Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 13
1.1 Cовременные воззрения на механизмы формирования боли и воспаления 13
1.2 Эффективность и безопасность анальгетиков-антипиретиков и нестероидных противовоспалительных средств на современном этапе развития медицинской и фармацевтической науки 26
1.3 Современные представления о производных 1,3,5-тиадиазина 34
Глава 2. Материалы и методы исследования 37
2.1 Материалы исследования 37
2.2 Методы исследования 46
2.2.1 Оценка анальгетической активности производных пиридо[2,1-b][1,3,5]тиадиазина на модели уксуснокислых «корчей» 46
2.2.2 Оценка антипиретической активности производных пиридо[2,1-b][1,3,5]тиадиазина на модели дрожжевой лихорадки 47
2.2.3 Оценка противовоспалительной активности новых производных тиадиазина на модели острого «формалинового отека» лапы крыс 48
2.2.4 Оценка гематотоксичности производных пиридо[2,1-b][1,3,5]тиадиазина 50
2.2.5 Оценка ульцерогенности производных пиридо[2,1-b][1,3,5]тиадиазина 50
Глава 3. Оценка анальгетической, антипиретической и противовоспалительной активности производных пиридо[2,1-b][1,3,5]тиадиазина 52
3.1 Оценка анальгетической активности производных пиридо[2,1-b][1,3,5]тиадиазина 52
3.2 Исследование антипиретической активности производных пиридо[2,1-b][1,3,5]тиадиазина 55
3.3 Исследование противовоспалительной активности производных пиридо[2,1-b][1,3,5]тиадиазина 59
Глава 4. Оценка острой токсичности и органотоксичности производных пиридо[2,1 b][1,3,5]тиадиазина 64
4.1 Оценка острой токсичности производных пиридо[2,1-b][1,3,5]тиадиазина 64
4.2 Оценка гематотоксичности производных пиридо[2,1-b][1,3,5]тиадиазина 66
4.3 Оценка ульцерогенного действия производных пиридо[2,1-b][1,3,5]тиадиазина 73
Глава 5. Обсуждение результатов исследования 78
Заключение 93
Выводы 95
Список сокращений и условных обозначений 97
Список литературы 99
- Эффективность и безопасность анальгетиков-антипиретиков и нестероидных противовоспалительных средств на современном этапе развития медицинской и фармацевтической науки
- Исследование антипиретической активности производных пиридо[2,1-b][1,3,5]тиадиазина
- Оценка гематотоксичности производных пиридо[2,1-b][1,3,5]тиадиазина
- Оценка ульцерогенного действия производных пиридо[2,1-b][1,3,5]тиадиазина
Введение к работе
Актуальность темы. В настоящее время боль с одной стороны
рассматривается как важнейший защитно-приспособительный механизм, с
другой – это причина страдний, часто длительных и нестерпимих, для
миллиардов жителей нашей планеты. С необходимостью купировать болевой
синдром различной интенсивности ежедневно сталкивается практикующий врач
любой специальности [Н. Н. Яхно, М. Л. Кукушкин, 2012]. По данным
статистики, около 90% всех патологических состояний человека
сопровождаются болью [А. Б. Данилов, 2014]. Согласно данным многочисленных научных исследований около 65% населения регулярно испытывают ощущение боли, а приблизительно 45% становятся жертвами хронического болевого синдрома [Ф. М. Кудаева, 2011, Ю. Л. Корсакова, 2012, Д. В. Жураховская, 2014, А. Е. Каратеев, 2011]. Постоянная боль делает человека эмоционально и физически опустошенным, подавленным, оставляет в напряжении и тревоге, ограничивает подвижность и инвалидизирует [А. М. Вейн, 2012, Redondo-Castro E, Navarro X., 2014].
На протяжении последних десятилетий лихорадочный синдром является одним из основных причин обращений за неотложной медицинской помощью больных любого возраста. Особую актуальность эта проблема имеет в педиатрической практике, где по статистике 8 из 10 обращений к участковому педиатру обусловлены повышением температуры тела ребенка [Ю. В. Марушко, 2013].
На сегодняшний день воспалительный процесс является ведущим патогенетическим звеном многих заболеваний, которые составляют около 80% всей патологии в практике врача любой специальности. Согласно мировой статистике, нестероидные противовоспалительные средства ежедневно в мире принимает более 30 млн. человек, причем лишь 10 млн. пациентов по назначению врача, а остальные – в качестве безрецептурных препаратов [В. Г. Барскова, 2011, Krum, H., 2012, Lostman, J.E., 2000].
В настоящее время основные направления фармакологической коррекции воспаления могут включать ингибирование ферментов (фосфолипаза A2, ЦОГ, липооксигеназа, 5-ЛОГ активирующий протеин); блокаду лейкотриеновых рецепторов; изменение синтеза эйкозаноидов -3-полиненасыщенными жирными кислотами, что способствует образованию менее активных медиаторов; блокаду рецепторов фактора активации тромбоцитов [Е. Ю. Гусев, 2013]. Среди существующих ныне лекарственных средств нестероидного происхождения наиболее мощной противовоспалительной активностью обладают индометацин и диклофенак натрия. Однако, вызываемая ими гастропатия в ряде случаев ограничивает длительное их применение [Т. Д. Звягинцева, С. М. Ткач, 2014, Н. В. Стуров, 2011].
Именно поэтому на сегодняшний день остро стоит вопрос разработки, исследования и введения в клиническую практику новых высокоэффективных, безопасных и экономически доступных анальгетических, антипиретических и противовоспалительных препаратов нового поколения.
1,3,5-тиадиазины представляют собой перспективный класс
гетероциклических соединений. Спектр практически важных свойств наиболее изученных их производных весьма широк [J. Agric, 2016, Mao, X. British J., 2014]. Вопросы практического использования конденсированных производных 1,3,5-тиадиазина изучены в заметно меньшей степени [Доценко В. В., 2015].
Степень разработанности темы. Данная тема раскрыта частично, лишь в
малом количестве специализированной литературы рассматриваются вопросы
практического использования производных 1,3,5-тиадиазинов. Не
рассматриваются вопросы наличия у некоторых из них противовоспалительной, анальгетической, антипиретической активностей.
Цель исследования – поиск среди новых производных пиридо[2,1-b][1,3,5]тиадиазина соединений, имеющих низкую ульцерогенность и гематотоксичность и обладающих анальгетической, антипиретической и противовоспалительной активностью.
Задачи исследования:
1. Определить класс токсичности и значение LD50 производных
пиридо[2,1-b][1,3,5]тиадиазина.
2. Исследовать влияние производных пиридо[2,1-b][1,3,5]тиадиазинана
слизистую оболочку желудка при их внутрижелудочном введении крысам.
3. Оценить влияние производных пиридо[2,1-b][1,3,5]тиадиазина на
показатели крови крыс с хроническим экссудативным воспалением.
4. Изучить анальгетическую активность производных пиридо[2,1-
b][1,3,5]тиадиазина на моделях химического (при внутрибрюшинном введении
уксусной кислоты) болевого раздражения.
5. Исследовать влияние производных пиридо[2,1-b][1,3,5]тиадиазина на
течение острого экссудативного воспаления у крыс.
6. Изучить антипиретическую активность производных пиридо[2,1-
b][1,3,5]тиадиазина на модели гипертермической реакции у крыс, вызванной
введением пекарских дрожжей.
Научная новизна. Впервые в экспериментах на животных в ряду новых
оригинальных производных пиридо[2,1-b][1,3,5]тиадиазина выявлены
соединения с анальгетической, антипиретической и противовоспалительной
активностью. Наиболее перспективными являются 3-(4-метил-3-хлорфенил)-8-
(2-метоксифенил)-6-оксо-3,4,7,8-тетрагидро-2H,6H-пиридо[2,1-
b][1,3,5]тиадиазин-9-карбонитрил и 8-(2,4,5-триметоксифенил)-6-оксо-3-(2-
фурилметил)-3,4,7,8-тетрагидро-2H,6H-пиридо[2,1-b][1,3,5]тиадиазин-9-
карбонитрил, превосходящие по противовоспалительной активности
диклофенак натрия в 3,5 и 2,13 раза, соответственно.
Максимально выраженной анальгетической активностью обладают 3-бензил-8-(3,4,5-триметоксифенил)-6-оксо-3,4,7,8-тетрагидро-2H,6H-пиридо[2,1-b][1,3,5]тиадиазин-9-карбонитрили 8-(2-метоксифенил)-6-оксо-3-(2-этилфенил)-3,4,7,8-тетрагидро-2H,6H-пиридо[2,1-b][1,3,5]тиадиазин-9-карбонитрил, значительно превосходящие таковую у анальгина.
Наличие максимально выраженной антипиретической активности установлено у 8-(3-метокси-4-этоксифенил)-6-оксо-3-(4-хлорфенил)-3,4,7,8-
тетрагидро-2Н,6Н-пиридо[2,1-b][1,3,5]тиадиазин-9-карбонитрила,значительно превосходящей таковую у парацетамола.
Было показано, что новые производные пиридо[2,1-b][1,3,5]тиадиазина
относятся к малотоксичным веществам (3 класс токсичности). Исследование
острой гастротоксичности на белых крысах показало, исследованные
оригинальные образцы при внутрижелудочном введении в дозе 10% LD50
обладают значительно менее выраженными ульцерогенными свойствами,
нежели выявленные у препаратов сравнения - диклофенака натрия
ииндометацина. А 8-(2-метоксифенил)-6-оксо-3-(2-этилфенил)-3,4,7,8-
тетрагидро-2H,6H-пиридо[2,1-b][1,3,5]тиадиазин-9-карбонитрил не оказывает эрозивно - язвенного повреждающего воздействия на слизистую оболочку желудка. Кроме того, эти образцы не оказывают гематотоксичного неблагоприятного воздействия на живой организм.
Научно-практическая значимость работы. Результаты работы имеют как теоретическое, так и практическое значение. Показана перспективность поиска обезболивающих и противовоспалительных средств, отличающихся низкой ульцерогенностью, среди конденсированных производных 1,3,5-тиадиазина.
Методология и методы исследования. Экспериментальные
исследования выполнены на 378 белых беспородных крысах обоего пола массой
180-220 г. Подопытных животных содержали в условиях вивария ГУ ЛНР
«Луганский государственный медицинский университет имени Святителя Луки»
с использованием стандартной диеты. Исследования проводили в соответствии
с правилами надлежащей лабораторной практики при проведении
доклинических исследований в РФ, а также правилами и Международными рекомендациями Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых при экспериментальных исследованиях.
Методологический подход был основан на выполнении комплекса
теоретических, фармакологических, токсикологических, статистических,
физико-химических, биофармацевтических методов.
Положения, выносимые на защиту:
1. Новые биологически активные соединения на основе производных
пиридо[2,1-b][1,3,5]тиадиазина: 2 (3-бензил-8-(3,4,5-триметоксифенил)-6-оксо-
3,4,7,8-тетрагидро-2H,6H-пиридо[2,1-b][1,3,5]тиадиазин-9-карбонитрил) и 6 (8-
(2-метоксифенил)-6-оксо-3-(2-этилфенил)-3,4,7,8-тетрагидро-2H,6H-
пиридо[2,1-b][1,3,5]тиадиазин-9-карбонитрил) имеют анальгетическую
активность в спектре фармакологической активности.
2. Соединение 8 (3-метокси-4-этоксифенил)-6-оксо-3-(4-хлорфенил)-
3,4,7,8-тетрагидро-2Н,6Н-пиридо[2,1-b][1,3,5]тиадиазин-9-карбонитрила
обладает антипиретической активностью.
3. Соединения 4 (3-(4-метил-3-хлорфенил)-8-(2-метоксифенил)-6-оксо-
3,4,7,8-тетрагидро-2H,6H-пиридо[2,1-b][1,3,5]тиадиазин-9-карбонитрил) и 3 (8-
(2,4,5-триметоксифенил)-6-оксо-3-(2-фурилметил)-3,4,7,8-тетрагидро-2H,6H-
пиридо[2,1-b][1,3,5]тиадиазин-9-карбонитрил обладают противовоспалительной
активностью.
4. Исследуемые образцы относятся к веществам класса токсичности 3
(умеренно токсичные соединения).
5. Три изученных производных тетрагидропиридо[2,1-b][1,3,5]тиадиазина,
обладающих высокой противовоспалительной активностью, не имеют
гематотоксических свойств.
6. Исследованные оригинальные новые производные
тетрагидропиридо[2,1-b][1,3,5]тиадиазина, по сравнению с диклофенаком
натрия и индометацином, обладают менее выраженной ульцерогенной
активностью.
Степень достоверности результатов исследования. Достоверность полученных результатов базируется на использовании современных методов, приборов и устройств для проведения технологических, физико-химических, биохимических и гематологических исследований, достаточном объеме проведенных экспериментов, репрезентативности выборки (378 особей лабораторных животных, не менее чем по 6 особей в группе) и статистической обработке полученной информации с использованием параметрических критериев (t-критерий Стъюдента) и непараметрических критериев (критерий Вилкоксона).
Апробация работы. Основные положения и результаты диссертации были
доложены и обсуждены на IX международной научно - практической
конференции «Актуальные проблемы науки XXI века» (30 апреля 2016, Москва),
на IV международной научной конференции «Медицина и здравоохранение»
(май 2016, Казань), на LVII международной научно - практической конференции
«Современная медицина: Актуальные вопросы» (июль 2016, Новосибирск), на
Второй международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых
ученных «Химические проблемы современности» (16-18 мая 2016, Донецк), на
первой международной научно - практической конференции аспирантов,
студентов, и магистрантов «Наука, технология, техника: перспективные
исследования и разработки» (30.11.2016, Калининград), на второй
международной научно - практической конференции «Вопросы современных
научных исследований» (февраль 2016, Омск), на Всероссийской научно -
практической конференции студентов, аспирантов и молодых ученных
«Технологический форсайт 2.0» (19-21 октября 2016, Краснодар), на 13
Всероссийской Бурденковской научной конференции (19 апреля 2017,
Воронеж), на второй республиканской научной конференции «Пироговские чтения» (24 ноября 2016, Луганск), на научно - практической конференции студентов и молодых ученных «Актуальные вопросы синтеза, доклинических исследований и применения в клинической практике новых лекарственных средств» (16.05.2016, Луганск), а также на расширенном заседании кафедры фундаментальной и клинической фармакологии ГУ ЛНР «Луганский государственный медицинский университет имени Святителя Луки».
Внедрение результатов в практику.
Результаты данного исследования являются основанием для дальнейшего
расширенного экспериментального изучения противовоспалительного,
анальгезирующего и жаропонижающего действия, разработки новых методов
синтеза и функциональной модификации производных пиридо[2,1-
b][1,3,5]тиадиазина с целью создания эффективных лекарственных препаратов.
Личное участие автора в получении результатов. Личный вклад автора состоит в анализе отечественных и зарубежных источников по теме диссертационного исследования и в непосредственном выполнении всех экспериментальных исследований по оценке безопасности, фармакологической активности новых производных пиридо[2,1-b][1,3,5]тиадиазина. Автор лично участвовал в анализе полученных данных, их статистической обработке и интерпретации, формулировке выводов. Публикации по результатам работы подготовлены при активном участии автора (авторский вклад составляет 85%).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 15 печатных работ, в том числе 3 – в центральных рецензируемых изданиях и журналах, рекомендованных ВАК при Министерстве образования и науки Российской Федерации.
Объем и структура диссертации. Работа изложена на 125 страницах машинописного текста, содержит 8 таблиц, 16 рисунков и 19 схем. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, обсуждения полученных результатов, заключения, выводов, и списка литературы, включающего 248 источников, в том числе 110 иностранных.
Эффективность и безопасность анальгетиков-антипиретиков и нестероидных противовоспалительных средств на современном этапе развития медицинской и фармацевтической науки
Воспаление – процесс, который является основным звеном в патогенезе подавляющего большинства заболеваний. Несомненно, опыт применения нестероидных противовоспалительных средств есть у врача любой специальности. Статистические данные свидетельствуют о том, что каждый третий рецепт в мире – это рецепт на НПВС [11]. По данным ВОЗ болевой синдром (неотъемлемая составляющая воспаления) является ведущей причиной обращения к врачу первичного звена и составляет до 40% в структуре приема [94]. Боль ухудшает физическое и эмоциональное состояние пациента, отрицательно влияет на качество его жизни, снижает трудоспособность, инвалидизирует [18].
Исходя из современных представлений - боль является не просто неприятным симптомом, а составляет угрозу жизни пациента [9]. Стойкие болевые ощущения могут провоцировать глубокие изменения гомеостаза, связанные с реакцией симпатоадреналовой системы: рост артериального давления, увеличение частоты сердечных сокращений, активизацию тромбоцитов, что в свою очередь приводит к осложнениям со стороны сердечно – сосудистой системы, которы могут закончиться летально [10].
На сегодняшний день существуют данные о значительном повышении риска развития сосудистых катастроф при остеоартрозе, то есть заболевании, которое не сопровождается органной патологией, однако характеризующееся хроническим болевым синдромом [17].
В настоящее время существует несколько подходов в патогенетическом лечении болевого синдрома. Вопервых это подавление синтеза медиаторов воспаления в зонах повреждения. Вовторых это ограничение ноцицетивной импульсации из зоны повреждения в центральную нервную систему, в результате чего уменьшаются зоны гиперальгезии и снижается выраженность болевой чувствительности. Препаратами, которые используются в этом направлении, являются местные анестетики. Втретих - прямое подавление возбудимости ноцицептивных нейронов. С этой целью могут быть использованы анальгетики центрального действия, в том числе наркотические [22].
Кроме того, если боль связана с напряжением мышц и в формировании болевого ощущения преобладает невропатический компонент, могут быть использованы антиконвульсанты [19]. Поскольку боль всегда носит субъективный характер, и выраженность болевых ощущений не имеет прямой причинно-следственной связи с объёмом повреждения тканей, не лишено смысла использование психотропных препаратов, в том числе антидепрессантов и седативных средств [32].
Исходя из вышеизложенного, понятно, что выбор лекарственного средства зависит от типа, причины и интенсивности болевого синдрома. Согласно результатам исследования, проведённых в 2003 году и включившего анализ 143 млн. назначений лекарственных средств, при болях 48% пациентов принимали НПВС, 21% - ненаркотические анальгетики, 13% - антиконвульсанты, 4% -антидепрессанты, 9% - транквилизаторы, 6% - местные анестетики, 4% -наркотические анальгетики [62]. Ежедневно в мире НПВС принимают около 30 млн. человек, а мировой объем продаж этих препаратов составляет около 10 млрд. долларов в день в денежном выражении [11]. Столь широкое использование этой группы препаратов напрямую связанно с их фармакологическими свойствами: способностью уменьшать выраженность воспалительного процесса, снижать болевое ощущение и гипертермию. Такого одновременного сочетания фармакодинамических эффектов не наблюдается ни у одного из известных в медицине лекарственных средств [23].
Противовоспалительное действие НПВС связано в основном с подавлением фазы экссудации воспалительного процесса. Некоторые наиболее эффективные препараты (индометацин, диклофенак) воздействуют также и на стадию пролиферации, что проявляется уменьшением синтеза коллагена и склерозированием тканей. Однако влияние на третью фазу воспаления на порядок меньше, чем на вторую. На фазу же альтерации НПВС влияния практически не оказывает [28].
Обезболивающее действие НПВС в больше степени проявляется при болевом синдроме слабой и средней интенсивности, который чаще возникает при поражении мышц, суставов, сухожилий, нервных стволов, при головной и зубной боли. Эффективность НПВС при сильной висцеральной боли значительно ниже [2].
Однако в нескольких слепых контролируемых исследованиях была показана достаточно высокая анальгетическая активность диклофенака [63], кеторолака и метамизола [91] в том числе в лечении послеоперационной боли и при почечной колике. Эффективность в последнем случае связана с торможением продукции простогландина Е2 в почках, снижением почечного кровотока и образования мочи, что в свою очередь ведет к уменьшению давления в лоханках почек и мочеточниках, что и обеспечивает анальгетический эффект [72].
НПВС по эффективности обезболивания конечно уступает наркотическим анальгетикам, однако лишены некоторых негатитивных моментов, присущих этой группе: не угнетают дыхательный центр, не формируют зависимость, не вызывают эйфорию, не обладают спазмогенным действием, а также не снижают температуру тела ниже нормы, в отличии от «гипотермических» (хлорпромазин, нейролептики) средств [89].
Основным элементом механизма действия НПВС является нарушение метаболизма арахидоновой кислоты из-за неспецифического угнетения фермента циклооксигеназы (ЦОГ) 1, 2 и 3 типов. Кроме этого противовоспалительное действие НПВС связано с торможением перекисного окисления липидов и стабилизацией мембран лизосом, что предотвращает повреждения клеточных структур; уменьшение образования АТФ, что снижает энергообеспечение воспалительной реакции; торможением агрегации нейтрофилов, что нарушает высвобождение медиаторов воспаления из них и торможением продукции ревматоидного фактора [45].
При изучении фармакологических свойств НПВС, было доказано, что все препараты этой группы ингибируют активность обеих форм ЦОГ, однако не в одинаковой степени. Установлено, что связывающий участок ЦОГ 2 несколько шире, чем ЦОГ, а так же более «гибок» и имеет дополнительную боковую гидрофильную полость, чьё формирование обусловлено заменой одной из молекул изолейцина на валин, а так же одной молекулы гистидина на аргинин. Именно из - за наличия этой «полости», структура синтезированных в последние годы НПВС, более селективных в отношении ЦОГ 2 in vitro, отличается наличием ригидной боковой цепи, содержащей сульфоновую или сульфонамидную группы [64], которая и способна проникать внутрь «полости» ЦОГ 2, чем и определяется более сильное подавление именно этого изофермента.
После открытия нескольких изоформ ЦОГ была предложена новая классификация НПВС по селективности в отношении различных форм циклооксигеназы (Drugs Therapy Perspectives, 2000 с дополнениями):
ЦОГ 1 – специфические,
ЦОГ – неспецефические,
ЦОГ 2 – преимущественные,
ЦОГ 2 – специфические,
ЦОГ 3 – специфические.
Базой для ее разработки послужили исследования функциональной активности НПВС в отношении ЦОГ, in vitro и in vivo. При этом определяется доза препарата, которую необходимо применить для подавлении 50% ЦОГ 1/ЦОГ 2. Индекс соотношения ЦОГ 1/ЦОГ 2 = С50 ЦОГ 1/С50 ЦОГ 2. Высокий индекс указывает на селективность препарата в отношении ЦОГ 2, а низкий - в отношении ЦОГ 1 [79]. На сегодняшний день к I группе можно отнести только ацетилсалициловую кислоту в низких дозах. Почти все известные и широко применяемые в медицине НПВС относятся к группе ЦОГ неспецифических, так как проявляют минимальные различия активности в отношении ЦОГ 1 и ЦОГ 2 in vitro и in vivo.
Немногочисленные преимущественные ингибиторы ЦОГ 2 (мелоксикам, нимесулид, этодолак) invitro подавляют ЦОГ 2 по разным исследованиям в 2 – 100 раз сильнее, чем ЦОГ 1, но на invivo, в максимальных терапевтических дозах они в определённой степени подавляют и ЦОГ 1. Специфические ингибиторы ЦОГ 2 более чем в 100 раз активнее, чем ЦОГ 1 [80].
Учитывая, что НВПС используются в медицинской практике очень широко, они должны обладать крайне высоким профилем безопасности [24]. Однако, статистические данные говорят о достаточно высокой частоте побочных эффектов [1] Они встречаются примерно в 25%случаев, а у 5% пациентов представляют серьёзную угрозу для жизни [1, 68-76]. Наиболее частыми осложнениями терапии НПВС, являются: гастропатии, энтеропатии, диспепсии, кардиоваскулярные осложнения [69]. По данным зарубежных авторов, частота побочных эффектов угрожающих жизни пациента, колеблется в зависимости от наличия различных факторов риска, и может составлять 1 случай на 100 пациентов в год [118].
Исследование антипиретической активности производных пиридо[2,1-b][1,3,5]тиадиазина
Нестероидные противовоспалительные средства весьма широко используют в качестве антипиретиков, в связи с чем проводили экспериментальную оценку жаропонижающей активности исследуемых соединений. Учитывая то обстоятельство, что НПВС снижают повышенную температуру тела и не влияют на нормальную, для оценки жаропонижающей активности новых производных тиадиазина у подопытных животных моделировали лихорадку.
Перед началом эксперимента все животные были тщательно осмотрены, учитывались их вес, возраст, двигательная активность и состояние шерстяного покрова. Крысы были распределены на интактную, контрольную («дрожжевая» лихорадка), две группы сравнения (анальгин и парацетамол) и 10 подопытных групп по количеству исследуемых пиридо[2,1-b][1,3,5]тиадиазинов.
В эксперименте использовали минимально допустимое для статистической обработки и получения достоверных результатов общепринятое количество животных (по 6 в группе), а также минимальное для достижения цели и решения задач исследования количество экспериментальных групп, т.е. общее количество животных. Определение антипиретической активности проводилось на модели «дрожжевой» лихорадки, которую моделировали подкожным введением 20 % суспензии пекарских дрожжей [11]. Ректальную температуру измеряли электронным термометром до введения пиррогена и через 18 часов после него. После индукции лихорадки вводили исследуемые вещества внутрижелудочно в дозе 5 мг/кг. Животные контрольной группы в эквивалентном количестве получали 0,9% раствор хлорида натрия. В качестве препарата сравнения использовали анальгин (группа сравнения 1) внутрижелудочно в дозе 5 мг/кг, а также парацетамол (группа сравнения 2) в аналогичной дозе. Антипиретический эффект оценивали через 2 часа после введения исследуемых веществ по изменению ректальной температуры тела животных.
Экспериментально полученные данные, характеризующие температуру тела исследуемых животных на разных этапах эксперимента, оценивались с применением одно - и многомерных методов статистической обработки. Первоначально определялась непрерывность выборок исследуемых значений и характеристика распределения в последних. В подавляющем большинстве случаев выборки являлись нормально распределенными или имели явную, математически выраженную тенденцию к нормальности распределения, что обусловлено небольшим числом экспериментальных животных в исследуемых группах. Вариативность выборок была достаточной для применения t-критерия при оценке достоверности различий признака.
С целью повышения информативности экспериментальных данных применялся многомерный метод древовидной кластеризации, основанный на оценке евклидовых расстояний. Это позволило организовать наблюдаемые данные в наглядные структуры, т.е. развернуть таксономии по исследуемому признаку [12, 13].
Введение 20% взвеси пекарских дрожжей способствовало тому, что через 18 часов ректальная температура подопытных животных контрольной группы составила 38,32 ± 0,39С, что на 1,26 С выше первоначальной. Еще через 2 часа ректальная температура крыс этой группы незначительно возрастает.
Как видно из полученных нами результатов, представленных в таблице 3. 2, в группе сравнения 1 через 2 часа после введения анальгина отмечается снижение температуры на 0,48 С. В группе сравнения 2 через 2 часа после введения парацетамола зафиксировано снижение температуры на 0,7 С.
Среди 10 исследуемых производных пиридо[2,1-b][1,3,5]тиадиазина максимальную отчетливо выраженную антипиретическую активность показало соединение 18. Так, через 2 часа после внутрижелучочного введения его в дозе 5 мг/кг у животных этой группы ректальная температура снизилась на 1,58 С и была на уровне первоначальных значений. Животные, получавшие соединения 1 и 2, через 2 часа после манифестации «дрожжевой» лихорадки, имели снижение температуры на 0,9 С и 1,11 С, соответственно, в условиях проводимого эксперимента.
Применение кластерного анализа показало наличие среди исследуемых веществ трех четко определяемых групп, имеющих взаимозависимые характеристики температурных реакций. В одну группу, наиболее близкую по свойствам к веществам сравнения вошли образцы 5 и 16, менее сходны с веществами сравнения 4 и 7, которые при этом входили в ту же группу.
Вторую группу, значительно отличающихся по формируемой температурной реакции веществ образовали соединения 1, 3, 2, 6, 17.
Наибольшие отличия по температурным свойствам на основании кластерного анализа определены у соединения 18. Данное вещество не вошло ни в одну из вышеперечисленных групп и сформировало собственный, отличающийся по свойствам кластер.
Введение производных пиридо[2,1-b][1,3,5]тиадиазина 6 и 17 в дозировке 5 мг/кг через 2 часа привело к снижению температуры тела на 1,05 С и 0,89 С, соответственно. Соединение 3 показало аналогичную парацетамолу антипиретическую активность. Данные об антипиретической активности оставшихся двух соединений, представленные в таблице, указывают на низкий ее уровень.
Таким образом, проведенные исследования на наличие фармакологической активности среди производных пиридо[2,1-b][1,3,5]тиадиазина показали наличие максимально выраженной антипиретической активности у 8-(3-метокси-4-этоксифенил)-6-оксо-3-(4-хлорфенил)-3,4,7,8-тетрагидро-2Н,6Н-пиридо[2,1-b][1,3,5]тиадиазин-9-карбонитрила18, значительно превосходящую таковую у парацетамола. Четыре соединения показали высокую антипиретическую активность, а один образец обладает аналогичной парацетамолу активностью анальгетика-антипиретика.
Оценка гематотоксичности производных пиридо[2,1-b][1,3,5]тиадиазина
Одним из видов токсичности в спектре побочных эффектов современных нестероидных противовоспалительных средств является гематотоксичность. В связи с этим целью настоящей работы было исследование показателей, характеризующих красный и белый кровяной росток кроветворения в клиническом анализе крови у животных с моделируемым процессом воспаления на фоне фармакокоррекции оригинальными производными тиадиазина.
Как видно из приведенных на рисунке 4.1 и в таблице 4.2 данных, количество эритроцитов в крови животных контрольной группы с подострым паротитом достоверно (p 0,03) cнижается на 16,8% в сравнении с показателями, зарегистрированными в интактной группе. В референтных группы 1, 2 и 3 достоверных отличий не выявлено.
Применение производных пиридо[2,1-b][1,3,5]тиадиазина 4, 6, 18 у животных с экспериментальным паротитом сопровождалось достоверным увеличением количества эритроцитов в сравнении с контрольной группой. Так, введение соединения 18 привело к восстановлению, а соединения 4 способствовало увеличению количества эритроцитов у крыс с экспериментально смоделированным паротитом до уровня значений у интактных животных (рисунок 4.1). Данные проведенных экспериментальных исследований относительно уровня гемоглобина в крови крыс контрольной группы показали резкое его достоверное снижение (на 16,3%) в сравнении с показателем, зарегистрированным в интактной группе (рисунок 4.2, таблица 4.2).
Используемые референты не в одинаковой степени влияют на красный кровяной росток. Из рисунка 4.2 видно, что 14-дневное применение индометацина у животных с экспериментальным паротитом привело к достоверному выраженному уменьшению количества гемоглобина в крови на 21,4% в сравнении с показателем в интактной группе животных.
Применяемые нами в опытных группах конденсированные производные тиадиазина 4, 18 обнаружили способность восстанавливать показатель гемоглобина на фоне моделируемого воспалительного процесса околоушной слюнной железы до нормальных значений (таблица 4.1).
Значения цветного показателя, приведенные на рисунке 4.3 и в таблице 4.1, показывают достоверное (р 0,03) уменьшение значения этого показателя в контрольной группе крыс в сравнении с интактной группой сходно с таковым, выявленным у крыс референтных групп 2 и 3, которые получали в качестве лечения подострого паротита анальгин и индаметацин. У животных опытных групп, получавших образцы 4, 18, выявлены достоверные отличия с показателями в контрольной группе по цветному показателю.
Как видно из рисунка 4.4, скорость оседания эритроцитов увеличивается в 4 раза в группе лабораторных животных с экспериментальным паротитом (контроль). Во всех референтных группах и во всех опытных группах имеются достоверные отличия в сравнении с контролем.
Сравнивая значения лейкоцитов в крови крыс с моделируемым воспалительным процессом с таковыми у интактных животных, видно снижение этого показателя на 26,6%. Используемые препараты - референты показали разнородность своего действия в отношении клеток белого кровяного ростка у крыс с подострым паротитом. Так, введение диклофенака натрия приводит к достоверному увеличению количества лейкоцитов в условиях эксперимента. Тогда как применение анальгина у животных с воспалением околоушной слюнной железы способно уменьшить на 41,85% показатель лейкоцитов в сравнении с интактной группой. Еще более выраженное угнетение белого кровяного ростка нами обнаружено в референтной группе 3 (индометацин). Там выявлено уменьшение на 52% в сравнении с интактной группой и на 34,5% в сравнении с контролем.
При сравнении общего количества лейкоцитов в крови крыс, получавших вещество18, с аналогичными значениями крыс контрольной группы, достоверных отличий не выявлено (рисунок 4.5). В опытной группе крыс, получавших вещество 4, общее количество лейкоцитов превышало контроль на 48,6% и имело сопоставимое значение с таковым у животных интактной группы.
Таким образом, полученные результаты подтверждают данные о высокой гематотокосичности индометацина и анальгина. Проведенные исследования производных пиридо[2,1-b][1,3,5]тиадиазина, обладающих высокой противовоспалительной активностью, определили соединения 4 (3-(4-метил-3 хлорфенил)-8-(2-метоксифенил)-6-оксо-3,4,7,8-тетрагидро-2H,6H-пиридо[2,1 b][1,3,5]тиадиазин-9-карбонитрил) и 18 (8-(3-метокси-4-этоксифенил)-3-(4 хлорфенил)-6-оксо-3,4,7,8-тетрагидро-2H,6H-пиридо[2,1-b][1,3,5]тиадиазин-9 карбонитрил) как не проявляющие гематотоксичность.
Оценка ульцерогенного действия производных пиридо[2,1-b][1,3,5]тиадиазина
Проведенные нами экспериментальные исследования подтвердили наличие отчетливо выраженной ульцерогенной активности индометацина и диклофенака натрия в группах сравнения. Так, при макроскопическом морфологическом исследовании желудков подопытных крыс, получавших внутрижелудочно индометацин в дозе 50 мг/кг на протяжении 4 суток однократно, были выявлены выраженные изменения со стороны слизистой, мышечной и серозной оболочек.
Слизистая оболочка желудка имела синевато-серую окраску, характеризовалась отечностью со сглаженными складками и единичными глубокими дефектами, заполненными тканевым детритом (рисунок 4.6). Кроме того, отмечались множественные пристеночные сгустки крови, а также петехиальные
Серозная оболочка желудка была гиперемирована, с выраженным сосудистым рисунком. У двух крыс из шести визуально обнаружены обширные участки истончения стенки желудка с отсутствием мышечного слоя (рисунок 4.7).
При исследовании стенки желудка животных второй группы сравнения, получавших дикофенак натрия в аналогичной дозировке и кратности введения, нами были обнаружены более выраженные эрозивно-язвенные поражения желудка на обеих его стенках и в области большой кривизны. Слизистая оболочка имела синюшно-красный цвет, многочисленные глубокие эрозии покрывали всю слизистую оболочку. В желудках всех шести крыс нами выявлены обширные участки истончения (рисунок 4.8).
При исследовании желудков крыс трех подопытных групп, получавших производные пиридо[2,1-b][1,3,5]тиадиазина было установлено, что на фоне внутрижелудочного введения соединения 6 слизистая оболочка желудка крыс не претерпела каких бы то ни было изменений (рисунок 4.9). Визуально она не отличалась от таковой у крыс контрольной группы, получавших дистиллированную воду.
Результаты макроскопических морфологическихисследований желудков крыс, получавшихсоединение 18 показали, что на 5-й день после ежедневного внутрижелудочного введения слизистая оболочка желудка была серо-розовой, складки хорошо контурировались, эрозивные дефекты не выявлялись, отмечалась незначительная очаговая гиперемия. Со стороны серозной оболочки отклонений от нормы выявлено не было (рисунок 4.10).
Наибольшей ульцерогенной активностью среди исследованных новых производных пиридо[2,1-b][1,3,5]тиадиазина обладает соединение 4. При морфологическом исследовании желудка подопытных крыс, получавших это вещество, были отмечены умеренно выраженная гиперемия слизистой оболочки, единичные точечные эрозивные дефекты диаметром до 0,1 см (рисунок 4.11).
Таким образом, два из трех исследованных оригинальных новых производных пиридо[2,1-b][1,3,5]тиадиазина обладают значительно менее выраженными ульцерогенными свойствами, нежели выявленные у диклофенака натрия ииндометацина. Вещество 6(3-(2-этилфенил)-8-(2-метоксифенил)-6-оксо-3,4,7,8-тетрагидро-2H,6H-пиридо[2,1-b][1,3,5]тиадиазин-9-карбонитрил) в серии опытов по исследованию острой гастротоксичности показало отсутствие эрозивно-язвенного повреждающего воздействия на слизистую оболочку желудка.