Содержание к диссертации
Введение
Глава 1 Обзор литературы 12
1.1 Строение и функции тромбоцитов 12
1.2 Роль систем цАМФ и цГМФ в функционировании тромбоцитов 16
1.3 Специфическая фармакологическая активность и фармакокинетика ацетилсалициловой кислоты 20
1.4 Специфическая фармакологическая активность и фармакокинетика дипиридамола и цилостазола 26
1.5 Специфическая фармакологическая активность и фармакокинетика клопидогреля 30
1.6 Специфическая фармакологическая активность и фармакокинетика некоторых ингибиторов гликопротеиновых рецепторов IIb/IIIa тромбоцитов 34
1.7 Заключение 36
Глава 2 Материалы и методы исследования 37
2.1 Материалы исследования 37
2.1.1 Экспериментальные животные 37
2.1.2 Оборудование 38
2.1.3 Химические реагенты 40
2.2 Методы исследования 44
2.2.1 Исследование антиагрегантной активности in vitro 44
2.2.2 Исследование антиагрегантной активности in vivo 45
2.2.3 Исследование влияния на плазменный гемостаз in vivo 45
2.2.4 Исследование антиагрегантной активности на модели сахарного диабета 46
2.2.5 Исследование антиагрегантной активности на модели внутрисосудистого артериального тромбоза 47
2.2.6 Исследование фармакокинетики in vivo 47
2.2.6.1 Дизайн исследования линейности фармакокинетики и абсолютной биодоступности 48
2.2.6.2 Дизайн исследования распределения в органах и тканях 48
2.2.6.3 Дизайн исследования фармакокинетики при многократном введении 49
2.2.7 Исследование фармакокинетики in vitro 49
2.2.7.1 Дизайн исследования метаболизма 49
2.2.7.2 Дизайн исследования ингибирования ферментов p450 50
2.2.7.3 Дизайн исследования трансмембранного транспорта 50
2.2.7.4 Дизайн исследования связывания с белками плазмы крови 51
2.2.8 Хроматографические условия 51
2.2.9 Расчет фармакокинетических параметров 52
2.2.10 Методы статистического анализа результатов 54
Глава 3 Результаты исследования 55
3.1 Результаты исследования антиагрегантной активности in vitro 55
3.2 Результаты исследования антиагрегантной активности in vivo 57
3.3 Результаты исследования влияния на плазменный гемостаз in vivo 58
3.4 Результаты исследования антиагрегантной активности на модели сахарного диабета 59
3.5 Результаты исследования антиагрегантной активности на модели внутрисосудистого артериального тромбоза 61
3.6 Результаты исследования фармакокинетики in vivo 63
3.6.1 Результаты исследования линейности фармакокинетики и абсолютной биодоступности 63
3.6.2 Результаты исследования фармакокинетики при многократном введении 65
3.6.4 Результаты исследования распределения по органам и тканям 66
3.7 Результаты исследования фармакокинетики in vitro 66
3.8 Результаты исследования метаболизма in vitro 69
3.9 Результаты исследования ингибирования основных представителей цитохрома p450 in vitro 69
Глава 4 Обсуждение результатов исследования 72
Заключение 81
Выводы 82
Список используемых сокращений 84
Список литературы 85
- Роль систем цАМФ и цГМФ в функционировании тромбоцитов
- Специфическая фармакологическая активность и фармакокинетика клопидогреля
- Результаты исследования антиагрегантной активности на модели сахарного диабета
- Обсуждение результатов исследования
Роль систем цАМФ и цГМФ в функционировании тромбоцитов
Тромбоциты играют ключевую роль в нормальном и патологическом гемостазе. В случае повреждения клеток эндотелия происходит активация тромбоцитов белками субэндотелиального матрикса и фактором фон Виллебранда. Активированные тромбоциты экскретируют вторичные молекулы активации – АДФ и TXA2, которые привлекают еще большее их количество к месту травмы [70].
В норме активация тромбоцитов крови находится под контролем некоторых механизмов, к которым относится PGI2 (простациклин) и NO [13].
Арахидоновая кислота под действием фосфолипазы A2 превращается в простагландин H2, который под действием PGI2-синтазы превращается в высокоактивный PGI2 (простациклин). Основным местом синтеза PGI2 является эндотелий сосудов [14]. Взаимодействие простациклина с тромбоцитами происходит через рецептор IP, который связан с Gs белком [15]. Активация Gs белка приводит к активации АЦ, что ведет к росту внутриклеточной концентрации цАМФ; это приводит к активации цАМФ-зависимой PKA. PKA фосфорилирует VASP, ИФ3, и PMCAs. Фосфорилирование VASP приводит к ингибированию реорганизации цитоскелета тромбоцита [16], в то же время фосфорилирование ИФ3, и PMCAs ведет к ингибированию выкачивания Ca2+ из внутриклеточных депо, а также выходу Ca2+ из клетки [17]; оба этих процесса приводят к уменьшению концентрации Ca2+ в цитоплазме и дезактивации тромбоцита.
Образование NO из аминокислоты L-аргинина катализирует NO-синтаза [18]. NO образуется во многих клетках, но для обеспечения текучести крови в норме свой определяющий вклад вносит эндотелиальная NO-синтаза (eNOS) клеток эндотелия. NO является очень липофильным соединением, что позволяет ему легко проникать через мембраны клеток к своей природной мишени – рГЦ, которая катализирует синтез цГМФ из ГТФ [19].
рГЦ млекопитающих является гем-содержащим ферментом, каталитический центр которого образован C-концевыми и субъединицами. Гемовый домен находится на N-концевом участке фермента, железо (Fe [II]) имеет 5 координационных связей, одна из которых связана с гистидиновым лигандом в положении 105 (His105) [20]. Связывание NO с гемом фермента увеличивает его активность в несколько сотен раз [40, 41]. рГЦ не связывается с кислородом, но связывается с оксидом углерода CO, который увеличивает его активность лишь в несколько раз. Связывание NO с рГЦ происходит в два этапа: сначала одна молекула NO образует с ферментом 6-координационный комплекс, на втором этапе происходит превращение комплекса в 5-координационный [20] (рисунок 3). После связывания первой молекулы NO с гемом происходят конформационные изменения, которые облегчают взаимодействие второй молекулы NO с гемовым железом и происходит замещение His105 на железо [21].
Активность eNOS находится в сильной зависимости от концентрации Ca2+ в цитоплазме.
Многие сердечно-сосудистые заболевания вызывают дисфункцию системы NO/рГЦ/цГМФ [22, 23, 24]. Использование доноров NO в качестве терапии сопряжено с рядом негативных моментов, в частности к ним очень быстро развивается толерантность [25], данные препараты также влияют на функции различных белков из-за способности их посттрансляционной модификации (за счет нитрозирования) [26], а также способствуют окислительному стрессу [27]. Решение данных проблем определяет необходимость создания новых соединений, стимулирующих рГЦ независимо от NO [28]. Первым открытым стимулятором рГЦ являлось соединение YC-1 [29]. Однако из-за плохой фармакокинетики и низкой специфичности препарата на основе субстанции YC-1 разработано не было [30]. Дальнейшие работы по оптимизации структуры и свойств YC-1 привели к появлению двух классов молекул: активаторов рГЦ и стимуляторов рГЦ [31]. Активаторы рГЦ активируют фермент независимо от гема, в то время как стимуляторы являются гем-зависимыми и взаимодействуют с ферментов двумя путями: как сенсибилизаторы рГЦ к эндогенному NO (в том числе и к экзогенному при комбинированной терапии) и как прямые стимуляторы рГЦ [30, 32].
Разрабатываемые препараты на основании активаторов рГЦ (Цинацигуат, вещество 58-2667) и на основании стимуляторов (вещества 41-2272 и 41-8543) не показали достаточной эффективности, биодоступности и безопасности [33, 34].
рГЦ может существовать в двух формах: нативная (гем-содержащая или восстановленная) и безгемная форма, которая в большом количестве появляется в условиях окислительного стресса при ряде сердечно-сосудистых заболеваниях [35]. АФК способны окислять железо гема рГЦ, в результате чего фермент становится нефункциональным [36], более того, безгемовая форма рГЦ быстро подвергается биодеградации убиквитином [37].
Единственным успешно прошедшим этап доклинических исследований и перешедшим к клиническим исследованиям стимулятором рГЦ является Риоцигуат (вещество 63-2521).
Активация рГЦ приводит к увеличению внутриклеточной концентрации цГМФ, который аллостерически активирует цГМФ-зависимую PKG. Последний фермент фосфорилирует VASP в положениях ser157 и ser239. VASP связывается непосредственно с актином и проксимальными участками интегрина, что ремоделирует цитоскелет тромбоцита и затрудняет морфологические изменения при его активации [38]. Кроме того, цГМФ способен ингибировать ФДЭ 3 типа, что приводит к повышению концентрации цАМФ, который активирует PKA; данный каскад также приводит к антиагрегантному эффекту [39] (рисунок 4). Активированная PKG фосфорилирует ERK2 и p38, что приводит к снижению экспрессии гликопротеина IIb/IIIa на поверхности тромбоцита.
Специфическая фармакологическая активность и фармакокинетика клопидогреля
Клопидогрель (Метил-(+)-(S)-альфа-(о-хлорфенил)-6,7-дигидротиено[3.2 c]пиридин-5(4Н)-ацетат) – антиагрегант тиенопиридинового ряда (рисунок 9), используемый для профилактики тромботических осложнений у пациентов с инфарктом миокарда, ишемическим инсультом или окклюзией периферических артерий, а также в составе двойной антиагрегантной терапии вместе с АСК [159]. В 1972 году доктор Фернан Элой работал над поиском новых противовоспалительных препаратов группы тиенопиридинов, создав несколько опытных образцов, среди которых были тиноридин и тиклопидин. В ex vivo и in vivo моделях противовоспалительных эффектов выявлено не было, однако были показаны антиагрегантные эффекты.
В 1972 году доктор Фернан Элой работал над поиском новых противовоспалительных препаратов группы тиенопиридинов, создав несколько опытных образцов, среди которых были тиноридин и тиклопидин. В ex vivo и in vivo моделях противовоспалительных эффектов выявлено не было, однако были показаны антиагрегантные эффекты.
Клопидогрель был запатентован в 1982 году и одобрен для медицинского применения в 1998 году. В 2010 г клопидогрель был второй по продажам препарат, а в 2016 стал 34 препаратом, наиболее часто назначаемым в США [160, 161].
В основе механизма действия клопидогрела лежит избирательное и необратимое ингибирование P2Y12 пуриновых рецепторов тромбоцитов (рецепторов к АДФ). Такое ингибирование приводит к тому, что восстановление чувствительности тромбоцитов к АДФ происходит через 8-10 дней за счет обновления циркулирующего пула [163 - 169]. P2Y12 представляет собой Gi-связанный трансмембранный рецептор, активация которого приводит к ингибированию АЦ; уменьшение внутриклеточной концентрации цАМФ приводит к снижению интенсивности фосфорилирования VASP. VASP в меньшей степени дезактивирует рецептор IIb/IIIa и тем самым достигается агрегантный эффект. Параллельно с описанным процессом идет процесс активирования Act (RAC-серин/треонин протеинкиназы) [164]. Данный факт очень важен ввиду того, что активация Act - эффектора сигнального пути PI3K - наблюдается при коллаген-индуцированной агрегации тромбоцитов [165]; снижение активности которого при ингибировании P2Y12 может вносить свой вклад в антиагрегантный эффект клопидогрела. Активация рецептора P2Y1 приводит к индуцированию PLC и в последствии к увеличению внутриклеточной концентрации Ca2+ [166]. Оба вышеописанных процесса приводят к агрегации тромбоцитов и увеличению экспрессии гликопротеина IIb/IIIa на их поверхности.
Ингибирование агрегации тромбоцитов, вызванное АДФ, было показано в исследованиях ex vivo на здоровых добровольцах даже при использовании довольно высоких концентраций АДФ [170-172]. Также было показано действие клопидогреля на агрегацию, вызванную коллагеном (1-10 мг/мл) и невысокой концентрацией тромбина (до 0,1 МЕ/мл). Однако увеличение концентрации данных индукторов приводит к полному нивелированию антиагрегантного действия клопидогреля, видимо, за счет снижения вклада АДФ-опосредованного механизма [173].
Ингибирование агрегации тромбоцитов происходит сразу после однократного перорального приема клопидогреля и сохраняется в течение 2 ч после него; ингибирование агрегации достигает уровня 40-60% после 3-7 дней каждодневного приема 75 мг/сут [174].
После приема внутрь клопидогрель быстро всасывается из кишечника с показателем абсолютной биодоступности около 50% [175]. Результаты исследований in vitro показывают, что на процесс всасывания клопидогреля влияет Pgp [176]. Клопидогрель является пролекарством для его активации необходима модификация ферментами печени [177, 178]. Превращение клопидогреля в его активный метаболит происходит в две последовательные стадии. Первая стадия проходит с участием ферментов монооксигеназной системы печени и приводит к образованию промежуточного фармакологически неактивного метаболита 2-оксо-клопидогреля. На второй стадии из продукта первой реакции образуется фармакологически активный метаболит R-130964 (clop-AM) [179]. В то же время большая часть всосавшегося клопидогреля (85-90%) гидролизуется печеночной карбоксилэстеразой-1 (CES1) до неактивного метаболита-производного карбоновой кислоты (SR26334) [180, 182] (рисунок 10). Вследствие этого лишь около 2% введенной дозы клопидогреля превращается в активный метаболит и приводит к антиагрегантному эффекту.
Клопидогрель и его основной неактивный метаболит имеет высокую степень связывания с белками плазмы крови (94%) и сохраняется таковой вплоть до увеличения концентрации в опытах in vitro до 100 мкг/мл. Исследование экскреции меченого 14C клопидогреля показало у крыс основное выведение через желчь и кал, в то время у обезьян тот же метод показал равный вклад в данный процесс почечной и печеночной экскреции. Клопидогрель слабо проникает через гематоэнцефалический барьер [183].
Результаты исследования антиагрегантной активности на модели сахарного диабета
Средние данные уровня глюкозы в крови крыс со стрептозотоцин индуцированным сахарным диабетом представлены в таблице 4.
Исходные значения уровня глюкозы в цельной крови крыс до введения стрептозотоцина в среднем составили 6,7 ммоль/л. К 3-м суткам после введения стрептозотоцина концентрация глюкозы в крови крыс контрольной и опытной групп составила 16,1±1,1 ммоль/л и 16,9±1,6 ммоль/л соответственно. На 10 сутки после введения стрептозотоцина перед забором крови концентрация глюкозы в цельной крови крыс составила: в контрольной группе 22,7±1,6 ммоль/л, в опытной – 20,0±2,7 ммоль/л (таблица 4). Таким образом, на модели стрептозотоцин-индуцированного сахарного диабета развивается выраженная гипергликемия.
Средние данные амплитуды АДФ-индуцированной агрегации тромбоцитов животных после 7-дневного введения субстанции GRS в дозе 10 мг/кг у крыс со стрептозотоцин-индуцированным сахарным диабетом представлены в таблице 5.
Субстанция GRS при курсовом (7-дневном) внутрижелудочном введении крысам в дозе 10 мг/кг не обладает гипогликемическими свойствами и не влияет на уровень глюкозы в крови крыс со стрептозотоцин-индуцированном сахарным диабетом.
Количество тромбоцитов в БТП интактных крыс составило 658±19 тыс./мл. Амплитуда обратимой АДФ-индуцированной агрегации тромбоцитов в БТП интактных крыс составила 23±2 % (таблица 5).
Количество тромбоцитов в БТП крыс со стрептозотоцин-индуцированном сахарным диабетом, получавших носитель в течение 7 суток, составило 661±13 тыс./мл. Амплитуда АДФ-индуцированной агрегации тромбоцитов в БТП крыс контрольной группы к 10-м суткам после инъекции стрептозотоцина составила 36±2%, что статистически значимо выше на 56% аналогичного показателя у интактных животных (таблица 5).
Таким образом, у крыс контрольной группы на фоне развившегося сахарного диабета наблюдается выраженная гиперагрегация тромбоцитов.
Количество тромбоцитов в БТП крыс со стрептозотоцин-индуцированном сахарным диабетом, получавших GRS в дозе 10 мг/кг в течение 7 суток, составило 651±13 тыс./мл. Внутрижелудочное 7-дневное введение GRS в дозе 10 мг/кг крысам с стрептозотоцин-индуцированным сахарным диабетом приводило к значимому снижению агрегации тромбоцитов: амплитуда АДФ-индуцированной агрегации тромбоцитов составила 27±2%, что на25 % ниже значений контрольной группы и не отличалось от показателя интактных животных (таблица 5).
Таким образом, субстанция GRS при курсовом (7-дневном) внутрижелудочном введении в дозе 10 мг/кг крысам со стрептозотоцин-индуцированным сахарным диабетом проявляет антиагрегантную активность, снижая амплитуду агрегации тромбоцитов до уровня значений у интактных животных.
Обсуждение результатов исследования
Минимальной концентрацией в опытах in vitro, которая обладает значимым антиагрегантным эффектом, является 0,7510-6 М; GRS в концентрации 0,7510-7 М не обладает данным эффектом, даже в виде тенденции. Дальнейшее ее увеличение до значений 0,7510-5 М и 1,510-5 М приводит к сопоставимому росту антиагрегантного эффекта. Пересчет минимальной эффективной концентрации GRS приводит к цифре порядка 200 нг/мл; такая и близкая к ней концентрация в плазме крови наблюдается после внутрижелудочного введения GRS в диапазоне доз 10-40 мг/кг. Однако, учитывая, что GRS в 1,6 раз интенсивнее распределяется в форменных элементах крови, для реализации антиагрегантного эффекта нужно больше концентрации в тромбоцитах в 1,6 раз.
Диапазон концентраций 0,7510-5–1,510-5 М в опытах in vitro приводит к максимальному антиагрегантному эффекту, однако в опытах in vivo таких концентраций в плазме крови животных достичь практически невозможно (2000-4000 нг/мл). В аналогичных концентрациях (0,7510-5–1,510-5 М) исследовали препараты сравнения ацетилсалициловую кислоту и дипиридамол; антиагрегантный эффект GRS в данных опытах сопоставим с дипиридамолом, однако уступает ацетилсалициловой кислоте. Недостижимо высокая эффективность ацетилсалициловой кислоты может быть обусловлена механизмом ее действия: подавление синтеза TXA2 задействует сразу несколько ингибиторных механизмов тромбоцитов, в то время как регуляция цАМФ-пути (дипиридамол) и цГМФ-пути (GRS) суммарно вносят меньший вклад в дезактивацию тромбоцитов, обладая меньшей токсичностью по сравнению с ацетилсалициловой кислотой.
Пересчет использованных концентраций ацетилсалициловой кислоты в опытах in vitro приводит к цифрам 1350-1800 нг/мл, достижение которых в системе in vivo теоретически возможно (в высоких дозах), но из-за ее быстрого метаболизма едва ли достижима адекватная системная экспозиция, достаточная для реализации сопоставимого с условиями in vitro эффекта. Однако ацетилсалициловая кислота до попадания в печень успевает прореагировать в воротной вене с некоторым пулом тромбоцитов и обеспечить антиагрегантный эффект, чем обуславливается ее высокая эффективность как препарата сравнения в опытах in vivo.
Пересчет использованных концентраций дипиридамола в опытах in vitro приводит к цифрам 3500-7500 нг/мл. Достижение таких концентраций в среде in vivo едва ли возможно.
Выбранный индуктор агрегации АДФ взаимодействует с P2Y1 и P2Y12 пуриновыми рецепторами тромбоцитов и активирует их. За счет этого уменьшается концентрации цАМФ и увеличивается концентрация Ca2+ внутри клетки. Это приводит к активации PKG и стимуляции секреции гранул тромбоцитов. Параллельно с этими процессами идет активация NO–синтазы и рГЦ, это приводит к увеличению внутриклеточной концентрации цГМФ, который помимо увеличения синтеза TXA2 ингибирует ФДЭ 3 типа.
Следовательно, АДФ одновременно задействует множество биохимических путей регуляции активности тромбоцитов. Ацетилсалициловая кислота ингибирует не только фоновый уровень синтеза TXA2, но и АДФ-опосредованный. В свою очередь дипиридамол ингибирует ФДЭ 3 типа и усиливает ингибирующее влияние цГМФ, которое обусловлено действием АДФ. Важно отметить, что в опыте in vitro антиагрегантный эффект дипиридамола обусловлен только ингибированием ФДЭ, в то время как для реализации его всех ингибирующих эффектов необходима среда in vivo.
Это позволяет предполагать, что в опытах in vivo антиагрегантная активность дипиридамола выше в сопоставимых концентрациях.
Введение в среду GRS приводит к стимуляции NO/рГЦ/цГМФ пути дезактивации тромбоцитов. Происходит комплексное действие на тромбоциты: увеличивается синтез TXA2, происходит ремоделирование цитоскелета клетки, изменяется интенсивность секреции гранул и ингибируется ФДЭ 3 типа.
В эксперименте in vivo показано, что антиагрегантный эффект GRS после однократного внутрижелудочного введения наблюдается уже через 1 ч и продолжается как минимум в течение 4 ч. Максимальный эффект наблюдается к 3-му часу после введения; к 4-му часу увеличения эффекта не наблюдается (выходит на «плато»). Данный факт может быть следствием преодоления GRS биологических мембран при всасывании, распределении и поступлении к мишени внутрь тромбоцитов. Однако, данные in vitro показывают, что 10-минутной инкубации достаточно для реализации значимого антиагрегантного эффекта (в том числе преодоления мембраны тромбоцита и создания достаточной внутриклеточной концентрации для запуска биохимических путей).
Следовательно, либо увеличение времени инкубации GRS с тромбоцитами в среде in vitro приведет к росту антиагрегантного эффекта, либо для всасывания и поступления GRS к мишени внутрь тромбоцита до насыщения концентрацией нужно порядка 3 ч. Нужно отметить, что в среде in vitro отсутствовали ферменты метаболизма.
Согласно данным изучения фармакокинетики Tmax составляет 1 ч, а Cmax для дозы 20 мг/кг – 202,2 нг/мл ( 0,710-6 М), для дозы 10 мг/кг – 150,2 нг/мл ( 0,510-6 М).
Увеличение выраженности антиагрегантного эффекта в течение 3 ч даже при уменьшении концентрации GRS в крови за счет элиминации (до значений порядка 50-70 нг/мл) может быть следствием необратимого запуска внутриклеточного сигнального пути NO/рГЦ/цГМФ или наличия фармакологически активного(ых) метаболита(ов) GRS (вероятно, продуктов фазы II), которые также обуславливают его антиагрегантный эффект.
Минимальный значимый антиагрегантный эффект наблюдается в дозе 2,5 мг/кг, дальнейшее ее увеличение до 5 мг/кг приводит к сопоставимому росту фармакодинамического эффекта. Увеличение дозы до 10 мг/кг и выше не приводит к росту антиагрегантного эффекта. Данный факт может быть следствием выхода высокой дозы GRS из места активного всасывания или насыщения активных переносчиков. Другой причиной может быть насыщение мишени и биохимического пути.
Введение дозы 1 мг/кг не приводит к статистически значимому антиагрегантному эффекту или в виде тенденции. Это может быть связано с низкой степенью взаимодействия сравнительно небольшого количества фармацевтической субстанции с мембранами, где происходит всасывание. Возможно, создание особо биодоступной лекарственной формы позволит увеличить всасывание дозы 1 мг/кг и приведет к антиагрегантному эффекту после ее введения.
В ходе исследования состояния плазменного звена гемостаза после однократного внутрижелудочного введения GRS было показано статистически значимое увеличение тромбинового времени при неизмененном количестве фибриногена. Дезактивация каскада свертывания крови на начальном этапе (сосудисто-тромбоцитарный гемостаз) неминуемо затрагивает все нижележащие звенья. Дезактивация тромбоцитов приводит к снижению активности скрамблазы и уменьшению присутствия фосфатидилсерина на внешней оболочке плазматической мембраны тромбоцитов. Это ведет к усложнению сборки комплекса протромбиназы (комплекс факторов V, X и Ca2+) на поверхности тромбоцитов и, таким образом, к снижению тромбиновой активности. Не исключается прямое взаимодействие производного индолинона с тромбином или фибриногеном (в том числе затруднение их взаимодействия).
При сахарном диабете происходит нарушение агрегационных свойств крови. Причины такого нарушения исходят от сосудистой стенки, самих клеток крови и свойств плазмы крови (увеличение вязкости, приводящее к нарушению адекватной доставки биологически активных веществ (антиагрегантных, антиоксидантных и пр.) к тканям).
Одним из важных механизмов эндотелиальной дисфункции при сахарном диабете является изменение сигнального пути NO/рГЦ/цГМФ. Фермент eNOS локализуется в кавеолах эндотелиальных клеток [197] и обладает низким уровнем базальной активности из-за связи с кавеолином-1, однако взаимодействие инсулина с клетками приводит к фосфорилированию субстрата инсулинового рецептора 1 (IRS-1) и активации пути PI3/Akt, который активирует eNOS.
В дополнение к основному пути PI3/Akt инсулин также активирует митоген-активируемые протеинкиназы (MAPK) через малые Ras ГТФ-азы [198]; это приводит к увеличению продукции эндотелина-1 (очень активного вазоконстриктора) и провосталительных молекул адгезии на лейкоцитах и клетках эндотелия ICAM-1 [199].