Анализ взаимодействия афобазола с сигма-1 рецепторами Абрамова Елена Владимировна

Содержание к диссертации

Введение

1 Обзор литературы 13

1.1 Афобазол – мультитаргетный анксиолитик нового поколения 13

1.2 Sigma1R

1.2.1 Структура Sigma1R 14

1.2.2 Экспрессия Sigma1R в ЦНС и периферических тканях 18

1.2.3 Локализация Sigma1R в клетке 19

1.2.4 Функции Sigma1R

1.2.4.1 Активация шаперона Bip 20

1.2.4.2 Транслокация Sigma1R в область цитоплазматической и ядерной 22 мембран

1.2.4.3 Регуляция Sigmar1 сигнального пути IRE1- XBP1 23

1.2.4.4 Регуляция сигнального пути Sigma1R- Insig1 24

1.2.4.5 Регуляция сигнального пути Sigma1R- Nrf2 25

1.2.4.6 Регуляция фосфолипазного пути трансдукции 25

1.2.4.7 Модуляция активности ионных каналов и рецепторов 27 цитоплазматической мембраны

1.2.5 Лиганды Sigma1R 30

2 Материалы и методы исследования 35

2.1 Препараты 35

2.2 Экспериментальные животные 36

2.2.1 Прижизненные манипуляции с животными 36

2.3 Метод радиолигандного анализа

2.3.1 Получение мембранных фракций 37

2.3.2 Конкурентное взаимодействие исследуемых соединений с [3H](+)-пентазоцином и [G-3H]PRE-084 в мембранных фракциях головного мозга мышей 38

2.3.3 Сцинтилляционный счет радиоактивности 42

2.3.4 Построение кривых конкурентного вытеснения меченых лигандов исследуемыми соединениями 42

2.3.5 Расчет значений параметра IC50 и IC50Hi 42

2.3.6 Расчет значений специфического связывания [3H](+)-пентазоцина 44

2.3.7 Определение содержания белка 44

2.3.8 Статистическая обработка данных 44

2.4 Метод иммунофлюоресцентного окрашивания 45

2.4.1 Культура клеток 45

2.4.2 Пробоподготовка для микроскопии

2.4.2.1 Визуализация липидных рафтов 45

2.4.2.2 Одновременная визуализация липидных рафтов и Sigma1R 2.4.3 Конфокальная микроскопия 46

2.4.4 Обработка данных 47

3 Результаты иследования

3.1 Сравнительный анализ аффинности афобазола к Sigmar1 в Р2 фракции головного мозга интактных мышей CD-1 при конкурентном взаимодействии с [3H](+)-пентазоцином 48

3.2 Анализ конкурентного взаимодействия афобазола с прототипными лигандами Sigmar1 [3H](+)-пентазоцином и [G-3H]PRE-084 в Р2 фракциях гомогенатов головного мозга интактных мышей линий CD-1, BALB/c и C57BL/6 in vitro 51

3.3 Анализ различий в связывании [3H](+)-пентазоцина с Sigmar1 в субклеточных Р2 и Р3 фракциях гомогенатов головного мозга интактных мышей линий CD-1, BALB/c и C57BL/6 55

3.4 Влияние афобазола на специфическое связывание [3H](+)-пентазоцина в субклеточных Р2 и Р3 фракциях гомогенатов головного мозга мышей линий CD-1, BALB/c и C57BL/6 ex vivo 57

3.5 Влияние эмоционально-стрессовых воздействий на специфическое

связывание [3H](+)-пентазоцина в головном мозге мышей линий CD 1, BALB/c и C57BL/6 60

3.5.1 Влияние процедуры внутрибрюшинной инъекции на специфическое связывание [3H](+)-пентазоцина в головном мозге мышей линий CD-1, BALB/c и C57BL/6 61

3.5.2 Влияние эмоционально-стрессового воздействия в тесте «Открытое поле» на специфическое связывание [3H](+)-пентазоцина в головном мозге мышей линий CD-1, BALB/c и C57BL/6 63

3.5.3 Комплексное воздействие процедуры внутрибрюшинной инъекции и тестирования в «Открытом поле» на специфическое связывание [3H](+)-пентазоцина в головном мозге мышей линий CD-1, BALB/c и C57BL/6 67

3.6 Влияние афобазола ex vivo в условиях эмоционально-стрессовых воздействий на специфическое связывание [3H](+)-пентазоцина в головном мозге мышей линий CD-1, BALB/c и C57BL/6 73

3.6.1 Влияние афобазола ex vivo на специфическое связывание [3H](+)-пентазоцина в головном мозге мышей линий CD-1, BALB/c и C57BL/6 в условиях стрессового воздействия процедуры внутрибрюшинной инъекции 73

3.6.2 Влияние афобазола ex vivo на специфическое связывание [3H](+)-пентазоцина в головном мозге мышей линий CD-1, BALB/c и C57BL/6 в условиях стрессового воздействия процедуры внутрибрюшинной инъекции и тестирования в «Открытом поле» 79

3.7 Определение влияния афобазола in vitro на внутриклеточную локализацию липидных рафтов и Sigmar1 в живых астроцитах человека 83

4 Обсуждение результатов 91

4.1 Эндогенные лиганды Sigmarl 91

4.2 Специфическое связывание [3Н](+)-пентазоцина с Sigmar1 при эмоционально-стрессовых воздействиях и введении афобазола 93

4.3 Влияние афобазола in vitro на внутриклеточную локализацию липидных рафтов и Sigmar1 в живых астроцитах человека 98

Выводы 102

Практические рекомендации 104

Список сокращений 105

Список литературы 107

Благодарности

• Транслокация Sigma1R в область цитоплазматической и ядерной 22 мембран
• Получение мембранных фракций
• Анализ различий в связывании [3H](+)-пентазоцина с Sigmar1 в субклеточных Р2 и Р3 фракциях гомогенатов головного мозга интактных мышей линий CD-1, BALB/c и C57BL/6
• Специфическое связывание [3Н](+)-пентазоцина с Sigmar1 при эмоционально-стрессовых воздействиях и введении афобазола

Введение к работе

Актуальность. Афобазол (5-этокси-2-[2-(морфолино)-этилтио] бензимидазола дигидрохлорид) синтезирован и фармакологически изучен в ФГБНУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова» (Патент РФ №2061686 от 10.06.1996). В 2006 году препарат внедрен в медицинскую практику в качестве анксиолитика (№ ЛС – 000861). Селективные анксиолитические свойства афобазола охарактеризованы в ряде экспериментальных и клинических работ (Середенин С.Б. и др. Вестник Российской академии медицинских наук. 1998. 11. С. 3-9; Незнамов Г.Г. и др. Экспериментальная и клиническая фармакология. 2001. Т. 64(2). С. 15-19). В исследованиях in vitro установлены лигандные взаимодействия афобазола с MT1, MT3, сигма-1 рецепторами (Sigma1R, 1) и рецепторным участком MAO A (Середенин С.Б., Воронин М.В. Экспериментальная и клиническая фармакология. 2009. Т. 72(1). С. 3-11).

Множественность нейрохимических мишеней препарата требует детального изучения каждого из установленных взаимодействий, что необходимо для понимания механизмов формирования клеточного ответа и фармакологического эффекта афобазола. Последнее дает возможность определения новых показаний назначения афобазола, создания рациональных схем его применения, построения гипотез о новых фармакологических средствах, селективно воздействующих на специфичные для афобазола мишени. Поэтому в НИИ фармакологии имени В.В. Закусова была поставлена задача комплексного изучения фармакодинамики афобазола.

Настоящая работа посвящена исследованию взаимодействия афобазола с Sigma1R.

Sigma1R – сравнительно недавно открытый трансмембранный белок-шаперон, локализованный преимущественно в эндоплазматическом ретикулуме, в областях, граничащих с митохондриями (Su T. P., et al. Trends in Pharmacological Sciences. 2010. V. 31(12). P. 557-566). Физиологическая роль Sigma1R состоит в выполнении шаперонных функций, в восстановлении 3D конформации измененных белков клетки (Pabba M. Frontiers in Cellular Neuroscience. 2013. 7. P. 50). Описаны взаимодействия Sigma1R с тирозинкиназными рецепторами, с рецепторами, связанными с G белками, с ионными каналами (Na⁺, K⁺, NMDA, VRCC, ASIC), с фосфолипазой С (Su T. P., et al. Trends in Pharmacological Sciences. 2010. V. 31(12). P. 557-566). Sigma1R стабилизируют инозитол 1,4,5-трисфосфатные рецепторы (ИФ3Р), пролонгируя высвобождение Са²⁺ в митохондрии, опосредуя таким образом активацию биоэнергетического обмена в клетке, снижают синтез активных форм кислорода в митохондриях, ограничивая развитие ЭПР стресса (Hayashi T., Su T. P. Cell. 2007. V. 131(3). P. 596-610). Многочисленные эффекты Sigma1R в конечном итоге повышают выживаемость клеток

в неблагоприятных условиях (Hayashi T. Psychiatry and Clinical Neurosciences. 2015. V. 69(4). P. 179-191).

Sigma1R экспрессирован в тканях органов большинства систем организма, в том числе и в ЦНС, что определяет его в качестве перспективной мишени терапии болезни Альцгеймера, болезни Паркинсона, шизофрении, депрессивных расстройств (Nguyen L., et al. Journal of Pharmacological Sciences. 2015. V. 127(1). P. 17-29). Лиганды Sigma1R разнообразны по химической структуре и фармакологическим эффектам. Среди препаратов, широко применяемых в клинике, афинностью к Sigma1R обладают ингибитор ацетилхолинэстеразы донепезил, антидепрессанты флуоксетин, сертралин, имипрамин, нейролептик галоперидол, нейростероиды прегненолон-сульфат, дигидроэпиандростерон, противокашлевые средства декстрометорфан, карбопентан и др (Cobos E.J., et al. Current Neuropharmacology. 2008. V. 6(4). P. 344-366).

Фармакодинамические эффекты Sigma1R, связанные с его лигандной активацией, до конца не ясны, имеют свою специфику для каждого из установленных лигандов и, поэтому требуют детального изучения. Более того, в литературе отсутствует окончательное определение агонистических и антагонистических свойств лигандов по отношению к Sigma1R. Группа Т. Hayashi, имеющая наибольший опыт в изучении структурно-функциональных особенностей Sigma1R, постулировала, что для характеристики лиганда в качестве агониста необходимо доказать способность вызывать транслокацию Sigma1R в область цитоплазматической мембраны (Hayashi T., Su T. P. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 2003. V. 306(2). P. 726-733; Hayashi T., Su T. P. Current Neuropharmacology. 2005. V. 3(4). P. 267-280).

Степень разработанности проблемы. Фундаментальные исследования, выполненные со времени идентификации Sigma1R в 1976 году, позволили установить их важную физиологическую роль как шаперонов, способствующих поддержанию 3D конформации функционально значимых белковых макромолекул клетки, рецепторов, ионных каналов, ферментов и др. Рассмотрены механизмы активации Sigma1R при аверсивных воздействиях на клетку (Hayashi T., Su T. P. Cell. 2007. V. 131(3). P. 596-610).

Другой важный блок исследований связан с изучением лигандных свойств, механизмов лигандной активации, поиску эндо- и экзогенных лигандов. Последние обнаружены среди лекарственных средств лечения ряда нервно-психических заболеваний, что обусловило активное изыскание новых оригинальных соединений, связывающихся с Sigma1R, перспективных для создания нейропротекторов и антидепрессантов. Фармакологические исследования концентрировались на изучении зависимости лигандных свойств от химической структуры с последующей оценкой отобранных соединений в доклинических разработках с использованием стандартных

экспериментальных моделей для данных групп лекарств (Hayashi T., Su T. P. CNS Drugs. 2004. V. 18(5). P. 269-284; Hayashi T., Stahl S. M. Drugs of the Future. 2009. V. 34(2). P. 137-146).

Однако, до настоящего времени поисковые работы не завершились успешными клиническими исследованиями. Открытыми остаются вопросы характера взаимодействия лигандов с Sigma1R, определения агонистических свойств в свете наиболее обоснованной в фундаментальных исследованиях концепции о способности агонистов вызывать транслокацию Sigma1R из ЭПР в область цитоплазматической и ядерной мембран.

В доступной литературе не обнаружено данных об участии Sigma1R в формировании реакций на эмоциональный стресс, в механизмах действиях анксиолитиков.

Поэтому, исходя из данных об анксиолитических свойствах афобазола и установленных в модельных экспериментах in vitro лигандных свойствах препарата к Sigma1R (Середенин С.Б., Воронин М.В. Экспериментальная и клиническая фармакология. 2009. Т. 72(1). С. 3-11; Незнамов Г.Г. и др. Экспериментальная и клиническая фармакология. 2001. Т. 64(2). С. 15-19), в настоящем исследовании изучено взаимодействие афобазола с Sigma1R при эмоционально-стрессовых воздействиях с использованием фармакогенетической методологии, учитывающей различия в фенотипах эмоционально-стрессовых реакций.

Цель исследования. Целью настоящей работы явилось выявление характера лигандных взаимодействий и изменений внутриклеточной локализации Sigma1R при связывании с афобазолом у интактных животных и в условиях эмоционального стресса.

Задачи исследования. Для достижения поставленной цели необходимо решить следующие задачи:

1. Определить аффинность афобазола к Sigma1R в Р2 фракции гомогенатов головного мозга мышей линии CD-1 в сравнении с известными лигандами.

2. Установить значения параметра IC₅₀ афобазола при конкурентном взаимодействии с прототипными лигандами Sigma1R [³H](+)-пентазоцином и [G-³H]PRE-084 в Р2 фракции гомогенатов головного мозга аутбредных мышей CD-1 и инбредных C57BL/6 и BALB/c, отличающихся по эмоционально-стрессовой реакции.

3. Исследовать специфическое связывание [³H](+)-пентазоцина с Sigma1R в Р2 и Р3 фракциях гомогенатов головного мозга интактных мышей линий CD-1, C57BL/6 и BALB/c in vitro.

4. Изучить влияние афобазола в анксиолитической дозе на специфическое связывание [³H](+)-пентазоцина с Sigma1R в Р2 и Р3 фракциях гомогенатов головного мозга мышей линий CD-1, C57BL/6 и BALB/c при эмоционально-стрессовых воздействиях.

5. Методом иммунофлюоресценции провести качественный анализ влияния афобазола на внутриклеточную локализацию липидных рафтов и Sigma1R в культуре живых астроцитов человека.

Научная новизна. Методом радиолигандного анализа доказано, что афобазол является лигандом Sigma1R, обладающим афинностью, близкой по значению к эндогенным лигандам рецептора.

Установлено, что афобазол в дозе 5 мг/кг увеличивает специфическое связывание [³H](+)-пентазоцина с Sigma1R в Р2 фракции гомогенатов головного мозга мышей линии CD-1.

Показано, что при конкурентном взаимодействии афобазола с [³H](+)-пентазоцином в Р2 фракциях гомогенатов головного мозга мышей линий CD-1, BALB/c, C57BL/6 и [G-³H]PRE-084 у C57BL/6 предпочтительна модель с одним сайтом связывания. Конкурентное вытеснение [G-³H]PRE-084 у CD-1 и BALB/c описывается моделью с двумя сайтами связывания.

Выявлены изменения и межлинейные различия в специфическом связывании [³H](+)-пентазоцина у инбредных мышей с разными фенотипами ответа на стресс и аутбредных животных при эмоционально-стрессовых воздействиях и введении афобазола.

Методом иммунофлюоресценции качественно показано внутриклеточное перераспределение липидных рафтов в живых астроцитах человека в область цитоплазматической и ядерной мембран при инкубации с афобазолом в концентрации 10^-5 М в течение 30 и 60 минут и колокализация липидных рафтов с Sigma1R.

Теоретическая и практическая значимость. Установленные результаты доказали лигандные свойства афобазола по отношению к Sigma1R и позволили определить анксиолитик в качестве агониста Sigma1R, что обусловило целесообразность дальнейшего фармакологического изучения в НИИ фармакологии имени В.В. Закусова афобазола в качестве цито- и нейропротектора и разработку новых показаний назначения афобазола. Эти результаты и материалы диссертационного исследования включены в формируемое регистрационное досье для расширения области медицинского применения афобазола.

Доказанное отсутствие значимых взаимодействий с Sigma1R основного метаболита афобазола соединения М-11 позволило применить сравнительный анализ

фармакологических эффектов М-11 и афобазола для изучения механизмов действия анксиолитика.

Методология и методы исследования. В настоящей работе использована
фармакогенетическая методология с применением физиологических,

фармакологических методов, радиолигандного и иммунофлюоресцентного анализа.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Определены характеристики рецепторного взаимодействия афобазола с Sigma1R в сравнении со стандартными экзогенными лигандами и эндогенным лигандом прогестероном. Установленная аффинность афобазола (IC50=2,7*10^-5 моль/л) близка к афинности прогестерона (IC50=9,02*10^-6 моль/л).

2. Интактные инбредные мыши с разным фенотипом эмоционально-стрессовой реакции и аутбредные животные не различаются по характеристикам взаимодействия лиганда с рецептором. Изменения возникают при эмоционально-стрессовых воздействиях и введении афобазола.

3. Эмоционально-стрессовые воздействия вызывают активацию и транспорт Sigma1R в область цитоплазматической мембраны.

4. Афобазол способен изменять специфическое связывание [³H](+)-пентазоцина в Р2 фракциях гомогенатов головного мозга мышей, что свидетельствует о транслокации рецептора в область цитоплазматической мембраны и характеризует афобазол в качестве агониста рецептора.

5. В живых астроцитах человека установлена колокализация Sigma1R и липидных рафтов.

Степень достоверности. Экспериментальные данные получены с использованием известных и хорошо воспроизводимых методов исследования. Статистическая обработка полученных данных проведена с применением современных методов математической статистики, что гарантирует высокую степень достоверности полученных результатов.

Личный вклад соискателя заключается в самостоятельной подготовке обзора литературы, выполнении экспериментальной части, проведении статистической обработки данных. Автором самостоятельно воспроизведена и скорректирована методика радиолигандного анализа. При непосредственном участии автора подготовлены публикации по результатам исследований.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы представлены в материалах международных конференций «The 28th CINP World Congress of Neuropsychopharmacology» (Стокгольм, 2012), «The 42th Annual Meeting, Society for Neuroscience» (Новый Орлеан, 2012), «The 29th CINP World Congress of Neuropsychopharmacology» (Ванкувер, 2014), доложены на IV съезде фармакологов

России «Инновации в современной фармакологии» (Казань, 2012), всероссийской научно-практической конференции молодых ученых «Проблемы разработки новых лекарственных средств» (Москва, 2013), всероссийской конференции молодых ученых с международным участием «Достижения современной фармакологической науки» (Рязань, 2015), 6-ой международной конференции «Биологические основы индивидуальной чувствительности к психотропным средствам» (Клязьма, 2015), международном конгрессе «BIT’s 14th Annual Congress of International Drug Discovery Science and Technology» (Сеул, 2016), на расширенном заседании отдела фармакогенетики ФГБНУ «НИИ фармакологии имени В.В.Закусова» (Москва, 2017).

Публикации. По результ ата м и сследован ий оп убли кованы 3 статьи в ведущих рецензируемых научных журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ, и 8 тезисов в материалах российских и международных конференций.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 131 странице машинописного текста. Состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и метов, использованных в исследованиях, результатов исследований, обсуждения, выводов. Работа содержит 23 рисунка и 10 таблиц. Список литературы включает 208 источников, из них 12 отечественных и 196 зарубежных.

Транслокация Sigma1R в область цитоплазматической и ядерной 22 мембран

Открытые в 1976 году Martin W. R. и его коллегами рецепторы первоначально были отнесены к группе опиоидных. Название рецептор получил по первой букве «S» соединения SKF-10,047, которое считалось его прототипным лигандом [113]. Однако, сформировавшаяся точка зрения о рецепторах как о подтипе опиоидных рецепторов в скором времени была опровергнута.

Другая попытка классификации связана с предположением об идентичности сайтов связывания для (+)-SKF-10,047 и фенциклидина (phencyclidine, PCP) на NMDA рецепторном комплексе [88; 126]. Однако, селективные лиганды NMDA рецепторов только частично вытесняли (+)-SKF-10,047, что свидетельствовало о взаимодействии (+)-[3H]SKF-10,047 не только с NMDA рецептором, но и с другими мишенями [167; 196]. Последующие радиолигандные исследования показали, что (+)-[3H]SKF-10,047 взаимодействует с двумя разными сайтами связывания и, следовательно, не является селективным лигандом рецепторов [166]. С сайтом, к которому (+)-[3H]SKF-10,047 имел большую аффинность, взаимодействовали призводные бензоморфана, такие соединения как (+)-пентазоцин, (+)-циклазоцин, нейролептики галоперидол, перфеназин, флуфеназин, анестетик фенциклидин [166; 172; 177; 178]. Сайт, к которому (+)-[3H]SKF-10,047 проявил большую аффинность, был определен как отдельный рецептор и согласно номенклатуре, предложенной Martin W.R., был назван – рецептором [172; 177; 178].

Биофизический и биохимический анализ продемонстрировали гетерогенность рецепторов. В настоящее время рецепторы подразделяются на два подтипа, 1 и 2, отличающиеся между собой молекулярной массой, распределением в тканях и органах, селективными лигандами [23; 146].

Клонирование Sigma1R осуществлено в 1996 году [64]. Определение аминокислотной последовательности показало, что Sigma1R не имеют гомологов среди других клонированных белков млекопитающих, это позволило окончательно отнести Sigma1R в отдельный класс рецепторов [64]. В последующих исследованиях был выделен ген Sigma1R человека, мышей, крыс, и оказалось, что их аминокислотные последовательности идентичны на 90% [100; 125; 140; 161; 162].

Согласно данным национального информационного центра США в области биотехнологии (NCBI), ген 1 рецептора мыши (Sigmar1, ID: 18391) локализуется в 4-ой хромосоме в положении A5-B2 и кодирует семь изоформ белка [204]. У человека ген рецептора (SIGMAR1, ID:10280) локализуется в коротком плече 9-ой хромосомы в положении 9p13.3 и кодирует семь изоформ белка [203]. Важно отметить литературные сведения о взаимосвязи между повреждением хромосомы в сегменте 9p13.3 и формированием психических расстройств, что позволяет думать о вовлеченности 1 рецепторов в механизмы нейродегенеративных и психических заболеваний [144]. Всемирная единая база белковых сиквенсев (UniProt) предоставляет данные о существовании двух изоформ белка у мыши [205] и пяти изоформ у человека [202], различающихся по количеству аминокислотных остатков. Аминокислотные последовательности изоформы 1 1 рецептора мыши (Sigma1R) O55242-1 и изоформы 1 1 рецептора человека (hSigmaR1) Q99720-1 считаются каноническими. Изоформа 1 Sigma1R состоит из 223 аминокислотных остатка с общей массой 25250 Да. Изоформа 2 короче за счёт отсутствия аминокислотных остатков в положениях 118-148. Изоформа 1 hSigmaR1 состоит из 223 аминокислотных остатков и имеет массу 25128 Да. В изоформах hSigmaR1 2, 3, 4, 5 отсутствуют аминокислотные остатки в положениях 31-50, 118-148, 103-106 и 107-223, 31-52 и 63-76, соответственно. Домен 118-148 опосредует связывание рецептора с лигандами, в частности поэтому его отсутствие в изоформе 2 SigmaR1 и изоформе 3 hSigmaR1 объясняет меньшую аффинность лигандов к рецепторам [55; 205].

В литературе встречается описание разных моделей строения Sigma1R, с одним и двумя трансмембранными доменами [64; 100; 125; 140; 161]. До того, как в 2016 году была определена кристаллическая структура Sigma1R, прототипной считалась модель с двумя трансмембранными доменами [16]. Согласно которой, первый трансмембранный домен (ТМ1) расположен со стороны N-терминали, в положениях аминокислотных остатков с 10 по 30, второй трансмембранный домен (ТМ2) располагается со стороны С-терминали между 81 и 101 положениями аминокислотных остатков. Участок аминокислотной последовательности, заключенный между трансмембранными доменами, расположен в экстрацеллюлярном пространстве и образует петлю из 50 аминокислотных о статков. N- и С- терминали располагаются в цитозоле и состоят из участков аминокислотных последовательностей с 1 по 9 и с 102 по 223 соответственно [205]. В аминокислотной последовательности ТМ2 расположен мотив GXXXG (Gly-87-Gly-88rp-89-Met-90-Gly-91), задействованный в конформационном преобразовании белка из мономерного состояния в олигомерное, для которых характерна разная функциональная активность рецептора. Специфическое связывание (+)-пентазоцина с рецептором в мономерном состоянии в несколько десятков раз ниже в сравнении с олигомерной формой. Мутации в GXXXG мотиве, а именно, замена глицина на лейцин или изолейцин в положениях Gly-87, Gly-88 и Gly-91 приводили к снижению специфического связывания (+)-пентазоцина на 95%. Лиганды Sigma1R вступая во взаимодействие с рецептором, стабилизируют пространственную структуру белка, и рецептор сохраняет олигомерную форму. Среди исследованных лигандов (DTG, PRE-084, 4-PPBP, BD-1047, SKF-83959, сфингозин, сфингозин-1-Р, пентазоцин и галоперидол) наибольший стабилизирующий эффект проявили 4-PPBP, BD-1047. В мономерном состоянии рецептор функционирует в качестве шаперона, взаимодействуя с ионными каналами, рецепторами, и регулирует их активность [57].

В дальнейшем, в соответствии с данными о кристаллической структуре Sigma1R, кото р ы е впервые были получены исследователями из Гарвардской и Стэнфордской медицинских школ, было установлено, что Sigma1R является олигомером, состоящим их трех протомеров. Каждый протомер имеет один трансмембранный домен, расположенный со стороны N-терминали в положениях аминокислотных остатков 6-31. Трансмембранные домены расположены в разных углах т римера. Участок аминокислотных последовательностей 32-223 образует С терминаль. С терминали протомеров располагаются в цитозоле близко друг к другу и формируют -складчатую структуру с лиганд-связывающим доменом в центре [13; 136; 153].

Получение мембранных фракций

Конкурентное взаимодействие с [3H](+)-пентазоцином исследовали: - в Р2 фракциях гомогенатов головного мозга интактных мышей линии CD-1 для определения параметра IC50 афобазола, М-11 и соединений, являющихся лигандами Sigma1R, взятых для сравнительного анализа; - в Р2 фракциях гомогенатов головного мозга интактных мышей линий CD-1, C57BL/6 и BALB/c для определения параметра IC50 афобазола; - в Р2 и Р3 фракциях головного мозга интактных, с внутрибрюшинной инъекцией контрольного раствора или афобазола, тестированных в «Открытом поле», с инъекцией контрольного раствора или афобазола и последующей экспозицией в «Открытом поле» мышей линий CD-1, C57BL/6 и BALB/c для определения параметра специфического связывания [3H](+)-пентазоцина.

Конкурентное взаимодействие с [G-3H]PRE-084 исследовали в Р2 фракциях гомогенатов головного мозга интактных мышей линий CD-1, C57BL/6 и BALB/c для определения параметра IC50Hi афобазола. Конкурентное взаимодействие афобазола, М-11 и соединений, являющихся лигандами Sigma1R, с [3H](+)-пентазоцином в Р2 фракциях гомогенатов головного мозга интактных мышей линии CD-1 исследовали в нескольких независимых экспериментах, количество независимых экспериментов для каждого лиганда отображено в таблице 1. В качестве меченого лиганда использовали [Ring-1,3-3H]-(+)-пентазоцин (PerkinElmer) с удельной активностью 29 Ки/ммоль в конечной концентрации 1 нмоль/л. В качестве холодных лигандов были взяты соединения афобазол, основной метаболит афобазола соединение М-11 (2-[2-(3-оксоморфолин-4-ил)этилтио]-5-этоксибензимидазола гидрохлорид), (+)-3-PPP гидрохлорид (Sigma-Aldrich), декстрометорфан гидробромид (Sigma-Aldrich), галоперидол (Sigma-Aldrich), PRE-084 гидрохлорид (Sigma-Aldrich), BD-1047 гидробромид (Sigma-Aldrich), прогестерон (Sigma-Aldrich). Конечные концентрации холодных лигандов представлены в таблице 1.

Радиолигандное связывание с [3H](+)-пентазоцином проводили при температуре 370С в течение 120 мин, с [G-3H]PRE-084 при 40С в течение 15 мин. Объем инкубационной смеси в обоих случаях составлял 500 мкл. Определяли общее и неспецифическое связывание меченых лигандов.

Инкубационная смесь, использованная для определения общего связывания меченых лигандов, состояла из 50 мкл [3H](+)-пентазоцина или [G-3H]PRE-084, 200 мкл 50 мM Tris HCl буфера (рH = 7.4, Т=370С или 40С в зависимости от используемого меченого лиганда) и 250 мкл суспензии мембранной фракции. Полученные методом дифференциального центрифугирования Р2 фракции ресуспензировали в 50 ммоль/л Tris-HCl буфера (рH=7.4, Т=370С или 40С), из расчета Р2 фракция головного мозга одной мыши на 2 мл 50 ммоль/л Tris-HCl буфера, полученные суспензии пулировали. Определение общего связывания проводили в трех повторах. Для определения неспецифического связывания в инкубационную смесь к 50 мкл [3H](+)-пентазоцина или [G-3H] PRE-084 добавляли 150 мкл 50 ммоль/л Tris HCl буфера (рH = 7.4, Т=370С или 40С в зависимости от используемого меченого лиганда), 50 мкл холодного лиганда в диапазоне конечных концентраций и 250 мкл суспензии мембранной фракции. Для приготовления стоковых растворов водонерастворимых холодных лигандов галоперидола и прогестерона в качестве растворителя использовали 96% этиловый спирт. Поэтому для соблюдения поправки на растворитель в инкубационную смесь, используемую для определения общего связывания, вместо 200 мкл 50 ммоль/л Tris HCl буфера добавляли 150 мкл 50 ммоль/л Tris HCl буфера и 50 мкл 9,6% этилового спирта. При определении неспецифического связывания для каждой концентрации холодного лиганда конкурентное взаимодействие с [3H](+)-пентазоцином или [G-3H]PRE-084 проводили в трех повторах.

Радиолигандное связывание останавливали, добавляя 10 мл 50 ммоль/л Tris-HCl буфера (Т = 40С, рH = 8.0) к инкубационной смеси и последующей быстрой фильтрацией через стекловолоконные фильтры GF/B (Whatman), предварительно обработанные 0,05% полиэтиленимином.

При определении специфического связывания [3H](+)-пентазоцина Р2 и Р3 фракции, выделенные из головного мозга одной мыши, ресуспензировали в 2 мл и 600 мкл 50 ммоль/л Tris-HCl буфера (рH=7.4, Т=370С) соответственно. В каждой субклеточной фракции определяли общее и неспецифическое связывание [3H](+)-пентазоцина в трех повторах. Радиолигандное связывание проводили при температуре 37С в течение 120 мин. Объем инкубационной смеси составил 160 мкл. Инкубационная смесь, использованная для определения общего связывания, содержала 16 мкл [3H](+)-пентазоцина, 48 мкл 50 мM Tris HCl буфера (Sigma-Aldrich) (t=37С, рH=7.4), 16 мкл 9,6% этилового спирта и 80 мкл суспензии мемранной фракции. Для определения неспецифического связывания к 16 мкл [3H](+)-пентазоцина, 64 мкл 50 ммоль/л Tris HCl буфера (Sigma-Aldrich) (t=37С, рH=7.4) добавляли 16 мкл галоперидола (Sigma-Aldrich) в конечной концентрации 10 мкмоль/л и 80 мкл суспензии мемранной фракции. Конечная концентрация [3H](+)-пентазоцина (29 Ки/ммоль) в инкубационной смеси составляла 1 нмоль/л.

Радиолигандное связывание останавливали путем добавления 6 мл 50 мM Tris HCl буфера (t=4С, рH=8.0) и последующей быстрой фильтрацией через стекловолоконные фильтры GF/B (Whatman), предварительно обработанные 0,05% полиэтиленимином.

Анализ различий в связывании [3H](+)-пентазоцина с Sigmar1 в субклеточных Р2 и Р3 фракциях гомогенатов головного мозга интактных мышей линий CD-1, BALB/c и C57BL/6

Афобазол, введенный внутрибрюшинно мышам линии CD-1 в анксиолитической дозе 5мг/кг за 30 минут до эвтаназии, в сравнении с контрольным раствором индуцировал увеличение специфического связывания [3H](+)-пентазоцина в Р2 (р 0,05 t тест) фракции гомогенатов головного мозга (рисунок 6, таблица 5). Изменения специфического связывания в Р3 фракции после внутрибрюшинной инъекции афобазола в сравнении с контрольным раствором установлено не было (р=0,98 t тест). Введение афобазола за 15 и 60 минут до эвтаназии мышам CD-1 не сопровождалось статистически значимым изменением специфического связывания [3H](+)-пентазоцина как в Р2 (р=0,39, р=0,84 t тест), так и в Р3 (р=0,79, р=0,9 t тест) фракциях в сравнении с внутрибрюшинной инъекцией контрольного раствора (рисунок 6, таблица 5).

У мышей линии BALB/c афобазол, введенный за 30 и 60 минут до эвтаназии, в сравнении с инъекцией контрольного раствора не приводил к достоверному изменению специфического связывания в Р2 (р=0,75 t тест, р=0,89 U тест) и Р3 (р=0,99 t тест, р=0,67 U тест) фракциях головного мозга (таблица 5).

Аналогично мышам линии BALB/c, у C57BL/6 афобазол, введеный за 30 и 60 минут до эвтаназии, в сравнении с контрольным раствором не вызывал статистически значимых изменений специфического связывания [3H](+)-пентазоцина как в Р2 (р=0,29, р=0,15 t тест), так и в Р3 (р=0,65 t т е с т, р=0,31 U тест) фракциях (таблица 5). Примечания1 Данные представлены в виде mdn(Q25%-Q75%);2 Единица измерения - DPM/мг белка;3 Т, мин - время между инъекцией контрольного раствора/афобазола и эвтаназией,Р2, Р3 – Р2 и Р3 фракции гомогенатов головного мозга мышей,К - группа животных с внутрибрюшинной инъекцией контрольного раствора,А - группа животных с внутрибрюшинной инъекцией афобазола;4 Количество животных в группах:CD-1 (К15 , А15 )=19, (К30 , А30 )=20, (К60 , А60 )=12, BALB/c (К30 )=11, (А30 )=12, (К60 , А60 )=6, C57BL/6 (К30 , А30 )=8, (К60 )=14, (А60 )=15, где15 , 30 , 60 – время (мин) между внутрибрюшинной инъекцией контрольного раствора/афобазола и эвтаназией. Анализируя полученные экспериментальные данные, можно сделать заключение, что афобазол в изученном интервале времени в сравнении с контрольным раствором достоверно увеличивал специфическое связывание [3H](+)-пентазоцина в Р2 фракции головного мозга беспородных мышей. Поэтому дальнейшее изучение эффектов афобазола в условиях эмоционально-стрессовых воздействий проводили через 30 мин после его введения.

Для дальнейшего изучения эффектов афобазола на специфическое связывание [3H](+)-пентазоцина с Sigma1R в условиях эмоционально-стрессовых воздействий на данном этапе исследования выполнен анализ влияния эмоционально-стрессовых воздействий на специфическое связывание [3H](+)-пентазоцина в Р2 и Р3 фракциях головного мозга мышей линий CD-1, BALB/c и C57BL/6. В качестве стрессирующих воздействий применяли процедуру внутрибрюшинной инъекции, тест «Открытое поле» и комбинированное воздействие внутрибрюшинной инъекции и последующей экспозиции в «Открытом поле».

В результате изучения влияния эмоционально-стрессового воздействия в тесте «открытое поле» на двигательную активность аутбредных мышей линии CD-1 и инбредных линий BALB/c и C57BL/6 подтверждены ранее установленные межлинейные различия, мыши линий CD-1 и C57BL/6 характеризуются большей двигательной активностью в сравнении с мышами BALB/c [11; 159]. 3.5.1. Влияние процедуры внутрибрюшинной инъекции на специфическое связывание [3H](+)-пентазоцина в головном мозге мышей линий CD-1,

В результате изучения влияния процедуры внутрибрюшинной инъекции на специфическое связывание [3H](+)-пентазоцина в Р2 и Р3 фракциях головного мозга мышей CD-1, BALB/c и C57BL/6 установлены межлинейные различия. Инъекция контрольного раствора индуцировала увеличение специфического связывания [3H](+)-пентазоцина в Р2 (р 0,05, р 0,0001 t тест) и Р3 (р 0,0001, р 0,005 t тест) фракциях головного мозга мышей линий CD-1 и BALB/c соответственно в сравнении с интактными животными и не приводила к достоверно значимым изменениям специфического связывания меченого лиганда в мембранных фракциях головного мозга мышей C57BL/6 (р=0,09, р=0,15 t тест для Р2 и Р3 фракций соответственно) (рисунок 7, таблица 6). C D -1

При исследовании влияния эмоционально-стрессового воздействия в тесте «Открытое поле» на специфическое связывание [3H](+)-пентазоцина в головном мозге мышей аутбредной и инбредных линий были установлены межлинейные различия. У аутбредных мышей линии CD-1 экспозиция в «Открытом поле» индуцировала снижение специфического связывания [3H](+)-пентазоцина в Р2 фракции гомогенатов головного мозга (р 0,005 U тест) в сравнении с интактными животными и не повлияла на связывание [3H](+)-пентазоцина в Р3 фракциях (р=0,2 t тест). У инбредных мышей линии BALB/c с пассивным фенотипом эмоционально-стрессовой реакции тестирование в «Открытом поле» напротив индуцировало увеличение специфического связывания [3H](+)-пентазоцина в Р3 фракции (р 0,05 t тест) в сравнении с интактыми животными и не повлияло на специфическое связывание в Р2 фракции (р=0,41 t тест). В р е з ул ь т а т е помещения в тест «Открытое поле» инбредных мышей линии C57BL/6, характеризующихся активным фенотипом эмоционально стрессовой реакции, статистически значимых изменений специфического связывания в Р2 и в Р3 фракциях головного мозга в сравнении с интактными животными установлено не было (р=0,22 t тест для Р2 и Р3 фракций) (рисунок 8, таблица 7).

Специфическое связывание [3Н](+)-пентазоцина с Sigmar1 при эмоционально-стрессовых воздействиях и введении афобазола

Установленные параметры рецепции [3H](+)-пентазоцина у интактных животных не выявили различий между инбредными линиями с разной реакцией на эмоциональный стресс и беспородными мышами.

Однако, сравнительный анализ данных специфического связывания [3H](+)-пентазоцина в мембранных фракциях головного мозга интактных, подвергнутых эмоционально-стрессовым воздействиям, с внутрибрюшинным введением афобазола мышей линий CD-1, BALB/c и C57BL/6 показал, что эмоциональный стресс и афобазол индуцируют изменения специфического связывания [3H](+)-пентазоцина у всех исследованных животных.

Зарегистрированные изменения рецепции различаются в зависимости от типа эмоционально-стрессового воздействия и специфичны для каждой линии животных.

У мышей линии C57BL/6, характеризующихся активным поведением в анксиогенной обстановке, применение в качестве стрессового воздействия только внутрибрюшинной инъекции либо тестирования в «Открытом поле» без предварительной инъекции контрольного раствора не приводили к изменениям специфического связывания [3H](+)-пентазоцина в мембранных фракциях в сравнении с интактными животными. Комплексное применение используемых стрессовых стимулов вызывало достоверное увеличение специфического связывания в обеих мембранных фракциях.

У мышей линии BALB/c, с противоположным пассивным фенотипом эмоционально-стрессовой реакции, и аутбредной линии CD-1 стрессовые воздействия вызывали отличные от животных линии C57BL/6 изменения. Контрольная инъекция у BALB/c и CD-1 приводила к статистически значимому увеличению специфического связывания [3H](+)-пентазоцина в обеих мембранных фракциях в сравнении с интактными животными. Экспозиция в «Открытом поле» повышала специфическое связывание лиганда в Р3 фракции у линии BALB/c, и напротив, снижала рецепцию в Р2 фракции у мышей CD-1. При совместном применении данных эмоционально-стрессовых воздействий специфическое связывание в мембранных фракциях у BALB/c и CD-1 оказалось сходным с интактными животными.

Установленные в условиях эмоционально-стрессовых воздействий изменения специфического связывания [3H](+)-пентазоцина не противоречат известным данным о лигандных свойствах и локализации рецепторов.

Исходя из изучаемых интервалов времени, факты увеличения специфического связывания лиганда в выполненных экспериментах нельзя интерпретировать как результат индукции экспрессии Sigma1R. Об этом же свидетельствуют и литературные данные [61; 79]. Более вероятное объяснение выявленных сдвигов представляется при анализе научной периодики.

T. Hayashi с соавторами на клетках линий СНО и NG108 показали, что Sigma1R обладают способностью к внутриклеточной транслокации. Эффект может быть обусловлен ЭПР стрессом или применением агонистов. При этом происходит диссоциация ко м п л е к с а Sigma1R-Bip, что активирует шаперонную функцию обоих белков. Шаперонные функции в области цитоплазматической и ядерной мембран Sigma1R реализуют за счет способности к транслокации [72; 76; 79; 128; 173; 180].

Внутриклеточное перераспределение рецепторов показано и методом иммунофлюоресцентного окрашивания на клетках линии СНО. ЭПР стресс индуцировал снижение интенсивности флюоресценции красителя, ассоциированного с Sigma1R, в области МАМ и увеличение в области ЭПР, цитоплазматической и ядерной мембран [79]. В других экспериментах на клетках линии NG108 методами иммунофлюоресцентного окрашивания и вестерн-блоттинга с применением агонистов рецепторов продемонстрировано, что транслокация Sigma1R в область цитоплазматической и ядерной мембран соответствует перераспределению рецепторов из мембранных фракций меньшей плотности Р3L во фракции большей плотности Р1, Р2 и Р3H [72]. Исходя из биологической закономерности преобразования эмоционального стресса в

клеточный стресс, мы предполагаем, что примененные в нашем исследовании эмоционально-стрессовые воздействия, такие как процедура внутрибрюшинной инъекции и экспозиция в тесте «Открытое поле», вызывали развитие ЭПР стресса, диссоциацию комплекса Sigma1R-Bip и транслокацию Sigma1R, зарегистрированную нами по изменениям специфического связывания [3H](+)-пентазоцина в Р2 и Р3 фракциях. Увеличение специфического связывания [3H](+)-пентазоцина в изученных мембранных фракциях согласуется с литературными данными и свидетельствует о перемещении рецепторов [70].

Однако, в отдельных опытах, например, у мышей CD-1 экспозиция в «Открытом поле» индуцировала снижение специфического связывания [3H](+)-пентазоцина в Р2 фракции. Нельзя исключить, что установленное падение опосредовано уменьшением количества рецепторов в результате гибели нейронов при активации в условиях ЭПР стресса проапоптотических сигнальных каскадов [85; 86; 107; 133], а с другой стороны может являться результатом конкурентного взаимодействия [3H](+)-пентазоцина с эндогенными лигандами Sigma1R. Поскольку известно, что их синтез и секреция, в частности прегненолона, прогестерона и DHEA в условиях стресса значимо возрастают [87; 106; 145; 183].

Отсутствие достоверных различий специфического связывания [3H](+)-пентазоцина у мышей линий BALB/c и CD-1 после комплексного воздействия внутрибрюшинной инъекции и последующей экспозиции в «Открытом поле» в сравнении с интактными животными, по-видимому, также не следует однозначно интерпретировать как отсутствие влияния на транслокацию рецепторов, поскольку, например, у животных линии BALB/c оба стрессовых воздействия по отдельности приводили к увеличению специфического связывания в мембранных фракциях. И в данном случае уместна интерпретация с позиции гибели нейронов и увеличения уровня эндогенных лигандов.

Отсутствие различий в специфическом связывании у мышей CD-1 после комплексного применения стрессовых воздействий в сравнении с интактными животными до некоторой степени соответствует их разнонаправленным эффектам: внутрибрюшинная инъекция сопровождалась увеличением специфического связывания в мембранных фракциях, а тестирование в «Открытом поле» - снижением.

Установленные межлинейные различия отражают разные фенотипы ответа на стресс использованных в иследовании линейных животных. Как показано большим числом работ прошлого столетия, мыши BALB/c в сравнении с C57Bl/6 имеют низкий порог чувствительности к острому и хроническому стрессу, что, вероятно, обусловлено неодинаковым ответом нейроэндокринной и нейромедиаторной систем [14; 26; 29; 147; 155; 156; 157; 158; 160; 163]. Учитывая, что в условиях стресса гипоталамо-гипофизарно-адреналовая система стимулирует высвобождение TNF-, который в свою очередь индуцирует развитие воспалительных реакций и продукцию активных форм кислорода, не исключено, что высокий уровень TNF- у животных BALB/c, обусловливает большее повреждающее действие стресса на клетки в сравнении с животными C57Bl/6 [18; 34; 70; 97; 187]. Поэтому нельзя исключить, что разные реакции на стресс обусловливают и различия в перераспределении Sigma1R у мышей BALB/c, характеризующихся низким порогом чувствительности к стрессу, и аутбредных CD-1 по сравнению с C57Bl/6 с высоким порогом чувствительности к стрессовым воздействиям.