Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 12
1.1 Энтеросорбция, механизмы адсорбции, требования к энтеросорбентам 12
1.2 Структура, физико-химические свойства монтмориллонита 15
1.3 Способы повышения сорбционной активности глинистых минералов 18
1.4 Медицинское применение монтмориллонитовых глин 19
1.5 Фармакологическое действие смектитовых глин при пероральном применении. Свойства обогащенного ионами серебра монтмориллонита 21
1.6 Клиническая эффективность энтеросорбентов, основанных на смектитовых минералах 30
1.7 Актуальность разработки энтеросорбента на основе монтмориллонита отечественного производства 35
Глава 2. Материалы и методы 38
2.1 Материалы исследования 38
2.1.1 Соответствие работы правилам и рекомендациям к проведению экспериментальных исследований 38
2.1.2 Экспериментальные животные 38
2.1.3 Объект исследования 39
2.1.4 Сведения о препаратах сравнения 40
2.2 Методы исследования 41
2.2.1 Исследование острой токсичности 41
2.2.2 Моделирование острых диарей 42
2.2.3 Исследование сорбционной активности на модели изолированных петель тонкой кишки 44
2.2.4 Моделирование острого и хронического токсического повреждения печени 45
2.2.5 Моделирование острого панкреатита 47
2.2.6 Изучение гистоморфометрических изменений в органах при моделировании патологических процессов. Определение биохимических и иммунологических показателей в плазме крови 48
2.2.7 Дизайн исследования 50
2.2.8 Статистическая обработка полученных результатов 51
Глава 3. Результаты собственных исследований 54
3.1 Определение острой токсичности энтеросорбента под лабораторным шифром Crim 04 на основе монтмориллонита 54
3.2 Экспериментальное изучение противодиарейного действия энтеросорбента под лабораторным шифром Crim 04 55
3.2.1 Изучение дозозависимого противодиарейного эффекта энтеросорбента под лабораторным шифром Crim 04 на модели серотонин-индуцированной диареи 55
3.2.2 Изучение дозозависимого противодиарейного эффекта энтеросорбента под лабораторным шифром Crim 04 на модели острой диареи, индуцированной касторовым маслом 69
3.2.3 Изучение дозозависимого противодиарейного эффекта энтеросорбента под лабораторным шифром Crim 04 на модели острой MgSO4-индуцированной диареи 83
3.3 Изучение сорбционной активности энтеросорбента под лабораторным шифром Crim 04 на модели изолированных петель тонкой кишки 96
3.4 Экспериментальное изучение эффективности энтеросорбента под лабораторным шифром Crim 04 при моделировании острого и хронического токсического повреждения печени 107
3.4.1 Исследование дозозависимого эффекта энтеросорбента под лабораторным шифром Crim 04 при экспериментальном остром токсическом повреждении печени 107
3.4.2 Исследование дозозависимого эффекта энтеросорбента под лабораторным шифром Crim 04 при экспериментальном хроническом токсическом повреждении печени 122
3.5 Экспериментальное изучение эффективности применения энтеросорбента под лабораторным шифром Crim 04 при остром панкреатите 138
Обсуждение результатов 146
Заключение 154
Выводы 156
Перечень сокращений и условных обозначений 158
Список литературы 160
Приложения 184
- Фармакологическое действие смектитовых глин при пероральном применении. Свойства обогащенного ионами серебра монтмориллонита
- Изучение дозозависимого противодиарейного эффекта энтеросорбента под лабораторным шифром Crim 04 на модели серотонин-индуцированной диареи
- Изучение сорбционной активности энтеросорбента под лабораторным шифром Crim 04 на модели изолированных петель тонкой кишки
- Экспериментальное изучение эффективности применения энтеросорбента под лабораторным шифром Crim 04 при остром панкреатите
Введение к работе
Актуальность темы исследования. На сегодняшний день
заболеваемость, распространенность и, что особенно важно, смертность от
состояний, ассоциированных с синдромом эндогенной интоксикации, а также
экзогенных интоксикаций солями тяжелых металлов, токсинами грибов и
бактерий являются актуальными социальными и медицинскими проблемами
(Zhu R.L., 2016; Masindi V., 2014). Диарея является одним из самых
распространенных заболеваний, связанных с загрязнением питьевой воды и
пищи токсическими агентами вирусной, бактериальной и грибковой природы.
Диарея остаётся одной из самых распространенных причин смертности в мире.
В 2015 году в мире от диареи погибло 1,39 млн. человек, большинство из
которых дети, у которых диарея занимает второе место в структуре смертности.
Ежегодно регистрируется более 1,7 млрд. случаев диареи в мире (ВОЗ, 2017,
2013). Острая диарея, как и многие другие заболевания внутренних органов,
такие как острые и хронические гепатиты, острый панкреатит, относится к
состояниям, ассоциированным с синдромом эндогенной интоксикации. При
этом происходит накопление токсических продуктов метаболизма,
ксенобиотиков, продуктов цитолиза во внутренних средах организмах со снижением элиминации их из организма (Самсонов К.В., 2009; Вершинин А.С., 2013; Левченко С.А., 2015; Урсова Н.И., 2012).
Для успешной терапии патологических состояний, ассоциированных с
синдромом эндогенной интоксикации, необходимо обеспечить достаточно
активную элиминацию токсических продуктов метаболизма. Эффективным и
доступным методом дезинтоксикации организма является метод энтеросорбции
(Liashenko N.V., 2014; Юлиш Е.И., 2011; Carretero M.I., 2010). Среди всего
разнообразия сырья для производства энтеросорбентов особое место занимают
глинистые минералы, главным образом смектиты. Слоистые алюмосиликаты
смектитовой группы при пероральном применении обладают антацидным,
противодиарейным, цитомукопротективным, противовоспалительным и
антицитокиновым действием, имеют высокую сорбционную активность в отношении токсинов бактерий, солей тяжелых металлов, афлатоксинов, гербицидов (Жилякова Е.Т., 2013, 2014; Yuan G.D., 2013; Jiang Y., 2013; Zychowski K.E., 2015; Bui Q.C., 2016). Эти исследования касаются смектита диоктаэдрического и монтмориллонита. Кроме того, монтмориллонит, обогащенный частицами серебра, обладает бактерицидным эффектом в отношении ряда микроорганизмов (Bui Q.C., 2016; Bukhanov V.D., 2017).
Смектит диоктаэдрический пользуется повышенным спросом у населения
России (Бондарев А.В., 2014). При этом в России зарегистрированы всего 4
энтеросорбента на основе минералов смектитовой группы. Однако все они
производятся из субстанций зарубежного производства. Разработка
лекарственных препаратов на основе отечественных субстанций является актуальной задачей и согласуется со стратегией развития фармакологической и медицинской промышленности Российской Федерации на период до 2020 года (Жилякова Е.Т., 2014).
Степень разработанности темы исследования. Сорбционные свойства глинистых минералов привлекают внимание ученых на протяжении последнего полувека (Bergaya F., 2013; Brigatti M.F., 2013). За последнее десятилетие опубликовано множество работ, касающихся структуры, физико-химических свойств, экспериментальных и клинических исследований эффективности смектитов, в том числе монтмориллонита (Komadel P., 2013; Yuan G.D., 2013; ВОЗ, 2013; Das R.R., 2015; Jiang Y., 2013; Afriyie-Gyawu E., 2008; Wang P., 2008). Достаточно полно изучены механизмы сорбции токсинов и ксенобиотиков на поверхности монтмориллонита (Полевая Е.В., 2012; Brouillard M.Y., 1989). Однако на российском фармакологическом рынке нет энтеросорбента на основе слоистых алюмосиликатов отечественного происхождения. Для решения данной задачи необходимо исследовать монтмориллонит российского происхождения на доклиническом уровне.
Цель исследования: изучить фармакологическую активность
энтеросорбента на основе монтмориллонита в экспериментальных условиях.
Задачи исследования:
-
Исследовать острую токсичность энтеросорбента на основе монтмориллонита под лабораторным шифром Crim_04.
-
Изучить фармакологическую активность энтеросорбента на основе монтмориллонита под лабораторным шифром Crim_04 в широком диапазоне доз на различных моделях острой диареи.
-
Изучить сорбционную активность энтеросорбента на основе монтмориллонита под лабораторным шифром Crim_04 в отношении энтеротоксина E. coli на модели изолированных петель тонкой кишки.
-
Изучить фармакологическую активность энтеросорбента на основе монтмориллонита под лабораторным шифром Crim_04 в широком диапазоне доз на моделях острого и хронического токсического повреждения печени.
-
Исследовать фармакологическую активность энтеросорбента на основе монтмориллонита под лабораторным шифром Crim_04 в широком диапазоне доз на модели острого L-аргинин-индуцированного панкреатита.
Научная новизна исследования. В опытах in vivo впервые установлено, что энтеросорбент на основе монтмориллонита Crim_04 является нетоксичной субстанцией при однократном внутрижелудочном введении животным в максимальной дозе. Впервые выявлена дозозависимая противодиарейная и цитомукопротективная активность энтеросорбента на основе монтмориллонита под лабораторным шифром Crim_04 на моделях серотонин-индуцированной, MgSO4-индуцированной диареи и диареи, индуцированной касторовым маслом. Противодиарейный эффект энтеросорбента под шифром Crim_04 заключается в увеличении времени начала диареи, сокращения количества дефекаций и повышении плотности каловых масс. Цитомукопротективный эффект проявляется в предотвращении развития отека ворсинок и гипертрофии крипт слизистой оболочки кишечника.
Впервые установлена высокая сорбционная активность энтеросорбента на основе монтмориллонита под лабораторным шифром Crim_04 по отношению к термолабильному холероподобному энтеротоксину E. coli.
Впервые установлена терапевтическая эффективность энтеросорбента на основе монтмориллонита под лабораторным шифром Crim_04 при моделировании острого и хронического повреждения печени, которая проявлялась в улучшении биохимических показателей, показателей иммунного статуса, уменьшении относительной массы печени, уменьшении выраженности некротических изменений печени, уменьшении выраженности патологических изменений почек и легких. Этот эффект носил дозозависимый характер. Впервые показана высокая эффективность применения энтеросорбента на основе монтмориллонита под лабораторным шифром Crim_04 на модели острого L-аргинин-индуцированного панкреатита, что проявляется в повышении суточной выживаемости животных, улучшении биохимических показателей, уменьшении выраженности отека и повреждения поджелудочной железы. При этом установлен четкий дозозависимый эффект.
Теоретическая и практическая значимость работы. Полученные данные использованы в рамках государственного контракта № 14.N08.11.0109 от 19.09.2016 «Доклинические исследования лекарственного средства – бактерицидного энтеросорбента на основе минерала монтмориллонита», проводимого в рамках ФЦП «Фарма-2020». Энтеросорбент под лабораторным шифром Crim_04 обладает противодиарейной активностью, терапевтической эффективностью при экспериментальных остром и хроническом токсических гепатитах, остром панкреатите. Энтеросорбент Crim_04 можно рекомендовать для изучения клинической эффективности и безопасности.
Методология и методы исследования. В проведенном научном
исследовании был использован комплексный подход для доклинического
изучения фармакологической активности энтеросорбента на основе
монтмориллонита под лабораторным шифром Crim_04 на различных моделях патологии. Исследование было проведено в соответствии с этическими нормами по работе с лабораторными животными с выбором адекватных моделей и методов, с использованием современного оборудования, позволяющих получить достоверные и репрезентативные результаты.
Положения, выносимые на защиту:
-
Энтеросорбент на основе монтмориллонита под лабораторным шифром Crim_04 являясь нетоксичным фармакологическим агентом (IV класс токсичности) обладает дозозависимой противодиарейной активностью на различных моделях острой диареи.
-
Энтеросорбент на основе монтмориллонита под лабораторным шифром Crim_04 обладает высокой сорбционной активностью в отношении термолабильного холероподобного токсина E. coli.
-
Энтеросорбент на основе монтмориллонита под лабораторным шифром Crim_04 обладает дозозависимой терапевтической активностью при моделировании острого и хронического токсического повреждения печени, а также острого L-аргинин-индуцированного панкреатита.
Степень достоверности и апробация результатов. Достоверность
результатов, полученных в ходе исследования, основывается на адекватном
выборе экспериментальных моделей, методологии научной работы,
использовании современного оборудования, достаточном объеме проведенных
экспериментов, достаточной для проведения исследования выборке,
правильной математической и статистической обработке.
Основные положения диссертационной работы были представлены на: VIII Международной научной конференции #SCIENCE4HEALTH2017, Москва, 2017; 82-й Всероссийской научной конференции студентов и молодых ученых с международным участием, посвящённой 82-летию КГМУ «Молодежная наука и современность», Курск, 2017; Общеуниверситетской конференции по итогам научно-исследовательской работы студентов, аспирантов и молодых ученых в 2016 году в рамках Недели науки НИУ «БелГУ», тематическая секция «Фармакология живых систем», Белгород, 2017. Апробация диссертации проведена на совместном заседании кафедры фармакологии и клинической фармакологии, НИИ Фармакологии живых систем НИУ «БелГУ».
Публикации. Положения диссертации опубликованы в 12 работах в центральной и местной печати, в том числе 3 – в изданиях, рекомендованных ВАК Министерства образования и науки Российской Федерации. По результатам диссертационного исследования подана 1 заявка на получение патента на изобретение РФ.
Личный вклад автора. Автором, под руководством научного руководителя, составлен дизайн и план исследования, проанализированы отечественные и зарубежные источники литературы. Автором лично проведена рандомизация животных, весь комплекс экспериментальных исследований с введение фармакологических агентов, выведением животных с дальнейшими биохимическими, иммунологическими и морфологическими исследованиями (при методологической помощи научного руководителя и консультантов), последующей математической и статистической обработкой результатов. Вклад автора является основным, заключается на всех этапах исследования.
Структура и объем работы. Диссертационная работа изложена на 190 страницах машинописного текста, иллюстрирована 18 таблицами, 56 рисунками. Работа состоит из введения, обзора литературы (глава 1), описания материалов и методов (глава 2), результатов собственных исследований (глава 3), заключения, выводов и списка литературы, содержащего 206 источников литературы, из них 73 отечественных и 133 зарубежных.
Фармакологическое действие смектитовых глин при пероральном применении. Свойства обогащенного ионами серебра монтмориллонита
Пероральное применение глин в лечении некоторых заболеваний основано на способности глины и глинистых минералов сорбировать, удерживать и элиминировать ксенобиотики, микроорганизмы и токсические продукты их деятельности, токсические продукты пищеварения, газы, пищевые аллергены. В ряде работ было показано позитивное воздействие препаратов на основе глинистых минералов в лечении ряда патологических состояний, главным образом при заболеваниях желудочно-кишечного тракта [107]. Употребление глины в качестве лекарственного средства, а также в качестве пищевой добавки имеет древнюю историю. Пероральное применение глин («геофагия») практикуется с древности во всех частях мира. Среди всего разнообразия глинистых минералов, в древности примитивными племенами в основном использовались глины с высоким содержанием монтмориллонита для предотвращения болей в желудке, расстройств пищеварения, лечения ожогов, уменьшения кислотности желудка, улучшения вкусовых качеств пищи [98, 119]. По сей день во многих областях мира глинистые минералы используются в пищу. Геофагия описана в южных частях Соединенных Штатов Америки, Африки и Азии и считается «приемлемой с культурной точки зрения» [204]. Существует несколько причин геофагии: 1. детоксикация или, по крайней мере, улучшение вкусовых качеств пищевых продуктов, содержащих нежелательные компоненты; 2. облегчение желудочно-кишечных расстройств, таких как диарея; 3. получение минеральных добавок, в частности железа и кальция; 4. в качестве антацида для снятия избыточной кислотности в пищеварительном тракте [202]. В целом из всех глин смектиты (включая монтмориллонит) считаются более реакционноспособными в желудочно-кишечном тракте [97].
Улучшение терапии состояний и заболеваний, сопровождающихся синдромом эндогенной интоксикации, является одной из социально значимых задач любой области медицины. В развитии синдрома эндогенной интоксикации особое место принадлежит нарушению функции микробиоценозов в различных биотопах человеческого организма. В некоторых областях медицины эффективность и проведение терапии основного заболевания зависит от состояния микрофлоры, её функционального состояния и нарушения её функций. К таким отраслям принадлежат главным образом гастроэнтерология, дерматология, эндокринология, аллергология, хирургия [59].
В последнее время появилась информация о процессах взаимодействия человеческого организма и микроорганизмов-комменсалов. Условно-патогенные микроорганизмы при некоторых неблагоприятных условиях способны вызывать различные патологические состояния. Поэтому, с точки зрения практической медицины, интерес представляет явление бактериальной транслокации. Так называют проникновение микроорганизмов из просвета желудочно-кишечного тракта во внутренние среды организма. Это происходит из-за влияния стрессовых воздействий, интоксикаций, иммунодефицита, поэтому принято считать бактериальную транслокацию патологическим процессом. Однако существует концепция защитного механизма бактериальной транслокации [56]. В ходе экспериментальных и клинических исследования было показано, что микроорганизмы-комменсалы способны проникать в кровь, лимфу, селезенку, лимфатические узлы, печень, накапливаться в очагах повреждения и выделять биологически активные вещества. В условиях желудочно-кишечного тракта сахаролитические микроорганизмы совместно с неперевариваемыми углеводами образуют энтеросорбент, способный связывать и элиминировать большую часть токсинов, поступающих и образующихся в желудочно-кишечном тракте [146]. По мнению некоторых исследователей дезинтоксикационная способность микрофлоры кишечника сопоставима с выраженностью печеночной детоксикации [25]. Показано, что ухудшение функционирования микрофлоры увеличивает нагрузку на печень, что ведет к повреждению гепатоцитов. Это приводит к развитию реактивного гепатита, неалкогольного стеатогепатоза, внутрипеченочному холестазу, дискинезии билиарного тракта [73]. Большой спектр клеточно-тканевых и внутрипросветных механизмов поддерживает состояние кишечной цитопротекции на высоком уровне и обеспечивает барьерные функции слизистой оболочки кишечника. Защитные механизмы оказывают перманентное действие, являются первичными и тесно связаны с нормальной микрофлорой кишечника [140].
Негативное влияние эндотоксемии, вызывающее снижение защитных факторов слизистой и нарушение целостности кишечного барьера, может быть компенсировано назначением энтеросорбентов, особенно на основе смектитовых глин, так как они обладают цитомукопротективным действием, образуя на поверхности слизистой оболочки ЖКТ защитную пленку.
Смектиты, в том числе монтмориллонит, при пероральном приеме обладают антацидным, противодиарейным, цитопротективным в отношении слизистой желудочно-кишечного тракта свойствами.
Повышенную кислотность в желудке, возникающую в результате избыточного образования соляной кислоты париетальными клетками фундальных желез желудка, можно эффективно уменьшить с помощью перорального использования несистемных антацидов, таких как энтеросорбенты на основе монтмориллонита. Глинистые минералы оказывают антацидный эффект посредством двух механизмов: непосредственная нейтрализация соляной кислоты в желудке и адсорбция ионов H+ на поверхности энтеросорбента. Антацидный эффект монтмориллонитовых глин обусловлен вторым механизмом, то есть сорбцией катионов водорода на поверхности, а также в межслоевом пространстве минерала. Основными центрами взаимодействия монтмориллонита и катионов водорода являются структурные катионы октаэдрического и тетраэдрического слоев (Mg2+, Al3+), а также межслоевое пространство и катионы расположенные в нем [94, 95].
Глины из группы смектита при пероральном применении оказывают стабилизирующее действие на барьерные функции слизистой оболочки желудочно-кишечного тракта, взаимодействуя непосредственно с элементами слизи. Тем самым глинистые минералы улучшают защиту слизистой от агрессивных факторов, действующих на слизистую желудочно-кишечного тракта [24, 139, 148].
Вступая во взаимодействие со слизью в желудочно-кишечном тракте, смектит образует на поверхности слизистой защитную пленку, уменьшающую агрессивное действие среды желудка. Кроме того он сорбирует газы, токсины, бактерии и вирусы. Механизм защитного действия заключается в увеличении вязкости слизи и торможении деградации гликопротеинов, входящих в её состав. Смектит уменьшает разрушение слизи бактериями и нарушение целостности мембран энтероцитов, что вызывает нормализацию водно-электролитного баланса и всасыванию нутриентов [64, 98]. На данный момент в России смектит является единственным энтеросорбентом с доказанными цитомукопротективными свойствами [67]. Кроме того, известно, что смектит изменяет жесткие соединения между клетками, тем самым улучшая клеточную адгезию, что приводит к усилению активности поджелудочной железы и кишечных ферментов и поддержанию целостности слизистой [205].
Диарея представляет собой острое или хроническое патологическое состояние, при котором наблюдается повышенное образование жидкости в просвете желудочно-кишечного тракта и его быстрая эвакуация естественным путем. Это проявляется учащенным жидким стулом, болями в животе, повышенным газообразованием. Диарея может быть вызвана бактериальной инфекцией, интоксикацией, неполноценной кишечной абсорбцией, аллергией и т.д. В связи с этим смектит широко используется для купирования диареи, сорбируя избыточную жидкость, газы, токсины бактерий в просвете желудочно-кишечного тракта, способствуя уменьшению воспаления в стенке тонкого и толстого кишечника [109, 148].
В условиях in vitro установлено, что смектит и псиллиум обладают наивысшей сорбционной способностью для Salmonella enteritidis и Escherichia coli. При этом результаты смектита были лучше не только по числу адсорбированных бактериальных клеток, но и по числу клеток, оставшихся в растворе после удаления сорбента [45]. В эксперименте была показана высокая сорбционная способность смектита и в отношении некоторых других грамположительных бактерий (Vibrio cholerae, Campylobacter jejuni, Clostridium difficile, Shigella sonnei), их токсинов и метаболитов, а также в отношении ротавируса. Смектит способен закреплять на своей поверхности и элиминировать до 90% вирусных частиц [67, 190, 197, 206].
В исследовании, в котором сравнивали сорбционную активность смектита и каолиновой глины по отношению к токсинам бактерий in vitro, было показано, что диосмектит адсорбирует энтеротоксины Escherichia coli и Vibrio cholerae более эффективно, чем каолиновая глина, особенно это было выражено при рН кишечника [93]. В исследовании in vitro с использованием токсикогенных штаммов Clostridium difficile и Clostridium perfringens обнаружено, что диосмектит способен связывать энтеротоксины каждого из этих штаммов. Кроме того, было обнаружено, что смектитовая глина не снижает активность метронидазола [198].
Монтмориллонитовые глины, обогащенные ионам серебра, обладают бактериостатическим и бактерицидным действием. Было исследовано влияние монтмориллонитовых глин на рост микроорганизмов Escherichia coli 987р, Salmonella dublin, Salmonella enteritidis, Staphylococcus hyicus р2, Staphylococcus аureus в широком диапазоне концентрации в мясопептонном агаре. Было показано, что серебряная форма монтмориллонита обладает бактериостатическим действием в концентрации 6,25 мг/мл и бактерицидным в концентрации 12,5 мг/мл. При этом натриевая, калиевая формы монтмориллонита, а также нативная монтмориллонитовая глина усиливали рост исследуемых микроорганизмов [2, 3].
Изучение дозозависимого противодиарейного эффекта энтеросорбента под лабораторным шифром Crim 04 на модели серотонин-индуцированной диареи
Согласно дизайна исследования серотонина гидрохлорид вводился однократно лабораторным мышам внутрибрюшинно в дозе 0,32 мг/кг через 30 минут после внутрижелудочного введения энтеросорбента под лабораторным шифром Crim_04 и препаратов сравнения.
Энтеросорбент под лабораторным шифром Crim_04 вводили однократно за 30 минут до моделирования острой диареи в дозах 880 мг/кг, 1660 мг/кг и 3320 мг/кг.
Согласно протокола исследования наблюдение за животными осуществлялось в течение 4 часов, после чего животные под наркозом выводились из эксперимента. На рисунке 3.1 представлен вид каловых масс различной консистенции в зависимости от уровня содержания в них жидкости.
Было установлено, что внутрибрюшинное введение серотонина гидрохлорида в дозе 0,32 мг/кг в течение 15 минут вызывало диарею у 100% животных с выраженным повышением содержания жидкости в каловых массах. Применение энтеросорбента под лабораторным шифром Crim_04, препарата «Смекта» и лоперамида значительно увеличивали время наступления диареи (рисунок 3.2).
Как видно из рисунка 3.2 применение энтеросорбента под шифром Crim_04 значительно задерживало наступление диареи. Этот эффект был наиболее выражен при применении энтеросорбента под шифром Crim_04 в дозе 3320 мг/кг. При этом диарея наступала более чем в 5,5 раза позже, чем в контрольной группе. Показатели энтеросорбента под лабораторным шифром Crim_04 в средней терапевтической дозе 1660 мг/кг достоверно не отличались от эффекта диоктаэдрического смектита в такой же дозе. Вместе с тем, энтеросорбент под лабораторным шифром Crim_04 и препарат «Смекта» значительно уступали по времени наступления диареи лоперамиду.
За время наблюдения был выполнены подсчет количества дефекаций и оценка влияния на этот показатель применения энтеросорбента на основе монтмориллонита под шифром Crim_04 в дозах 880 мг/кг, 1660 мг/кг и 3320 мг/кг в сравнении с препаратом «Смекта» и лоперамидом (рисунок 3.3).
Было выявлено, что введение серотонина гидрохлорида вызывает значительное увеличение количества дефекаций за указанный период времени по сравнению с группой интактных животных. Применение энтеросорбента под лабораторным шифром Crim_04 снижало количество дефекаций у мышей при моделировании серотонин-индуцированной диареи. Наиболее выраженным это влияние было при использовании субстанции в дозе 3320 мг/кг. Выраженность действия энтеросорбента под шифром Crim_04 в средней терапевтической дозе 1660 мг/кг достоверно не отличалось от противодиарейного эффекта «Смекты». Лоперамид значительно превосходил по сокращению количества дефекаций при моделировании острой серотонин-индуцированной диареи энтеросорбенты Crim_04 и «Смекта» и достоверно снижал количество дефекаций по сравнению с группой интактных животных.
Анализ консистенции каловых масс в зависимости от содержания в них жидкости и подсчета на его основе коэффициента выраженности диареи при моделировании серотонин-индуцированной диареи при применении энтеросорбента под лабораторным шифром Crim_04 в дозах 880 мг/кг, 1660 мг/кг и 3320 мг/кг представлен на рисунке 3.4.
При моделировании серотонин-индуцированной диареи было установлено значительное увеличение содержания в каловых массах жидкости, то есть наблюдалось увеличение количества дефекаций с преобладанием водянистых каловых масс. При внутрижелудочном введении энтеросорбента под лабораторным шифром Crim_04 наблюдалось уменьшение коэффициента выраженности диареи, заключенного в уменьшении содержания жидкости в каловых массах, дефекации были преимущественно влажными. Наиболее этот эффект выражен в группах животных, получавших энтеросорбент под шифром Crim_04 в дозе 3320 мг/кг. Энтеросорбент под лабораторным шифром Crim_04 в средней терапевтической дозе не уступает по противодиарейному эффекту относительно консистенции каловых масс противодиарейной активности препарата «Смекта». Лоперамид показывал более выраженный противодиарейный эффект. При его применении содержание жидкости в каловых массах приближалось к таковому в группе интактных животных.
Совокупные результаты изучения противодиарейной активности энтеросорбента под лабораторным шифром Crim_04 на модели серотонин индуцированной диареи по основным критериям, применявшимся в исследовании, а так же количество дефекаций по часам, показаны в таблице 3.1.
Морфологическое исследование
Морфологическое исследование включало в себя оценку микроскопической картины микропрепаратов тонкой кишки мышей, а так же измерение высоты ворсинок и их ширины у основания, глубины и ширины крипт и расчет отношения длины ворсинки к её ширине у основания и длины ворсинки к глубине крипт.
У животных контрольной группы с моделированием серотонин-индуцированной диареи наблюдались выраженные изменения структуры тонкой кишки. Макроскопически слизистая кишечника набухшая, отечная, розово-серого цвета, отдельными участками гиперемирована, главным образом на верхушках ворсинок. Поверхность слизистой оболочки покрыта слегка мутной, полужидкой слизью, которая хорошо смывается водой.
Микроскопически слизистая отечна, ворсинки отечны и гиперемированы.
Определяется укорочение и деформирование ворсинок. На концах некоторых ворсинок наблюдается слущивание эпителия с обнажением собственной пластинки слизистой. Определяется выраженная гипертрофия крипт.
Кровеносные сосуды слизистой и подслизистого слоя полнокровны. Мышечная и серозная оболочки кишечника без изменений. В просвете кишки большое количество слизи (рисунок 3.6). Эти изменения не были характерны для группы интактных животных (рисунок 3.5).
В группе животных, получавших энтеросорбент под лабораторным шифром Crim_04 в дозе 880 мг/кг на фоне серотонин-индуцированной диареи, патологические изменения в строении тонкого кишечника характеризовались наличием отека и умеренной гиперемии слизистой оболочки, единичными участками обнажения собственной пластинки слизистой, умеренное кровенаполнение сосудов слизистой и подслизистого слоя. Гипертрофия крипт. Мышечная и серозная оболочки без патологии.
Изучение сорбционной активности энтеросорбента под лабораторным шифром Crim 04 на модели изолированных петель тонкой кишки
Согласно дизайну исследования для эксперимента брали половозрелых крыс самцов линии Wistar массой 200±0,9 г. Моделирование острой диареи осуществляли путем формирования изолированных петель тонкого кишечника под наркозом. Для моделирования диареи использовали термолабильный холероподобный энтеротоксин E. coli в дозе 2 мкг на петлю в объеме 0,2 мл 0,9% раствор натрия хлорида. Энтеросорбент на основе монтмориллонита под лабораторным шифром Crim_04 и препарат «Смекта» в виде водных суспензий в концентрациях 50 мг/мл, 100 мг/мл и 200 мг/мл вводили в просвет петель кишечника в объеме 0,2 мл на петлю. В контрольной группе в петли кишечника вводили 0,9% раствор натрия хлорида. Наблюдение за животными осуществлялось в течение 4 часов от момента ушивания передней брюшной стенки. После чего животные под наркозом выводили из эксперимента с последующим взвешиванием и измерением длины петель кишечника и забором участков тонкого кишечника для морфологического исследования.
В результате исследования было выявлено, что введение в изолированные петли кишечника ТХЭТ в дозе 2 мкг на петлю вызывает повышенную экссудацию и накопление жидкости в просвете кишки, что выражается в возрастании величины индекса дилатации для этих петель в сравнении с контрольными петлями. Применение энтеросорбента на основе монтмориллонита под лабораторным шифром Crim_04 значительно уменьшает выраженность дилатации кишки под действием ТХЭТ, при этом этот эффект носит дозозависимый характер. Сорбционная активность энтеросорбента под шифром Crim_04 в различных дозах по отношению к термолабильному холероподобному энтеротоксину E. coli на модели изолированных петель тонкой кишки достоверно не отличается от сорбционной активности препарата «Смекта» (рисунок 3.25).
Установлено, что применение энтеросорбента под лабораторным шифром Crim_04 на модели изолированных петель тонкой кишки значительно уменьшает выраженность выхода жидкости в просвет кишки при воздействии термолабильного холероподобного энтеротоксина E. coli в дозе 2 мкг/петля. Этот эффект носил четкий дозозависимый характер, наибольшую активность энтеросорбент под шифром Crim_04 имел в концентрации суспензии 200 мг/мл. Активность энтеросорбента под шифром Crim_04 достоверно не отличалась от активности препарата «Смекта» (рисунок 3.26).
Морфологическое исследование
Морфологическое исследование включало в себя оценку микроскопической картины микропрепаратов тонкой кишки лабораторных крыс, а так же измерение высоты ворсинок и их ширины у основания, глубины и ширины крипт и расчет отношения длины ворсинки к её ширине у основания и длины ворсинки к глубине крипт.
При морфологическом изучении материала, полученном из контрольных петель кишечника, наблюдались выраженные изменения структуры тонкого кишечника. Макроскопически стенка кишки утолщена, слизистая кишечника набухшая, отечная, грязно-серого цвета, отмечаются участки гиперемии, точечных кровоизлияний, главным образом на верхушках складок. Поверхность слизистой оболочки покрыта мутной, жидкой слизью, которая хорошо смывается водой.
Микроскопически слизистая сильно отечна, ворсинки отечны и гиперемированы. Определяется укорочение и деформирование ворсинок, гипертрофия крипт. На концах ворсинок наблюдается слущивание эпителия с обнажением собственной пластинки слизистой, точечные кровоизлияния. Кровеносные сосуды слизистой и подслизистого слоя полнокровны. В подслизистом слое определяется выраженная лимфоидная инфильтрация. Мышечная и серозная оболочки кишечника без изменений. В просвете кишки большое количество слизи (рисунок 3.28). Эти изменения не были характерны для материала из интактных петель (рисунок 3.27).
У животных, которым в просвет кишки вводили энтеросорбент под лабораторным шифром Crim_04 в виде водной суспензии с концентрацией 50 мг/кг, патологические изменения в строении тонкого кишечника характеризовались наличием отека гиперемии слизистой оболочки, точечными кровоизлияниями в слизистую, единичными участками обнажения собственной пластинки слизистой, умеренным кровенаполнением сосудов слизистой и подслизистого слоя. Мышечная и серозная оболочки без патологии.
В материале, полученном из петель, в которые вводили энтеросорбент под шифром Crim_04 в виде суспензии с концентрацией 100 мг/мл на модели изолированных петель тонкой кишки, патологические изменения тонкой кишки заключались в отеке слизистой оболочки, гиперемии слизистой, кровоизлияний не наблюдалось. Явления слущивания эпителия были умеренными, встречались единичные участки обнажения собственной пластинки слизистой оболочки. Кровенаполнение сосудов слизистой оболочки и подслизистого слоя было умеренным. Мышечный слой и серозная оболочка без патологических изменений.
В препаратах от животных при применении энтеросорбента под шифром Crim_04в концентрации суспензии 200 мг/мл на модели изолированных петель тонкой кишки наблюдали слизистую обычного строения, отека не было, участки гиперемии не встречалось. Подслизистый слой обычного строения. Сосуды умеренно полнокровны. Мышечная и серозная оболочки без патологии (рисунок 3.29).
При проведении морфометрических исследований было установлено, что в препаратах интактных петель длина и ширина ворсинок слизистой, а также глубина и ширина крипт находилась в пределах нормы, что свидетельствовало об отсутствии отека слизистой оболочки и подслизистого слоя и сохранения слизистой нормальных сорбционных свойств. В контрольных петлях на модели изолированных петель тонкой кишки выявлены значительные изменения размеров ворсинок и гипертрофия крипт с уменьшением высоты ворсинок в 2,3 раз по сравнению с интактными животными, увеличение ширины ворсинок у основания в 1,3 раза, глубины крипт в 1,2 раза и ширины крипт в 1,3 раза. Применение энтеросорбента под шифром Crim_04 в виде суспензии с концентрацией 200 мг/мл значительно улучшало гистологическую картину тонкой кишки, приближая морфометрические показатели к уровню интактных животных. Энтеросорбент под шифром Crim_04 в виде водной суспензии с концентрацией 200 мг/мл значительно увеличивал отношение длины ворсинки к её ширине у основания, а также отношение длины ворсинки к глубине крипт, достигая по этому показателю уровня интактных животных. Это свидетельствует о значительном уменьшении отека, предотвращения развития деформации структурных элементов слизистой оболочки и сохранения её функции (рисунок 3.30, таблица 3.7).
Экспериментальное изучение эффективности применения энтеросорбента под лабораторным шифром Crim 04 при остром панкреатите
Согласно дизайну исследования острый панкреатит моделировался путем внутрибрюшинного введения раствора L-аргинина в фосфатном буфере (pH=6,8) в дозе 1,5 г/кг однократно. Интактным животным внутрибрюшинно вводилось эквиобъемное количество 0,9% раствора натрия хлорида. Энтеросорбент под лабораторным шифром Crim_04 в дозах 385 мг/кг, 770 мг/кг, 1500 мг/кг в виде водных суспензий вводились одновременно с L-аргинином и затем каждые 12 часов суммарно в количестве 4 раз крысам внутрижелудочно. Крысам в контрольной группе внутрижелудочно вводили эквиобъемное количество 0,9% раствора натрия хлорида.
Согласно протокола животные выводились из эксперимента под наркозом через 72 часа после индукции острого панкреатита.
Установлено, что после внутрибрюшинного введения L-аргинина в дозе 1,5 г/кг летальность в контрольной группе в первые сутки составила 35%. Выжившие животные на протяжении эксперимента были вялые, гиподинамичные, шерсть была взъерошена, на прикосновение животные реагировали вокализацией. Отмечено резкое снижение потребление корма и увеличение потребление жидкости. При биохимическом исследовании была выявлена очень высокая активность амилазы сыворотки крови животных. В контрольной группе активность амилазы была в 8,5 раз больше, чем в группе интактных животных, что свидетельствует о развитии у животных острого панкреатита. Кроме того индукция острого панкреатита приводила к повышению активности трансаминаз, повышению уровня триглицеридов и глюкозы плазмы крови (таблица 3.16).
Установлено, что энтеросорбент на основе монтмориллонита под лабораторным шифром Crim_04 значительно нивелирует биохимические сдвиги происходящие при моделировании острого L-аргинин-индуцированного панкреатита у крыс. Применение энтеросорбента под лабораторным шифром Crim_04 значительно уменьшает активность амилазы сыворотки крови (на 56,3%), активность АсАТ и АлАТ (на 67,0% и 33,8% соответственно), ведет к уменьшению уровней триглицеридов и глюкозы (на 58,6% и 41,5% соответственно) в сыворотке крови крыс.
Эти изменения свидетельствуют об уменьшении воспалительного, цитолитического и метаболического синдромов, сопровождающих острый панкреатит. При этом эффект энтеросорбента на основе монтмориллонита под шифром Crim_04 носил дозозависимый характер, наиболее выраженный в дозе 1500 мг/кг. Кроме того применение энтеросорбента под шифром Crim_04 в дозе 1500 мг/кг приводило к снижению летальности в первые сутки до 15%. Энтеросорбент «Смекта» в сопоставимых дозах показывал сходные результаты.
Динамика биохимических показателей при моделировании L-аргинин-индуцированного панкреатита на фоне применения энтеросорбента под лабораторным шифром Crim_04 в дозе 1500 мг/кг относительно интактной группы представлено на рисунке 3.49.
Морфологическое исследование
После выведения из эксперимента при лапаротомии были выявлены вздутие кишечника, в брюшной полости определяется умеренное количество серозного выпота, у некоторых животных с геморрагическим компонентом. Поджелудочная железа отечна. Было произведено определение массы поджелудочной железы с целью расчета её относительной массы. Кроме того было произведено определение относительного содержания жидкости в поджелудочной железе (таблица 3.17).
Из таблицы видно, что индуцирование острого панкреатита приводило к одновременному снижению массы тела крыс и увеличению массы поджелудочной железы на 53,3% относительно группы интактных животных. Содержание жидкости в поджелудочной железе значительно возрастало в контрольной группе животных, это свидетельствует о развитии отека поджелудочной железы. Эти изменения были менее выражены при применении энтеросорбента под шифром Crim_04. В группе животных, получавших энтеросорбент под лабораторным шифром Crim_04 в дозе 1500 мг/кг, масса тела животных составила 97,8% от массы интактных животных, что на 5,6% больше, чем в контрольной группе. Относительная масса поджелудочной железы на 31,1% меньше, чем в контрольной группе. Содержание жидкости в поджелудочной железе в группе животных, принимавших энтеросорбент под шифром Crim_04 в дозе 1500 мг/кг достоверно снижалось относительно контрольной группы и приближалось к показателям интактной группы (р 0,05).
При гистологическом исследовании было выявлено, что при индукции острого панкреатита внутрибрюшинным введением L-аргинина в дозе 1,5 г/кг в ткани поджелудочной железы наблюдается выраженный отек как внутридольковый, так и междольковый, крупные и умеренные очаги некроза ациноцитов, точечные кровоизлияния, выраженная очаговая лейкоцитарная инфильтрация, островки Лангерганса разного калибра (рисунок 3.50, Б). В группе интактных животных поджелудочная железа сохраняла типичное строение (рисунок 3.50, А).
При применении энтеросорбента под шифром Crim_04 в дозе 385 мг/кг ткань поджелудочной железы была отечна, определяются очаги некроза ациноцитов, очаговая воспалительная инфильтрация, островки Лангерганса разного калибра, участков кровоизлияний зафиксировано не было (рисунок 3.50, В).
В микропрепаратах ткани поджелудочной железы животных, получавших энтеросорбент под шифром Crim_04 дозах 770 мг/кг и 1500 мг/кг, определялся умеренный отек интерстиция, умеренная лейкоцитарная инфильтрация, очаги некроза ациноцитов были единичными и малыми по площади, кровоизлияний не было, островки Лангерганса обычного строения (рисунок 3.50, Г, Д).
Для оценки выраженности и тяжести повреждения поджелудочной железы использовали шкалу повреждения поджелудочной железы. Отмечено, что при моделировании острого панкреатита внутрибрюшинным введением L-аргинина происходит увеличение показателя шкалы. При применении энтеросорбента под шифром Crim_04 происходит достоверное снижение показателя шкалы повреждения поджелудочной железы. Наиболее это влияние выражено в группах крыс, принимавших энтеросорбент Crim_04 в дозах 770 мг/кг и 1500 мг/кг (таблица 3.18).