Введение к работе
Актуальность научного исследования
Несмотря на значительные достижения в диагностике и лечении, гестоз по-прежнему остается грозным заболеванием второй половины беременности. По данным различных авторов, частота встречаемости гестоза колеблется от 6 до 25% (Савельева Г.М., 2003; Крукиер И.И., 2009). В структуре материнской смертности гестоз занимает 2-3 место. На его долю приходится до 25% случаев (Мозговая Е.В. и др., 2003). У детей, родившихся у матерей, перенесших гестоз, перинатальная заболеваемость достигает 78%, а смертность в 3-4 раза превышает популяционную. Кроме этого, страдает умственное и физическое развитие ребенка, а у женщин повышается вероятность развития хронической патологии почек и артериальной гипертензии (Мозговая Е.В. и др., 2003).
Многочисленные факты свидетельствуют о том, что клинические проявления гестоза обусловлены развитием патологических изменений в эндотелии кровеносных сосудов, которые связаны с нарушением регуляции их тонуса и реологических свойств крови (Климов В.А., 2006; Мар-
ков Х.М., 2005; Bger R.H., 2009). В последние годы обнаружено, что пусковым моментом развития данной патологии может являться повышение концентрации в материнской плазме метилированных аналогов L-аргинина асимметричного диметиларгинина (ADMA) и монометиларгинина
(L-NMMA) (Fliser D., 2005; Perticone F., 2009; Pope A.J., 2009), являющихся эндогенными ингибиторами эндотелиальной NO-синтазы (еNOS).
При морфологическом исследовании плаценты многие авторы описывают специфическую гистологическую картину, заключающуюся в диспропорциях развития ее пограничного участка между материнской и плодными частями, что приводит к ишемическим явлениям в плаценте.
В ответ на плацентарную ишемию происходит выделение большого количества гуморальных факторов, оказывающих большое влияние на сосудистый тонус. Некоторые из них способствуют развитию системной эндотелиальной дисфункции: свободные радикалы, аутоантитела рецептора ангиотензина II (тип 1) (AT1-AA), цитокины (фактор некроза опухоли) (TNF-), рецептор-1 растворимого фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) (sFlt-1). Следствием этого являются усиление образования таких факторов, как эндотелин, тромбоксан, 20-гидроксиэйкозатетраеновая кислота (20-HETE) и повышенная чувствительность к ангиотензину II. Кроме этого, проявлениями системной эндотелиальной дисфункции при гестозе является угнетение синтеза сосудорасширяющих факторов: оксида азота (NO) и простациклина. Финалом сложных патофизиологических изменений, приводящих к нарушению синтеза гуморальных факторов и регуляции сосудистого тонуса, является дисфункция внутренних органов. Наиболее ярко эти закономерности прослеживаются у женщин с ранними проявлениями гестоза.
Принципы современной фармакологической терапии гестоза направлены на восстановление функции жизненно важных органов, снижение артериального давления (сульфат магния, антагонисты кальция, -блокаторы, центральные адреномиметики, спазмолитические препараты), инфузионно-трансфузионную и дезинтоксикационную терапию, нормализацию водно-солевого обмена, реологических и коагуляционных свойств крови, улучшение маточно-плацентарного кровотока и включают в себя нормализацию структурно-функциональных свойств клеточных мембран (Савель-
ева Г.М., 2010). В свете современных представлений о патогенезе гестоза, ее существенным недостатком является отсутствие целенаправленного использования препаратов для коррекции NO-продуцирующей функции эндотелия.
Таким образом, сформировалось достаточно четкое представление о новых подходах поиска лекарственных препаратов для лечения и профилактики гестоза, направленных на преодоление ADMA-обусловленного ингибирующего влияния на eNOS и уменьшение ишемических явлений в плаценте.
В более ранних исследованиях, проведенных в нашей лаборатории, было показано, что препараты, повышающие содержание субстрата для синтеза NO – L-аргинина, увеличивают активность NO-синтазы, усиливают образование NO и предотвращают развитие эндотелиальной дисфункции у крыс-самцов при ADMA-подобном L-NAME-индуцированном дефиците оксида азота. Кроме этого, эффективными на данной модели оказались активатор eNOS – резвератрол, антиоксиданты, эритропоэтин и др. Определенное развитие получили исследования эндотелиопротективной активности на других «eNOS–ассоциированных» экспериментальных моделях: гипоэстроген-индуцированной, гомоцистеин-индуцированной, метаболического Х синдрома, при реактивном поствакцинальном васкулите и сепсис-индуцированной эндотелиальной дисфункции.
Таким образом, в настоящее время накопилось достаточно большое количество сведений о влиянии различных факторов на течение гестоза и их роли в развитии эндотелиальной дисфункции как основного патогенетического звена этого грозного заболевания. Становится очевидной перспектива поиска новых лекарственных препаратов для лечения и профилактики гестоза, механизм действия которых будет включать коррекцию нарушений функции эндотелия. Однако в доступной литературе не обнаружено сведений об изучении эндотелиопротективного действия в условиях ADMA-подобного гестоза L-аргинина, L-норвалина, тадалафила, а также их комбинаций с препаратами, входящими в стандартную терапию гестоза, витамином В6 и фолиевой кислотой, поливитаминно-минеральными комплексами, эритромицином, азитромицином, рекомбинантным эритропоэтином, а также эффективности противоишемических мероприятий.
Работа выполнена по инициативному плану, включена в программу «Разработка и совершенствование методов ранней диагностики, лечения и профилактики сердечно-сосудистых заболеваний с целью улучшения качества и увеличения продолжительности жизни больных» на 2007–2012 гг., номер госрегистрации 0120.0710379. Исследование поддержано Грантом президента РФ № МК-905.2012.4 и Грантом на поддержку научных исследований в рамках реализации федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России на 2009-2013 годы», соглашение № 14.132.21.1337. Номер государственной регистрации темы диссертационного исследования 01201058348.
Цель исследования: провести оценку коррекции экспериментального гестоза с помощью фармакологических подходов, направленных на ADMA-eNOS-детерминированные пути, и методами, в основе реализации которых лежат биологические процессы, протекающие при дистантном ишемическом прекондиционировании.
Основные задачи исследования
1. Разработать ADMA-подобную модель патологии у беременных животных и провести оценку комплекса качественных и количественных нарушений с использованием результатов функциональных проб, данных ЛДФ-метрии плацентарной микроциркуляции, биохимических маркеров и морфологического исследования плаценты и почек.
2. Провести исследование эффективности коррекции экспериментального гестоза препаратами стандартной фармакологической терапии артериальной гипертензии (метилдопа и амлодипин) с использованием выбранных критериев: результатов функциональных проб и данных биохимического и морфологического исследований.
3. Оценить степень коррекции морфофункциональных нарушений у беременных животных с экспериментальным гестозом фармакологическими агентами с доказанной ранее эндотелиопротективной активностью донатора NO - L-аргинина и ингибитора аргиназы - L-норвалина, а также их комбинаций с метилдопой и амлодипином на основании предложенной методологии.
4. Изучить эффективность коротких эпизодов ишемии-реперфузии при коррекции экспериментального гестоза. Оценить роль АТФ-зависимых К+ каналов и iNOS в реализации эндотелиопротективного эффекта дистантного ишемического прекондиционирования.
5. Исследовать эффективность применения рекомбинантного эритропоэтина, обладающего прекондиционирующим эффектом, при коррекции экспериментального гестоза с использованием результатов функциональных проб, данных ЛДФ-метрии плацентарной микроциркуляции, биохимических маркеров и морфологических исследований плаценты и почек.
6. Изучить эффективность применения ингибитора ФДЭ5 – тадалафила, обладающего прекондиционирующим эффектом, при коррекции экспериментального гестоза с использованием результатов, полученных при выполнении описанного протокола исследования.
7. Оценить степень коррекции морфофункциональных нарушений у беременных животных с ADMA-подобной моделью патологии антибактериальными препаратами из группы макролидов, обладающими актиоксидантной и противовоспалительной активностью.
8. Провести исследование эффективности коррекции морфофункциональных нарушений у беременных животных с ADMA-подобной моделью патологии препаратами из группы витаминно-минеральных комплексов для беременных и витаминами В6 и фолиевой кислотой, обладающими различными механизмами действия.
Научная новизна исследования
В работе впервые предложен способ моделирования ADMA-подобной патологии у беременных животных. Продемонстрировано, что экспериментальная ADMA-подобная патология у животных в период гестации характеризуется морфофункциональными нарушениями, характерными для клинической картины гестоза.
Препараты, входящие в стандартную фармакологическую терапию гестоза (амлодипин и метилдопа), уменьшают морфофункциональные нарушения при коррекции ADMA-подобной модели патологии у беременных животных, однако выраженность данного эффекта не достигает целевого уровня.
Получены данные, свидетельствующие о том, что L-аргинин и
L-норвалин оказывают выраженное протективное действие при коррекции ADMA-подобной модели патологии у беременных животных.
Комбинация фармакологических агентов с доказанной ранее эндотелиопротективной активностью, увеличивающих количество субстрата для синтеза NO: L-аргинина и L-норвалина, с препаратами, входящими в стандартную фармакологическую терапию при коррекции морфофункциональных нарушений у беременных животных с ADMA-подобной патологией, оказывает наиболее выраженный эффект за счет воздействия на различные звенья патогенеза.
Использование коротких эпизодов ишемии-реперфузии задних конечностей оказывает выраженное протективное действие при коррекции морфофункциональных изменений при моделировании ADMA-подобной патологии. Значительную роль в реализации положительных эффектов дистантного ишемического прекондиционирования при коррекции морфофункциональных нарушений у беременных животных с ADMA-подобной моделью гестоза играют АТФ-зависимые К+ каналы и iNOS.
Введение рекомбинантного эритропоэтина при ADMA-подобной патологии у животных приводит к коррекции морфофункциональных нарушений. Однако по силе своего эффекта рекомбинантный эритропоэтин уступает L-аргинину.
В настоящей работе выявлена эффективность использования для коррекции морфофункциональных нарушений у беременных животных с ADMA-подобной моделью патологии фармакологического препарата «Тадалафила», относящегося к группе ингибиторов фермента фосфодиэстеразы 5.
Проведенное исследование показало уменьшение морфофункциональных нарушений у беременных животных с ADMA-подобной моделью патологии при использовании антибактериальных препаратов из группы макролидов: азитромицина и эритромицина, обладающих актиоксидантной и противовоспалительной активностью.
Впервые показана эффективность использования фолиевой кислоты, комбинации фолиевой кислоты и витамина B6, препаратов «Компливит триместрум 2 триместр» и «Компливит триместрум 3 триместр» для коррекции морфофункциональных нарушений у беременных животных с ADMA-подобной моделью патологии.
Научно-практическая значимость
В работе обоснована эффективность применения фармакологических агентов для коррекции морфофункциональных нарушений у беременных животных с ADMA-подобной моделью патологии, точками приложения в механизмах действия которых являются различные eNOS-обусловленные патогенетические звенья. Показано, что использование различных препаратов, улучшающих NO-продуцирующую функцию, позволяет нормализовать плацентарную микроциркуляцию, артериальное давление, предотвратить альбуминурию, а также изменение соотношений сосудистых реакций на ацетилхолин (эндотелийзависимая вазодилатация) и нитропруссид (эндотелийнезависимая вазодилатация), предотвратить снижение показателей биохимических маркеров (Тоtal NO), добиться положительной динамики морфологических показателей в плацентарной и почечной ткани.
Полученные данные позволяют обосновать новое перспективное направление для поиска и создания эффективных лекарственных препаратов для лечения гестоза и преэклампсии, в основе реализации механизма действия которых будет лежать патогенетическое воздействие на различные ADMA-eNOS-детерминированные механизмы развития этой патологии.
На основании результатов проведенной исследовательской работы разработаны теоретические положения, совокупность которых можно квалифицировать как крупное научное достижение в развитии перспективных направлений в фармакологии, клинической фармакологии, состоящее в экспериментальном обосновании новых патогенетических подходов к лечению гестоза.
Внедрение результатов научных исследований
На основании данных диссертационного исследования запланировано проведение целенаправленных клинических исследований L-норвалина, L-аргинина, тадалафила, коротких эпизодов ишемии-реперфузии, а также их комбинаций с препаратами, входящими в стандартную фармакологическую терапию эндотелий-ассоциированной патологии.
Материалы диссертационного исследования, касающиеся эндоте-
лиопротективной активности препаратов «Компливит триместрум 2 триместр» производства ОАО «Фармстандарт-Лексредства» (РУ № ЛСР-008560/10) и «Компливит триместрум 3 триместр» производства ОАО «Фармстандарт-Лексредства» (РУ № ЛСР-008555/10), включены в состав документов, поданных на регистрацию в М3 РФ.
Полученные результаты используются в учебных программах кафедр фармакологии, клинической фармакологии КГМУ, кафедры фармакологии Орловского государственного университета и кафедры фармхимии и фармакогнозии, фармакологии и фармацевтических дисциплин, биохимии и фармакологии Белгородского государственного университета, кафедры фармакологии Воронежской медицинской академии.
Основные положения, выносимые на защиту
1. ADMA-подобная L-NAME-индуцированная патологии у беременных животных характеризуется морфофункциональными нарушениями, характерными для клинических проявлений гестоза.
2. Введение препаратов, входящих в стандартную терапию гестоза, и фармакологических агентов, влияющих на путь L-аргинин – NO – цГМФ, оказывает протективное действие при коррекции морфофункциональных нарушений при ADMA-подобной модели патологии у беременных животных, причем наибольшей эффект наблюдается при их комбинированном использовании.
3. Использование коротких эпизодов ишемии-реперфузии и рекомбинантного эритропоэтина как препарата, обладающего прекондиционирующими свойствами, оказывает выраженное протективное действие на коррекцию морфофункциональных изменений при моделировании ADMA-подобной патологии. Важную роль в реализации протективных эффектов коротких эпизодов ишемии-реперфузии играют АТФ-зависимые К+ каналы и iNOS.
4. Введение антибактериальных препаратов из группы макролидов азитромицина и эритромицина оказывает выраженный положительный эффект при коррекции морфофункциональных нарушений у беременных животных с ADMA-подобной моделью патологии.
5. Применение витаминных препаратов для коррекции мофофункциональных нарушений, возникающих у беременных животных при ADMA-подобной модели патологии, оказывает выраженный положительный эффект.
Апробация диссертации
Материалы работы доложены на итоговых научных сессиях и конференциях молодых ученых ГОУ ВПО КГМУ в 2009, 2010, 2011 и 2012 гг., V и ХIV национальных конгрессах «Человек и лекарство», V конгрессе «Рациональная фармакотерапия и клиническая фармакология» (Санкт-Петербург, 2010), III Всероссийском научно-практическом семинаре «Методологические аспекты экспериментальной и клинической фармакологии» (Волгоград, 2011), X итоговой научно-практической конференции клинических ординаторов, интернов, молодых ученых «Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины» НИУ БелГУ, конференции «Фундаментальные и прикладные исследования в медицине», Франция (Париж, 2012), конференции «Фундаментальные и прикладные исследования в медицине», Россия (Сочи, 2012).
Апробация диссертации проведена 25 мая 2012 г. на совместном заседании кафедр фармакологии, клинической фармакологии, патофизиологии, гистологии, внутренних болезней № 2, акушерства и гинекологии, акушерства и гинекологии ФПО, НИИ экологической медицины КГМУ и на кафедре фармацевтических дисциплин Белгородского государственного национального исследовательского университета.
Личный вклад автора
Автору принадлежит основная роль при определении направления исследования, постановке цели и поиске путей её достижения. Лично автором проведен анализ отечественных и зарубежных источников по теме выполняемой диссертации. На основании анализа литературных данных выдвинуты рабочие гипотезы о возможных путях фармакологической коррекции экспериментального гестоза с помощью подходов, направленных на ADMA-eNOS-детерминированные механизмы, и методами, в основе реализации которых лежат процессы, протекающие при дистантном ишемическом прекондиционировании. Вклад автора является определяющим и заключается в непосредственном участии на всех этапах исследования.
В опубликованных работах, выполненных в соавторстве, автором лично проведена разработка дизайна и протокола исследования, определены ключевые критерии оценки морфофункциональных нарушений при моделировании исследуемой патологии и оценки эффективности вводимых тестируемых препаратов. При непосредственном участии автора осуществлялось выведение животных из эксперимента с регистрацией физиологических показателей и проведением функциональных проб on-line с помощью программного комплекса Asqknowledge 3.8.1, забор тканей и органов для биохимического и морфологического исследований, биохимические и морфологические исследования, статистическая обработка полученных данных, научное обоснование, обобщение и представление полученных результатов.
Публикации
По теме диссертации опубликовано 36 печатных работ, из них 20 в российских рецензируемых научных журналах, включённых в перечень изданий, рекомендованных ВАК для публикаций результатов диссертаций, отражающих полностью содержание работы. Получено 12 патентов РФ на изобретения и 1 патент РФ на полезную модель.
Структура и объём работы
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов исследования, обсуждения полученных результатов, выводов и списка литературы, включающего 455 источников, из них
81 отечественного и 374 зарубежных авторов. Диссертация изложена на 280 страницах машинописного текста, содержит 35 таблиц, 97 рисунков.