и беременность
2.5.1. Гестационный диабет 26
2.5.2. Здоровье и развитие потомства у матерей, страдающих диабетом 2.6. Связь между поврежденностью ДНК и пре- и постнатальными нарушениями 29
2.7. Антигенотоксиканты
2.7.1. Афобазол 32
2.7.2. Бетаин
2.8. Коррекция пре- и постнатальных нарушений у потомства 34
2.9. Экспериментальные модели диабета 35
2.10. Оценка пре- и постнатального развития потомства в эксперименте 37
3. Материалы и методы исследования 40
3.1. Экспериментальные животные 40
3.2. Модель стрептозотоцинового диабета и препараты 40
3.3. Экспериментальные группы и схемы введения
3.3.1. Экспериментальные группы при эмбриотоксических, биохимических и генотоксических исследованиях 42
3.3.2. Экспериментальные группы при исследовании поведения у потомства 43
3.4. Оценка генотоксических эффектов стрептозотоцинового диабета в эмбриональных и плацентарных тканях крыс (Метод «ДНК-комет») 44
3.5. Исследование репродуктивной токсичности на модели стрептозотоцинового диабета 45 3.5.1. Оценка эмбриотоксического действия 45
3.6. Биохимические исследования 47
3.7. Наблюдение за постнатальным развитием потомства
3.7.1. Формирование сенсорно-двигательных рефлексов 48
3.7.2. Тест «Горизонтальная веревочка» 49
3.7.3. Тест «Открытое поле» 49
3.7.4. Тест «Приподнятый крестообразный лабиринт»
3.7.5. Тест «Ж-образный лабиринт» 51
3.7.6. Тест «Экстраполяционное избавление» 52
3.8. Статистическая обработка результатов исследования 53
4. Результаты исследования 53
4.1. Разработка модели стрептозотоцинового диабета у беременных крыс 54
4.2. Содержание глюкозы в крови и моче беременных крыс со стрептозотоциновым диабетом, влияние афобазола и бетаина 57
4.3. Генотоксические эффекты стрептозотоцинового диабета на 14 день развития в эмбриональной и плацентарной тканях крыс, влияние афобазола и бетаина
4.3.1. В плацентарной ткани 59
4.3.2. В эмбриональной ткани 60
4.4. Генотоксические эффекты стрептозотоцинового диабета на 20 день развития в
плацентарной и эмбриональной тканях крыс, влияние афобазола и бетаина 62
4.4.1. В плацентарной ткани 62
4.4.2. В эмбриональной ткани
4.4.2.1. Мозг эмбриона 63
4.4.2.2. Кровь эмбриона 64
4.5. Оценка эмбриотоксичности у крыс со стрептозотоциновым диабетом, влияние
афобазола и бетаина 66
4.5.1. Оценка костной системы плодов крыс со стрептозотоциновым диабетом, влияние афобазола и бетаина 69
4.5.2. Оценка внутренних органов плодов крыс со стрептозотоциновым диабетом, влияние афобазола и бетаина 73
4.5.3. Динамика массы потомства крыс со стрептозотоциновым диабетом, влияние афобазола и бетаина 74
4.6. Формирование сенсорно-двигательных рефлексов у потомства крыс со стрептозотоциновым диабетом, влияние афобазола и бетаина 77
4.6.1. Оценка показателей потомства крыс со стрептозотоциновым диабетом в тесте «Горизонтальная веревочка», влияние афобазола и бетаина 79
4.7. Поведение потомства крыс со стрептозотоциновым диабетом в тесте «Открытое поле», влияние афобазола и бетаина 80
4.8. Поведение потомства крыс со стрептозотоциновым диабетом в тесте «Экстраполяционное избавление», влияние афобазола и бетаина 84
4.9. Поведение потомства крыс со стрептозотоциновым диабетом в тесте «Приподнятый крестообразный лабиринт», влияние афобазола и бетаина 85
4.10. Когнитивное поведение потомства крыс со стрептозотоциновым диабетом, влияние афобазола и бетаина 90
4.11. Уровень глюкозы в крови 90-дневного потомства крыс со стрептозотоциновым диабетом, влияние афобазола и бетаина 96
5. Обсуждение результатов 98
6. Выводы 111
7. Практические рекомендации 112
8. Список сокращений 113
9. Список литературы 114
- Тератогенный потенциал генотоксикантов
- Экспериментальные группы и схемы введения
- Содержание глюкозы в крови и моче беременных крыс со стрептозотоциновым диабетом, влияние афобазола и бетаина
- Оценка показателей потомства крыс со стрептозотоциновым диабетом в тесте «Горизонтальная веревочка», влияние афобазола и бетаина
Введение к работе
Актуальность проблемы. Диабет – социально значимое, мультифакторное заболевание с генетической предрасположенностью, характеризующееся широкой распространенностью. По данным Международной федерации диабета(IDF) на 2013 год, в мире 382 миллиона людей страдают сахарным диабетом (СД) (). В РФ по данным Государственного регистра сахарного диабета (ГРСД) на 31.12.2012 г. общее число зарегистрированных по обращаемости больных, включая детей и подростков с СД 1 и 2 типа, составило 3 779 423 человек.
При условии должной диетической и медикаметозной предгравидарной подготовки, диабет не является противопоказанием для беременности, однако число невынашиваний беременности при этом заболевании достигает 29 %.Характерным осложнением является многоводие, которое связано с увеличением концентраций глюкозы в околоплодных водах и наблюдается в 20-30% случаев. Симптомокомплекс «диабетическая фетопатия» новорожденных от матерей с СД1 выявляется у 75%, а при гес-тационном сахарном диабете (ГСД) – у 25 % обследованных. Частота детей с врожденными пороками составляет 6-8%, что в 2-3 раза выше по сравнению с женщинами без диабета, около 2% новорожденных имеют тяжлые пороки, несовместимые с жизнью (Неонатология: национальное руководство. Под ред. Н.Н. Володина. Из-во: ГЭОТАР-Медиа. 2009. 848 c.). Имеются отдельные указания на негативное влияние диабета беременных на постнатальное развитие потомства (SimeoniU., BarkerDJ. Se-minarsinfetalandneonatalmedicine. 2009. 14(2). P. 119-124; Metzger B.E. Clinical obstetrics and gynecology. 2007. 50(4). P. 972-979; Hami J., Shojae F., Vafaee-Nezhad S., et al. Worldjournalofdiabetes. 2015. 6(3). P. 412-422).
Беременность часто сопровождается развитием гестационного диабета, считалось, что он возникает в 1-3% случаев. Сегодня его частота оценивается не менее чем в 20 %, а к 2030 году прогнозируется рост этой патологии до 4 % (Болотская Л.Л., Еса-ян Р.М., Олейник О.В. Сахарный диабет. 2011. № 2. С. 131-132). Очевидно, что спорадический характер возникновения ГСД ограничивает возможность его профилактики и сопряженных нарушений развития ребенка с помощью традиционных приемов-предгравидарной подготовки, что требует разработки новых подходов.
Степень разработанности проблемы.Диабет – заболевание, ведущую роль в патогенезе которого играют нарушения свободно-радикального окисления (Балаболкин М.И., Клебанова Е.М., Креминская В.М. Лечение сахарного диабета и его сосудистых
осложнений. Руководство для врачей. М: Медицина. 2005. 512 с.). Окислительный стресс неизбежно сопровождается повреждениями ДНК соматических клеток. (Сере-денин С.Б., Дурнев А.Д. Фармакологическая защита генома. М.: ВИНИТИ. 1992. 161 с.). Известны наблюдения, показывающие увеличение поврежденности ДНК в клетках пациентов, страдающих диабетом, а также отмечены корреляционные связи между гипергликемией и уровнями повреждений ДНК (SongF., JiaW., YaoY., etal. Clinical Science. 2007. 112. P. 599–606; Arifa M., Islama M.R., Waisea T.M.Z., et al. Diabetes and Metabolism. 2010. 36. P. 51–57).
УбольныхСД1 иСД2выявляетсядефициткогнитивныхфункций, такихкакпамятьив-нимание (Sims-RobinsonC., KimB., FeldmanE.L. Diabetesandcognitivedysfunction. In:Neurobiology of Brain Disorders: Biological Basis of Neurological and PsychiatricDi-sorders. Zigmond M.J., Rowland L.P., Coyle J.T. Elsevier Inc. 2015. P. 189-201), ав экспериментах на мышах показана сопряженность поврежденийДНК в клетках головного-мозга и нарушений поведения (Kaefer V., Semedo J.G., Silva Kahl V.F., etal. Journal of applied toxicology. 2010. 30(8). P. 745-753).
Наконец, в нашем коллективе усилиями О.В. Шредер (2009), А.С. Соломиной (2011) и Е.Д. Шредер (2014),установлена взаимосвязь между повреждениями ДНК в эмбриональных и плацентарных клетках и нарушениями пре- и постнатального развития потомства крыс, выражающихся, в том числе, в поведенческих нарушениях. Те же авторы, на моделях табакокурения, циклофосфамидного тератогенеза и алкогольной интоксикации, показали возможность фармакологической коррекции постнаталь-ных поведенческих нарушений, связанных с эффектами повреждения ДНК в эмбриональных клетках, с помощью афобазола, который, помимо основной анксиоли-тической активности, обладает антимутагенными и цитопротекторными свойствами (Дурнев А.Д., Жанатаев А.К., Шредер О.В., Середенин С.Б. Экспериментальная и клиническая фармакология. 2009. Т. 72. 1. С. 46-51).
Вышеперечисленные факты позволили предположить, что антимутагены могут явиться фармакологическими корректорами различного рода нарушений пре- и пост-натального развития в условиях экспериментального сахарного диабета.
При выборе антимутагенных препаратов, помимо афобазола, внимание привлек растительный метаболит, криопротектор растительных клеток бетаин, который в сходном с афобазолом диапазоне доз, продемонстрировал выраженную антимутагенную активность invivo (Кобелев К.В., Орещенко А.В., Дурнев А.Д., Жанатаев А.К.
Способ антимутагенного воздействия на организм. Патент на изобретение РФ 2261704).
В качестве потенциально пригодной базовой экспериментальной модели была избрана индукция диабета у крыс с помощью стрептозотоцина, котораяопытным пу-тембыла адаптирована для оценки корригирующего влияния фармакологических препаратов на пре- и постнатальноеразвитие потомства в условиях гипергликемии во время беременности.
Таким образом,известны экспериментальные исследования, доказывающие возможность фармакологической коррекции афобазолом пре- и постнатальных нарушений в потомстве крыс, подвергнутых действию различных повреждающих факторов. Однако отсутствуют какие-либо экспериментальные свидетельства о возможности фармакологической коррекции генотоксических эффектов и связанных нарушений пре- и постнатального развития потомства у животных с индуцированным сахарным диабетом. Подобного рода исследования являются необходимым этапом доклинических исследований при разработке фармакологических средств защиты здоровья детей у матерей, страдающих СД.
Цель исследования. Оценка влияния афобазола и бетаина на генотоксические повреждения в плацентарных и эмбриональных клетках и нарушения пре- и постна-тального развития у потомства крыс со стрептозотоциновым диабетом.
Основные задачи исследования. Для достижения цели были поставлены следующие задачи:
-
Подобрать условия экспериментального стрептозотоцинового диабета у беременных крыс, позволяющие регистрировать анализируемые пре- и постнатальные нарушения на уровнях, достаточных для оценки влияния на них фармакологических корректоров.
-
Оценить влияние афобазола в дозах 1, 10 и 50 мг/кг и бетаина в дозах 10, 50 и 100 мг/кг на уровень глюкозы в крови и моче крыс с экспериментальным диабетом и у их потомства.
-
Охарактеризовать поврежденность ДНК в плацентарной и эмбриональной тканях эмбрионов, развивающихся у крыс с экспериментальным диабетом, и оценить влияние афобазола в дозах 1, 10 и 50 мг/кг и бетаина в дозах 10, 50 и 100 мг/кг на ге-нотоксические эффекты с помощью щелочной версии метода «ДНК-комет».
-
С использованием комплекса классических методов оценки репродуктивной токсичности и поведенческих тестов оценить пре- и постнатальные отклонения упо-5
томства крыс с экспериментальным диабетом, получавшихв период беременности пе-рорально, ежедневно афобазол в дозах 1, 10 и 50 мг/кг или бетаин в дозах 10, 50 и 100 мг/кг.
5. Оценить корреляцию между содержанием глюкозы в крови и моче с геноток-
сическими эффектами в плацентарной и эмбриональной тканях крыс с экспериментальным диабетом при разных сроках наблюдения, корреляцию между поврежденно-стью ДНК в плацентарной и эмбриональной тканях с нарушениями развития и когнитивными нарушениями у потомства крыс с экспериментальным диабетом, получавших афобазол или бетаин.
Научная новизна. Предложена модификация экспериментальной модели стреп-тозотоцинового диабета, пригодная для оценки генотоксических эффектов в плацентарных и эмбриональных клетках, пре- и постнатальных нарушений развития потомства и их коррекции фармакологическими веществами.
Впервые установлено значимое увеличение поврежденности ДНК в плацентарных и эмбриональных тканях крыс, с индуцированным стрептозотоциновым диабетом. Показано, что потомство этих животных характеризуется набором признаков, сходных с таковыми при симптомокомплексе «диабетическая фетопатия»; пастозность, гиперемия кожных покровов, нарушения становления рефлексов и когнитивных функций у потомства.
Впервые, продемонстрирована возможность фармакологической коррекции гено-токсических эффектов в эмбриональных и плацентарных клетках крыс с экспериментальным диабетом с помощью афобазола и бетаина, показано снижение морфологических и/или когнитивных нарушений потомства крыс со стрептозотоциновым диабетом, внутриутробное развитие которых протекало на фоне введения афобазола или бетаина. Антигенотоксические свойства бетаина в плацентарных и эмбриональных тканях установлены впервые.
Выявлены достоверные корреляции между уровнями глюкозы и повреждением ДНК в плацентарных и эмбриональных тканях крыс, поврежденностью ДНК в этих тканях и когнитивными нарушениями у потомства.
Впервые установлено, что афобазол в отдельных дозах снижает содержание глюкозы в крови беременных крыс с экспериментальным диабетом, а бетаин в разных дозах оказывает разнонаправленное действие на этот показатель и увеличивает выведение глюкозы с мочой.
Теоретическая и практическая значимость. Совокупность полученных результатов свидетельствует в пользу ранее сформулированной гипотезы о самостоятельной значимости повреждений ДНК в формировании пре- и постнатальных нарушений у потомства при действии различных повреждающих факторов(Дурнев А.Д., Жанатаев А.К., Шредер О.В., Середенина В.С. Молекулярная медицина. 2013. 3. С. 3-19) и подтверждают предположение о том, что антимутагены могут явиться фармакологическими корректорами ряда нарушений пре- и постнатального развития в условиях гипергликемии. Это создает необходимую основу для разработки способов антимутагенной профилактики осложнений беременности у больных диабетом.
Выявление способности афобазола или бетаина в отдельных дозах нормализовать гликемический статус 90-дневных крысят-самцов (афобазол) или крысят-самок (бетаин) открывает принципиальные возможности поиска фармакологических способов снижения риска развития диабета у потомства матерей, страдающих этим заболеванием.
Методология и методы исследования. Применена классическая методология поиска фармакологических средств коррекции патологических состояний с использованием экспериментальных моделей на животных. Использованы современные верифицированные методы учета генотоксических поражений, эмбриотоксических эффектов и нарушений постнатального развития потомства, включая общепринятые поведенческие методики. Исследование соответствует пунктам 1 и 4 паспорта специальности «фармакология, клиническая фармакология», шифр 14.03.06.
Основные положения, выносимые на защиту:
-
У животных с диабетом, индуцированным однократным внутрибрюшинным введением стрептозотоцина в дозе 40 мг/кг в первый день беременности, наблюдаются гипергликемия, увеличение поврежденности ДНК в плацентарных и эмбриональных клетках, в потомстве этих животных выявляются нарушения пре- и постнаталь-ного развития.
-
Между гипергликемией и повреждениями ДНК в эмбриональных и плацентарных клетках, повреждениями ДНК в указанных клетках и нарушениями когнитивных функций в потомстве крыс со стрептозотоциновым диабетом существуют значимые корреляции.
-
Афобазол в дозах 1, 10 и 50 мг/кг или бетаин в дозах 10, 50 и 100 мг/кг ежедневно, перорально вводимые беременным крысам со стрептозотоциновым диабе-
том,значимо снижают поврежденность ДНК в плацентарных и эмбриональных клетках.
-
Замедление становления безусловных рефлексов, морфологические, поведенческие и когнитивные нарушения значимо снижаются или отсутствуют в потомстве крыс со стрептозотоциновым диабетом, перорально получавших в период беременности афобазол в дозах 10 и 50 мг/кг или бетаин в дозах 50 и 100 мг/кг.
-
Афобазол или бетаин в отдельных дозах снижают гипергликемию у беременных крыс со стрептозотоциновым диабетом, бетаин увеличивает выведение глюкозы с мочой. У крысят-самцов крыс со стрептозотоциновым диабетом, пренатально получавших афобазол 10 мг/кг, и у крысят-самок, пренатально получавших бетаин 100 мг/кг, нормализуется содержание глюкозы в крови на 90 день развития.
Степень достоверности. Исследование выполнено на достаточном экспериментальном материале с использованием адекватных методов оценки и статистической обработки полученных данных.
Личный вклад соискателя состоит в непосредственном участии в получении исходных данных, их систематизации и апробации результатов исследования. Автором лично выполнена экспериментальная и аналитическая часть диссертации, сформулированы положения и выводы, подготовлены публикации по результатам диссертационного исследования.
Апробация работы. Результаты диссертационной работы были доложены на IV съезде фармакологов России «Инновации в современной фармакологии» (Казань, 18– 21 сентября 2012 года), «Science-based assessment of laboratory animal welfare» Rus-LASA-ICLAS (Санкт-Петербург, 2014), «12th World Congress of Biological Psychiatry» (Афины, 14 – 18 июня 2015года), Всероссийской конференции молодых ученых с Международным участием, посвященной 150-летию со дня рождения академика Н.П. Кравкова (Рязань, 22 –23 октября 2015 года), 6-ой Международной конференции «Биологические основы индивидуальной чувствительности к психотропным средствам» (Клязьма, 9 – 13 ноября 2015 года), а также представлены на расширенном заседании конференции лаборатории лекарственной токсикологии 3 декабря 2015 года.
Публикации. Результаты исследования опубликованы в 3 статьях в ведущих рецензируемых научных журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ, 1 главе в книге, изданной за рубежом, 5 тезисах докладов в материалах российских и международных конференций.
Объем и структура диссертации.Диссертационная работа изложена на 132 страницах компьютерного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов экспериментов, их обсуждения, выводов, списка сокращений и литературы. Иллюстрирована 36 таблицами,18 рисунками и 2 схемами. Библиографический указатель включает 63 отечественных и 121 иностранный источник.
Тератогенный потенциал генотоксикантов
К АФК относят супероксиданион радикал О2-, гидроксильный радикал OH-, пе-роксильный радикал RO2-, алкоксильный радикал RO-, гидроперокильный радикал HO2-, перекись водорода H2O2, гипохлорная кислота HOCl, озон O3, синглетный кислород, пе-роксинитрит ONOO- [104].
Окислительный стресс рассматривается как патогенетическое событие, приводящее к тотальному поражения субклеточных структур и макромолекул. Эволюционно выработаны механизмы, препятствующие его развитию в организме. Они объединяются понятием антиоксидантная защита или антиоксидантная система организма. Согласно Davies (1988) выделяют первичную и вторичную антиоксидантные системы. Первичная, направленная на перехват и инактивацию активных форм кислорода. Она представлена -каротином, аскорбиновой кислотой, альфа-токоферолом, глутатио-ном, мочевой кислотой и ферментами супероксиддисмутазой (СОД), каталазой, глута-тионпероксидазой (ГП). Вторичная, направлена на устранение поражений биомолекул и / или пораженных биомолекул, вызываемых окислительным стрессом, и представлена липолитическими ферментами, протеиназами, ДНК-репарирующими ферментами, эндо-и экзонуклеазами, лигазами [89].
Центральную роль в осуществлении ферментативной антиоксидантной защиты играют ферменты СОД и каталаза, которые, соответственно, дисмутируют супероксида-нион радикал до пероксида водорода и разлагают пероксид водорода до воды, т.е. осуществляют регуляторную функцию на самых первых этапах одноэлектронного восстановления кислорода, что позволяет рассматривать эти ферменты как ключевые в регуляции всех последующих свободнорадикальных событий, включая перекисное окисление липидов (ПОЛ).
Большое внимание уделено исследованию патогенетической роли окислительного стресса при диабете [141]. При СД возникают идеальные условия для формирования окислительного стресса: увеличивается содержание субстратов окисления (глюкоза и свободные жирные кислоты), уменьшается образование и по неустановленным причинам снижается активность элементов естественных антиоксидантных систем – таких, как глутатион, СОД, каталаза и глутатионовая пероксидаза [162].
Гипергликемия, являющаяся патогномическим признаком СД, всегда сопровождается развитием ОС. Это твердо установленный хрестоматийный факт неоднократно описан в научных трудах и врачебных руководствах. Из данных приведенных в таблице 1, обобщающих результаты исследований уровня 8-гидроксигуанозина (8-OHdG), являющегося маркером ОС, у больных диабетом, видно, что уровень маркера превышает аналогичные показатели у бессимптомных пациентов в среднем в 2-3 раза и зависит от возраста, пола, длительности заболевания, курения. Таблица 1. Клинико-экспериментальные литературные данные, доказывающие увеличение основного маркера окислительного стресса у больных СД.
ВЭЖХ-АД после ТФЭ (моча) 69 пациентов с диабетической нефро-патией, 30 контроль Уровни 8-OHdG в моче у больных диабетической нефропатии с макроальбуминурией были значительно выше, чем в контроле (5,72 +/- 6,89 мкмоль / моль креатинина по сравнению с 2,33 +/- 2,83 мкмоль / моль креатинина, Р = 0,018). Значимые отличия уровня 8-OHdG в суточной моче у пациентов с макроальбуминурией и пациентов с нормоальбуминурией (19,2 +/- 16,8 мкг / 24 ч против 8,1 +/- 1,7 мкг / 24 ч, Р = 0,015). Была положительная корреляция между уровнями 8-OHdG и гликозилированного гемоглобина (HbA1c) (г = 0,287, P = 0,022). Слабая корреляция между уровнями 8-OHdG и триглицеридов (г = 0,230, р = 0,074) [172].
ИФА (моча) 81 СД2, 100 контроль Общая 24 ч экскреция 8-OHdG заметно выше у пациентов с ИНСД, чем в группе контроля (68,2 ± 39,4 мкг против 49,6 ± 37,7 мкг, Р = 0,001) [123].
ВЭЖХ (сперма) 11 СД1, 12 контроль У больных СД1 в сперматозоидах были значительно более высокие уровни фрагментации ДНК (44% против 27%, р 0,05) и концентрации 8-OHdG (3,6 против 2,0 молекул 8-OHdG в 105 молекул дезоксигуанозина; P 0,05). Кроме того, положительная корреляция наблюдалась между фрагментации ДНК и концентрации 8-OHdG в 105 молекул дезоксигуанозина (RS = 0,7, P 0,05) [66].
ИФА (кровь) 47 СД2 (22 с диабетической нефропа-тией и 23 без осложнений), 25 контроль Сыворотка 8-OHdG была значительно увеличена у больных СД (24,90 ± 6,29 нг / мл) по сравнению с подобранных по возрасту здоровых субъектов (5,86 ± 1,82 нг / мл, р 0,01). Кроме того, пациенты с диабетической нефропатией имели значительно более высокий 8-OHdG чем у больных СД без сосудистых осложнений (26,89 ± 6,44 нг / мл против 23,14 ± 5,59 нг / мл, р 0,05) [160].
ИФА (кровь) 35 СД2, 8 преддиа-бетическое состояние, 119 контроль Уровень 8-OHdG в сыворотке у пациентов с преддиа-бетом был значительно выше, чем в контроле (671,3±140 pg/m против 210,1±166 pg/ml; P 0,01). У пациентов с диабетом был самый высокий уровень 8-OHdG в сыворотке 1979,6±1209 pg/ml [67].
На фоне полной уверенности в вовлеченности ОС в патогенез СД вопрос о механизмах его развития исследован слабо. По существу, на основе ряда несистематических исследований сформулировано несколько гипотез различной степени обоснованности. Центральной среди них является гипотеза, поддерживаемая подавляющим большинством авторов и декларирующая, что ОС возникает в результате избыточной продукции АФК, возникающих при автоокислении глюкозы. Однако, биохимический механизм этого процесса in vivo не раскрыт. Единичное наблюдение профессора З.В. Ланкина и сотрудников, свидетельствует, что автоокисление глюкозы протекает при участии ионов переменной валентности, в частности, меди [42].
Другой механизм, активация полиолового пути окисления глюкозы, в результате которого глюкоза превращается в сорбитол, приводит к истощению NADPH, что снижает антиоксидантную защиту, обусловленную глутатионом [4, 81].
Гликозилирование ферментов антиоксидантой защиты может быть одной из причин развития ОС при СД. Например, при взаимодействии сахаров (глюкозы) с аминогруппами белков образуются продукты Амадори, в частности пентозидин, уровень которого в коже коррелирует с осложнениями СД 1 типа [146]. Продукты Амадори инициируют реакцию Майларда (1912 г.) в результате которой образуются конечные продукты гли-козилирования (AGEs). Больные СД имеют более высокий уровень AGEs, чем здоровые [108].
Гипергликемия активирует РКС-зависимую NADH-оксидазу, которая продуцирует АФК, в культивируемых эндотелиальных клетках аорты, клетках гладких мышц и ме-зангиальных клетках [83, 109, 118, 122]. Не исключено, что сходный механизм может быть реализован in vivo.
Исследования, проведенные in vitro показали, что добавление высоких концентраций глюкозы приводит к увеличению продукции АФК в митохондриальной цепи переноса электронов (ЭТЦ). Хроническая гипергликемия приводит увеличению продукции АФК митохондриями, что может быть источником окислительного стресса [94, 132].
В общих чертах развитие окислительного стресса и его патогенетические последствия при СД могут быть обобщены в виде следующей схемы 1.
Очевидно, что при СД окислительный стресс может возникать различными путями, в действительности, имеет место комбинация указанных выше механизмов.
Окислительный стресс является источником эндогенных соединений, которые, как свидетельствуют многочисленные литературные сведения, обладают цитотоксическим свойствами, в том числе, способностью поражать макромолекулы. Особое внимание привлекает способность АФК вызывать химические модификации ДНК. В связи с неос 18 поримой ролью окислительного стресса в патогенезе сахарного диабета существует необходимость подробного анализа работ, посвященных изучению генотоксических событий при СД.
Экспериментальные группы и схемы введения
По результатам нового международного исследования, опубликованного в журнале Birth Defects Research Part A: Clinical and Molecular Teratology, аномалии развития центральной нервной системы (ЦНС), в том числе Spina bifida, обнаруживаются более, чем у 5000 плодов в Европе ежегодно. По оценке исследователей, из нескольких университетов Германии и Швейцарии добавление фолиевой кислоты в основные продукты питания должно предотвратить по крайней мере половину этих случаев. Подобная практика уже существует в 70 странах, не входящих в Европейский Союз (ЕС), в частности в Канаде и в Австралии. Более 15 лет наблюдений в странах, практикующих добавление фолиевой кислоты в пищу, не выявило побочных эффектов этой новации [134].
Существует потребность в разработке средств фармакологической коррекции пре-натальных нарушений у плода. Лаборатория лекарственной токсикологии НИИ фармакологии имени В.В. Закусова уже несколько лет занимается поиском средств фармакологической коррекции внутриутробных нарушений у потомства, причиной возникновения которых являются генотоксические повреждения. В частности, подробно исследуется известный анксиолитик афобазол, у которого помимо основных показаний, представленных в инструкции по медицинскому применению, по результатам доклинических исследований были выявлены антигенотоксические и антитератогенные свойства. В настоящей работе с этой целью использован также бетаин.
В настоящее время существует много экспериментальных моделей сахарного диабета (таблица 3), которые дают возможность изучения патологий, возникающих при этом заболевании, а также делают возможным разработку новых средств лечения и профилактики [115, 130, 159]. Наиболее распространенными химическими индукторами диабета у грызунов являются аллоксан и стрептозотоцин [119, 124]. Для целей нашей работы был выбран стрептозотоцин, так как он вызывает устойчивую гипергликемию с меньшим количеством летальных исходов [135]. Исследования показали, что экспериментальный стрептозотоциновый диабет приводит к окислительному стрессу и наруше 36 нию антиоксидантного статуса [112], что дает возможность моделировать СД с механизмами схожими у человека при СД.
В настоящее время в России экспериментальные исследования по оценке пре- и постнатального развития проводятся в соответствии с Руководством по проведению доклинических исследований лекарственных средств [44]. Особое внимание в исследованиях также уделено рекомендациям ВОЗ и Правилам надлежащей лабораторной практики (GLP), выполнение которых позволяет объективно оценить репродуктивную токсичность лекарственных средств.
Для исследований применяют здоровых половозрелых животных обоего пола, наиболее удобны для экспериментов крысы, мыши, кролики и другие лабораторные животные.
При изучении эмбрио- и фетотоксического действия препарат вводится беременным крысам либо весь период беременности или в определенный период развития плода (доимплантационный, эмбриональный, фетальный) [40]. Выбор доз осуществляется на основании данных предыдущих исследований, чаще всего доза, соответствующая терапевтической и доза на порядок выше терапевтической.
В исследовании эмбриотоксичности фиксируют такие показатели, как пред – и пост имплантационная гибель, количество желтых тел, мест имплантаций, резорбций, живых и мертвых плодов, массу и краниокаудальный размер плодов, состояние костной системы по методу Доусона-Петерса [139] и внутренних органов по методу Вильсона [25]. При исследовании нарушений у потомства регистрируют физическое развитие, сенсорно-двигательные рефлексы (переворачивание на плоскости, избегание края, веревочка), эмоционально-двигательное поведение (открытое поле, приподнятый крестообразный лабиринт, тест экстраполяционного избавления, Ж-лабиринт).
Для изучения генотоксических механизмов тератогенеза применяется метод «ДНК-комет», который является чувствительным, простым, недорогим и быстрым. Метод может быть использован для обнаружения повреждений ДНК отдельных клеток и выявления двунитевых разрывов, однонитевых разрывов и щелочно-лабильных сайтов. В последние годы этот метод широко используется в исследованиях по репарации ДНК, генетической токсикологии, радиационных загрязнений, старения и других [24]. Выше изложенные факты позволяют сформулировать следующие положения:
Таким образом, созданы необходимые теоретические и методические предпосылки для экспериментального доказательства наличия генотоксических эффектов в эмбриональных клетках в экспериментальных моделях диабета и их связи с нарушениями пре- и постнатального развития, успешная реализация которого открывает перспективу фармакологического поиска средств коррекции репротоксических эффектов диабета среди соединений, обладающих антимутагеннными / антигенотоксическими свойствами. В свою очередь, выявление подобных соединений может рассматриваться как важный шаг совершенствования ведения беременных женщин, страдающих диабетом с целью профилактики осложнений беременности и нарушений развития у новорожденных. Целью настоящего исследования явилась оценка влияния антимутагенов афобазола и бетаина на генотоксические повреждения в эмбриональных и плацентарных клетках и нарушения пре- и постнатального развития у потомства крыс со стрептозотоциновым диабетом.
Содержание глюкозы в крови и моче беременных крыс со стрептозотоциновым диабетом, влияние афобазола и бетаина
В клетках мозга эмбрионов крыс, получавших афобазол во всех использованных дозах, наблюдалось снижение уровня поврежденности ДНК «% ДНК в хвосте» и «апоп-тотических комет», по сравнению с данными, выявленными у животных со стрептозо-тоциновым диабетом. Статистически значимое снижение «% ДНК в хвосте» в 2 раза, по сравнению с модельной группой, было выявлено в клетках мозга эмбрионов крыс, получавших афобазол в дозе 10 мг/кг. Уровень поврежденности ДНК в мозге эмбрионов крыс, получавших препарат в дозах 1, 10 и 50 мг/кг, не отличался от значений, наблюдаемых в контроле.
Таким образом, можно констатировать, что афобазол в дозах 1, 10 и 50 мг/кг снижал уровни показателей «% ДНК в хвосте» до контрольных значений.
При анализе показателя «апоптотические кометы» наиболее выраженное снижение в 9 раз, по сравнению со стрептозотоциновой моделью, было зарегистрировано в мозге эмбрионов при использовании афобазола в дозах 10 и 50 мг/кг. Примечательно, что под действием препарата в указанных дозах показатель «апоптотические кометы» значимо снизился также по отношению к данным, зарегистрированным в контроле, в 3,6 и 3,5 раз, соответственно.
Влияние бетаина
Уровни показателей «% ДНК в хвосте» в клетках мозга эмбрионов крыс, получавших бетаин, были снижены, но значимо не отличались от таковых у животных, составивших группу стрептозотоцинового диабета. В то же время, уровни повреждений ДНК «% ДНК в хвосте» в клетках эмбрионов крыс, получавших бетаин в дозе 50 и 100 мг/кг, не отличался от значений, наблюдаемых в группе контроля. Это позволяет говорить о тенденции, указывающей на протекторные эффекты бетаина.
Количество «апоптотических комет» в клетках мозга эмбрионов крыс, получавших бетаин во всех использованных дозах, значимо снижалось до уровня контрольных значений, а у самок, получавших бетаин в дозах 50 и 100 мг/кг этот показатель снизился в 2,6 и 2,8 раз, соответственно, по сравнению с контрольными значениями.
В результате анализа данных поврежденности ДНК 1139 клеток крови эмбрионов на 20 день внутриутробного развития (таблица 11) было установлено, что у эмбрионов контрольных самок «% ДНК в хвосте» составляет 5,60 %, а «апоптотических комет» -4,72 %.
В 590 клетках крови модельных эмбрионов из группы «стрептозотоциновый диабет» было отмечено значимое повышение «% ДНК в хвосте» на 57 % и «апоптотических комет» в 2 раза, по сравнению с контрольной группой.
Афобазол в дозе 50 мг/кг, но не в дозах 1 и 10 мг/кг, вызывал значимое снижение показателя «% ДНК в хвосте» в 2 раза и уровня «апоптотических комет» на 44 % в клетках крови эмбрионов по сравнению с аналогичными показателями в модельной группе стрептозотоцинового диабета. При этом, данные, зарегистрированные на фоне введения афобазола во всех использованных дозах не отличались от контроля по уровню поврежденности ДНК и числу «апоптотических комет». Последнее наблюдение может трактоватся как тенденция к снижению генотоксического эффекта под действием афобазола.
При использовании бетаина в дозе 100 мг/кг показатели «% ДНК в хвосте» и «апоптотических комет» в крови эмбрионов значимо снизились в 2,2 и 6,7 раз, по сравнению с модельной группой стрептозотоцинового диабета, а также оказались значимо ниже контрольных значений. Уровень поврежденности ДНК и «апоптотических комет» в крови эмбрионов крыс, получавших бетаин в дозе 50 мг/кг, не отличался от значений аналогичных показателей в группе контроля, однако, не имел значимых различий с показателями, зарегистрированными в группе стрептозотоцинового диабета.
Обобщая выше изложенные результаты, следует заключить, что афобазол, вводимый перорально, ежедневно на протяжении беременности в дозах 1 и 50 мг/кг значимо уменьшал показатели поврежденности ДНК «% ДНК в хвосте» или в дозах 10 и 50 мг/кг «апоптотические кометы» в плацентарных клетках, в дозах 1, 10 и 50 мг/кг уменьшал «% ДНК в хвосте» и в дозе 1 мг/кг «апоптотические кометы» в эмбриональных клетках на 14 день беременности; афобазол во всех дозах снижал «% ДНК в хвосте» в клетках плаценты и в дозе 10 мг/кг в клетках мозга и в дозе 50 мг/кг в клетках крови эмбрионов, в всех дозах уменьшал количество «апоптотических комет» в клетках плацент и мозга эмбрионов и в дозах 1 и 50 мг/кг в клетках крови эмбрионов на 20 день беременности крыс со стрептозотоциновым диабетом.
В свою очередь, бетаин, вводимый перорально, ежедневно на протяжении беременности в дозе 100 мг/кг значимо уменьшал показатель поврежденность ДНК «% ДНК в хвосте» в плацентарных и эмбриональных клетках на 14 день беременности; в дозах 10, 50 и 100 мг/кг снижал количество «апоптотических комет» в клетках плацент и мозга эмбрионов и в дозах 50 и 100 мг/кг в клетках крови эмбрионов, в дозе 100 мг/кг уменьшал «% ДНК в хвосте» в клетках крови эмбрионов на 20 день беременности крыс со стрептозотоциновым диабетом.
Из этих наблюдений следует, что использованные препараты оказывают очевидное антигенотоксическое действие на клетки плацент и развивающихся зародышей у крыс со стрептозотоциновым диабетом. Они, проявляют протекторные эффекты избирательно от дозы и ткани. Выраженность защиты весьма высока, поскольку во многих случаях показатели генотоксичности, регистрируемые при стрептозотоциновом диабете, на фоне введения афобазола или бетаина не отличаются от показателей контроля или регистрируются в значениях, которые ниже контрольных показателей.
Полученные результаты опубликованы в статье: В.В. Забродина, Е.Д. Шредер, О.В. Шредер, А.Д. Дурнев, С.Б. Середенин. Влияние афобазола и бетаина на ДНК-повреждения в плацентарных и эмбриональных тканях крыс с экспериментальным стрептозотоциновым диабетом. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2015. Т. 159, № 6. С. 731-735. [35]
Оценка показателей потомства крыс со стрептозотоциновым диабетом в тесте «Горизонтальная веревочка», влияние афобазола и бетаина
Исследования по проблемам репродуктивного здоровья, генетической токсикологии и бихевиористики общепризнаны и развиваются независимо друг от друга. В каждой из перечисленных областей имеются очевидные достижения.
В области, исследования репродуктивного здоровья сформированы концепции о влиянии внешних факторов на развитие плода, определены наиболее часто встречающиеся механизмы тератогенеза и создана необходимая методологическая база для выявления тератогенов и закономерностей тератогенного действия (см. раздел 2.10.). Созданы многочисленные списки тератогенов. Наиболее известным и информативных из них является Каталог Шепарда [183].
Однако, только в последние десятилетия, формируется и находит экспериментальное подтверждение мысль о том, что тератогенные воздействия могут выражаться не только в грубых морфологических нарушениях постнатального развития или эмбриоле-тальных эффектах, но также проявляться в виде поведенческих и когнитивных нарушений и других слабо выраженных отклонений в постнатальном развитии [55, 65].
Большим подспорьем в исследовании обозначенной проблемы являются методы и приемы, выработанные в бихевиористике и широко апробированные в психофармакологии. Тесты различной сложности широко используются для выявления влияния лекарств-кандидатов на поведенческие и когнитивные функции лабораторных животных. Это, в частности, тест «открытое поле», позволяющий регистрировать ориентировочно-исследовательскую и двигательную активности, приподнятый крестообразный лабиринт для оценки тревожности, Т-образный лабиринт для оценки когнитивных функций. В предшествующих работах нашей лаборатории (лаборатория лекарственной токсикологии НИИ фармакологии имени В.В. Закусова) было показано, что эти тесты позволяют надежно регистрировать когнитивные и поведенческие нарушения, возникающие в результате негативных воздействий различных химических агентов в пренатальном периоде.
Наконец, в области генотоксикологии, в самое последнее время появился и был хорошо апробирован метод «ДНК-комет», позволяющий с высокой надежностью оценивать поврежденность / целостность ядерной ДНК в плацентарных и эмбриональных клетках на всех этапах внутриутробного развития. Три перечисленных направления исследований были в едином комплексе сфокусированы ранее на экспериментальном выявлении роли поврежденности ДНК в формировании нарушений пре- и постнатального развития у млекопитающих, в частности, крыс. В этих исследованиях была установлена корреляционная связь между поврежденностью ДНК эмбриональных клеток и плаценты и различными нарушениями развития. В частности, при использовании в качестве тератогена химического алкилирующего агента, противоопухолевого препарата циклофосфамида было установлена связь между уровнями поврежденности ДНК в эмбриональных клетках и тератогенными поражениями у плодов (R 0,7) при 20-часой экспозиции: протрузии языка, гипогнатии, микромелии, ахейрии, экзофтальма, тератом; при 24-часовой экспозиции: менингоэнцефалоцеле, кра-ниошизиса, микроцефалии, экзофтальма, микрогнатии, гипогнатии, протрузии языка, микромелии, ахейрии, аподии, омфалоцеле, тератом [59].
В экспериментах, предусматривающих анализ поколения F1 крыс, получавших этанол во время беременности, при 3 и 6 часовой экспозициях выявлена связь между повышением уровня поврежденности ДНК в клетках плацент и эмбрионов и увеличением числа эмбрионов с односторонней гидроцефалией, гидроцефалией, расширением среднего желудочка, аномальным морфогенезом мозга (p 0,05). У поколения F1 были выявлены значимые связи между повышением уровня поврежденности ДНК и выработки пищедобывательного навыка в «Т-образном лабиринте» по показателям: время достижения пищевого подкрепления и латентное время обучения (p 0,05) [57].
Таким образом, обобщение результатов указанных наблюдений позволяет заключить, что повреждение ДНК плацент и эмбриональных клеток ассоциировано с нарушениями пре- и постнатального развития экспериментальных животных, что согласуется с ранее высказанной гипотезой о самостоятельной патогенетической роли первичных (предмутационных) повреждений ДНК [8, 21].
В настоящем исследовании это заключение было проверено с использованием стрептозотоциновой модели диабета. Его справедливость была подтверждена на основе анализа корреляционных связей между показателями поврежденности ДНК «% ДНК в хвосте» и «апоптотические кометы», с одной стороны, и уровнем глюкозы в крови самок крыс и показателями, характеризующими когнитивную функцию у поколения F1, с другой стороны.
Анализ соответствия модели реальным клиническим проявлениям диабетических поражений у потомства целесообразно начать с анализа морфологических признаков. Для потомства матерей, страдающих диабетом, типично наличие симпатокомплекса диабетическая фетопатия, который включает увеличенную массу тела, красновато-синюшный оттенок кожных покровов, отечность мягких тканей, подкожные кровоизлияния, РДС. Сходные признаки, такие как пастозность и подкожные кровоизлияния, наблюдаются в потомстве крыс со стрептозотоциновым диабетом. У новорожденных наблюдается гипогликемия, в потомстве крыс на 90 день развития также выявляется значимая гипогликемия по сравнению с контрольной группой. Наконец, при диабете у человека и животных, использованных для моделирования диабета, отмечается выраженная гипергликемия, являющаяся главным и основным патогенетическим проявлением диабета. Согласно литературным данным в неонатальный период у детей, рожденных от матерей, страдающих диабетом, наблюдается отставание в развитии [63], у потомства крыс со стрептозотоциновым диабетом, как было показано в настоящей работе и будет подробно рассмотрено далее, наблюдается снижение когнитивных способностей и отставание в становлении безусловных рефлексов.
Таким образом, проявления пре- и постнатальных нарушений, регистрируемых в потомстве крыс со стрептозотоциновым диабетом в целом соответствуют клиническим проявлениям у новорожденных, внутриутробное развитие которых протекало в условиях некомпенсированной гипергликемии.