Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 13
1.1. Характеристика производных 3-оксипиридина 13
1.2. Эмоксипин и его применение в медицинской практике 16
1.3. Проблема сахарного диабета и его осложнений в здравоохранении 19
1.4. Применение антиоксидантов в терапии осложнений сахарного диабета 29
Глава 2. Материалы и методы 32
2.1. Экспериментальные животные 32
2.2. Изучаемые лекарственные средства 32
2.3. Моделирование аллоксанового диабета и режим применения эмоксипина 33
2.4. Определение концентрации глюкозы в периферической крови животных 34
2.5. Моделирование острой гипоксической гипоксии у мышей с аллоксановым диабетом 35
2.6. Моделирование острой церебральной ишемии у мышей 35
2.6.1 Странгуляционная ишемия 36
2.6.2. Тотальная ишемия 36
2.7. Оценка анксиолитического действия с использованием приподнятого крестообразного лабиринта в эксперименте на крысах 36
2.8. Оценка антидепрессивного действия в тесте Porsoslt у крыс 37
2.9. Постановка теста «закапывания шариков» на интактных мышах 38
2.10. Оценка антиангедонического действия в тесте «предпочтения сахарозы» у крыс 39
2.11. Оценка поведения животных в тесте «открытое поле» 40
2.12. Статистическая обработка данных 40
Глава 3. Результаты исследования 41
3.1. Изучение антигипоксического действия эмоксипина и его влияние на устойчивость к острой церебральной ишемии при экспериментальном сахарном диабете у мышей 41
3.1.1. Влияние эмоксипина на устойчивость к острой гипоксической гипоксии у мышей с экспериментальным сахарным диабетом 41
3.1.2. Влияние эмоксипина на устойчивость мышей с экспериментальным сахарным диабетом к острой церебральной ишемии 43
3.1.3. Влияние эмоксипина на устойчивость к субтотальной ишемии ростральных отделов головного мозга у мышей с экспериментальным СД 46
3.1.4. Влияние эмоксипина на устойчивость к тотальной ишемии каудальных отделов головного мозга у мышей с экспериментальным СД 48
3.2. Влияние эмоксипина на концентрацию глюкозы в периферической крови при экспериментальном сахарном диабете у мышей 50
3.3. Влияние эмоксипина на тревожно-депрессивные нарушения при экспериментальном сахарном диабете у крыс 52
3.3.1. Оценка анксиолитического и антидепрессивного потенциала эмоксипина в экспериментах на интактных животных 53
3.3.1.1. Оценка анксиолитического потенциала эмоксипина 53
3.3.1.2. Влияние эмоксипина на поведение крыс в тесте «Открытое поле» 59
3.3.1.3. Оценка антидепрессивного потенциала эмоксипина 62
3.3.1.3.1. Влияние эмоксипина на принудительное плавание в тесте Porsolt 62
3.3.1.3.2. Влияние эмоксипина на показатели теста «предпочтения сахарозы» 64
3.3.1.3.3. Влияние эмоксипина на обсессивно-компульсивную активность мышей в тесте «закапывания шариков» 69
3.3.3. Оценка анксиолитического и антидепрессивного действия эмоксипина в условиях экспериментального СД 71
3.3.3.1. Оценка анксиолитического потенциала эмоксипина в условиях экспериментального СД 71
3.3.3.2. Оценка антидепрессивного потенциала эмоксипина в условиях экспериментального СД 81
3.4. Оценка влияния эмоксипина на уровень глюкозы в периферической крови у крыс в условиях экспериментального СД 84
Заключение 89
Выводы 106
Практические рекомендации 107
Список сокращений 108
Список литературы 109
- Проблема сахарного диабета и его осложнений в здравоохранении
- Влияние эмоксипина на устойчивость мышей с экспериментальным сахарным диабетом к острой церебральной ишемии
- Влияние эмоксипина на показатели теста «предпочтения сахарозы»
- Оценка влияния эмоксипина на уровень глюкозы в периферической крови у крыс в условиях экспериментального СД
Проблема сахарного диабета и его осложнений в здравоохранении
СД представляет собой важную проблему здравоохранения и является одним из приоритетных неинфекционных заболеваний (НИЗ) в настоящее время [208]. В течение последних десятилетий распространенность СД неуклонно растет. По данным ВОЗ, в 2014 году диабетом страдали 422 миллиона взрослых во всем мире по сравнению с 108 миллионами в 1980 году [208]. Глобальный уровень заболеваемости диабетом (стандартизованный по возрасту) почти удвоился с 1980 года, увеличившись с 4,7% до 8,5% среди взрослого населения, и в настоящее время сохраняется угроза дальнейшего распространения этого заболевания. В соответствии с текущим прогнозом предполагается, что к 2030 году число больных СД составит 552 миллиона человек.
Выделяют несколько типов СД: СД 1 типа, 2 типа, гестационный и др.. Наиболее распространенными являются СД 1 и 2 типа. Развитие СД 1 типа обусловлено формированием абсолютной недостаточности инсулина, а СД 2 типа связывают с относительной недостаточностью гормона [261, 232]. При прогрессировании заболевания недостаточность инсулина вне зависимости от типа СД приобретает смешанный характер. Это обусловлено развитием вторичной инсулинорезистентности при СД 1 типа, которая сопровождается снижением эффективности заместительной инсулинотерапии [247]. Длительное течение СД 2 сопровождается вторичным поражением -клеток поджелудочной железы, что приводит к снижению секреции инсулина и также требует включения инсулинотерапии в комплексное лечение болезни [251, 190].
В настоящее время ключевыми звеньями патогенеза развития осложнения при СД 1 и 2 типа считают инсулинорезистентность (ИР), нарушение секреции инсулина, повышение продукции глюкозы печенью, а также наследственную предрасположенность и особенности образа жизни и питания, ведущие к ожирению [60]. Развитие ИР в большей степени связывают с нарушением действия инсулина на пострецепторном уровне, в частности со значительным снижением мембранной концентрации специфических транспортеров глюкозы (ГЛЮТ-4, ГЛЮТ-2, ГЛЮТ-1). Последствиями ИР являются дислипопротеинемия, гиперинсулинемия, и гипергликемия. Эти метаболические отклонения являются пусковым механизмом активации различных патогенетических звеньев, которые в свою очередь приводят к окислительному стрессу, эндотелиальной дисфункции и развитию атеросклеротических изменений. Такие изменения способствуют развитию осложнений СД [3].
В настоящее время многие авторы рассматривают окислительный стресс (ОС) как один из основных патогенетических звеньев развития осложнений при СД [3, 7, 216, 287]. Экспериментальные и клинические исследования показывают, что окислительный стресс играет важную роль в патогенезе и развитии осложнений обоих типов СД [237]. ОС является результатом нарушения баланса между прооксидантами и компонентами системы антиоксидантной защиты, при котором скорость продукции свободно-радикальных метаболитов превосходит темп их устранения [66]. В патогенезе ОС наиболее чувствительной системой является ЦНС [32, 129]. Это связано с тем, что нейроны головного мозга характеризуются более высоким уровнем окислительного метаболизма по сравнению с нервными клетками других локализаций. С этой точки зрения наиболее чувствительными являются нейроны, расположенные в поле СА1 гиппокампа. Этот участок головного мозга активно участвует в когнитивных процессах, а также в процессах регуляции аффективных статуса [214].
Патогенез ОС в головном мозге у больных СД существенно не отличается от механизмов ОС в других органах и системах при других патологических процессах [46, 3, 32]. Хроническая гипергликемия и неферментное гликирование белков являются основными патофизиологическими механизмами формирования ОС в ЦНС при СД [2, 129, 223]. Абсолютный или относительный дефицит инсулина являются другим механизмом, определяющим развитие ОС при СД. Важно отметить, что при СД 2 типа развивается относительный дефицит инсулина, который связан со снижением чувствительности клеток и тканей к этому гормону и регистрируется даже на фоне гиперинсулинемии [103].
Коррекция физиологического уровня инсулина является фактором, предотвращающим развитие ОС, и, соответственно, препятствующим формированию гликированных белков. Кроме того, известно, что инсулин сам обладает антиоксидантными свойствами [279].
Было показано, что в эксперименте длительная гипергликемия приводит к развитию целого ряда неблагоприятных эффектов у экспериментальных животных: снижение двигательной активности, уменьшении числа сердечных сокращений, повышение потребности в кислороде [217].
Высокая медико-социальная значимость СД связана с проблемой его поздних осложнений, которые затрагивают практически все органы и системы организма человека и очень часто снижают качество жизни пациентов с СД, а также могут приводить к фатальным последствиям [7].Все осложнения диабета делятся на 2 большие группы [84]:
1) острые осложнения (кетоацидотическая, гиперосмолярная, гипогликемическая, лактоацидотическая комы).
2) хронические (поздние) осложнения:
1. Микрососудистые осложнения:
- диабетическая ретинопатия;
- диабетическая нефропатия.
2. Макрососудистые осложнения:
- ишемическая болезнь сердца;
- ишемическая болезнь мозга;
- хронические облитерирующие заболевания периферических артерий.
3. Диабетическая нейропатия:
- периферическая (симметричная, ассиметричная);
- автономная (кардиоваскулярная, гастроинтерстициальная, урогенитальная и др.).
Длительное течение СД приводит к закономерным развитием ангио- и нейропатий [208]. Одной из важнейших проблем является развитие дистальной симметричной сенсомоторной полинейропатии (ДСПП), которая является одним из факторов риска развития синдрома диабетической стопы (СДС) [47, 58, 59]. Диабетическая нейропатия является одним из существенных факторов, оказывающих влияние на качество и продолжительность жизни пациентов с СД [113, 133, 202, 226].
Следует подчеркнуть, что длительное течение СД приводит к поражению парасимпатического и симпатического отделов вегетативной нервной системы [7]. Симпатическая дисфункция у больных СД проявляется нарушением прессорных постуральных рефлексов с развитием выраженной ортостатической гипотензии [182]. Поражение вегетативной нервной системы при СД обуславливает широкую распространенность бессимптомной ишемии миокарда и бессимптомной гипогликемии, являющихся жизнеугрожающими состояниями у больных СД [7].
Важно отметить, что одним из рисков сосудистых осложнений является острый тромбоз церебральных артерий, что приводит к развитию инсульта с общеизвестными фатальными или инвалидизирующими исходами, которые являются одними из самых распространенных и неблагоприятных осложнений ДЭ [5, 273]. Развитие СД предрасполагает к острым нарушениям мозгового кровообращения (ОНМК), которые являются одной из важнейших причин инвалидизации и смертности населения [82, 206]. СД относится к числу основных факторов риска развития инсульта. В эпидемиологических исследованиях в финской популяции было показано, что относительный риск инсульта для мужчин с СД составляет 6, а для женщин - 8,2. В этой же работе было показано, что 16% смертей от инсульта связаны с СД у мужчин и 33% у женщин [271]. Существует несколько возможных механизмов развития инсультов при СД.
К ним относятся сосудистая эндотелиальная дисфункция, преждевременная повышенная артериальная жесткость, системное воспаление и утолщение капиллярной базальной мембраны [183]. Аномалии в раннем диастолическом наполнении левого желудочка обычно наблюдаются при диабете II типа. Предлагаемые механизмы застойной сердечной недостаточности при СД 2 типа включают микрососудистые нарушения, метаболические расстройства, интерстициальный фиброз, гипертонию и вегетативную дисфункцию [183].
Влияние эмоксипина на устойчивость мышей с экспериментальным сахарным диабетом к острой церебральной ишемии
ОНМК связаны с окклюзией сосудов в головном мозге, кровоснабжение которого обеспечивается двумя артериальными системами: внутренних сонных (каротидный бассейн) и позвоночных артерий (вертебробазилярный бассейн).
Кровоснабжение ростральных структур головного мозга происходит преимущественно из каротидного бассейна, каудальных - преимущественно из вертебробазилярного бассейна. В связи с этим было целесообразно провести 2 серии экспериментов, одна из которых была направлена на оценку антиишемического действия эмоксипина при ишемии ростральных структур, другая - каудальных. Для этого нами были отобраны модели с очевидной валидностью и высокой чувствительностью, применение которых предельно минимизировало неизбежные страдания лабораторных животных, что является краеугольным положением этических норм, регулирующих эксперименты на животных и отраженных в отечественных и иностранных нормативных документах [213, 281, 212, 241, 272, 219, 204, 244, 120, 119, 127].
Перспективность изучения антиишемического церебропротективного действия в условиях СД было проиллюстрировано результатами предварительного эксперимента, в котором оценивали действие эмоксипина на острую церебральную ишемию у интактных животных (без экспериментального СД). В этих исследованиях эмоксипин вводили однократно внутрибрюшинно за 30 мин. до моделирования острой ишемии. В проведенном эксперименте было выявлено, что эмоксипин обладает выраженной антиишемической активностью. Этот эффект характеризовался обратной зависимостью от дозы препарата (таблица 2). Введение эмоксипина в дозе ЭСТД и ЭСТД приводило к увеличению времени жизни животных практически на 34% и на 22,5% соответственно. Вместе с тем, повышение дозы эмоксипина до 2 ЭСТД приводило к утрате антиишемической активности.
В модели декапитационной ишемии, в которой моделировали острую ишемию и в бассейне каротидной артерии, и в бассейне вертебробазилярной артерии, было выявлено парадоксальное проишемическое действие эмоксипина в дозах ЭСТД и ЭСТД. В группах животных, которые получали 12,5 и 25 мг/кг эмоксипина регистрировалось небольшое (на 15-17% по отношению к интактному контролю), но достоверное уменьшение длительности гаспинга (таблица 2).
Введение эмоксипина в дозе 50 мг/кг не влияло на длительность агонального дыхания.
Таким образом, в предварительном эксперименте было выявлено разнонаправленное действие эмоксипина на течение острой ишемии головного мозга у мышей: антиишемическое действие при моделировании ишемии, преимущественно в ростральных структурах головного мозга и проишемическое действие при моделировании тотальной церебральной ишемии.
Важно подчеркнуть, что при использовании обеих моделей ОНМК выраженность влияния эмоксипина снижалась по мере нарастания дозы (таблица 2). Такая форма зависимости соответствует характеристикам немонотонных кривых «доза-эффект» и позволяет считать, что влияние эмоксипина на устойчивость к острой церебральной ишемии может быть связана с его действием на систему дофаминергической нейромедиации, роль которой в регуляции активности инспираторных нейронов общеизвестна [227].
В дальнейших исследованиях мы оценивали влияние эмоксипина на устойчивость к ОНМК при экспериментальном СД.
Влияние эмоксипина на показатели теста «предпочтения сахарозы»
В предыдущих экспериментах было выявлено, что эмоксипин обладает анксиолитическим и антидепрессивным потенциалом (соответственно по результатам тестирования в ПКЛ и данным теста Porsolt). Было дополнительно изучено его влияние на выраженность ангедонии, которая наряду с гипотимией относится к числу главных симптомов депрессии [61]. В нашем эксперименте была использована модель ангедонии, вызванная дексаметазоном [180]. В представленном разделе проводился сравнительный анализ антиангедонического действия эмоксипина и амитриптилина в эксперименте на интактных крысах.
Анализ полученных данных продемонстрировал существенное угнетение гедонического поведения крыс в результате введения дексаметазона (таблица 11, 12). Это проявилось уменьшением числа подходов к поилке с раствором сахарозы на 43 % и трехкратным снижением её абсолютного потребления у крыс в группе «дексаметазон-контроль» в сравнении с группой «интактный контроль». Установленный факт согласуется с представлениями о роли стрессорного нарастания уровня циркулирующих глюкортикоидов в развитии депрессивной симптоматики [180] и позволяет расценивать дексаметазон-индуцированное подавление потребления сахарозы как фармакологическую модель стрессорной ангедонии [178]. Важно добавить, что медианное значение числа подходов к поилке с водой у подгруппы «дексаметазон-контроль» также оказалось в три раза ниже соответствующего параметра «интактного контроля». Столь выраженное подавление дипсогенной мотивации на фоне предшествующего 24-часового отсутствия доступа к воде тоже укладывается в рамки проявлений депрессии. По-видимому, сокращение потребления воды и раствора сахарозы полностью нивелирует естественный феномен «предпочтения сахарозы», что проявляется 50 % медианным значением коэффициента предпочтения сахарозы в подгруппе «дексаметазон-контроль» (таблица 12). Необходимо заметить, что коэффициент предпочтения сахарозы в подгруппе «дексаметазон-контроль» статистически не отличался от соответствующего параметра в «интактном контроле». Это позволяет предположить, что инъекции 0.9% раствора натрия хлорида являются неблагоприятным воздействием для крыс и приводят к развитию у них «мягкого хронического стресса» [285]. В «интактном контроле» данный режим предусматривал одно подкожное и три внутрибрюшинных введения 0,9% раствора натрия хлорида на протяжении 19 часов. Вполне возможно, что отсутствие значимых различий между группами «дексаметазон-контроль» и «интактный контроль» в величинах данного коэффициента отражает своеобразный «эффект пола» (floor effect), т.е. предельно возможный ангедонический ответ даже на относительно слабое стрессогенное воздействие (повторные инъекции 0,9% раствора натрия хлорида). Необходимо подчеркнуть, что трехкратное введение амитриптилина на таком фоне более чем в 2 раза снижает число подходов к поилке с водой, не влияя на количество подходов к поилке с раствором сахарозы (таблица 11). В результате формируется отчетливая (хотя и статистически незначимая) тенденция к нарастанию коэффициента предпочтения сахарозы и её абсолютного потребления. Значительно более выраженный антиангедонический эффект трициклического антидепрессанта наблюдался у крыс, предварительно получавших дексаметазон. Как видно (таблица 12), трехкратное введение амитриптилина крысам вызывало прирост коэффициента предпочтения сахарозы на 75% и абсолютного потребления дисахарида на 45% по сравнению с «дексаметазон-контролем». Выраженное корригирующее влияние амитриптилина на проявления дексаметазон индуцированной ангедонии иллюстрирует её депрессивную природу.
Введение эмоксипина в относительно низких дозах (1/2 ЭСТД и ЭСТД) приводило к увеличению коэффициента потребления сахарозы на 22,5 – 33% по сравнению с «интактным контролем» (таблица 11) и на 46% относительно «дексаметазон-контроля» (таблица 12). Такое проявление антиангедонического действия эмоксипина по распределению эффективных доз полностью совпадало с характеристиками его протекторного действия при субтотальной ишемии головного мозга у мышей (раздел 3.1.3). Важно отметить, что на фоне предварительного введения дексаметазона, эмоксипин во всех дозах троекратно увеличивал абсолютное потребление сахарозы (таблица 12), полностью компенсируя дексаметазон-индуцированное подавление консумации этого дисахарида.
Кроме того, в относительно высоких дозах (ЭСТД и 2ЭСТД) эмоксипин корригировал дексаметазон-индуцированное уменьшение числа подходов к поилке с раствором сахарозы, увеличивая соответствующий показатель на 50 – 100% по сравнению с подгруппой «дексаметазон-контроль» (таблица 12). При введении в минимальной дозе (1/2 ЭСТД) эмоксипин уменьшал число подходов к поилке с водой на 33 % по сравнению с «дексаметазон-контролем», не влияя при этом на число подходов к поилке с сахарозой.
Не меньшего внимания заслуживают достоверные различия в величинах абсолютного потребления сахарозы между группами крыс, получавших «антидепрессант сравнения» (амитриптилин) и эмоксипин на фоне предварительного введения дексаметазона (таблица 12). Как видно, медианные значения этого показателя у животных, получавших эмоксипин в дозах ЭСТД и 2ЭСТД, оказались больше, чем в 2 раза выше соответствующего значения группы «дексаметазон-амитриптилин».
Полученные данные иллюстрируют явное превосходство эмоксипина над трициклическим антидепрессантом амитриптилином по способности корригировать дексаметазон-индуцированную ангедонию у крыс. Таким образом, результаты экспериментов с уверенностью позволяют заключить, что введение эмоксипина в относительно низких дозах обладает выраженным антиангедоническим действием и, соответственно, обладает антидепрессивным действием. В связи с этим, эмоксипин может рассматриваться как перспективное средство коррекции гедонического дефицита, превосходящее по своему антиангедоническому потенциалу амитриптилин.
Оценка влияния эмоксипина на уровень глюкозы в периферической крови у крыс в условиях экспериментального СД
В предыдущих экспериментах на мышах было выявлено, что двухнедельное применение эмоксипина в дозах ЭСТД и 2 ЭСТД приводило к уменьшению выраженности гипергликемии у мышей с экспериментальным диабетом (раздел 3.2). Целесообразно было исследовать влияние эмоксипина на уровень гипергликемии у животных другого вида - у крыс при различных схемах использования препарата у на фоне экспериментального диабета.
О нарушениях углеводного обмена судили по выраженности гипергликемии. Медиана концентрации глюкозы в периферической крови у крыс в группе интактного контроля при однократном введении 0,9% р-ра натрия хлорида составила 4,3 ммоль/л (таблица 21). После 7-и кратного введения 0,9% раствора натрия хлорида медиана концентрации глюкозы в периферической крови у крыс составила 4,8 ммоль/л, а после 14-и кратного введения 5,9 ммоль/л.
На 5- е сутки после введения аллоксана у крыс развилась выраженная гипергликемия: медиана концентрации глюкозы в периферической крови у крыс был более, чем в 4 раза выше значения показателя у интактных животных (таблица 21). У крыс с экспериментальным СД, получавших 7-дневный курс инсулинотерапии уровень глюкозы в периферической крови был практически в 3 раза выше значения показателя у интактных животных, а после 14 сут. инсулинотерапии этот показатель был выше, чем в группе интактных животных более чем в 2,5 раза (таблица 21). Таким образом, указанная схема применения аллоксана и инсулина позволила моделировать экспериментальную гипергликемию со стабильным уровнем, превышающим значение в группе интактных животных практически в 3 раза. По-видимому, сохранение высоких показателей гликемии в течение изучаемого периода аллоксанового СД связано с недостаточной дозой инсулина что соответствует общеизвестным сложностям подбора оптимальной инсулинотерапии.
Однократное внутрибрюшинное введение эмоксипина через 3 суток после индукции СД приводило к некоторому снижению выраженности аллоксановой гипергликемии, однако такие изменения не приводили к достоверным отличиям от значения показателя в группе «аллоксановый диабет – контроль» (таблица 21).
Семикратное внутрибрюшинное введение эмоксипина животным с СД на фоне инсулинотерапии вызывало достоверное снижение выраженности аллоксановой гипергликемии у крыс практически в 2,5 раза по сравнению с группой «аллоксановый диабет-контроль». Такой эффект наблюдался при использовании эмоксипина во всех дозах.
Применение эмоксипина во всех используемых дозах в течение 14 дней у животных с экспериментальным СД приводило к достоверному снижению концентрации глюкозы в периферической крови у крыс по сравнению со значением показателя у животных из группы «аллоксановый диабет-контроль». Следует отметить, что применение эмоксипина в дозе ЭСТД и 2 ЭСТД уже после первой инъекции оказывало влияние на уровень гипергликемии. Семикратное введения изучаемого лекарственного средства во всех дозах приводило к коррекции экспериментальной гипергликемии, а 14-и кратное использование препарата в дозах ЭСТД и 2 ЭСТД нормализовало аллоксановый диабет практически до уровня интактного контроля (таблица 21). Для сопоставления влияния эмоксипина на проявление тревоги и депрессии с действием изучаемого лекарственного средства на динамику диабетической гипергликемии проводили анализ связи этих показателей с помощью корреляции Спирмена. В этих исследованиях не было выявлено достоверной связи между временем иммобильности (р = -0,23; p = 0,56), а также времени, проведенном в открытых рукавах приподнятого крестообразного лабиринта (р = -0,11; p = 0,78), с концентрацией глюкозы в периферической крови у крыс, получавших эмоксипин. Это позволило заключить, что анксиолитическое и антидепрессивное действие эмоксипина при экспериментальном сахарном диабете не связаны с влиянием этого лекарственного средства на выраженность диабетической гипергликемии.