Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 14
1.1. Современные подходы к применению наружных лекарственных форм для фармакотерапии раневого процесса 14
1.2. Фармакологические свойства хитозана и его применение в медицине 26
1.3. Таурин – фармакологическое действие и перспективы применения для лечения ран 32
1.4. Аллантоин – свойства и применение в медицине 41
Резюме 48
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования
2.1. Объекты исследований 52
2.2. Сведения о препаратах сравнения 52
2.3. Реактивы, использованные в исследованиях 53
2.4. Технологические и физико-химические методы исследования 55
2.5. Токсикологические методы исследования..
2.5.1. Методы изучения накожной острой токсичности 57
2.5.2. Методы изучения накожной субхронической токсичности 58
2.5.3. Методы изучения местнораздражающего действия 59
2.6.Методы исследования специфической активности
2.6.1. Модель плоскостной полнослойной кожной раны 62
2.6.2. Модель линейной кожной раны 64
2.6.3.Модель термического ожога кожи
2.6.4. Метод изучения капилляропротекторного действия на модели выхода трипанового синего в место воспаления 67
2.6.5. Метод изучения противовоспалительного действия на модели отека лапы крыс. 68
2.7. Лабораторные методы исследования 69
2.8. Патологоанатомические и гистологические методы исследования 70
2.9. Методы статистической обработки данных 71
ГЛАВА 3. Исследования по разработке геля хитозана с таурином и аллантоином 73
3.1. Физико-химический анализ совместимости компонентов состава геля с использованием метода ИК-спектроскопии 73
3.2. Реологические исследования 74
3.3. Биофармацевтические исследования in vitro 76
3.4. Разработка технологии и технологической блок-схемы 77
3.5. Оценка качества и изучение стабильности геля 78
Резюме 80
ГЛАВА 4. Токсикологические исследования геля хитозана с таурином и аллантоином 81
4.1. Исследование накожной острой токсичности 81
4.2. Исследование накожной субхронической токсичности 84
4.3. Изучение местнораздражающего действия
4.3.1. Метод накожных аппликаций 92
4.3.2. Конъюнктивальная проба 93
4.3.3. Оценка кожно-резорбтивного действия 96
Резюме 97
ГЛАВА 5. Фармакологические исследования ранозаживляющего геля хитозана с таурином и аллантоином 98
5.1. Сравнительная оценка влияния геля хитозана с таурином и аллантоином на процесс заживления плоскостной полнослойной раны у мышей 98
5.2. Сравнительная оценка ранозаживляющего действия геля хитозана с таурином и аллантоином на модели линейной раны у крыс 111
5.3. Оценка противоожогового действия геля хитозана с таурином и аллантоином на модели термического ожога кожи 116
5.4. Изучение противовоспалительного действия геля хитозана с таурином и аллантоином на модели отека лапы крыс 126
5.5. Изучение капилляропротекторного действия геля хитозана с таурином и аллантоином в тесте выхода трипанового синего в место воспаления 130
Резюме 132
Обсуждение результатов исследования 134
Заключение 138
Выводы 139
Список литературы
- Фармакологические свойства хитозана и его применение в медицине
- Реактивы, использованные в исследованиях
- Биофармацевтические исследования in vitro
- Конъюнктивальная проба
Введение к работе
Актуальность темы исследования. Каждый десятый житель России
ежегодно получает ранения различной степени тяжести, поэтому лечение и уход
за ранами различной этиологии продолжает оставаться актуальной задачей
современной медицины, что связано с повышением уровня военного, бытового,
спортивного, производственного травматизма (Абаев Ю.К., 2006; Блатун Л.А,
2011). На территории Российской Федерации в настоящее время
зарегистрировано более 1000 лекарственных препаратов для местного лечения ран, однако далеко не все они отвечают требованиям предъявляемым к современным ранозаживляющим средствам (Чернецкая Ю.Г., 2009; Бесчастнов В.В., 2011; Привольнев В.В., 2011; Скрябин К.Г., 2013; Грищук О.Л., 2013).
Для лечения ран предпочтительно использование комбинированных
препаратов для местного применения, проявляющих синергизм действующих
веществ и основы в различных лекарственных формах – аэрозоли, мази, пасты,
гели, линименты, растворы. Согласно последним данным научной литературы для
лечения ран и ожогов предпочтительно использование гелей так как они имеют
ряд преимуществ по сравнению с другими лекарственными формами: не
нарушают жидкостный баланс и газообмен; имеют pH от 4,0 до 6,0, близкий к pH
кожи; легко наносятся и равномерно распределяются по поверхности; способны
связывать экссудат, предотвращают обратную миграцию микроорганизмов в
рану; проявляют охлаждающее действие за счет испарения воды; способствуют
процессам грануляции и эпителизации; хорошо высвобождают действующие
вещества из основы, обеспечивают глубокое проникновение в ткани, увеличивают
продолжительность действия активных компонентов и эффективны в течение 18-
24 ч (Лукманова К.А., 2004; Зиновьев Е.В., 2014). Среди множества гелевых основ
особое внимание уделяется природным биополимерам, таким как хитозан,
получаемый из панцирей ракообразных. Он поддерживает влажную среду и
газообмена в ране, обеспечивает создание кислой среды, способствующей
репаративным процессам, проявляет антибактериальное и антиоксидантное
действие (Довгилева О.М., 2007; Dai T., 2011; Francesko А., 2011; Володько А.В.,
2014; Azuma K., 2015). Отдельные экспериментальные доклинические
исследования показали, что перспективным веществом для лечения ран является
таурин (2-аминоэтансульфоновая кислота), так как по данным отдельных
экспериментальных исследований он обладает антиоксидантным,
противовоспалительным, ангиопротекторным, мембраностабилизирующим,
осморегулирующим действием. Его местное применение увеличивает прочность
раневого рубца на разрыв, понижает уровень малонового диальдегида и
гистамина в раневой ткани (Dincer S., 1996; Degim Z., 2002; Макарова Л.М., 2014).
Одним из перспективных компонентов является аллантоин – низкомолекулярное
гетероциклическое соединение, оказывающее ранозаживляющий эффект
посредством стимуляции пролиферации фибробластов и синтеза внеклеточного матрикса, что приводит к формированию малозаметного рубца (Shestopalov A.V., 2006; Araujo L.U., 2010; Becker L.С., 2010; Szymanska E., 2012; Tosti, A., 2013). В
связи с вышеизложенными, актуальным направлением исследования является разработка рационального и эффективного ранозаживляющего средства, содержащего хитозан, таурин и аллантоин в лекарственной форме гель для наружного применения, превосходящего существующие аналоги и отвечающего большинству современных требований к препаратам для лечения ран, что в итоге позволит расширить ассортимент ранозаживляющих лекарственных препаратов на фармацевтическом рынке России.
Степень разработанности темы исследования. За последнее десятилетие проведено множество исследований посвященных разработке и изучению различных комбинаций местных ранозаживляющих средств (Спасов А.А., 2009; Гребнева О.Л., 2010; Кузнецова М.И., 2010; Володина Т.А., 2011; Оболенский В.Н., 2013). Многочисленные данные экспериментальных и клинических исследований свидетельствуют о том, что включение в современные лекарственные формы биодеградируемых полимеров, новых регенерантов-репарантов, антиоксидантов и их комбинаций является перспективным (Демьяненко И.А., 2012; Зиновьев Е.В., 2014; Azuma К., 2015). К настоящему времени достаточно изучены фармакологические свойства таурина, аллантоина и хитозана, при этом сведения о том, что каждый из них способствует ускорению течения раневого процесса получены только лишь в ходе экспериментальных исследований (Peng S., 2011; Suzuk S., 2011; Huang S., 2014; Rafiee S, 2014). Однако, в РФ отсутствует фармакопейная статья на хитозан, он не является компонентом лекарственных препаратов и не используется в качестве основы для местных лекарственных форм. Аллантоин входит в состав некоторых комбинированных лекарственных препаратов для местного применения, таких как: раствор «Йокс» (Айвэкс Фармасьютикалс с.р.о., Чешская Республика), гель «Контрактубекс» (Mерц Фарма ГмбХ и Ко.КГаА, Германия), мазь «Гепатромбин» (Хемофарм А.Д., Сербия). Таурин в настоящее время применяется внутрь в виде таблеток «Дибикор», ООО Пик-Фарма, Россия) при заболеваниях сердечнососудистой системы и сахарном диабете, а так же местно в форме глазных капель (глазные капли «Тауфон», ФГУП Московский эндокринный завод, Россия) при заболеваниях глаз дистрофического характера.
К настоящему времени исследований по разработке комбинированной лекарственной формы – гель, содержащий хитозан с таурином и аллантоином, позволяющей значительно ускорить течение раневого процесса не проводилось. Для решения данной проблемы необходимо определить совместимость входящих в состав геля компонентов, оценить его безопасность, влияние на течение раневого и ожогового процесса.
Цель исследования: разработать гель, содержащий хитозан, таурин и аллантоин, изучить его ранозаживляющие свойства в экспериментальных доклинических исследованиях на лабораторных животных.
Задачи исследования:
1. Определить физико-химическую совместимость высокомолекулярного хитозана, таурина, аллантоина и научно обосновать оптимальный состав ранозаживляющего геля. По критерию максимальной эффективности в
сравнительном скрининговом исследовании выбрать оптимальную
концентрацию таурина и аллантоина на модели плоскостной полнослойной кожной раны у мышей, на основании реологических, биофармацевтических исследований установить оптимальную концентрацию хитозана в геле.
-
Исследовать острую, субхроническую накожную токсичность и местнораздражающее действие разработанной лекарственной формы у экспериментальных животных.
-
Провести сравнительную оценку эффективности геля хитозана с таурином и аллантоином, геля «Солкосерил» и мази «Левомеколь» при лечении плоскостной полнослойной кожной раны у мышей на основании результатов измерения площади ран и гистологических исследований, а также при лечении линейной раны у крыс на основании результатов ранотензиометрии, гематологических и биохимических исследований.
-
Изучить влияние геля хитозана с таурином и аллантоином на течение ожогового процесса у крыс по результатам определения ранозаживляющего действия, данным гематологических, биохимических, гистологических исследований в сравнении с гелем «Солкосерил».
-
Выявить дополнительные фармакологические свойства геля хитозана с таурином и аллантоином в экспериментах по исследованию капилляропротекторного и противовоспалительного действия.
Научная новизна исследования. Впервые на основании
фармакологических, реологических, биофармацевтических исследований
разработан оптимальный состав геля хитозана с таурином и аллантоином (Патент
РФ № 2611400 «Ранозаживляющий гель для наружного применения», опубл.
21.02.17). Гель отличается тем, что содержит 4% таурина, 1% хитозана, 0,5%
аллантоина, 0,5% уксусной кислоты и воду очищенную. Впервые было
установлено, что гель хитозана с таурином и аллантоином является
малотоксичным (IV класс токсичности), способствует относительно контроля
повышению прочности рубца на разрыв в 1,5 раза, при этом на 8 сутки
превосходит гель «Солкосерил» на 31,2%, обеспечивая уменьшение
неспецифических признаков воспаления и интоксикации. Он превосходит мазь «Левомеколь» и гель «Солкосерил» по ранозаживляющему действию на 9 сутки на 40,24% и 25,38% соответственно, способствуя уменьшению площади ран. При нанесении на ожоговую рану гель вызывает полное заживление ран на 5 суток раньше при сравнении с контрольной группой, превосходит гель «Солкосерил» по эффективности на 28,5% по критерию периода полузаживления. Применение геля хитозана с таурином и аллантоином обеспечивает достоверное уменьшение проницаемости капилляров в тесте выхода трипанового синего не менее чем на 40,0% относительно контрольной группы. Предварительное нанесение геля ХТА приводит к достоверному уменьшению отека конечности, вызванного введением формалина через 180 минут на 16,6% относительно контроля.
В целях проведения ранотензиометрических исследований для оценки ранозаживляющей эффективности геля было разработано устройство (Патент РФ № 163084 «Механический ранотензиометр», опубл. 10.07.16). Для изучения
противоожогового действия геля было разработано устройство (Заявка на выдачу патента РФ № 2016147428 «Устройство для моделирования экспериментальных термических ожоговых ран различных степеней», заявл. 02.12.2016.).
Теоретическая и практическая значимость работы. Впервые в ходе
технологических исследований выявлено отсутствие физико-химической
несовместимости компонентов и подобран оптимальный состав геля, содержащего хитозан, таурин и аллантоин. С фармакологической точки зрения, теоретическая значимость работы состоит в том, что нами подтверждены ранозаживляющие, противовоспалительные и капилляропротекторные свойства каждого из компонентов разработанного геля в отдельности – высокомолекулярного хитозана, таурина и аллантоина. При этом на модели плоскостной полнослойной раны, модели отека лапы крыс и модели выхода трипанового синего в место воспаления впервые выявлено, что совместное применение всех указанных компонентов в составе геля значительно более эффективно, чем использование каждого из них по отдельности, что позволяет придти к заключению о наличии аддитивного эффекта комбинации веществ в составе лекарственной формы гель. Практическая значимость работы заключается в том, что гель хитозана с таурином и аллантоином проявляет выраженные ранозаживляющие и противоожоговые свойства и значительно сокращает сроки заживления ран и ожогов, превосходит по эффективности мазь «Левомеколь» и гель «Солкосерил» по критерию периода полузаживления раны, оказывает сходный по степени выраженности с гелем «Троксевазин» капилляропротекторный эффект и несколько менее выраженный противовоспалительный эффект по сравнению с гелем «Вольтарен эмульгель».
Методология и методы диссертационного исследования. При
проведении экспериментальных исследований соблюдали методические
рекомендации Руководства по проведению доклинических исследований
лекарственных средств, части первой (Миронов А.Н., 2012). Исследования
проведено на базе фармацевтического факультета ФГБОУ ВО «Воронежский
государственный университет» на белых беспородных конвенциональных
половозрелых мышах, крысах, морских свинках обоего пола. Методологический
подход был основан на выполнении комплекса теоретических,
фармакологических, токсикологических, гистологических, статистических,
физико-химических, биофармацевтических, реологических методов, что
обеспечило разработку оптимального, безопасного и эффективного
ранозаживляющего средства в лекарственной форме гель.
Дизайн исследования составлен с соблюдением норм и правил этических принципов экспериментов над животными с учетом требований Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях, и в полной мере отражает структуру диссертационной работы.
Положения, выносимые на защиту:
1. Компоненты в составе геля, содержащего высокомолекулярный хитозан, таурин и аллантоин являются физико-химически совместимыми.
2. Каждый из компонентов геля – хитозан, таурин и аллантоин – в
отдельности обладает ранозаживляющим действием, на модели плоскостной
полнослойной раны установлены эффективные ранозаживляющие
концентрации таурина – 4,0% и аллантоина – 0,5%. На основании
реологических и биофармацевтических исследований в лекарственной форме
гель установлено оптимальное содержание хитозана – 1,0%.
3. Гель хитозана с таурином и аллантоином является низкотоксичным (IV
класс токсичности).
-
Гель хитозана с таурином и аллантоином эффективен при лечении плоскостной полнослойной раны у мышей и линейной раны у крыс, превосходя по эффективности мазь «Левомеколь» не менее чем на 40% и гель «Солкосерил» на 25%.
-
Гель хитозана с таурином и аллантоином эффективен при лечении термического ожога кожи у крыс, способствуя полному заживлению на 5 суток раньше по сравнению с контролем.
-
Гель хитозана с таурином и аллантоином при местном применении проявляет противовоспалительные и капилляропротекторные свойства средней степени выраженности.
Степень достоверности полученных результатов. Достоверность
полученных результатов базируется на использовании современных методов,
приборов и устройств для проведения технологических, физико-химических,
биохимических, гематологических и гистологических исследований,
достаточном объеме проведенных экспериментов, репрезентативности выборки (381 особь лабораторных животных, не менее чем по 6 особей в группе) и статистической обработке полученной информации с использованием параметрических критериев (t-критерий Стъюдента) и непараметрических критериев (критерий Вилкоксона и U критерий Манна-Уитни).
Апробация результатов. Основные положения диссертации
представлены на региональных, всероссийских и международных научных
конференциях, ежегодных научных сессиях ФГБОУ ВО «Воронежского
государственного университета» с 2014 г. по 2017 г.; «Фундаментальная наука и
клиническая медицина – человек и его здоровье», г. Санкт-Петербург, 2016;
«Молодежь и медицинская наука в XXI веке», Киров, 2016; «Пути и формы
совершенствования фармацевтического образования. Создание новых
физиологически активных веществ», Воронеж, 2016; «Инновационные технологии на базе фундаментальных научных разработок – прорыв в будущее», Воронеж, 2014; «Всероссийская Бурденковская научная конференция», Воронеж, 2014; «Инновационные разработки молодых ученых Воронежской области на службу региона», Воронеж, 2015; «Современные аспекты использования растительного сырья и сырья природного происхождения в медицине», Москва, 2017. Апробация диссертации проведена на межкафедральном заседании фармацевтического факультета ФГБОУ ВО ВГУ (протокол № 1503-08а от 22.03.2017).
Публикации. Основные положения диссертации опубликованы в 14 печатных работах и содержат полный объем информации по теме диссертации, в том числе 4 статьи в изданиях рекомендуемых ВАК Министерства образования и науки РФ. По результатам исследования получен 1 патент РФ на изобретение, 1 патент РФ на полезную модель.
Личный вклад автора. Автором самостоятельно проведен анализ литературных данных по теме диссертации, под руководством научного руководителя составлен план и дизайн исследования. Автором лично проведены все исследования по разработке лекарственной формы, все экспериментальные исследования на 381 лабораторном животном с последующей статистической обработкой полученных данных и анализом результатов исследования. Морфологические, биохимических, гематологические исследований проведены при непосредственном личном участии автора. Автором лично подготовлены для публикации все основные печатные работы, включая патенты, написана рукопись диссертации и автореферата. Вклад автора является основным и заключается в участии на всех этапах исследования.
Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 172 страницах текста компьютерной верстки, проиллюстрирована 23 таблицами, 23 рисунками. Работа состоит из введения, обзора литературы (глава 1), описания материалов и методов (глава 2), результатов собственных исследований (глава 3-5), их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы включающего 219 источников литературы, из них 141 отечественных и 78 зарубежных. В работе имеется 4 приложения на 12 страницах.
Фармакологические свойства хитозана и его применение в медицине
Вместе с тем следует подчеркнуть, что широко используемые мягкие лекарственные формы применяемые для лечения ран на липофильной основе, в настоящее время считаются малоэффективными, так как они не обладают осмотической активностью, нарушают отток экссудата, создают парниковый эффект в ране, действующие вещества входящие в состав их липофильной основы слабо диффундируют в ткани раны. В основном такие препараты эффективны только при лечении чистых ран в фазу регенерации [109]. Устраняю эти недостатки местные лекарственные формы, в которых действующие вещества растворены в гидрофильной основе [46]. В данном случае одним из возможных подходов является разработка гелей, так как они не нарушают жидкостный баланс, газообмен в ране, способны уменьшать вязкость при механическом воздействии (тиксотропность), легко наносятся, равномерно распределяются по поверхности кожи, хорошо высвобождают действующие вещества из основы и обеспечивают глубокое проникновение в ткани, увеличивают продолжительность действия активных компонентов и эффективны в течение 18-24 ч, способны связывать экссудат, предотвращают обратную миграцию микроорганизмов в рану, проявляют охлаждающее действие за счет испарения воды, а также способствуют процессам грануляции и эпителизации, обладают микробиологической, химической устойчивостью. По сравнению с мазями на липофильной основе гели имеют pH от 4,0 до 6,0, близкий к pH кожи, что способствует подавлению роста бактерий и усилению роста фибробластов [187, 204]. В состав гелей возможно включение практически любых гидрофильных и гидрофобных лекарственных веществ [108]. Кроме того, по сравнению с повязками, они атравматичны, что крайне важно в плане отсутствия отрицательного психо-эмоционального воздействия на больного [82, 104]. Гели в настоящее время широко применяют для оказания первой помощи при ранениях, при этом для обеспечения полноценной регенерации, их нанесение должно осуществляться в соответствии с фазами раневого процесса [1, 100, 109, 110].
Более 30 лет назад на смену мазям на липофильной основе пришли гидрофильные мази на основе полиэтиленгликолей (ПЭГ), которые имеют ряд преимуществ: основа является физиологически индифферентной, хорошо высвобождает действующие компоненты, смешивается с раневым экссудатом, осмотический эффект наблюдается в течение 18-20 ч, обладает дегидратирующим действием, проявляет солюбилизируюее действие, что способствует проникновению лекарственных веществ в глубину тканей, кроме того возможно применение таких мазей на всех фазах течения раневого процесса [25, 109]. Лечение гнойных ран число которые в настоящее время составляет 35-40% от общего количества хирургических пациентов является актуальным, поэтому необходимо проводить первичную хирургическую обработку ран с последующим использованием антисептических растворов [1, 12, 46, 100, 101, 110, 130, 217]. Наиболее широко используемыми, малотоксичными, универсальными антисептическими средствами являются «Хлоргексидин» (ООО БиоФармКомбинат, Россия), бензилдиметил [3-(миристоиламино) пропил]аммоний хлорид моногидрат (например, препарат «Мирамистин» (ООО Инфамед, Россия)), повидон-йод+калия йодид (например, препарат «Йодопирон» (ООО ЮжФарм, Россия)), однако синтетические средства не всегда способны оказать воздействие на раневую микрофлору [41, 109].
Важнейшими принципами местной фармакотерапии раневого процесса в I фазе являются обеспечение антибактериального и противовоспалительного действия, поддержание влажной среды в ране, ускорение репаративных процессов. Вместе с тем имеющиеся на рынке ранозаживляющие средства обладают рядом преимуществ и недостатков, например мазь «Банеоцин» (Сандоз ГмбХ, Австрия), содержит неомицин и бацитрацин, применяется для профилактики и лечения инфекции в послеоперационном периоде, одной из особенностей данной мази является отсутствие абсорбции действующих веществ и при этом создание высоких концентраций в коже, при этом средство не оказывает обезболивающего и некролитического действия [100].
Широко применяются многокомпонентные гидрофильные мази на основе ПЭГ, содержащие антибиотик хлорамфеникол и репарант метилурацил «Левомеколь», «Левосин» (ОАО Нижфарм, Россия), однако известно, что хлорамфеникол способен вызывать агранулоцитоз и апластическую анемию.
Гидроксиметилхиноксилиндиоксид входит в состав известной мази «Диоксидин» (ОАО Нижфарм, Россия), проявляет антибактериальное действие, ПЭГ основа обеспечивает пролонгированный осмотический эффект, способствует оттоку экссудата, обеспечивает формирование сухого струпа и снижение микробной контаминации, при этом средство не оказывает обезболивающее и охлаждающее действие [41, 104, 109].
Известный препарат отечественного производства «Стелланин-ПЭГ» (ООО Фармпрепарат, Россия), содержащий диэтилбензимидазолия трийодид, проявляет антибактериальный эффект за счет высвобождения активного йода, наряду с этим обладает противовоспалительным действием и высоким осмотическим потенциалом, что обеспечивает эффективность при лечении гнойных ран за счет эвакуации гнойного отделяемого из раневого дефекта, однако известно, что йод способен повреждать грануляционную ткань [12]. Мазь «Офломелид» (ООО МС ВИТА, Россия) на основе ПЭГ, содержит лидокаин и офлоксацин, оказывает регенерирующее, противомикробное, местноанестезирующее, противовоспалительное действие, однако препарат не улучшает регионарный кровоток и не проявляет антиоксидантной активности [25, 109]. Одной из широко используемых современных гидрофильных мазей на основе ПЭГ является мазь «Бактробан» (Глаксо Оперэйшенс Великобритания Лимитед, Великобритания), содержит антибиотик местного действия мупироцин и применяемая для профилактики раневой инфекции после небольших порезов, ран и ссадин, при этом средство не оказывает противовоспалительное и обезболивающее действие.
Кроме того, в клинической практике для лечения инфицированных ран широко используют препараты серебра (растворы солей серебра, комплексные соединения серебра, коллоидное серебро), препараты, содержащие сульфадиазин серебра: кремы – «Дермазин» (Лек д.д., Словения), «Аргедин» (АО Босналек, Босния и Герцеговина), мази – «Сульфаргин» (Таллиннский фармацевтический завод, Эстония), «Эбермин» (Центр Генной Инженерии и Биотехнологии, Куба). В ране сульфадиазин серебра диссоциирует, высвобождая ионы серебра, обладающие широким спектром антибактериального действия. Данные препараты имеют гидрофильно-эмульсионную основу и применяются для лечения инфицированных, поверхностных ран со слабой экссудацией. Крем «Аргосульфан» (Фармзавод Ельфа А.О., Польша) имеет в составе сульфатиазол серебра и широко применяется для лечения гнойных ран, при этом перечисленные средства не оказывают охлаждающее и некролитическое действие [41].
Реактивы, использованные в исследованиях
ИК-спектроскопию осуществляли при помощи аппарата Vertex 70 (Bruker Optik GmbH, Германия), в диапазоне 4000-1000 см-1, с последующим анализом полученных ИК спектров поглощения исследуемых веществ по отдельности и в смеси, пробоподготовка проводилась в соответствии с требованиями ОФС.1.2.1.1.0002.15 «Спектрометрия в инфракрасной области» ГФ XIII, с обработкой данных в программах OMNIC 7 и Origin 8.1 [29, 120].
Потенциометрическое определение рН
Определение pH водных извлечений гелей хитозана с таурином и аллантоином осуществляли в соответствии с требованиями ОФС.1.2.1.0004.15 «Ионометрия» ГФ XIII и ГОСТ 29188.2-91 «Метод определения водородного показателя, рН», используя Универсальный иономер ЭВ-74 (Завод измерительных приборов, Беларусь) [26, 29].
Реологические исследования
Основными реологическими показателями при производстве, оценке качества и хранении мягких лекарственных форм являются: динамическая вязкость (г, Пас), напряжение сдвига (т, Па). Исследования гелей осуществляли на ротационном вискозиметре Rheotest-II (MLW, Германия) в соответствии с требованиями ОФС.1.2.1.0015.15 «Вязкость» ГФ XIII [139].
Биофармацевтические методы
Определение скорости и полноты высвобождения таурина и аллантоина из разработанной лекарственной формы осуществляли in vitro методом равновесного диализа по Крувчинскому. В качестве модели полупроницаемой мембраны использовали лецитиновую мембрану, изготовленную в соответствии с требованиями патента РФ № 2202835 [91]. В качестве диализной среды использовали воду очищенную (+37,0±2,0 C), с рН=6,0. Содержание высвободившегося таурина и аллантоина в пробах диализата определяли спектрофотометрическим методом при =218±2,0 нм для аллантоина и =360±2,0 нм для таурина, через 15 мин в течение первого часа, а затем каждый час в течение 12 часов. Расчет степени высвобождения (Х), % осуществлялся по формуле (1): X = А- Вх100 (1) где А - количество вещества высвободившегося в диализную среду из геля, мг; В - количество вещества в геле, мг. Количественное определение таурина и аллантоина в геле Количественное определение таурина и аллантоина в геле хитозана с таурином и аллантоином изучали методами спектрофотометрии (СФ) и высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Определение СФ методом осуществляли на спектрофотометре Hitachi U1900 (Hitachi Ltd, Япония) в соответствии с требованиями ОФС.1.2.1.1.0003.15 «Спектрофотометрия в ультрафиолетовой и видимой областях» ГФ XIII. Определение методом ВЭЖХ осуществляли на хроматографе «Стайер» (Аквилон, Россия) со спектрофотометрическим детектором JET chrom UV-VIS detector UVV-105, в соответствии с требованиями ОФС.1.2.1.2.0005.15 «Высокоэффективная жидкостная хроматография» ГФ XIII [29].
Микробиологические методы
Определение микробиологической чистоты гелей осуществляли в соответствии с требованиями ОФС.1.2.4.0002.15 «Микробиологическая чистота» ГФ XIII, поверхностным методом [29]. 2.5. Токсикологические методы исследования
Острую накожную токсичность геля ХТА, изучали при аппликационном применении половозрелым беспородным конвенциональным мышам обоего пола (n=40) массой тела 21,1±2,3 г. Кормление животных осуществлялось полнорационным комбикормом с добавлением пшеницы, ржи и моркови. В соответствии с рекомендациями изложенными в Руководстве по проведению доклинических исследований лекарственных средств (А.Н. Миронов, 2012), в связи с ограниченным количеством наносимого геля на поверхность кожи, процедуру аппликации осуществляли восьмикратно на протяжении суток с перерывом в один час [112]. Животным первой группы гель ХТА наносили на кожу в дозе 0,3 г за один прием, в суммарной суточной дозе 96 г/кг. Животным второй группы 1,0 г геля, в суммарной суточной дозе 320 г/кг. Животным третьей группы наносили на кожу 2,0 г геля ХТА за один прием, в суммарной суточной дозе 640 г/кг. Животным четвертой группы в связи с тем, что нанести накожно дозу более 640 г/кг в сутки не представляется технически возможным, поэтому производили нанесение данной дозы на протяжении 2 суток, в суммарной дозе 1280 г/кг. Предварительно с целью оптимального дозирования необходимого количества геля, у мышей удаляли на поверхности тела 70% шерстного покрова со стороны спины и живота с помощью депиляционного крема Deep depil. Для предотвращения переохлаждения животных в ходе эксперимента поддерживали температуру в виварии в пределах +25-27С. Контроль за состоянием поведения животными осуществляли на протяжении 14 суток, на первые сутки после нанесения геля, мониторинг за состоянием подопытных животных осуществлялся непрерывно. Оценивали общее состояние подопытных животных, выживаемость животных, интенсивность двигательной активности, изменение поведенческих реакций, наличие рефлексов положения, частоту дыхательных движений [23]. Величину LD50 рассчитывали по формуле Беренса (2)
Биофармацевтические исследования in vitro
При разработке мягких лекарственных форм необходимо изучение структурно-механических свойств, а конкретно реологических показателей: динамическая вязкость (г, Пас), напряжение сдвига (т, Па), что дает возможность оценить, как потребительские свойства, такие как намазывающаяся способность, так и выбор рационального технологического процесса, связанный с подачей материала по трубопроводу и экструзией. Реологические исследования проводили по методике, представленной в главе 2.
Основным вспомогательным веществом в разработке мягкой лекарственной формы - гель является гелеобразователь, концентрация которого влияет на реологические характеристики готового продукта. По литературным данным наиболее оптимальной концентрацией хитозана является от 0,5% до 2,0% [132, 151]. Поэтому нами были изготовлены образцы геля хитозана с концентрациями 0,5%, 1,0%, 2,0%, 3,0%. Концентрация гелеобразователя подбиралась при визуальном осмотре изготовленных модельных образцов с концентрациями 0,5%, 1,0%, 2,0%, 3,0% по показателям: набухаемость, прозрачность, однородность, намазывающая способность. Оптимальная концентрация гелеобразователя хитозана – 1,0%, которая была использована в дальнейших исследованиях. При введение таурина и аллантоин в состав 1,0% хитозанового геля, наблюдалось незначительное снижение динамической вязкости. Для изучения влияния температуры на реологические свойства гелей ХТА, проведены исследования по изучению напряжения сдвига при температуре 20C и 37C. Полученные данные по определению динамической вязкости и напряжению сдвига представлены (см. приложение 2, таблица 2).
Реограммы течения геля хитозана 1,0% и геля хитозана с таурином и аллантоином. Для гелей хитозана с концентрацией 1,0% и геля ХТА при температурах 20 C и 37 C, на основании полученных данных построены реограммы течения (рисунок 3.2). Установлено, что структурная вязкость геля ХТА при температуре 37 C незначительно уменьшалась, однако оставалась в пределах диапазона реологического оптимума для гелей (от 2 до 10 Пас).
Наличие восходящих и нисходящих кривых петель гистерезиса представленных на рисунке 3.2 указывает на то, что исследуемый гель ХТА обладает тиксотропными свойствами, что прогнозирует его оптимальную текучесть при перемешивании, необходимую для облегчения фасовки препарата, с хорошей способностью к выдавливанию из туб и комфортное нанесение геля на кожу.
Биофармацевтические исследования в разработке мягкой лекарственной формы являются информативными и представляют важную информацию о качественных и количественных характеристиках лекарственного средства, что позволяет оценить степень высвобождения таурина и аллантоина из основы геля. Проведению биофармацевтических исследований предшествовала разработка и валидация методики количественного определения таурина и аллантоина в геле методом СФ (см. приложение 3).
Анализ данных свидетельствует, что высвобождение таурина и аллантоина происходило следующим образом: за первый час высвободилось через лецитиновую мембрану 8,07% аллантоина и 7,65% таурина, через четыре часа 49,05% и 50,66% соотвественно, а через 12 часов высвобождение составило 80,46% и 82,08%. Далее отмечено медленное увеличение степени высвобождения действующих веществ до 97,90% аллантоина и 98,81% таурина.
Таким образом, на основании биофармацевтических исследований, установлено что данный состав геля равномерно высвобождает действующие вещества в течение 24 часов.
Технологический процесс производства геля хитозана с таурином и аллантоином заключался в растворении уксусной кислоты в воде очищенной, с дальнейшим введением по массе субстанции хитозана при тщательном перемешивании с температурным режимом от 25 до 30 С, до полного набухания, которое составляло от 12 до 18 часов. В полученную гелевую основу вводили аллантоин, при тщательном перемешивании до полного растворения, затем к однородной массе добавляли субстанцию таурина. На основании технологического процесса производства геля на основе хитозана с таурином и аллантоином, была составлена технологическая блок-схема (см. приложение 2, рисунок 1). На основании данных полученных при изучении совместимости компонентов, реологических характеристик, биофармацевтических и скрининговых фармакологических исследований (представленных в главе 5) разработан гель следующего состава: Состав на 100 г. геля хитозана с таурином и аллантоином.
Разработанный гель хитозана с таурином и аллантоином оценивали по показателям в соответствии с требованиями ОФС.1.4.1.0008.15 «Мази» и ОФС.1.4.1.0001.15 «Лекарственные формы», полученные данные представлены в приложении 2, таблице 3. Для количественного определения таурина и аллантоина при совместном присутствии, была разработана и валидирована методика их количественного определения методом СФ и ВЭЖХ (см. приложение 3 и 4).
Анализ проведенных исследований геля хитозана с таурином и аллантоином по показателям оценки качества: описание, подлинность, количественное определение, pH, микробиологическая чистота, масса содержимого упаковки, вязкость, показал, что все показатели находились в допустимых пределах рекомендуемых значений нормативной документации на протяжении всего срока хранения (см. приложение 2, таблица 3) [29].
Разработанный гель ХТА при температурном режиме 15-25C после 3 месяцев хранения, являлся не стабильным по показателю динамической вязкости, которая уменьшалась прямо пропорционально времени хранения, что дало основание к изучению стабильности геля, только при температурном режиме 2-8C. В ходе исследования на протяжении всего срока хранения динамическая вязкость (при скорости 27.0 с-1) практически не изменялась, и находилась в диапазоне значений от 4.0 Пас до 6.0 Пас.
Как видно из (рисунок 3.4, рисунок 3.5) образцы геля ХТА в течение 18 месяцев хранения при температуре 2-8C сохраняли свои исходные реологические характеристики. Площадь петли гистерезиса не изменялась, это указывает на структурную устойчивость гелеобразующего компонента и правильный выбор его концентрации, а также активных веществ и рациональной технологии. вежеприготовленный гель 6 месяцев
Конъюнктивальная проба
Объектом исследования были белые беспородные конвенциональные половозрелые мыши самцы (n=84), массой тела 20,0±1,5 г, возрастом 3 месяца. Выделяли 12 групп по 7 животных в каждой. Первая группа была интактной без нанесения раны. Вторая группа была контрольной, рана без нанесения лекарственных средств, при этом происходило самопроизвольное заживление раны. В третьей группе на рану наносили мазь «Левомеколь». В четвртой группе на рану наносили гель «Солкосерил». В пятой группе на раневую поверхность наносили 1,0% хитозановый гель. В шестой группе на рану животным наносили 4,0% раствор таурина, в седьмой группе – 0,5% раствор аллантоина. В восьмой группе рану обрабатывали 1,0% раствором таурина, в девятой группе 0,125% раствором аллантоина. В десятой группе рану обрабатывали 0,25% раствором таурина, в одиннадцатой группе – 0,03% раствор аллантоина. В двенадцатой группе на рану наносили гель на основе 1,0 % хитозана с 4,0% таурином и 0,5% аллантоином (ХТА). Изучаемые вещества наносили на рану 1 раз в день 14 дней в дозе 0,2 г.
В результате проведнных исследований было установлено, что животные благоприятно переносят применение геля с хитозаном, таурином и аллантоином, он не оказывал раздражающего действия, не вызывал гиперемии и отека кожных покровов, не влиял на уровень общей двигательной активности подопытных животных. За период наблюдения не было выявлено случаев смертельного исхода, нагноения раны и осложненного течения раневого процесса, гель легко наносился на раны, сорбировал раневые выделения, не высушивая дно раны, останавливал кровотечение и поддерживал влажную среду в ране.
Анализ результатов экспериментального исследования показал, что в контрольной группе наблюдалось постепенное уменьшение площади раны на всех этапах течения раневого процесса на протяжении всего периода исследования. В третьей группе нанесение мази «Левомеколь» уменьшало площадь раны на 9 сутки на 16,38% относительно контроля (p 0,05). В четвертой группе применение геля «Солкосерил» приводило к сокращению сроков заживления ран на 2 суток, гель достоверно оказывал положительное влияние на уменьшение площади ран на 7 сутки на 29,93% относительно контроля (p 0,05). В пятой группе раны обрабатывали 1,0% гелем хитозана, что приводило к сокращению сроков заживления ран на 3 суток, на 6 и 8 сутки площадь раны уменьшилась на 22,81% и 40,51% соответственно относительно контроля (p 0,05). В шестой группе после нанесения 4,0% раствора таурина на раневую поверхность, отмечалось уменьшение площади ран на 5 и 8 сутки на 21,07% и 35,75% соответственно по сравнению с контролем (p 0,05). В седьмой группе на раневую поверхность животным наносили 0,5% раствор аллантоина, на 7 сутки было выявлено ускоренное заживление ран на 25,38% (p 0,05). В восьмой группе, где раны были обработаны 1,0% раствором таурина, отмечено к 8 суткам сокращение площади ран на 19,88%, к 9 суткам на 20,27% по сравнению с контролем (p 0,05). В девятой группе раны орошались 0,125% раствором аллантоина, что приводило к уменьшению площади ран на 7 сутки на 11,89% относительно контроля (p 0,05).
8 десятой группе рану орошали 0,25% раствором таурина, в одиннадцатой группе животным на рану наносили 0,03% раствор аллантоина, на 7 сутки было выявлено незначительное улучшение заживления ран на 8,20% и 6,03% соответственно относительно контроля (p 0,05). В двенадцатой группе обработка раневой поверхности разработанным гелем ХТА способствовала полному заживлению ран на 4 суток раньше, в сравнении с контрольной группой, ранозаживляющее действие проявлялось уже с конца 1 суток после нанесения повреждения и характеризовалось уменьшением площади раны на 5,62%, на 7 сутки на 42,60%, к 9 суткам площадь раны сократилась на 56,62% относительно контроля (p 0,05). Гель ХТА в сравнении с мазью «Левомеколь» сокращал сроки заживления ран на 4 суток и уменьшал площадь ран на 9 сутки на 40,24% (p 0,05), обработка раневой поверхности гелем ХТА в сравнении с гелем «Солкосерил» ускорило процесс заживления ран на 9 сутки на 25,38% (p 0,05).
На основании динамики изменения площади ран контрольных и леченных животных, определены периоды полузаживления ран, представлены на (рисунок 5.2). Полученные экспериментальные данные свидетельствуют, что мазь «Левомеколь», гель «Солкосерил» и гель хитозана сокращают сроки полузаживления ран по сравнению с контролем на 15,05% и 37,01% и 31,54% (p 0,05) соответственно.