Содержание к диссертации
Введение
Глава 1 Блокаторы медленных кальциевых каналов в регуляции образования соединительной ткани (обзор литературы) 23
1.1. Механизмы межклеточных взаимодействий на территории соединительной ткани 23
1.1.1. Фибробласты – основные функционально активные клетки соединительной ткани – как возможный объект фармакологического воздействия 24
1.1.2. Макрофагально-фибропластическое взаимодействие 27
1.1.3. Основы фиброгенеза. Воспаление как стереотипная реакция 29
1.1.4. Физиологические основы кальциевого гомеостаза: каналы и насосы мембран фибробластов, внутриклеточные кальций-связывающие белки 33
1.2. Блокаторы медленных кальциевых каналов (антагонисты кальция) как возможный инструмент воздействия на функцию фибробластов 38
1.2.1. Фармакологические свойства блокаторов медленных кальциевых каналов (антагонистов кальция). Возможности использования для регуляции функции фибробластов 38
1.2.2. Классификация органических антагонистов кальция 39
1.2.3. Фармакологические эффекты блокаторов медленных кальциевых каналов 41
1.2.4. Влияние блокаторов медленных кальциевых каналов на экспрессию транскрипционного фактора NF-kB в культуре активированных фибробластов 42
1.3. Актуальные области клинического использования модулирующей активности антагонистов кальция на функции фибробластов 44
1.3.1. Клиническое обоснование целесообразности фармакологической регуляции образования соединительнотканных перитонеальных спаек 45
1.3.1.1. Современные представления о методах профилактики образования и рецидива послеоперационных перитонеальных спаек 48
1.3.1.2. Клинико-патогенетические особенности гипертрофических и келоидных рубцов 52
1.3.1.3. Клиническое использование антифиброгенного действия БМКК 62
Резюме 63
Глава 2 Материалы и методы исследования 65
1.1. Общая характеристика экспериментального и фармацевтического материала 67
1.2. Экспериментальное обоснование доз БМКК при спайкообразовании in vivo и in vitro 75
1.2.1. Подбор дозового режима интроперитонеального введения верапамила крысам 75
1.3. Методы исследования 76
1.3.1. Культуральные методы 76
1.3.2. Морфологические и иммуноцитохимические методы 79
1.3.3. Биохимические методы 81
1.3.4. Иммунологические методы 82
1.3.5. Электрофизиологические методы 82
1.4. Фармацевтические исследования 83
1.4.1. Разработка верапамилсодержащего крема 83
1.4.2. Фармакотехнологические методы 84
1.4.2.1. Метод получения модели биологической мембраны 84
1.4.2.2. Метод диализа через полупроницаемую мембрану 84
1.4.2.3. Метод высокоэффективной жидкостной хроматографии 85
1.4.3. Способ приготовления антирубцового крема 86
1.5. Характеристика материала при моделировании патологических рубцов кожи 86
1.5.1. Характеристика рубцовых повреждений кожи 87
1.5.2. Биомикроскопия кожи 88
1.6. Методы статистического анализа полученных результатов 88
Глава 3 Моделирование спаечного процесса брюшной полости и критерии оценки его выраженности 91
3.1. Степень выраженности спаечного процесса, макро- и микроскопическая характеристика спаек при гемоперитонеуме у крыс и кроликов 91
3.2. Функциональная активность перитонеальных фибробластов и макрофагов при развитии спаечного процесса в брюшной полости 96
3.2.1. Биохимическая характеристика процесса перитонеального спайкообразования 96
3.2.2. Содержание провоспалительных цитокинов в перитональной жидкости крыс на этапах пролиферации и завершения воспалительного процесса при гемоперитонеуме 99
Резюме 101
Глава 4 Оценка дозозависимого эффекта регуляции активности перитонеальных фибробластов и макрофагов блокаторами медленных кальциевых каналов при использовании клеточных технологий 103
4.1. Морфо-функциональная характеристика перитонеальных фибробластов и макрофагов в культуре клеток 103
4.2. Сравнительная оценка классических блокаторов медленных кальциевых каналов верапамила , дилтиазема и нифедипина в качестве регуляторов функции перитонеальных фибробластов и макрофагов; дозозависимый эффект 108
4.3. Оценка влияния классических БМКК верапамила, дилтиазема и нифедипина на активность ядерного фактора транскрипции NF-kB 115
Резюме 122
Глава 5 Верапамил как средство профилактики перитонельного спайкообразования в эксперименте 124
5.1. Подбор дозового режима интраперитонеального введения верапамила 124
5.2. Влияние верапамила на формирование спаек в брюшной полости крыс и кроликов при гемоперитонеуме 130
5.3. Воздействие верапамила на синтез фибробластами компонентов межклеточного матрикса при моделировании спаечного процесса в брюшной полости 133
5.4. Коррекция цитокинсинтетической активности макрофагов крыс при гемоперитонеуме с использованием верапамила 137
Резюме 140
Глава 6 Фармакотехнологические исследования по разработке оптимального состава антирубцового крема с верапамилом 141
6.1. Обоснование выбора действующего вещества антирубцового крема – верапамила 142
6.2. Выбор оптимальной основы для антирубцового крема 142
6.3. Биофармацевтическое изучение процесса высвобождения верапамила из различных количественных композиций антирубцового крема 144
Резюме 148
Глава 7 Верапамил как средство ремоделирования патологического кожного рубца в эксперименте 149
7.1. Характеристика патологических кожных рубцов и их изменений при экспериментальной терапии 149
7.2. Данные биомикроскопии рубцовых изменений кожи 152
7.3. Сравнительная морфологическая характеристика патологических рубцов у крыс после экспериментальной терапии верапамилом в составе антирубцового крема и водно-вазелин-ланолиновой основой крема 153
7.3.1. Структура кожи спины контрольных крыс 153
7.4. Формирование рубцов после иссечения кожного лоскута 160
7.5. Изучение эффективности действия верапамила на процесс окончательной трансформации патологического рубца 170
Резюме 179
Глава 8 Обсуждение результатов исследования 181
Заключение 195
Выводы. 199
Список сокращений 202
Указатель литературы 203
- Физиологические основы кальциевого гомеостаза: каналы и насосы мембран фибробластов, внутриклеточные кальций-связывающие белки
- Степень выраженности спаечного процесса, макро- и микроскопическая характеристика спаек при гемоперитонеуме у крыс и кроликов
- Воздействие верапамила на синтез фибробластами компонентов межклеточного матрикса при моделировании спаечного процесса в брюшной полости
- Изучение эффективности действия верапамила на процесс окончательной трансформации патологического рубца
Введение к работе
Актуальность темы исследования
Проблема избыточного образования соединительной ткани в медицине затрагивает
фактически все сферы: актуальна в клинике внутренних болезней, хирургии, комбустиологии,
косметологии, офтальмологии. Почти 45% всех случаев смерти в развитых странах мира
приходится на хронические фибропролиферативные заболевания (Wynn T.A. с соавт.,
2012). Частным случаем фибропролиферативных состояний являются послеоперационные
спайки и гипертрофические/келоидные рубцы (Awonuga A. O. с соавт., 2011; Zeisberg M. с
соавт., 2013). Спайки развиваются у 50-100% больных после общехирургических
абдоминальных операций и у 70-97% пациенток после гинекологических оперативных
вмешательств (Аникин С.С. с соавт., 2012; Дронов А.И. с соавт., 2015; Ward B.C. с соавт.,
2011). Особое место среди потенциальных последствий спайкообразования занимают
абдоминальная и тазовая боли, кишечная непроходимость, сложность повторных
хирургических вмешательств и интраперитонеальной химиотерапии, у женщин
бесплодие, повышенный риск внематочной беременности. Распространенность
гипертрофических/келоидных рубцов после ожогов составляет около 67% (Nguyen T. A. с соавт., 2015). Чрезмерное рубцевание является ведущей причиной снижения качества жизни обожженных. Ожоговые больные часто требуют длительного периода реабилитации. Значительная часть восстановительной фазы относится к функциональным и косметическим ограничениям, накладываемым гипертрофическими и келоидными рубцами, включающим сокращение диапазона движения конечностей, интенсивный кожный зуд и непереносимость высокой или низкой температур, нарушения физической и социальной активности пациентов (Al-Shaqsi S. с соавт., 2016).
Степень разработанности темы исследования Проблеме повышения качества лечения больных с перитонеальными спайками и с гипертрофическими и келоидными кожными рубцами посвящены многочисленные современные работы отечественных и зарубежных авторов (Адамян А. В., 2013; Анойко Е. А., 2016; Батюнин В. А., 2009; Ермолов А. С. с соавт., 2008; Randall D. с соавт., 2016; Mettler L. с соавт., 2008; Alkhamesi N. A. с соавт., 2013; Fortin C. N. с соавт., 2015; Uysal B. с соавт., 2012) Однако, несмотря на современные достижения и разнообразие способов профилактики и
лечения спайко- и рубцовообразования, результаты их нельзя признать удовлетворительными
(Бойко В. В. с соавт., 2013; Weisthal S. с соавт, 2014). Одним из перспективных направлений
решения проблемы является использование фармакологических средств, обладающих
воздействием на ключевые патогенетические звенья процессов спайко- и рубцовообразования
на клеточном и молекулярном уровнях. Однако патогенез спаек и келоидных рубцов до сих пор
недостаточно изучен (Butler P.D. с соавт., 2008), отсутствуют адекватные методики
моделирования спаек и как следствие - не существует терапии, эффективно препятствующей избыточному фиброгенезу. Возможности антифибротической терапии определяются современными знаниями о клеточно-молекулярных механизмах фиброгенеза. Известно, что основой фиброгенеза являются фибробласты, синтезирующие при активации большое количество внеклеточного матрикса (Mettler L. с соавт., 2008; Parker M. W. с соавт., 2014; Weber K. T. с соавт., 2015). Важно отметить, что фиброгенез продолжается до тех пор, пока эти клетки сохраняются в ране; их удаление путем апоптоза является частью перехода между грануляционной тканью и заживлением с образованием физиологических рубцов (Barnes P. J., 2014). Задержка и отсутствие индукции апоптоза фибробластов приводят к чрезмерному фиброгенезу (Ikeda K. с соавт., 2013; Duffield J. S. с соавт., 2013). Одним из главных факторов, регулирующих процессы апоптоза, является ядерный транскрипционный фактор NF-kB. Активация NF-B приводит к блокированию процессов апоптоза, продлевая жизнь клеток-эффекторов в очаге воспаления (Lee Y. S. с соавт., 2015). Моноциты, макрофаги и дендритные клетки также оказывают влияние на воспаление и фиброз. Эти клетки регулируют активацию фибробластов и их предшественников через цитокин-зависимые и -независимые пути, в том числе и через влияние на ядерный фактор транскрипции NF-kB, вызывая дополнительное повреждение тканей и стимулируя антиапоптотические свойства фибробластов (Fernandez I. E. с соавт., 2012; Fernandez I. E. с соавт., 2012; Lee Y. S. с соавт., 2015). Ключевым вторичным мессенджером, опосредующим большинство клеточных событий и принимающим активное участие в регуляции основной функции фибробластов – строительстве соединительной ткани, является ионизированный кальций (Ca2+) (Бозо И. Я. с соавт., 2010; Chen J. B. с соавт., 2010). Нарушения Ca2+-гомеостаза фибробластов сопровождаются изменением жизнеспособности клеток, процессов пролиферации, синтеза белка, активацией факторов транскрипции (Gryshchenko O. с соавт., 2016; Weisthal S. с соавт., 2014). Напротив, многие факторы роста и цитокины изменяют содержание Ca2+ в фибробластах (Shlyonsky V. с соавт., 2011). Некоторые ферменты способны трансформировать информацию, закодированную в частоте Са2+ колебаний (Kaneko Y. с соавт., 2014; Smedler E. с соавт., 2014). Это приводит к активации факторов транскрипции с последующей регуляцией транскрипции генов (Hwang Y. P. с соавт., 2011;
Jimenez S. A., 2013; Zamponi G. W. с соавт., 2015; Zamponi G. W., 2015). Важная роль Са2+-гомеостаза в регуляции протеостаза, транскрипции генов и клеточных процессов, связанных с дифференцировкой, пролиферацией и гибелью клеток, участвующих в фиброгенезе (Gryshchenko O. с соавт., 2016; Weisthal S. с соавт., 2014), указывают на то, что антагонисты кальция (блокаторы медленных кальциевых каналов - БМКК), которые тормозят или полностью блокируют вход ионов кальция внутрь клеток по потенциалзависимым кальциевым каналам, могут быть инструментом воздействия на фибробласты и клетки их микроокружения при избыточном образовании заместительной соединительной ткани. Однако использование БМКК в клинической практике ограничивается их кардиогемодинамическими эффектами, нивелирующими их антифиброгенное действие.
В последние годы в зарубежной литературе появился ряд сообщений, прямо или
косвенно свидетельствующих о наличии у БМКК фармакологических эффектов, реализуемых
модификацией формирующейся соединительной ткани с подавлением формирования
атеросклеротического поражения (Ishii N. с соавт., 2012; Hayashi T. с соавт., 2014; Liang S. J. с
соавт., 2016; Coca A. с соавт., 2013), снижением коллаген-продуцирующей функции легочных
фибробластов (Janssen L. J. с соавт., 2015), наличием антифиброгенного эффекта при фиброзе
печени (Zhang Y. с соавт., 2016) и болезни Пейрони (Alizadeh M. с соавт., 2014; Dell’Atti L.,
2015), при контрактуре Дюпюитрена (Malta M. C. с соавт., 2013; Zidel P., 2012), уменьшением
образования послеоперационных эпидуральных и внутрисуставных спаек (Li M. С соавт., 2016).
Появились данные локального применения БМКК верапамила в клинике для лечения
гипертрофических и келоидных рубцов (Boggio R. F. с соавт., 2014; Danielsen P. L., 2016) при
инъекционном введении препарата в ткани рубца. Существенным недостатком методики
считают выраженную болезненность процедуры. Исследования новых свойств известных,
зарекомендовавших себя в медицинской (кардиологической) практике БМКК, носят скорее
констатирующий характер, то есть документируют эффективность БМКК в предотвращении
чрезмерного фиброгенеза, но при этом не содержат сколько-нибудь аргументированного
толкования механизмов их действия. Следует учитывать, что БМКК - большая и достаточно
неоднородная по химической структуре группа лекарственных средств, включающая
высокоспецифичные в отношении медленных кальциевых каналов (производные
фенилалкиламина, бензотиазепина, дигидропиридина) и неспецифичные (производные
прениламина, дифенилпиперазины) препараты, существенно различающиеся по
фармакокинетическим параметрам и фармакодинамическим свойствам. Вероятно, БМКК
разных химических групп обладают разной активностью в отношении регуляции формирования соединительной ткани. Данные о влияние разных БМКК на процессы фиброгенеза при спайко-
и рубцовообразовании немногочисленны, противоречивы и требуют дальнейших исследований (Ishii N., 2012; Kawamura A. с соавт., 2014; Ohya S. с соавт., 2016).
Все выше изложенное явилось основанием для проведения исследований действия БМКК на формирование соединительной ткани при спайко- и рубцовообразовании (от создания адекватной экспериментальной модели патологического процесса до выявления механизмов действия БМКК на молекулярном, клеточном, органном и организменном уровнях, с определением наиболее эффективного препарата, дозового режима и способов его введения), а также возможности использования вновь выявленных свойств лекарственных средств группы БМКК для более рационального их применения, создания новых лекарственных форм.
Цель исследования
Выявить закономерности и особенности фармакодинамики блокаторов медленных кальциевых каналов в качестве регуляторов образования соединительной ткани при спаечном процессе в брюшной полости и формировании патологических кожных рубцов. Разработать оптимальный состав и технологию оригинального антирубцового крема с верапамилом, обосновать его эффективность и безопасность.
Задачи исследования
-
Для проведения фармакодинамических исследований на крысах и кроликах создать модель перитонеального спайкообразования, провести мониторинг спаечного процесса и разрастания соединительной ткани в брюшной полости с определением функциональной активности фибробластов и макрофагов.
-
Изучить дозозависимое влияние БМКК нифедипина, дилтиазема и верапамила на пролиферативную и анаболическую активность перитонеальных фибробластов и макрофагов крыс с использованием клеточных технологий.
-
Исследовать экспрессию транскрипционного фактора NF-B в перитонеальных и дермальных фибробластах и влияние БМКК нифедипина, дилтиазема и верапамила на молекулярные механизмы регуляции активности разных типов фибробластов.
-
Среди исследуемых БМКК определить наиболее эффективный препарат для предотвращения избыточного фиброгенеза; обосновать дозовый режим его внутрибрюшинного введения крысам, оптимальный для профилактики образования спаек при минимальной выраженности или отсутствии кардио- и гемодинамических эффектов
-
Изучить влияние верапамила на распространенность спаечного процесса в брюшной полости крыс и кроликов, морфологические характеристики спаек, биохимические показатели и цитокиновый профиль перитонеальной жидкости.
-
Разработать новую лекарственную форму - антирубцовый крем с верапамилом, обосновать выбор компонентов для противорубцовой композиции, провести технологические исследования по разработке оптимального состава крема.
-
Экспериментально обосновать эффективность и безопасность применение антирубцового крема с верапамилом для профилактики и лечения патологических кожных рубцов.
Научная новизна
Впервые с использованием комплексного и разноуровневого (молекулярный, клеточный и организменный уровень) подхода на адекватной экспериментальной модели образования спаек в брюшной полости (патент 2260854 РФ) in vivo (крысы, кролики) и in vitro (первичная культура перитонеальных фибробластов крыс с гемоперитонеумом и перевиваемой культуре дермальных фибробластов человека, производства Axol Bioscience), а также на модели формирования патологических рубцов кожи доказано наличие у широко используемых в кардиологии лекарственных средств БМКК способности регулировать избыточное образование соединительной ткани при перитонеальном спайкообразовании и посттравматическом формировании келоидных и гипертрофических кожных рубцов.
Показано, что моделирование гемоперитонеума приводит к образованию в брюшной полости экспериментальных животных множественных соединительнотканных спаек и вызывает как in vitro, так и in vivo повышение (в среднем 6 - 10-кратное) пролиферативной активности фибробластов, их коллагенсинтетической функции, продукции гиалуроновой кислоты, усиливает функциональную активность макрофагов, увеличивая темпы их трансформации из моноцитов, синтез провоспалительных цитокинов TNF-a и IL-1.
Изучение in vitro на первичных культурах перитонеальных фибробластов крыс позволило установить факт прямого воздействия БМКК верапамила и дилтиазема на морфофункциональное состояние фибробластов и макрофагов. Показано, что в основе предотвращения избыточного роста соединительной ткани верапамилом или дилтиаземом лежит снижение чрезмерной при гемоперитонеуме пролиферативной активности фибробластов и макрофагов, активности ядерного фактора транскрипции NF-B, приводящего к ингибированию процессов апоптоза, торможение продукции оксипролина и гиалуроновой кислоты, провоспалительных цитокинов. Выявлена дозовая зависимость установленного эффекта: наибольшей фармакологической активностью обладал верапамил в концентрации 0,0001 мл"1. Нормализующий эффект верапамила оказался более значимым (в среднем на 35,5%, р<0,05), чем у дилтиазема в той же концентрации. Нифедипин фармакологической активности в отношении перитонеальных фибробластов и макрофагов не демонстрировал.
Впервые установлено, что независимо от типа культивируемых клеток
(перитонеальные фибробласты крыс или дермальные фибробласты человека) под действием БМКК происходят однотипные изменения молекулярных механизмов их активации – ингибирование ядерного фактора транскрипции NF-B. Наличие у верапамила угнетающего влияния на NF-kB объясняет универсальность его антипролиферативного действия в отношении фибробластов в составе соединительнотканных образований различной локализации.
In vivo, в экспериментах по изучению фармакодинамики верапамила, подтверждена
доказанная in vitro эффективность лекарственной модуляции функций перитонеальных
фибробластов и клеток их микроокружения. Установлена оптимальная доза (0,1 мг/ кг массы
тела) верапамила для внутрибрюшинного введения, оказывающая выраженный
фармакологический эффект в отношении избыточной продукции соединительной ткани, пролиферативной и анаболической активности перитонеальных фибробластов и макрофагов и не вызывающая значимых изменений кардио- и гемодинамики.
Патогенетически обоснована целесообразность использования верапамила как средства
профилактики и лечения спаечной болезни и гипертрофических и келоидных рубцов кожи.
Доказанная оптимизация функций фибробластов и образования соединительной ткани под
действием верапамила путем влияния на кальциевый обмен, а также универсальность
действия БМКК на молекулярные механизмы регуляции перитонеальных и дермальных
фибробластов обосновывают разработку лекарственной формы верапамила накожного
применения для профилактики и лечения патологических кожных рубцов.
Разработан антирубцовый крем (патент 2290919 РФ), содержащий 0,25% раствор верапамила, ланолин и вазелин, димексид при определенном количественном соотношении компонентов, обоснованном теоретически и подтвержденном стендовыми испытаниями. На основании результатов технологических и биофармацевтических исследований был осуществлен выбор оптимальной концентрации верапамила и предпочтительной основы крема, проведена оценка антирубцового крема в качестве средства предупреждения избыточного фиброгенеза. При экспериментальном изучении динамики клинических, биомикроскопических и морфологических изменений в патологических рубцах кожи установлена эффективность крема, содержащего верапамил, при щадящем, безболезненном способе его применения. Клинический эффект проявлялся формированием физиологического рубца, уменьшением площади рубцовой поверхности, изменением цвета рубца, исчезновением болевых ощущений. Морфологическим и биомикроскопическим методами доказан факт более раннего структурного созревания рубца без гипертрофии. С использованием данного способа фармакологического
воздействия удалось контролировать процесс избыточного рубцевания, добиться оптимальных морфологических, функциональных и косметических результатов.
Теоретическая и практическая значимость работы
Работа носит фундаментальный и прикладной характер. В результате проведенных
исследований определены новые свойства широко используемых в кардиологии классических
БМКК в отношении регуляции образования соединительной ткани, изучены их
фармакодинамические характеристики, выявлен наиболее эффективный для регуляции
избыточного фиброгенеза препарат – верапамил, что легло в основу создания новой
лекарственной формы - антирубцового крема с оценкой эффективности его применения.
Для изучения механизмов формирования перитонеальных спаек и исследований
лекарственных средств коррекции избыточного роста соединительной ткани создана
адекватная универсальная модель спайкообразования на основе введения аутокрови в
брюшную полость разных видов животных (патент 2260854 РФ).
В разработанной модели с помощью клеточных технологий определена
фармакологическая эффективность действия различных групп БМКК: производных
фенилалкиламина (верапамил), бензотиазепина (дилтиазем), дигидропиридина (нифедипин) на образование заместительной соединительной ткани путем регуляции функции основных клеток соединительной ткани - фибробластов и клеток их микроокружения.
Выявлено, что верапамил является наиболее эффективным препаратом для регуляции
избыточного фиброгенеза с универсальным механизмом действия на разные типы
фибробластов (перитонеальные фибробласты крысы и дермальные фибробласты человека).
Обоснован дозовый режим (0,1 мг/ кг массы тела) внутрибрюшинного введения верапамила,
оптимальный для профилактики избыточного роста соединительной ткани при
спайкообразовании с отсутствием кардио- и гемодинамических эффектов.
Разработана новая лекарственная форма верапамила для местного воздействия на
формирующийся гипертрофический/келоидный рубец – антирубцовый крем (патент 2290919
РФ). В фармакологических экспериментах установлена эффективность крема, проявляющаяся
уменьшением площади рубцовой поверхности, изменением цвета рубца, исчезновением
болевых ощущений. Морфологически доказан факт более раннего структурного созревания
рубца кожи без гипертрофии. Верапамил укорачивал все фазы воспаления, усиливал
репаративные процессы, блокировал гипертрофию и приводил к преимущественному формированию физиологических рубцов.
Методология и методы исследования
Реализована методология изучения фармакодинамической активности БМКК в отношении соединительной ткани и ее основных клеток - фибробластов: от формулировки рабочей гипотезы через внедрение адекватной экспериментальной модели и проведение исследований in vivo и in vitro, до создания новой лекарственной формы антирубцового крема с верапамилом.
Всесторонние доклинические испытания новых свойств БМКК на живых системах проводились in vivo на целостном организме (447 животных - крысы, кролики) и in vitro на 720 первичных культурах перитонеальных фибробластов и макрофагов и на 160 перевиваемых культурах дермальных фибробластов человека (Human Dermal Fibroblasts (Adult) производства Axol Bioscience). Проведены фармакотехнологические исследования по разработке оптимального состава антирубцового крема с верапамилом.
Эксперименты выполнялись на 383 белых крысах самцах массой 200 – 240 граммов и 64 кроликах самцах породы Шиншилла массой 2500 – 3200 граммов при строгом соблюдении требований Европейской конвенции (Страсбург, 1986) по содержанию, кормлению и уходу за подопытными животными, выводу их из эксперимента и последующей утилизации. В постановке опытов руководствовались требованиями Всемирного общества защиты животных (WSPA) и Европейской конвенции по защите экспериментальных животных 86/609. На первом этапе экспериментов разрабатывался способ моделирования внутрибрюшинных спаек (гемоперитонеум) у крыс и кроликов (патент 2260854 РФ).
На втором этапе проведено 6 серий экспериментов: 1-я серия - in vivo исследовали морфологические характеристики пеританеальных спаек, биохимический состав и цитокиновый профиль перитонеальной жидкости на 7, 10 сутки после моделирования гемоперитонеума у крыс;
2-я серия - in vitro тестировали БМКК: верапамил, дилтиазем и нифедипин в разных дозовых
режимах на первичных культурах перитонеальных фибробластов крыс с гемоперитонеумом;
3-я серия - in vivo, после выявления в культуральном модуле препарата с наиболее
выраженным фармакологическим эффектом (верапамил), оценили его действие на
формирование соединительной ткани в целостном организме крыс, определили режим
дозирования верапамила, исходя из необходимости минимизировать кардио- и
гемодинамические эффекты препарата;
4-я серия - in vivo, для подтверждения универсальности разработанной модели
спайкообразования и идентичности действия верапамила у разных видов животных, проведены
эксперименты на кроликах с оценкой морфо-функциональных характеристик процесса спайкообразования;
5 серия - in vitro, для выявления универсальности действия верапамила на разные типы фибробластов (перитонеальные фибробласты крысы и дермальные фибробласты человека) тестировали БМКК верапамил, дилтиазем и нифедипин на перевиваемой культуре дермальных фибробластов человека (Human Dermal Fibroblasts (Adult) производства Axol Bioscience). Полученный экспериментальный материал послужил основанием для создания новой лекарственной формы верапамила для местного воздействия на формирующийся гипертрофический/келоидный рубец - антирубцового крема, содержащего 0,25% раствор верапамила гидрохлорида, ланолин, вазелин, димексид (патент 2290919 РФ); 6-я серия - in vivo, для оценки эффективности оригинального антирубцового крема, после моделирования патологических рубцов кожи, на них дважды в день наносили крем с верапамилом и сравнивали с результатами аналогичного воздействия на рубцы основы крема без верапамила. Для подтверждения безопасности крема его втирали в неповрежденный участок кожи. Морфо-функциональные исследования проводили на 10, 30 и 60 сутки лечения.
Для решения поставленных цели и задач использовались экспериментальные фармакологические, фармацевтические, культуральные, морфологические, биохимические, иммунологические, функциональные и статистические методы исследований.
Положения, выносимые на защиту
-
В основе спаечного процесса в брюшной полости крыс и кроликов при моделировании гемоперитонеума (патент 2260854 РФ) лежат механизмы активации фибробластов с усилением их пролиферации, синтеза коллагена и гликозаминогликанов, активацией ядерного фактора транскрипции NF-B, приводящей к блокированию апоптоза, ростом функциональной активности макрофагов и синтеза провоспалительных цитокинов TNF-аи IL-1.
-
БМКК производные фенилалкиламина (верапамил) и бензотиазепина (дилтиазем) в культурах активированных перитонеальных клеток и дермальных фибробластов оказывают выраженный фармакологический эффект в отношении избыточной активности перитонеальных фибробластов и макрофагов, ингибируя их пролиферативную активность, избыточную продукцию компонентов межклеточного матрикса и цитокинов, угнетая экспрессию транскрипционного ядерного фактора NF-kB перитонеальных и дермальных фибробластов. Эффективность верапамила в эквимолярных дозах вдвое выше. Производные дигидропиридина (нифедипин) данных эффектов не проявляют.
-
Доза верапамила 0,1 мг/кг массы тела при внутрибрюшинном введении не вызывает значимых изменений кардио- и гемодинамики и является оптимальной для профилактики спайкообразования, тормозя избыточное разрастание соединительной ткани путем регуляции активности фибробластов и макрофагов, приводящей к снижению уровня белковосвязанного оксипролина, гиалуроновой кислоты, провоспалительных цитокинов TNF- и IL-1 в перитонеальной жидкости крыс и кроликов.
-
Разработан оптимальный состав и технология оригинального антирубцового крема с верапамилом (патент 2900919 РФ). Соотношения лекарственного средства и вода-ланолин-вазелиновой основы 3:6:1 обеспечивает оптимальную скорость и полноту высвобождения верапамила из крема. В опытах in vivo изучено антирубцовое действие крема при накожном нанесении и установлена его высокая специфическая активность, проявляющаяся уменьшением площади рубцовой поверхности с трансформацией патологических рубцов кожи в физиологические. Применение крема является безболезненным, безопасным.
Степень достоверности результатов
Достоверность полученных результатов обусловлена достаточным объемом (383 белые крысы, 64 кролика, 880 культур клеток) и корректным формированием изучаемых выборок, широким спектром и высокой информативностью современных методов исследования, многоуровневым тестированием in vitro и in vivo, положительными решениями по результатам патентной экспертизы результатов исследования с выдачей патентов РФ на изобретения (№№ 2260854, 2900919), адекватностью статистической обработки полученных данных с помощью параметрических (t-критерий Стьюдента) и непараметрических (критерий Манна-Уитни, Вилкоксона, 2, критерий Колмогорова-Смирнова) методов анализа, публикациями результатов исследования в рецензируемых научных изданиях. Количество экспериментальных животных в каждой группе статистически обосновано по Lopez-Jimenez F. и достаточно для получения достоверных результатов. Первичная документация проверена комиссией в соответствии с приказом ректора ФГБОУ ВО ОмГМУ Минздрава России № 57-у от 19 июня 2017 года.
Апробация материалов диссертации
Материалы и основные положения диссертации представлены на IX национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2002); Всемирном конгрессе по клинической и иммунной патологии (Сингапур, 2002); Межрегиональной научно-практической конференции «Современные направления развития регионального здравоохранения» (Омск, 2005); (Шимкент 2008); (Тюмень
2009);
(Москва 2009); (Владивосток 2009); (Кемерово 2009); (Пятигорск
2010); (Москва 2010); »
(Казань 2011); (Москва 2012);
(Воронеж 2013); (Чебоксары 2013); (Новосибирск 2013);
(Уфа, 2014); (Актобе, 2014), (Екатеринбург, 2014); заседании Межвузовского Комитета по этике (г.Москва, протокол №03-16 от 17 марта 2016 года); расширенном заседании кафедр фармакологии, клинической фармакологии, патофизиологии, клинической патофизиологии, факультетской терапии, госпитальной терапии, общей хирургии, анестезиологии и реаниматологии, общей химии ФГБОУ ВО «Омский государственный медицинский университет» МЗ РФ (г.Омск, протокол № 2 от 27 июня 2017 года).
Публикации
По теме диссертации опубликовано 23 научных работ, в том числе 21 – в журналах, рекомендуемых ВАК для докторских диссертаций, и 2 (патенты РФ на изобретения) к ним приравненных. Изданы монография и учебно-методическое пособие.
Объем и структура диссертации
Физиологические основы кальциевого гомеостаза: каналы и насосы мембран фибробластов, внутриклеточные кальций-связывающие белки
Одним из ведущих мессенджеров, опосредующих большинство клеточных событий, является кальций Ca2+. Участие кальция в регуляции основной функции фибробластов – строительстве соединительной ткани и, в частности, продукции коллагена – доказано [33, 297, 359, 461]. Многие факторы роста и цитокины вызывают увеличение [Ca2+] в фибробластах [474]. Фармакологическое нарушение Ca2+ гомеостаза фибробластов используется в исследованиях, чтобы связать корреляцию изменений концентрации Ca2+ с различными клеточными реакциями, в том числе синтезом белка, активацией факторов транскрипции, миграцией, жизнеспособностью клеток и пролиферацией [496]. В большинстве клеток в состоянии покоя существует 10000-кратный градиент концентрации для Ca2+ через плазмалемму. Этот градиент поддерживается Ca2+ помпой, гидролизующей АТФ, чтобы обеспечить энергию для движения Ca2+ против электрохимического градиента. [423]. Там также может быть Na+/Ca2+ теплообменник, который использует энергию, содержащуюся в градиенте концентрации Na+ (в свою очередь, созданной Na+/K+ -АТФазой) для выведения Ca2+ из клетки. Разнообразные внутри- или внеклеточные сигналы вызывают локальный рост концентрации Са2+. Последний взаимодействует с внутриклеточными Са-связывающими белками, большая часть которых служит либо трансмембранными переносчиками Са2+ внутри клетки, либо создает своеобразный буфер для поддержания низкого уровеня концентрации внутриклеточного Са2+. Структура таких белков в процессе связывания Са2+ практически не измененяется. Существуют также регуляторные Са-связывающие белки, структура которых в процессе связывания Са2+ заметно измененяется. Следствием изменения структуры и активности Са-связывающих белков-мишеней служат разнообразные клеточные реакции: изменение формы, перемещение в пространстве, ускоренный синтез АТФ и иных соединений, срочно необходимых клетке, переход от покоя к ускоренной пролиферации и пр. По мере понижения уровня Са2+ в цитоплазме до исходного уровня с участием специальных транспортных АТФаз, комплексы Са2+ и Са-связывающих белков диссоциируют, белки перестают взаимодействовать со своими мишенями, клетка переходит в состояние покоя.
Внеклеточный Са2+ попадает в клетку через множество ионных каналов. Некоторые из них являются высокоселективными для Ca2+ и непроницаемы для других катионов (особенно одновалентных катионов, таких как Na+ и K+), тогда как другие селективны для катионов, но тем не менее исключают ток анионов [412].
Некоторые высокоселективные Ca2+ каналы активируются или открываются при деполяризации мембраны, а также могут проявлять чувствительные к напряжению инактивационные характеристики. Эти и независимые от напряжения Са2+ селективные каналы можно отличить на основании их характеристик активации, деактивации и инактивации [480]. Кроме того, они обладают различной чувствительностью к широкой палитре фармакологических средств [546]. Три конкретных подтипа Ca2+ каналов, по имеющимся данным, особенно существенны в патогенезе фиброза [414]. Ca2+ каналы Т-типа служат «кардиостимуляторами» ритмической активности в разнообразных типах клеток. Эти каналы активируются относительно небольшой мембранной деполяризацией и потом так же быстро инактивируются. Они генерируют относительно небольшой и кратковременный пульсовой приток Ca2+, который затем может вызвать другие Ca2+-опосредованные и/или зависимые от напряжения клеточные события [467, 531]. L- тип Ca2+ каналов играет ключевую роль во многих типах клеток, где они опосредуют изменения уровня Ca2+ в ответ на тонкие изменения мембранного потенциала, в том числе, порожденные Т-типом Ca2+ каналов. Деполяризация мембраны и накопление Ca2+ в устье этих каналов в свою очередь становится причиной задержки инактивации каналов, обеспечивая отрицательную обратную связь для этого Ca2+ -выводящего пути [548]. Некоторые внутриклеточные органеллы экспрессируют Ca2+ помпы на своих мембранах и тем самым накапливают Ca2+ в концентрациях столь же высоких как во внеклеточном пространстве, а так же имеют ионные каналы, которые могут высвобождать этот сохраненный Ca2+ в управляемом режиме в ответ на определенные раздражители [415]. Эндоплазматический ретикулум (ER), например, экспрессирует Ca2+ помпу (SERCA), а также два типа ионных Са2+ каналов. Один из них открывает инозитолтрифосфат (IP3), вторичный мессенджер, образующийся под действием фосфолипазы С [448].
Многие клеточные процессы Са2+ -зависимы. Одна из стратегий, используемая многими клетками – «манипулирование» Ca2+ в разных частях клетки, когда повышение концентрации Ca2+ в одной части клетки регулирует определенную функцию, в то же время уменьшая Ca2+ в другом участке клетки, чтобы подавить другую функцию [458, 534]. Один из примеров этого – микродомены Са2+, регулирующие миграцию фибробластов, в клетках линии Wi-38. Эти мигрирующие фибробласты проявляют обратный градиент Са2+, при этом низкая концентрация Са2+ найдена по их переднему краю, где функционируют многочисленные эффекторные белки, опосредующие миграцию, которые требуют повышенной концентрации Ca2+. Решение этой головоломки было найдено в Са2+ микродоменах: по всей передней кромке клеток среди региона со сниженной концентрацией Са2+ были найдены микродомены достаточно высокой концентрации Са2+ со средним диаметром всего 5.27 (±0.05) мкм и длительностью от 10 мсек до 4 сек [375]. Кроме того, в нейронах приток Са2+ через один канал подтипа TRPC5 ингибирует дендритный рост, тогда как Са2+ приток через другой канал подтипа TRPC6 инициирует дендритный рост [518].
Другая стратегия, используемая клетками для дифференциальной регулировки Ca2+-зависимых событий – модуляция Ca2+ в виде волн с различной частотой, которая, в свою очередь, зависит от силы раздражающего стимула. Некоторые ферменты способны трансформировать информацию, закодированную в частоте Са2+ колебаний [521]. Например, в Т-клетках быстрые колебания стимулировали один набор факторов транскрипции (NFAT и Oct/OAP) для экспрессии IL-2, в то время как менее частые колебания активировали другой транскрипционный фактор (NF -кВ) с экспрессией IL-8 [340]. Эта специфичность выражается в различной Са2+ чувствительности ряда сигнальных молекул и транскрипционных факторов [423]. Таким образом, данный агонист может регулировать различные клеточные функции посредством различных частот колебаний [427]. Кальмодулин (Cmd) при связывании четырех ионов Са2+ может активировать несколько эффекторов [423]. Один из важнейших среди них – Са2+/Cmd–зависимые киназы (CamK). Транскрипционный фактор NF-B, как правило, удерживается в цитозоле посредством связи с его ингибиторами IB, однако фосфорилирование IB с участием CamK приводит к деградации этих комплексов, позволяя NF-B транслоцироваться в ядро и промоцировать транскрипцию генов [306]. Поскольку реаккумуляция IB осуществляется медленно (они должны быть ресинтезированы), низких частот Са2+-колебаний достаточно, чтобы обеспечить транскрипцию NF-B-регулируемых генов [338].
Существует длинный и постоянно растущий список других транскрипционных факторов, регулируемых тем или иным подтипом CamK [325]. Другой общепризнанный Cmd эффектор - кальциневрин, серин/треонин фосфатаза, которая дефосфорилирует NFAT с последующей транслокацией его в ядро и регуляцией транскрипции генов [341, 511]. Другие киназы внутри ядра рефосфорилируют NFAT, обусловливая его скорейшее возвращение в цитозоль [339]. Оптимальной для NFAT-опосредованной транскрипции является не постоянная концентрация Са2+, а повторяющиеся Са2+ - колебания в определенном диапазоне частот. Этот диапазон может варьировать, так как определяется свойствами других участвующих кофакторов. Напротив, другие Са2+-зависимые ферменты с совершенно иными кинетическими свойствами будут лучше стимулироваться устойчивым повышением Са2+, чем периодическими Са2+ осцилляциями [310, 547]. Частоты Са2+ осцилляций могут быть преобразованы не только киназами и фосфатазами, но и с помощью Са2+-зависимой протеазы кальпаина. При активации Са2+ эта цистеиновая протеаза проявляет свое действие с помощью различных цитозольных и/или ядерных факторов [516]. S100 Са2+ связывающие белки - низкомолекулярные белки с важными регуляторными функциями в буферизации кальция, регуляции киназ и фосфатаз, клеточной пролиферации, дифференцировки, метаболизма энергии, цитоскелет-мембранных взаимодействий и воспаления. Этот белок характеризуется наличием двух Са2+-связывающих участков и структурно похож на Сmd. После активации путем связывания Са2+ эти белки могут взаимодействовать с эффекторами в цитозоле или транспортируются в ядро и взаимодействуют с факторами транскрипции, или могут даже активировать внеклеточные эффекторы [509].
Степень выраженности спаечного процесса, макро- и микроскопическая характеристика спаек при гемоперитонеуме у крыс и кроликов
Спаечный процесс в брюшной полости крыс и/или кроликов моделировался однотипно путем однократного инъекционного внутрибрюшинного введения экспериментальному животному аутокрови через прокол в каудальной трети белой линии живота после ее забора в количестве 1% массы тела из дорсальной хвостовой вены крысы, или из краевой вены уха кролика (патент 2260854 РФ). Наличие спаечного процесса у всех животных было подтверждено макро- и микроскопически на 7-10 сутки с момента введения аутокрови в брюшную полость (рис. 2). Моделирование гемоперитонеума приводило к образованию в брюшной полости экспериментальных животных множественных соединительнотканных спаек, количество которых было сопоставимо в экспериментальных группах крыс и кроликов (табл.4).
Спайки преимущественно локализовались в нижнем (каудальном) этаже брюшной полости и были представлены висцерально-париетальными (с вовлечением брюшной стенки) и висцеро- висцеральными спайками.
Макроскопически спайки могли быть разделены на тяжевые, плоскостные, пленчатые, паутинные и смешанные (табл.4, рис. 2).
Микроскопически спайки были представлены волокнистой соединительной тканью, степень зрелости которой зависела от сроков наблюдения. Так от 7 к 10 суткам фибринозные наложения и рыхлая соединительная ткань с хаотичным расположением коллагеновых волокон и отсутствием врастания капилляров организовывались до плотной волокнистой соединительной ткани, представленной толстыми пучками упорядоченных коллагеновых волокон с небольшим врастанием капилляров. Отмечалась и динамика изменения клеточного состава. На 7 – 8 сутки - большое количество лимфоцитов, гистиоцитов, фибробластов, единичные гигантские многоядерные клетки; на поверхности спаек имелось небольшое количество мезотелиоцитов. К 9 суткам начинали преобладать фибробласты; лимфоциты, плазмоциты обнаруживались в небольшом количестве; встречались единичные фиброциты и гигантские многоядерные клетки; поверхность спаек частично покрыта мезотелиоцитами. На 10 сутки формировалась зрелая рубцовая соединительная ткань с упорядоченным расположением коллагеновых волокон, где присутствовали гомогенные участки и волокнистые структуры. Клеточный состав был представлен фиброцитами, фибробластами, мононуклеарами, встречались единичные плазматические, тучные клетки и многоядерные клетки типа гигантских клеток инородных тел; 2/3 поверхности спаек было покрыто мезотелиоцитами.
Таким образом, экспериментальное моделирование спаечного процесса в брюшной полости животных путем введения аутокрови, вызывало к 10 суткам поствоспалительного периода формирование спаек. Уровень спайкообразования, локализация спаек, их микроскопические характеристики в экспериментах на крысах и на кроликах не разнились.
Изучение межклеточных и клеточно-матриксных механизмов, реализующихся в процессе спайкообразования, макрофагально фибробластического взаимодействия, играющего ключевую роль в регуляции роста соединительной ткани, выявило наличие чрезмерной активности основных клеток соединительной ткани – фибробластов и клеток их микроокружения - макрофагов. Как показали наши исследования, выраженное и распространенное спайкообразование в брюшинной полости при гемоперитонеуме сочеталось с высокой активностью перитонеальных фибробластов - основных клеток-продуцентов межклеточного матрикса соединительной ткани, которые синтезируют как основные волокнистые структуры, в том числе коллаген, специфической маркрной меткой которого является оксипролин, так и основные компоненты аморфного вещества, в том числе гликозаминогликаны. Исследование коллагенсинтетической функции фибробластов, заключающееся в определении в перитонеальной жидкости белковосвязанного оксипролина, продемонстрировало отчетливый рост показателя к 10 суткам после моделирования гемоперитонеума. Его значение превышало аналогичные показатели интактных животных в 7 раз, что свидетельствует об усилении выработки коллагена (табл. 5, рис. 7).
Воздействие верапамила на синтез фибробластами компонентов межклеточного матрикса при моделировании спаечного процесса в брюшной полости
Показанный нами in vitro эффект нормализующего влияния верапамила на функции фибробластов и клеток их микроокружения является патогенетическим обоснованием для проведения исследований новых свойств БМКК верапамила по регуляции образования соединительной ткани при асептическом воспалении брюшины in vivo на разных видах животных. Профилактическое введение верапамила крысам определило достоверное снижение содержания белковосвязанного оксипролина в перитонеальной жидкости к 10 суткам после моделирования аутогемоперитонеума (табл. 26).
Была установлена прямая и тесная корреляционная связь между количеством спаек и содержанием исследуемого биохимического субстрата в перитонеальной жидкости. Плотность этой корреляции прослеживалась как в группе животных без профилактического введения лекарственных средств (серия I, 2-я группа, r=0,92, p 0,05), так и при воздействии верапамила (серия III, 10-я группа, r=0,76, p 0,05) – рис.20.
Несколько более низкий коэффициент корреляции между исследуемыми биохимическими показателями и числом перитонеальных спаек у животных, подвергшихся воздействию верапамила, может быть объяснен дискретностью показателя, характеризующего интенсивность спайкообразования (число спаек, а не их масса, площадь), и потому – преобладанием его нулевых (незначимых) значений у большинства экспериментальных животных данной группы.
Профилактическое внутрибрюшинное введение верапамила кроликам также определяло достоверное снижение его содержания в перитонеальной жидкости к 10 суткам после моделирования гемоперитонеума (табл.26). Была установлена прямая и тесная корреляционная связь между содержанием исследуемого биохимического субстрата в перитонеальной жидкости и количеством спаек (рис. 20).
Плотность этой корреляции прослеживалась как в группе кроликов без медикаментозного воздействия (количество спаек – оксипролин r=0,95, p 0,05), так и в группе животных с введением верапамила (количество спаек – оксипролин r=0,75, p 0,05).
Сопоставление уровней гиалуроновой кислоты в перитонеальной жидкости кроликов с гемоперитонеумом без введения верапамила и в группе животных, получивших данное лекарственное средство одновременно с моделированием асептического воспаления брюшины, также выявило снижение ее уровня в результате действия верапамила (р 0,05, рис 21). При этом плотность корреляционной связи числа перитонеальных спаек с уровнем исследуемого биохимического субстрата в перитонеальной жидкости оставалась высокой (рис. 22)
Таким образом, в условиях нашего опыта уровень белковосвязанного оксипролина и гиалуроновой кислоты в перитонеальной жидкости животных характеризовал снижение анаболической активности фибробластов при гемоперитонеуме под действием верапамила.
Изучение эффективности действия верапамила на процесс окончательной трансформации патологического рубца
Рандомизацию и разделение животных со сформированными рубцами на две группы для сравнительного изучения действия верапамила в составе антирубцового крема (основная группа) и его водно-вазелин-ланолиновой основы (группа сравнения) проводили с помощью генератора случайных чисел. В основной группе и группе сравнения было по 38 животных – по 2 с физиологическими рубцами, по 3 с гипертрофическими келоидными рубцами и по 33 животных с гипертрофическими рубцами. Исследования степени выраженности рубцового процесса, морфо-физиологические характеристики патологических рубцов в сравниваемых группах животных проводили через 10, 30 и 60 суток с момента их формирования.
Животные основной группы (n=38) получали верапамил в составе антирубцового крема 1 раз в сутки, а животным группы сравнения (n=38) наносили водно-вазелин-ланолиновую основу. В последующем проведено исследование влияния верапамила на степень выраженности рубцового процесса, морфо-физиологические характеристики патологических рубцов через 10, 30 и 60 суток с момента их формирования.
Стадия окончательной трансформации (ремоделирования) рубца начиналась, согласно использованной модели через 55 сут после травмы, когда заканчивались процессы формирования рубцовой ткани как таковой и эпителизации поверхности. В течение этой стадии из рубцов исчезали сосуды, волокна коллагена выстраивались вдоль определенной линий, а рубец становится светлым и плотным. До начала экспериментальной терапии группы не отличались составом животных, имеющих разные типы рубцов (таб. 36). В обеих группах преобладали животные с гипертрофическими рубцами (табл. 36). Использованное лечение существенно изменило структуру групп. Если через 10 суток после его начала статистически значимых различий между группами выявлено не было, то через 30 и 60 суток разница по некоторым показателям была более двух раз. В динамику статистически значимо уменьшалось содержание патологических гипертрофических рубцов и увеличивалось содержание нормотрофических рубцов. В большей мере это было характерно для животных основной группы (табл. 36). Тем не менее, в течение 60 суток четвертая стадия (окончательной трансформации) раневого процесса полностью не завершалась. В группе сравнения оставалось 16, а в основной группе 9 животных с патологическими рубцами. Требовалось дополнительное время или коррекция схемы использования препарата.
Эффект верапамила определялся также с использования четырехпольных таблиц сопряженности (табл. 37).
При сравнении результатов лечения основной группы и группы сравнения было установлено, что отношение шансов (ОШ) больше 1,0, это свидетельствовало о наличии положительного влияния препарата на физиологическое заживление раны и способствовало переходу патологических рубцов в физиологические.
При анализе рубцовой ткани белых крыс отмечены особенности их морфологического строения в зависимости от длительности применения лекарственных препаратов. Через 10 суток после начала лечения гипертрофических рубцов, в сравнении с 55 сутками раневого процесса, различия были незначительные. Выявлялся палилломатоз эпителия в эпидермисе, клетки базального слоя гиперхромные с высоким ядерно-цитоплазматическим индексом, вакуольная дистрофия эпителиоцитов, грубые толстые коллагеновые волокна (рис. 39). Все это было характерно для гипертрофированных рубцов, сформировавшихся еще через 55 суток после травмы (рис. 34, 36).
Существенно то, что уже после начала лечения (10 сутки) параллельно воспалительным и гипертрофическим изменениям в рубцовой ткани и в эпидермисе в группе сравнения часто наблюдались дистрофические процессы разной степени выраженности (рис. 40). Формировались очаги фибриноидного набухания (рис. 40). Перифокально определялись скопления фибробластов (рис. 40), что указывало на активную репаративную перестройку ткани рубца.
В глубоких отделах рубцов, на границе с подкожно-жировой клетчаткой, определялись очаги гиалиноза темно-эозинофильного цвета. Дистрофические изменения клеток многослойного плоского эпителия, помимо вакуольной дистрофии, проявлялись в нарушенном (пара- и дискератоз) и чрезмерном (гиперкератоз) созревании клеток. Кроме того, в клетках базального слоя определялись признаки повышенной пролиферативной активности, что является проявлением усиленной регенерации в ответ на воспаление и альтерацию.
Особенностью строения созревших экспериментальных рубцов в начале лечения было большое содержание конволют (особых двуслойных упаковок) тонкостенных сосудов со структурно сформированными стенками в верхних отделах рубцов (главным образом - в области лимфогистиоцитарных инфильтратов) и сравнительно немногочисленные, с узким просветом и толстыми склерозированными стенками, сосуды в более глубоких отделах (рис. 41).
Выявлялись эпителиальные акантотические выросты. В фиброзной ткани верхний слой состоял из рыхло расположенных, тонких коллагеновых волокон с обилием тонкостенных капилляров. Более глубокий слой состоял из компактно расположенных толстых коллагеновых волокон. Между пучками тонких коллагеновых волокон выявлено обилие незрелых соединительнотканных клеток (фибробластов), единичные толстостенные сосуды; между толстыми пучками -зрелые соединительнотканные клетки (фиброциты), единичные толстостенные сосуды.
В зоне рубца также отмечалась вакуольная дистрофия эпителиоцитов, гиперхромия клеток базального слоя эпидермиса, в сетчатом слое дермы - обилие капилляров со структурно сформированными стенками и множество фибробластов между толстыми коллагеновыми волокнами (рис. 42).
В группе сравнения через 30 и даже 60 суток от начала лечения определялись единичные перикапиллярные лимфогистиоцитарные инфильтраты. В эпидермисе выявлялись умеренная вакуольная дистрофия клеток и гиперкератоз (рис. 42). Под слоем базальных клеток определялось фибриноидное набухание коллагеновых волокон, а в глубоких отделах рубца, на границе с подкожно-жировой клетчаткой - отдельные гиалиновые волокна.