Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Роль процессов свободнорадикального окисления в метаболизме бактерий, развитии инфекции и действииантибактериальных средств (обзор литературы) 17
1.1. Роль процессов свободнорадикального окисления в жизнедеятельности бактерий 17
1.2. Роль свободнорадикального окисления в механизме противомикробного действия антибактериальных средств 23
1.3. Роль процессов свободнорадикального окисления в реализации противомикробного иммунитета 29
1.4. Окислительный стресс и его коррекция при бактериальных инфекциях 38
1.5. Резюме 49
Глава 2. Материалы и методы исследования 52
2.1. Дизайн исследования 52
2.2. Исследования in vitro
2.2.1. Исследования на периодических бактериальных культурах 52
2.2.2. Исследование химического взаимодействия антибактериальных средств и антиоксидантов 57
2.3. Исследования in vivo 58
2.3.1. Экспериментальные животные 58
2.3.2. Дозирование фармакологических веществ 58
2.3.3. Изучение влияния антиоксидантов на течение экспериментального перитонита крыс 59 2.3.4. Изучение влияния антибактериальных средств и их сочетнаний с антиоксидантами на печень, почки и процессы свободнорадикального окисления 60
2.3.5. Изучение состояния печени, почек и свободнорадикального окисления при применении антибактериальных средств и его комбинаций с антиоксидантами в условиях экспериментального перитонита 61
2.3.6. Методы биохимических исследований крови 61
2.4. Статистическая обработка результатов 71
Глава 3. Влияние антиоксидантов на развитие периодических бактериальных культур и течение экспериментального бактериального перитонита 72
3.1. Влияние антиоксидантов на развитие периодической культуры Escherichia coli и течение экспериментального перитонита 72
3.2. Влияние антиоксидантов на развитие периодической культуры Klebsiella pneumoniae и течение экспериментального перитонита 80
3.3. Резюме 87
Глава 4. Взаимодействие антиоксидантов и антибактериальных средств 88
4.1. Взаимодействие гентамицина и антиоксидантов 88
4.1.1. Химическое и фармакологическое взаимодействие гентамицина и антиоксидантов in vitro 88
4.1.2. Влияние гентамицина на печень, почки и процессы свободнорадикального окисления и его коррекция антиоксидантами 98
4.1.3. Состояние печени, почек и свободнорадикального окисления при применении гентамицина и его комбинаций с антиоксидантами в условиях экспериментального перитонита 101
4.2. Взаимодействие ципрофлоксацина и антиоксидантов 107
4.2.1. Химическое и фармакологическое взаимодействие ципрофлоксацина и антиоксидантов in vitro 107
4.2.2. Влияние ципрофлоксацина на печень, почки и процессы свободнорадикального окисления и его коррекция антиоксидантами 117
4.2.3. Состояние печени, почек и свободнорадикального окисления при применении ципрофлоксацина и его комбинаций с антиоксидантами в условиях экспериментального перитонита 120
4.3. Взаимодействие цефтазидима и антиоксидантов 125
4.3.1. Химическое и фармакологическое взаимодействие цефтазидима и антиоксидантов in vitro 125
4.3.2. Влияние цефтазидима на печень, почки и процессы свободнорадикального окисления и его коррекция антиоксидантами 135
4.3.3. Состояние печени, почек и свободнорадикального окисления при применении цефтазидима и его комбинаций с антиоксидантами в условиях экспериментального перитонита 138
4.4. Взаимодействие хлорамфеникола и антиоксидантов 144
4.4.1. Химическое и фармакологическое взаимодействие хлорамфеникола и антиоксидантов in vitro 144
4.4.2. Влияние хлорамфеникола на печень, почки и процессы свободнорадикального окисления и его коррекция антиоксидантами 153
4.4.3. Состояние печени, почек и свободнорадикального окисления при применении хлорамфеникола и его комбинаций с антиоксидантами в условиях экспериментального перитонита 156
4.5. Взаимодействие тетрациклина и антиоксидантов 161
4.5.1. Химическое и фармакологическое взаимодействие тетрациклина и антиоксидантов in vitro 161
4.5.2. Влияние тетрациклина на печень, почки и процессы свободнорадикального окисления и его коррекция антиоксидантами 170
4.5.3. Состояние печени, почек и свободнорадикального окисления при применении тетрациклина и его комбинаций с антиоксидантами в условиях экспериментального перитонита 173
4.6. Резюме 178
Заключение 182
Выводы 231
Практические рекомендации 233
Список литературы
- Роль процессов свободнорадикального окисления в реализации противомикробного иммунитета
- Исследование химического взаимодействия антибактериальных средств и антиоксидантов
- Влияние антиоксидантов на развитие периодической культуры Klebsiella pneumoniae и течение экспериментального перитонита
- Взаимодействие ципрофлоксацина и антиоксидантов
Введение к работе
Актуальность темы исследования. Использование антибактериальных средств привело к появлению и широкому распространению резистентных микроорганизмов, в некоторых случаях устойчивых к нескольким классам антибактериальных препаратов (Козлов Р.С. и соавт., 2015; Hoban D.J. et al., 2011; Rice L.B., 2009). В связи с этим важной современной особенностью инфекционных заболеваний является отсутствие стабильной картины чувствительности возбудителей к антимикробным средствам, обусловливающее возможную клиническую неэффективность химиотерапевтических агентов (Голуб А.В. и соавт., 2011). Европейская сеть по эпиднадзору за устойчивостью к антимикробным препаратам («EARS-Net») ежегодно регистрирует до 400000 случаев развития полирезистентных инфекций, селекция которых вызвана, прежде всего, нерациональным использованием антибиотиков и антисептиков. Многие исследователи отмечают, что если существующие негативные тенденции не изменятся, то медицина столкнется с проблемой полувековой давности, когда еще отсутствовали антибиотики (Косинец А.Н. и соавт., 2014; Козлов Р.С., 2009; Kapil A., 2005). В связи с этим совершенствование антимикробной химиотерапии, направленное на повышение эффективности антибактериальных средств и снижение числа полирезистентных штаммов возбудителей инфекционных заболеваний, остается высокоактуальной задачей.
Среди возбудителей инфекций особое место занимает условно-патогенная микрофлора. Массовое распространение штаммов, устойчивых к действию антибактериальных средств, в популяциях условно-патогенных микроорганизмов стало важной проблемой клинической медицины в связи с их более высокими адаптационными возможностями по сравнению с возбудителями классических инфекций. Особенно проблемной является антибиотикорезистентность бактерий семейства Enterobacteriaceae, вызывающих широкий спектр заболеваний разной локализации и тяжести течения (Анганова Е.В., 2012; Билев А.Е. и соавт., 2011; Сидоренко С.В., 2004; Walsh T.R. et al., 2012).
С начала XX века модель лечения инфекционных больных традиционно укладывается в знаменитую триаду Эрлиха «лекарство-микроорганизм-макроорганизм». По мнению Падейской Е.Н. (2010), триада Эрлиха кратко, но очень точно отражает сложный процесс взаимодействия ее компонентов, каждый из которых характеризуется индивидуальными биологическими свойствами и строго определенными функциями. При этом клиническая эффективность препарата зависит от целого ряда факторов и взаимного влияния и взаимодействия компонентов.
Однако фармакотерапия больного с бактериальной инфекцией в подавляющем большинстве случаев не ограничивается применением антибактериального средства и включает в себя другие лекарственные вещества, эффекты которых направлены, прежде всего, на организм больного. При этом система «лекарство-микроорганизм-макроорганизм» усложняется за счет дополнения другими веществами, и конечная эффективность лечения больного будет определяться не только взаимодействиями внутри «триады Эрлиха», но и влиянием средств вспомогательной терапии на зараженный макроорганизм, микроорганизм и активность применяемого антибактериального препарата.
В связи с признанием универсальной роли усиления процессов свободнора-дикального окисления (СРО) в развитии различных заболеваний, в т.ч. инфекционных, в качестве вспомогательной терапии больным с бактериальными инфекциями могут назначаться антиоксиданты (АО) (Невская Н.А., 2009; Нечаева Г.И. и соавт., 2004; Lowes D.A. et al., 2013). По нашим данным, более половины специалистов включают в комплексную терапию больных c бактериальными инфекциями вещества с АО-активностью (Мирошниченко А.Г. и соавт., 2012). Применение последних считается патогенетически обоснованным, так как любая бактериальная инфекция сопровождается повышенной генерацией активных форм кислорода (АФК), повреждающих биомолекулы и вносящих существенный вклад в развитие нарушений клеточного метаболизма, тканевой и органной дисфункции (Lowes D.A. et al., 2013; Ruggeri A.J. et al., 2010; Exline M.C., Crouser E.D., 2008; Ding S. et al., 2007).
С другой стороны, усиление процессов СРО в условиях бактериальной инфекции является универсальным естественным защитным механизмом. Гиперпродукция АФК («респираторный взрыв») играет ключевую роль в реализации функций фагоцитов (Bedard K., Krause K.H., 2007). Установлено, что скорость гибели возбудителей в организме человека прямопропорциональна скорости продукции АФК макрофагами (Voyich J.M. et al., 2005; Nathan C.F., 1987; Fanton J.C., Ward P.A., 1982). Нарушение образования клетками супероксиданион-радикала может привести к повышению восприимчивости организма к инфекционным заболеваниям (Babior B.M., 1978). Кроме того, в низких концентрациях радикальные частицы выступают в качестве внутриклеточных сигнальных молекул, обеспечивающих нормальное протекание биохимических процессов (Chen K. et al., 2008; D'Autreaux B., Toledano M.B., 2007; Gloire G. et al., 2006; Tonks N.K., 2005). При этом активация собственных АО-систем является важнейшим компонентом защиты бактерий от окислительного повреждения в условиях иммунного ответа (Wang S. et al., 2009; Voyich J.M. et al., 2005).
По некоторым данным, бактерицидное действие многих антибактериальных средств имеет общий механизм, связанный с генерацией гидроксильных радикалов и развитием окислительного стресса в бактериальных клетках. Это подтверждается взаимосвязью степени бактерицидного эффекта с уровнем ОН-радикалов (Dwyer D.J. el al., 2007; Kohanski M.A. et al., 2007). В связи с этим АО могут уменьшать действие таких химиотерапевтических средств, и, соответственно, снижать эффективность лечения (Goswami M. et al., 2007).
Таким образом, целесообразность применения АО в условиях антибактериальной фармакотерапии носит противоречивый характер. В связи с этим изучение влияния АО на процессы размножения патогенных бактерий и антибактериальную активность химиотерапевтических средств является актуальным и может открыть новые перспективы совершенствования лечения инфекционных больных.
Степень разработанности. Вещества с антиоксидантным типом действия довольно продолжительное время применяются в комплексной терапии многих заболеваний, однако анализ существующих на настоящий момент данных показал, что вопрос целесообразности использования АО в условиях бактериальной инфекции остается открытым. Это связано с тем, что многие рекомендации, указывающие на необходимость фармакологической коррекции пероксидации, основаны лишь на
регистрации повышения интенсивности процессов СРО при инфекции без реального практического опыта использования АО, изучения влияния их на развитие возбудителя и активность антибактериальных средств. Имеющиеся результаты исследований in vitro, опубликованные авторами разных стран, не позволяют однозначно определить рациональные комбинации АО и антибактериальных средств, так как не учитывают возможные взаимодействия в системе «макроорганизм – микроорганизм – антибактериальное средство – АО», возникающие при введении препаратов в инфицированный организм. Кроме того, в научной литературе отсутствуют данные о сравнительной чувствительности контрольных и клинических штаммов одного вида к воздействию комбинаций антибактериальных средств и АО.
Цель исследования – оценка изменения активности химиотерапевтических средств в отношении условно-патогенных бактерий (на примере основных клинически значимых представителей семейства Enterobacteriaceae – Escherichia coli и Klebsiella pneumoniae) под влиянием антиоксидантов.
Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:
-
установить возможность химического взаимодействия между антибактериальными веществами (гентамицин, ципрофлоксацин, цефтазидим, хлорамфеникол, тетрациклин) и антиоксидантами (восстановленный глутатион, аскорбиновая кислота, N-ацетилцистеин, метилэтилпиридинол) in vitro;
-
изучить влияние антиоксидантов на развитие периодических культур контрольных и клинических штаммов Escherichia coli и Klebsiella pneumoniae;
3) исследовать закономерности изменения антибактериальной активности
химиотерапевтических средств в отношении периодических культур бактерий (in
vitro) под действием антоксидантов;
-
изучить влияние антибактериальных средств и их комбинации с антиоксидантами на процессы свободнорадикального окисления у крыс;
-
установить влияние антиоксидантов на гепато- и нефротоксичность антибактериальных средств;
-
выявить изменения процессов свободнорадикального окисления в условиях экспериментального бактериального перитонита крыс и возможности их коррекции с помощью антиоксидантов;
-
изучить влияние комбинаций антиоксидантов с антибактериальными средствами на процессы свободнорадикального окисления у крыс с экспериментальным бактериальным перитонитом.
Научная новизна исследования. Методом высокоэффективной жидкостной хроматографии в сочетании с тандемной масс-спектрометрией (ВЭЖХ-МС) было доказано отсутствие химического взаимодействия антибактериальных средств (ген-тамицин, ципрофлоксацин, цефтазидим, хлорамфеникол, тетрациклин) с АО (восстановленный глутатион, аскорбиновая кислота, метилэтилпиридинол, N-ацетилцистеин). Впервые проведено сравнительное изучение влияния ряда АО на активность антибактериальных средств различных классов in vitro, а также в условиях экспериментальной инфекции. Установлено, что восстановленный глутатион является универсальным соединением, обеспечивающим снижение эффективности многих антибактериальных средств. Выяснено, что синтетический АО метилэтил-пиридинол имеет схожий с аминогликозидами механизм антимикробного действия и является синергистом по отношению к другим классам антибактериальных
средств. Установлено, что модулирующая активность АО в отношении действия антибактериальных средств различается между штаммами одного вида микроорганизма. Выяснено, что введение метилэтилпиридинола позволяет не только эффективно преодолеть развитие окислительного стресса, но и снизить выраженность печеночной и почечной дисфункций при экспериментальном перитоните, вызванном Escherichia coli или Klebsiella pneumoniae. На примере тетрациклина показано, что вещества, оказывающие токсическое действие на органы элиминации ксенобиотиков, могут вызывать ложную картину усиления пероксидации за счет накопления продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ). Показано, что уровень продуктов ПОЛ не всегда отражает интенсивность воспалительного процесса при бактериальной инфекции, а маркеры СРО не могут служить показателем эффективности антибактериальной терапии в случае применения антибактериальных средств, влияющих на процессы пероксидации.
Теоретическая и практическая значимость исследования. Разработаны модели in vitro и in vivo для исследования веществ, влияющих на активность антибактериальных средств. Обоснованы причины необходимости динамического наблюдения за развитием периодических бактериальных культур при исследовании веществ, влияющих на размножение бактерий и их чувствительность к антибактериальным средствам. Доказано, что метод разведения с интерпретацией по конечной точке не применим для определения чувствительности микроорганизмов к цефтазидиму. Экспериментально обоснованы принципы применения АО в зависимости от их влияния на развитие бактерий, активности антибактериального средства, а также влияния последнего на процессы СРО и функцию выделительных органов. Установлено, что измерение активности щелочной фосфатазы (ЩФ) путем регистрации разложения фосфатированных субстратов не может выступать в качестве достоверного показателя печеночной дисфункции при тяжелых инфекциях, вызванных грамотрицательными микроорганизмами, за счет того, что эндотоксины последних, содержащиеся в биологическом материале, могут конкурировать за активный центр фермента. Установлено, что использование АО в условиях химиотерапии гентамицином противопоказано вследствие уменьшения антибактериальной активности антибиотика и незначительного их влияния на его нефро-токсичность. Результаты исследования расширяют знания относительно совместного применения антибактериальных средств и АО при бактериальной инфекции.
Методология и методы исследования. Исследование проведено в научно-исследовательском институте биологической медицины ФГБОУ ВО «Алтайский государственный университет» и на кафедре фармакологии ФГБОУ ВО «Алтайский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации. Работа носит экспериментальный характер и включает в себя химико-аналитические методы (изучение взаимодействия антибактериальных средств и АО ВЭЖХ-МС, бактериологические методы (изучение бактериальных культур in vitro), биохимические методы (измерение плазменных концентраций общего белка, церулоплазмина, мочевины и креатинина, тиобарбитурат-реактивных продуктов (ТБРП), активности аланинаминотрансферазы (АЛТ) и ЩФ в плазме крови, измерение активности каталазы, глутатионпероксидазы (ГПО), концентрации восстановленного глутатиона и гемоглобина в эритроцитах), а также непараметрические методы статистического анализа.
С позиции методологии научного познания для решения поставленных задач применены экспериментальные (наблюдение, эксперимент, сравнение, моделирование) и эмпирическо-теоретические (абстрагирование, индукция, дедукция) методы.
Расчет дозирования и режимы введения фармакологических агентов основаны на эффективности в экспериментальных исследованиях, терапевтических дозах для человека c последующим межвидовым перерасчетом. Расчет концентраций антибактериальных средств для исследований in vitro проводился в соответствии с методическими указаниями МУК 4.2.1890-04 «Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.
Дизайн проведенного исследования планировался с учетом рекомендаций по проведению доклинических исследований, методическими указаниями по определению чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам и одобрен локальным этическим комитетом.
Положения, выносимые на защиту
-
Взаимодействие между бактерией, химиотерапевтическим средством и антиоксидантом носит индивидуальный характер и определяет целесообразность назначения комбинаций указанных лекарственных средств в условиях бактериальной инфекции. Модулирующая активность антиоксиданта в отношении активности антибактериального средства различается не только в пределах одного семейства, но и одного вида бактерии, что свидетельствует о некорректности переноса соответствующих свойств антиоксиданта в отношении конкретного штамма на другие штаммы того же вида.
-
Антибактериальные средства (гентамицин, ципрофлоксацин, цефтазидим, хлорамфеникол, тетрациклин) и антиоксиданты (восстановленный глутатион, аскорбиновая кислота, метилэтилпиридинол, N-ацетилцистеин) не вступают в химическое взаимодействие, в том числе не образуют устойчивых комплексов, при температуре 37С.
-
Для установления влияния антиоксиданта на активность антибактериального средства in vitro необходимо динамическое наблюдение за развитием периодической бактериальной культуры. Особенности фармакодинамики антибактериального средства, ограниченность питательных ресурсов инкубационной среды, накопление токсических продуктов может привести к ошибочной интерпретации по результатам одиночного измерения (обычно через 24 часа).
-
Использование антиоксидантов (аскорбиновая кислота, метилэтилпириди-нол, N-ацетилцистеин) в условиях химиотерапии гентамицином противопоказано, так как приводит к снижению эффективности фармакотерапии.
Внедрение результатов научных исследований. На основании данных диссертационного исследования запланировано проведение целенаправленных клинических исследований по повышению эффективности комплексной антибактериальной терапии больных с бактериальными инфекциями, вызванными представителями семейства Enterobacteriaceae.
Результаты исследования внедрены в учебный процесс кафедры экологии, биохимии и биотехнологии, кафедры физико-химической биологии и биотехнологии Алтайского государственного университета (г. Барнаул), кафедры фармаколо-
гии, кафедры микробиологии с вирусологией Алтайского государственного медицинского университета (г. Барнаул), кафедры фармакологии, кафедры микробиологии, вирусологии, иммунологии Курского государственного медицинского университета (г. Курск).
Результаты исследования внедрены в работу лабораторий КГБУЗ «Диагностический центр Алтайского края» (г. Барнаул), ООО «Клинико-диагностическая лаборатория «Здоровье» (г. Барнаул), работу лабораторий и лечебную работу КГБУЗ «Городская больница №5, г. Барнаул» (г. Барнаул), НУЗ «Отделенческая клиническая больница на ст. Барнаул» ОАО «РЖД» (г. Барнаул).
Степень достоверности и апробация результатов. Полученные данные достоверны, что обеспечивается применением современных методологических подходов, лабораторных методов, качественных реактивов и оборудования. Обработка результатов проводилась с использованием специализированного программного обеспечения и адекватных методов статистического анализа.
Материалы диссертации доложены и обсуждены на заседаниях научно-исследовательского института биологической медицины ФГБОУ ВО «Алтайский государственный университет», кафедры фармакологии и проблемной комиссии по фармакологии и фармации ФГБОУ ВО АГМУ Минздрава России (2011-2017), I Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых «Сибирский медико-биологический конгресс» (Барнаул, 2011), 77-й Всероссийской научной конференции студентов и молодых ученых «Молодежная наука и современность» (Курск, 2012), II Всероссийской научной конференции молодых ученых «Проблемы биомедицинской науки третьего тысячелетия» (Санкт-Петербург, 2012), VII Международной научной конференции молодых ученых-медиков (Курск, 2013), XX Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2013), Заочной научно-практической конференции «Микробиология в современной медицине» (Казань, 2013), Международной конференции «Молекулярная эпидемиология актуальных инфекций» (Санкт-Петербург, 2013), III Всероссийской научной конференции молодых учёных «Проблемы биомедицинской науки третьего тысячелетия» (Санкт-Петербург, 2016).
По теме диссертации опубликовано 26 печатных работ, в том числе 17 – в изданиях из Перечня российских рецензируемых научных журналов, в которых должны быть опубликованы научные результаты диссертации на соискание ученой степени доктора наук, утвержденного Высшей аттестационной комиссией при Минобрнауки России.
Апробация диссертации проведена на расширенном заседании научно-исследовательского института биологической медицины ФГБОУ ВО «Алтайский государственный университет» с участием кафедры фармакологии ФГБОУ ВО АГМУ Минздрава России.
Личный вклад автора. Автору принадлежит основная роль при определении направления исследования, постановке цели и задач, формировании дизайна исследования. Автором проведен анализ отечественных и зарубежных источников по теме выполняемой диссертации, на основании которого выдвинуты рабочие гипотезы о возможных направлениях влияния АО на активность антибактериальных средств.
Вклад автора является определяющим и заключается в его непосредственном участии в качестве исполнителя на всех этапах исследования.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 284 страницах машинописного текста, иллюстрирована 14 рисунками и 75 таблицами, состоит из введения, четырех глав (обзор литературы, материалы и методы исследования, 2 главы с результатами), заключения и списка литературы, в котором приведено 458 источника, из них 355 – иностранных авторов.
Роль процессов свободнорадикального окисления в реализации противомикробного иммунитета
Механизмам бактерицидного действия антибактериальных средств посвящены многие исследования. Для улучшения эффективности антибактериальной терапии необходимо детальное изучение механизмов, приводящих к гибели бактериальных клеток после действия антибиотиков широкого спектра. В этом отношении одним из перспективных направлений является изучение мишеней системы клеточного ответа на действие антибактериальных средств (АБС) с целью предотвращения развития устойчивости бактерий к химиотерапии [196].
Как полагают, гибель микроорганизмов в условиях воздействия АБС происходит вследствие взаимодействия препарата с конкретными внутриклеточными мишенями и нарушения соответствующих биохимических процессов [421]. Обнаружено, что бактерицидный эффект некоторых АБС реализуется за счет накопления гидроксильных радикалов в токсических концентрациях, а приобретение резистентности к таким веществам и появление так называемых пер-систеров достигается путем активации метаболических путей, препятствующих указанному накоплению [143]. Описанная концепция также подтверждается взаимосвязью степени бактерицидного эффекта химиотерапевтического средства с уровнем гидроксильных радикалов [252, 104].
Dwyer D.J. et al. (2007), а также Kohanski М.А. et al. (2007) в экспериментах, проведенных на Escherichia coli, установили, что фторхинолон норфлокса-цин, -лактамный антибиотик ампициллин и аминогликозид канамицин, несмотря на известные механизмы действия, фактически вызывают гибель бактериальной клетки за счет индукции окислительного стресса [252, 104]. Показан вклад АФК в антибактериальное действие фторхинолона ципрофлоксацина [151, 247]. С помощью системного биологического подхода были идентифицированы аналогичные механизмы гибели бактериальных клеток в результате действия фторхинолона норфлоксацина – ингибитора ДНК-гиразы [252]. Хорошо известно, что фторхинолоны реализуют свое антибактериальное действие путем связывания с бактериальной ДНК-гиразой (топоизомераза II, продукт экспрессии gyrA и gyrB) и топоизомеразой IV (продукт экспрессии parC и parE) с последующим нарушением процессов суперспирализации ДНК, образованием разрывов и блокадой репликации [384]. Проведен фенотипический анализ и анализ с использованием микрочипов для определения дополнительных мишеней норфлок-сацина при действии на кишечную палочку [252]. В результате было установлено, что норфлоксацин вызывает окислительное повреждение клетки за счет увеличения образования АФК, вызванного отчасти за счет повреждения участков ДНК, регулирующих внутриклеточный метаболизм ионов железа. Показано, что ингибиторы ДНК-гиразы приводят к активации SoxR-опосредованного ответа на супероксидный стресс [374], оперонов восстановления поврежденных железо-серных кластеров [139], Fur-регулируемых процессов импорта и утилизации железа, а также SOS-ответа на повреждение ДНК [159]. Показано, что эти события способствуют гиперпродукции гидроксильных радикалов в реакции Фентона, играющих важную роль в механизме бактерицидного действия норфлоксацина. Важно отметить, что генерация АФК не связана с окислительно-восстановительными превращениями антибактериального средства: при изучении устойчивых к норфлоксацину штаммов Escherichia coli повышение генерации гидроксильных радикалов не отмечалось [252]. Опираясь на эти данные, Kohanski M.A. et al. (2007) установили, что все бактерицидные антибактериальные средства вне зависимости от их клеточной мишени способствуют генерации гидроксильных радикалов в летальных концентрациях как у грамотрицательных, так и у грамположительных микроорганизмов [104]. Основным источником этих радикалов является цикл трикарбоновых кислот в условиях транзитного дефицита НАДН и дестабилизации железо-серных кластеров. Также сообщается, что фторхинолоны являются мутагенами и при поглощении ультрафиолетового излучения могут вызывать окислительное повреждение ДНК [244]. Другие исследования показали, что норфлоксацин в суббактерицидных дозах вызывает мутации в S. typhimurium TA102 и TA104, но не вызывает генотоксические мутации в Escherichia coli Pol A–/PolA+ [234]. Мутагенное действие норфлоксацина можно предотвратить применением антиоксидан-тов. По данным Krizkova L. et al. (2000), применение кофейной и феруловой кислот ингибирует офлоксацин-индуцируемый мутагенез в Euglena gracilis [369]. Окислительное повреждение ДНК S. typhimurium TA102, вызванное норфлокса-цином, ингибируется -каротином или экстрактами растений, таких как Roheo discolor [234, 121]. Кроме того, Самойлова З.Ю. и соавт. (2012) указывают на пробактериальный эффект кверцетина, и, в меньшей степени, танина в присутствии ципрофлоксацина [80]. Эти данные косвенно подтверждают, что норфлок-сацин и ципрофлоксацин являются веществами, генерирующими АФК. На основании того, что последние вызывают повреждение генетического материала клеток макроорганизма, по результатам проведенных исследований Alba M.A. (2008) предлагают для уменьшения риска генотоксичности использовать норфлоксацин совместно с антиоксидантами – витаминами Е и С [175]. Витамин С оказывал минимальный антимутагенный эффект по сравнению с витамином Е, так как в присутствии ионов двухвалентных металлов аскорбиновая кислота может выступать в качестве прооксидантного вещества [291].
Аминогликозиды (стрептомицин, гентамицин и другие) являются очень мощными антибиотиками широкого спектра действия [328]. Точный механизм действия антибиотиков этого класса окончательно не выяснен. Установлено, что они нарушают синтез белка путем связывания с 30S-субъединицей рибосом [183, 230, 328]. Некоторые исследования показали, что антибиотики стимулируют образование АФК в некоторых видах бактерий [364].
Исследование химического взаимодействия антибактериальных средств и антиоксидантов
Аланинаминотрансфераза (АЛТ) относится к группе аминотрансфераз и катализирует обратимую реакцию дезаминирования аминокислоты аланина. Активность АЛТ оценивалась в качестве маркера показателя дисфункции печени (цитолитического синдрома) при применении лекарственных средств и/или абдоминальном сепсисе, сопровождающем экспериментальный перитонит [39, 149]. Активность фермента определяли с использованием набора ООО «Витал Диагностикс СПб» (Россия).
Принцип метода основан на образовании пирувата в результате взаимодействия альфа-кетоглутарата и L-аланина, катализируемого АЛТ. Концентрация пирувата определяется фотометрически на основе его реакции с 2,4-дифенилгидразином. Для этого к 0,05 мл плазмы крови добавляли 0,25 мл субстратной смеси на фосфатном буфере, содержащем 0,2 М D,L-аланина и 2 мМ альфа-кетоглутарата). Полученную смесь инкубировали на водяной бане при 37С 30 мин, после чего добавляли 0,25 мл 1 мМ раствора 2,4-динитрофенил-гидразина и инкубировали 20 мин при комнатной температуре. Реакцию останавливали добавлением 2,5 мл 0,4 М раствора гидроксида натрия. Для приготовления холостой пробы 0,05 плазмы добавляли вместе с раствором 2,4-динитрофенилгидразина. Опытные пробы фотометрировали против холостых проб на анализаторе ФЛЮОРАТ-02-АБЛФ-Т (Россия) при 545 нм и длине оптического пути 1 см. Расчет активности фермента производили по калибровочному графику, построенному путем фотометрирования растворов пирувата натрия возрастающей концентрации. ЩФ широко распространена в тканях. Особенно много этого фермента в слизистой оболочке кишечника, эпителиоцитах желчных протоков, образующих просвет желчных канальцев, проксимальных отделах извитых канальцев почек, плаценте, легких. Повышение активности наблюдается при поражении гепато-билиарной системы, прободении кишечника, сепсисе, бактериальных инфекциях [39]. Активность ЩФ определяли с использованием набора ООО «Витал Диа-гностикс СПб» (Россия).
Принцип метода основан на гидролизе под действием ЩФ п-нитрофенилфосфата с образованием п-нитрофенола. Количество образовавшегося в единицу времени п-нитрофенола, пропорциональное активности фермента, определяется по оптической плотности образца при 405 нм. В опытную и контрольную пробирки вносили по 0,5 мл рабочего реагента, полученного смешением 27 мМ раствора п-фенилфосфата с 55 мМ глициновым буфером (рН 10,4) в соотношении 4:1. В опытную пробирку добавляли 0,05 мл плазмы крови. Пробы инкубировали на водяной бане 30 минут при 37С и охлаждали до комнатной температуры. После этого в опытную и контрольную пробы вносили по 5 мл 20 мМ гидроксида натрия, в контрольную пробу добавляли 0,05 мл плазмы крови. Опытные пробы фотометрировали с помощью фотоэлектроколориметра КФК-3 (СССР) при длине волны 405 нм и толщине поглощающего слоя 1 см против контрольных проб. Расчет активности ЩФ производили по калибровочной кривой, построенной путем фотометрирования растворов п-нитрофенола возрастающей концентрации.
Мочевина – синтезируемый в печени конечный продукт детоксикации эндогенного аммиака. Существенное повышение концентрации мочевины в плазме указывает на нарушение функции почек [39]. Концентрацию мочевины определяли с использованием набора ООО «Витал Диагностикс СПб» (Россия).
Принцип метода основан на том, что мочевина с диацетилмонооксимом в кислой среде в присутствии тиосемикарбазида и трехвалентного железа образует окрашенный комплекс. Интенсивность окраски пропорциональна концентрации мочевины в пробе. Перед проведением анализа готовили рабочий реагент путем смешивания 10 мл 40 мМ раствора диацетилмонооксима, 10 мл 7,2 М раствора серной кислоты, 2 мл 38,4 мМ раствора тиосемикарбазида гидрохлорида, 0,4 мл 5 мМ раствора хлорного железа и 58 мл дистиллированной воды. Для приготовления опытной пробы 2 мл рабочего реагента смешивали с 0,01 мл плазмы крови, контрольной пробы – с 0,01 мл дистиллированной воды, калибровочной пробы – с 0,01 мл калибратора (8,33 мМ раствор мочевины). Пробы тщательно перемешивали и инкубировали на кипящей водяной бане 10 минут. После окончания инкубации пробы охлаждали под проточной водой и измеряли оптическую плотность опытной и калибровочной проб против контрольной пробы в кюветах с толщиной поглощающего слоя 5 мм при длине волны 540 нм с помощью фото-электроколориметра КФК-3 (СССР). Расчет концентрации мочевины в плазме крови проводили по формуле: D С = оп 8,33, Dкал где: С – концентрация мочевины, ммоль/л; Dоп – оптическая плотность опытной пробы; Dкал – оптическая плотность калибровочной пробы.
Влияние антиоксидантов на развитие периодической культуры Klebsiella pneumoniae и течение экспериментального перитонита
Аминогликозиды являются мощными антибиотиками и единственными ингибиторами биосинтеза белка с бактерицидным типом действия. Введение в инкубационную среду гентамицина в сублетальной концентрации приводит к стойкому подавлению бактериальной биомассы всех изучаемых штаммов кишечной палочки: фаза адаптации длится более 12 часов, лог-фаза реализуется за пределами наблюдений в условиях эксперимента (в промежутке между 12 и 24 часами инкубации, табл. 15-17).
Анализ методом ВЭЖХ-МС показал отсутствие химического взаимодействия между гентамицином и изучаемыми антиоксидантами, включая образование устойчивых комплексов. Однако, несмотря на это, все антиоксиданты феноменально снижают чувствительность бактерий к антибиотику. В наиболее высоких концентрациях восстановленный глутатион вызывает значимый прирост бактериальной биомассы уже начиная с 4 часа инкубации. С течением времени пробактериальное действие глутатиона становится заметным и при его более низких концентрациях. Так, через 12 часов после начала инкубации для каждого штамма становится наиболее отчетливой прямопропорциональная зависимость между снижением эффективности гентамицина и концентрацией восстановленного глутатиона (при 4 мМ концентрации глутатиона оптическая плотность штамма ЕС1 превышает контрольные значения в 5 раз, для штамма ЕС2 в 8,2 раза, для штамма ЕС3 – в 4,3 раза). Обращает на себя внимание тот факт, что наибольшая концентрация восстановленного глутатиона позволяет уже к 12 часу эксперимента приблизиться к возможному максимуму развития культуры, обусловленному питательными возможностями инкубационной среды.
Аскорбиновая кислота оказывает похожее, но менее выраженное действие. Значимый прирост бактериальной биомассы для всех изучаемых штаммов E. coli наблюдается только через 10 часов после инкубации, он носит прямопро-порциональную зависимость от концентрации антиоксиданта. К 12 часу наблюдений аскорбиновая кислота в концентрации 4 мМ обусловливает значимый прирост бактериальной биомассы на 150% по сравнению с контролем для штамма ЕС1, на 160% – для штамма ЕС2 и на 175% – для штамма ЕС3.
Метилэтилпиридинол, антибактериальные свойства которого были установлены и описаны ранее, не только не подавляет развитие бактериальных культур, но и оказывает наиболее выраженное антагонистическое действие в отношении к гентамицину по сравнению с другими изучаемыми антиоксидантами. Обнаружено, что метилэтилпиридинол в концентрации 4 мМ уже к 6 часу инкубации усиливает развитие изучаемых штаммов E. coli в 5-7 раз. При наиболее низкой концентрации метилэтилпиридинола значимый прирост бактериальной биомассы фиксируется лишь эпизодически на протяжении всего эксперимента.
По степени и профилю пробактериального действия N-ацетилцистеин сходен с аскорбиновой кислотой. Наиболее интенсивно N-ацетилцистеин в максимальной концентрации препятствует бактерицидному действию гентамицина в отношении штамма ЕС2 (к 12 часу эксперимента плотность этих инкубационных смесей превышает контрольные значения в 4 раза).
Отдельного внимания заслуживает рассмотрение состояния инкубационных смесей через 24 часа после начала эксперимента. Как видно из представленных данных, происходит смена прямопропорциональной зависимости плотности биомассы всех изучаемых бактериальных культур от концентраций антиокси-дантов, регистрируемой на 12 часу эксперимента, на обратнопропорциональную. Несмотря на кажущееся противоречие, с учетом наблюдаемой в первые 12 часов динамики указанное явление можно объяснить ускоренным развитием культур в присутствии антиоксидантов, и, соответственно, более ранним наступлением фазы отмирания.
Рассмотрим данные, представленные в табл. 18-20 и отражающие влияние антиоксидантов на активность гентамицина в отношении штаммов K. pneu-moniae. В отсутствии антиоксидантов штаммы КР1 и КР2 достигают своего максимума развития через 10 часов. Вхождение штамма КР3 в стационарную фазу происходит между 12 и 24 часами эксперимента вне периода наблюдения.
Восстановленный глутатион для штаммов КР1 и КР2 во всех концентра-цииях проявляет значимое пробактериальное действие уже через 4 часа эксперимента, а для штамма КР1 такой эффект приводит к достижению предела бактериальной биомассы уже между 6 и 8 часами инкубации. Развитие штамма КР3 в присутствии восстановленного глутатиона имеет несколько иную динамику и характеризуется плавным наращением плотности бактериальной культуры, интенсивность которого сохраняет свою зависимость от концентрации антиокси-данта вплоть до 12 часа эксперимента. К этому времени оптическая плотность смесей, содержащих глутатион, намного превышает контрольные значения (в 3-4 раза).
Аскорбиновая кислота уменьшает действие гентамицина менее выражено. Для штамма КР1 значимый прирост бактериальной биомассы при всех концентрациях антиоксиданта фиксируется лишь через 6 и 8 часов. Интересно отметить, что для штаммов КР1 и КР2 на 10 часу инкубации в присутствии аскорбиновой кислоты наблюдается вход в стационарную фазу без статистически значимого различия по показателю оптической плотности от контрольных смесей (для указанных штаммов, инкубируемых без антиоксидантов, аналогичный вход приходится на это же время). Для штамма КР3 пробактериальное действие аскорбиновой кислоты не проявляется в концентрации 0,25 мМ, а для более высоких концентраций становится наиболее выраженным к 12 часу эксперимента.
Взаимодействие ципрофлоксацина и антиоксидантов
Прежде всего, необходимо отметить, что ципрофлоксацин приводит к значимому снижению концентрации ТБРП в плазме. Аналогичное снижение наблюдается и при комбинации антибактериального средства c N 125 ацетилцистеином и метилэтилпиридинолом. В последнем случае антиоксидант-ное действие наиболее выражено – уровень ТБРП снижается на 29% относительно контрольных значений. Исходя из профиля ТБРП, комбинация ципро-флоксацина с аскорбиновой кислотой антиоксидантного эффекта не проявляет.
Вышеописанной картине несколько противоречит изменение концентрации восстановленного глутатиона. Введение ципрофлоксацина препятствует истощению этого эндогенного антиоксиданта, однако комбинации ни с одним из антиоксидантов такого эффекта не дают. При рассмотрении профиля антиокси-дантных ферментов видно, что активность каталазы и активность глутатионпе-роксидазы значимо не различаются между всеми группами.
Лечение животных с клебсиеллезным перитонитом сопровождается иными изменениями (табл. 38). Прежде всего, обращает на себя внимание тот факт, что у всех животных, подвергшихся фармакологическому вмешательству, не изменяется уровень плазменного ТБРП, а также концентрация восстановленного глутатиона эритроцитов, что говорит об отсутствии тормозящего действия на процессы перекисного окисления как у самого антибактериального средства, так и у его комбинаций с антиоксидантами. Как и в случае с эшерихиозным перитонитом, активность ГПО и активность каталазы у всех животных серии находится на одном уровне.
Химическое и фармакологическое взаимодействие цефтазидима и антиоксидантов in vitro Цефтазидим также является антибиотиком с бактерицидным типом действия. Относясь к цефалоспоринам (III поколение), он ацетилирует специфические пенициллинсвязывающие белки на поверхности цитоплазматической мем 126 браны, тормозит синтез пептидогликана клеточной стенки, приводя к ее повреждению и лизису бактериальной клетки.
Анализ методом ВЭЖХ-МС показал отсутствие химического взаимодействия между цефтазидимом и изучаемыми антиоксидантами, включая образование устойчивых комплексов. Однако обращает на себя внимание тот факт, что через 12 часов после инкубации содержание антибиотика в пробах значительно снижается (в среднем на 23%) за счет разрушения молекулы.
При нахождении антибиотика в сублетальных концентрациях отмечается хотя и сдержанный, но достаточно быстрый прирост биомассы штаммов Esche-richia coli (табл. 39-41). Интересной особенностью является тот факт, что, в отличие от антибактериальных средств, рассматриваемых выше, цефтазидим значительно сокращает длительность стационарной фазы и проводит к более быстрому возникновению фазы отмирания, начало которой регистрируется уже в пределах 12 часов с момента начала инкубации.
Специфическое влияние на активность цефтазидима оказывает восстановленный глутатион. Уже через 4 часа после начала эксперимента фиксируется значимое усиление развития штамма ЕС1 во всех пробах, содержащих глутатион (талб. 39). На 6 и 8 час оптическая плотность проб, содержащих антиоксидант в наименьших концентрациях оказывается выше контрольных значений, а в наибольших – ниже. В дальнейшем сохраняется тенденция более выраженного прироста бактериальной биомассы в пробах с наименьшими концентрациями глутатиона. Но по окончанию инкубации (через 24 часа) только пробы, содержащие антиоксидант в концентрации 4 мМ, статистически значимо содержали больше бактериальной биомассы по сравнению с контролем. Рассматривая влияние глутатиона на развитие культуры штамма ЕС2 можно отметить схожие особенности. Важно отметить, что на 6 часу инкубации фиксируется значимое возрастание оптической плотности во всех образцах, которое, однако, характеризуется обратной пропорциональностью по отношению к концентрации глута-тиона. На 8 часу оптическая плотность становится ниже контрольных значений, характер указанной пропорциональности реверсивно сменяется на прямой и сохраняется в этом виде до окончания эксперимента (табл. 40). Картина изменения активности цефтазидима в отношении клинического штамма ЕС3 отлична от вышеописанной динамики. В пределах 12 часов наблюдений фиксируется эпизодическое угнетение развития штаммов в пробах с различными концентрациями глутатиона без каких-либо зависимостей. Через 24 часа плотность биомассы в пробах, содержащих 4 мМ глутатиона, значимо выше контрольной на 33% (табл. 41).
В пробах, содержащих аскорбиновую кислоту, наблюдается противоположная динамика. Первоначально фиксируется значимое снижение оптической плотности (для штамма ЕС1 – на 8 часу, для штаммов ЕС2 и ЕС3 – на 6 часу инкубации). Однако затем происходит интенсивный прирост бактериальной биомассы в пробах, регистрируемый для штаммов ЕС2 и ЕС3 при каждом последующем наблюдении, а для штамма ЕС1 – через 24 часа в инкубационных смесях с наиболее высокими концентрациями аскорбиновой кислоты (2 и 4 мМ).
Метилэтилпиридинол оказывает сходное действие с аскорбиновой кислотой. Наименьшее влияние этот антиоксидант оказывает на развитие штамма ЕС1 – эффекты проявляются только в пробах, содержащих метилэтилпиридинол в наибольшей концентрации – 4 мМ. Динамика прироста культуры в этих пробах соответствует вышеописанной: через 6 и 8 часов эксперимента плотность проб ниже, а через 12 и 24 часа – значимо выше контрольных значений. Более выраженное влияние оказывает присутствие метилэтилпиридинола в инкубационных смесях, содержащих клинические штаммы кишечной палочки (табл. 40 и 41). Плотности бактериальной биомассы во всех этих пробах отличаются от контрольных значений, начиная с 8 часа эксперимента. Как упоминалось ранее, ме-тилэтилпиридинол по профилю действия сходен с аскорбиновой кислотой. Важное отличие между этими антиоксидантами заключается в том, что первый более эффективно подавляет пророст биомассы штаммов, что, однако, приводит к их более интенсивному развитию в дальнейшем.