Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Взаимодействие лейкоцитов и семенной жидкости в женском репродуктивном тракте (обзор литературы) 13
1.1. Проблема бесплодия. Мужской фактор в развитии бесплодия 13
1.2. Изучение параметров семенной жидкости 15
1.2.1. Фрагментация ДНК сперматозоидов 16
1.3. Особенности взаимодействия нейтрофилов и семенной жидкости 19
1.3.1. Протективные функции нейтрофилов 20
1.3.2. Влияние семенной жидкости на нейтрофильные гранулоциты 23
1.4. ДНКазная активность семенной жидкости 25
Глава 2. Материалы и методы 29
2.1 Объекты исследования 29
2.2. Забор материала 31
2.2.1. Получение цельной периферической крови 31
2.2.2. Получение чистой фракции нейтрофилов 32
2.2.2.1. Активация нейтрофилов, выделенных из периферической крови женщин, пирогеналом 32
2.2.3. Получение семенной жидкости 33
2.2.4. Получение фракций семенной жидкости
2.5. Спермиологический анализ семенной жидкости 33
2.6. Количественное определение концентрации ДНКазы I семенной жидкости 34
2.7. Определение индекса фрагментации ДНК сперматозоидов мужчин 36
2.8. Иммунологические методы исследования 38
2.8.1. Определение лизосомальной активности нейтрофилов, выделенных из
периферической крови 38
2.8.2. Оценка внутриклеточного кислородзависимого метаболизма
нейтрофилов, выделенных из периферической крови, с помощью НСТ-теста 39
2.8.3. Исследование фагоцитарной активности нейтрофилов, выделенных из периферической крови, с помощью световой микроскопии 40
2.8.4. Обнаружение нейтрофильных внеклеточных ловушек при окраске акридиновым оранжевым 40
2.9. Молекулярно-биологические методы исследования 42
2.10. Методы статистической обработки результатов 43
Глава 3. Изучение показателей семенной жидкости у мужчин репродуктивного возраста 45
3.1. Анализ показателей стандартной спермограммы 45
3.2. Определение концентрации ДНКазы I семенной жидкости 47
3.3. Определение уровня фрагментации ДНК сперматозоидов 48
Глава 4. Влияние семенной жидкости и ее компонентов на функциональную активность интактных и индуцированных нейтрофилов, выделенных из периферической крови 52
Глава 5. Влияние семенной жидкости, имеющей отклонения в показателях спермограммы, на функциональную активность нейтрофилов, выделенных из периферической крови 61
5.1. Влияние семенной жидкости, характеризующейся повышенной вязкостью на функциональную активность нейтрофилов, выделенных из периферической крови. 62
5.2. Влияние клеточных элементов эякулята, характеризующегося повышенной вязкостью, на функциональную активность нейтрофилов, выделенных из периферической крови 67
5.3. Влияние надосадочной жидкости, полученной из эякулята, характеризующегося повышенной вязкостью, на функциональную активность нейтрофилов, выделенных из периферической крови 71
5.4. Влияние семенной жидкости, характеризующейся лейкоцитоспермией, на функциональную активность нейтрофилов, выделенных из периферической крови .77
5.5. Влияние клеточных элементов эякулята, характеризующегося лейкоцитоспермией, на функциональную активность нейтрофилов, выделенных из периферической крови 81
5.6. Влияние надосадочной жидкости, полученной из эякулята, характеризующегося лейкоцитоспермией, на функциональную активность нейтрофилов, выделенных из периферической крови 85
5.7. Влияние семенной жидкости на функциональную активность нейтрофилов, выделенных из периферической крови, в зависимости от концентрации ДНКазы эякулята 89
5.8. Влияние клеточных элементов эякулята на функциональную активность нейтрофилов, выделенных из периферической крови, в зависимости от концентрации ДНКазы I семенной жидкости 95
5.9. Влияние надосадочной жидкости на функциональную активность нейтрофилов, выделенных из периферической крови, в зависимости отконцентрации ДНКазы I семенной жидкости 100
Заключение 106
Выводы 128
Список сокращений и условных обозначений 130
Список литературы
- Фрагментация ДНК сперматозоидов
- Активация нейтрофилов, выделенных из периферической крови женщин, пирогеналом
- Определение концентрации ДНКазы I семенной жидкости
- Влияние клеточных элементов эякулята, характеризующегося повышенной вязкостью, на функциональную активность нейтрофилов, выделенных из периферической крови
Введение к работе
Актуальность темы исследования и степень ее разработанности
Оплодотворение и нормальная имплантация реализуются благодаря
многофакторному взаимодействию компонентов не только репродуктивной, но и иммунной системы. Если до недавнего времени устойчивой точкой зрения среди исследователей было иммуносупрессивное действие семенной жидкости в отношении компонентов женского репродуктивного тракта (Bouve, J., Pillot J. In vivo and in vitro immunosuppressions in mice by a 100-110-Kd fraction from boar seminal plasma. 1987. Vol.14, №4. P. 135-140), то к настоящему моменту скопилось большое количество сведений, указывающих на иммунорегуляторное действие эякулята в женском репродуктивном тракте (Robertson S.A. Seminal plasma and male factor signaling in the female reproductive tract. Cell Tissue Res. 2005. Vol. 322. P. 43-52; Sharkey D.J., Macpherson A.M., Tremellen K.P. [et al.] Seminal plasma differentially regulates inflammatory cytokine gene expression in human cervical and vaginal epithelial cells. Mol Hum Reprod. 2007. Vol. 13, №7. P. 491-501), так как семенная жидкость, помимо сперматозоидов – мужских половых клеток, содержит многочисленные факторы, которые оказывают разнонаправленное действие , J., J. [et al.] Hormones and endocrine disruptors in human seminal plasma. 2013. Vol. 47, №3. P. 149-158).
Основными иммунокомпетентными клетками секретов женского репродуктивного
тракта являются нейтрофильные гранулоциты (Телешева Л.Ф. Иммунологические
факторы секретов репродуктивного тракта женщин: дис. д-ра мед. наук. Челябинск, 2000.
324 с.). Многочисленность и широкий функциональный потенциал данных клеток по
праву делает их клетками «первой линий защиты» (Долгушин И.И., Бухарин О.В.
Нейтрофилы и гомеостаз. Екатеринбург, 2001. 259 с.). Реализация протективных функций
нейтрофилов обеспечивается за счет механизмов внутри- и внеклеточной
бактерицидности (Маянский А.Н., Маянский Д.Н. Очерки о нейтрофиле и макрофаге. Новосибирск: Наука, 1989. 328 с.). К защитным видам активности нейтрофилов относят захват и поглощение чужеродных объектов в ходе фагоцитоза, кислородзависимые механизмы, выделение содержимого гранул во внеклеточное пространство, образование экстрацеллюлярных сетей (Yipp B.G., Kubes P. NETosis: how vital is it? P. 2784-2794) [11].
Попадание семенной жидкости в женский репродуктивный тракт обуславливает массовую миграцию нейтрофилов, что сравнивают с развитием классической
воспалительной реакции (Katila T. Post-mating inflammatory responses of the uterus. Reprod
Domest Anim. 2012. Vol.47. P. 31-41.). Это приводит к неизбежному взаимодействию
нейтрофилов и компонентов семенной жидкости. Особенности этого взаимодействия
являются важной составляющей репродуктивного процесса, поскольку нейтрофилы
участвуют в механизмах избирательной селекции сперматозоидов и утилизации
несостоятельных мужских половых клеток (Barraund-Lange V., Pont J.C., Zlyyat A. [et al.]
Seminal leukocytes are Good Samaritans for Spermatozoa. Fertil. Steril. 2012. Vol. 96. P. 1315-
1319). В свою очередь семенная жидкость оказывает влияние на функционирование
нейтрофилов женского репродуктивного тракта. Но особенности этого взаимодействия
изучены недостаточно , W.C., S. [et al.] Equine CRISP3
modulates interaction between spermatozoa and polymorphonuclear neutrophils.
2011. Vol. 85, №1. P. 157-164) В связи с этим представлялось интересным и важным рассмотреть взаимодействие нейтрофилов и эякулята человека. Данный факт и определил цель исследования.
Цель исследования
Оценить функциональную активность нейтрофилов при их взаимодействии с семенной жидкостью и ее компонентами.
Задачи исследования
1. Изучить показатели семенной жидкости, в том числе уровень
дезоксирибонуклеазы I и степень фрагментации дезоксирибонуклеиновой кислоты
сперматозоидов, у мужчин репродуктивного возраста.
2. Определить функциональную активность и морфологические формы
нейтрофилов, выделенных из периферической крови женщин, при взаимодействии с
цельной семенной жидкостью и ее компонентами у мужчин репродуктивного возраста.
-
Оценить функциональную активность и морфологические формы нейтрофилов, выделенных из периферической крови женщин, при взаимодействии с цельной семенной жидкостью и ее компонентами у мужчин с вискозипатией.
-
Изучить функциональную активность и морфологические формы нейтрофилов, выделенных из периферической крови женщин, при взаимодействии с цельной семенной жидкостью и ее компонентами у мужчин с лейкоцитоспермией.
-
Изучить функциональную активность и морфологические формы нейтрофилов, выделенных из периферической крови женщин, при взаимодействии с цельной семенной жидкостью и ее компонентами в зависимости от концентрации дезоксирибонуклеазы I в эякуляте.
Методология и методы исследования
Работа носит характер сравнительного когортного исследования. Методология исследования основывалась на позициях диалектического материализма и данных доказательной медицины (Царегородцев Г.И., Ерохин В.Г. Диалектический материализм и теоретические основы медицины. М.: Медицина, 1986. 288 с.). В работе использованы иммунологические и статистические методы исследования.
Степень достоверности, апробация результатов, личное участие автора
Объем фактического материала, арсенал использованных методов исследования, статистическая обработка полученных результатов адекватны поставленной цели и решаемым задачам. Исследования выполнены на сертифицированном оборудовании: микроскоп Primo Star (Karl Zeiss, Германия), люминисцентный микроскоп ECLIPSE 50i (Nikon, Япония), автоматический иммуноферментный анализатор Personal Lab (Adaltis, Италия), приборы для проведения ПЦР – «Rotor-Gene» 3000, «Rotor-Gene» 6000 («Corbett Research», Австралия). Обработка данных проведена с использованием современных пакетов прикладных программ, что подтверждает достоверность полученных результатов.
Основные положения диссертации доложены и обсуждены на V Международной (XII итоговой) научно-практической конференции молодых ученых, посвященной 70-летию ЮУГМУ (г.Челябинск); Российском научном форуме на Урале с международным участием «Актуальные вопросы фундаментальной медицины» (г. Екатеринбург, 2014); ХХ Всероссийской научно-практической конференции "Достижения и перспективы развития лабораторной службы России" (Москва, 2015); Международном научном форуме «Иммунитет и аллергия: взгляд в будущее» (Москва, 2015); VII Всероссийской научной конференции: «Иммунология репродукции: теоретические и клинические аспекты» (г.Ростов-на-Дону, 2015), Пермском научном форуме (г. Пермь, 2015).
Личный вклад соискателя состоит в непосредственном участии на всех этапах выполнения диссертационной работы. Основная идея, планирование научной работы, включая формулировку рабочей гипотезы, определение методологии и общей концепции диссертационного исследования проводились совместно с научным руководителем Савочкиной Альбиной Юрьевной, доктором медицинских наук, профессором кафедры Микробиологии, вирусологии, иммунологии и клинической лабораторной диагностики ГБОУ ВПО ЮУГМУ Минздрава России. Цель и задачи сформулированы совместно с научным руководителем. Дизайн исследования разработан диссертантом совместно с научным руководителем. Анализ современной отечественной и зарубежной литературы по изучаемой проблеме проведен лично диссертантом. Проведение и интерпретация
лабораторных исследований проводилась совместно с сотрудниками НИИ иммунологии
ГБОУ ВПО ЮУГМУ Минздрава России Мезенцевой Е.А., Никушкиной К.В., Орнер И.Ю.
Интерпретация экспериментальных исследований осуществлялась совместно с
сотрудниками НИИ иммунологии и ЦНИЛ ГБОУ ВПО ЮУГМУ Минздрава России Абрамовских О.С., Батуриной И.Л., Долгушиным И.И., Зотовой М.А., Маяковой В.Б., Курносенко И.В., Прокопьевой О.Б., Самусевой И.В., Смирновой Т.Г.
Положения, выносимые на защиту
-
Установлена связь между уровнем фрагментации дезоксирибонуклеиновой кислоты сперматозоидов и показателями семенной жидкости: общим количеством сперматозоидов в эякуляте, степенью подвижности сперматозоидов и концентрацией дезоксирибонуклеазы I в семенной жидкости.
-
Функциональная активность нейтрофилов, выделенных из периферической крови женщин, изменяется при взаимодействии с цельной семенной жидкостью и ее компонентами.
-
Функциональная активность нейтрофилов, выделенных из периферической крови женщин, изменяется при взаимодействии с семенной жидкостью, характеризующейся вискозипатией, лейкоцитоспермией, низкой концентрацией дезоксирибонуклеазы при сравнении с семенной жидкостью, характеризующейся нормозооспермией.
Научная новизна
Впервые приведена характеристика функциональной активности нейтрофильных гранулоцитов, выделенных из периферической крови женщин, при взаимодействии с семенной жидкостью, полученной от мужчин репродуктивного возраста.
В работе показано, что у 29,6 % обследованных мужчин регистрируется повышенный уровень фрагментации ДНК сперматозоидов на фоне изменений показателей спермограммы: снижении общего количества сперматозоидов, снижении показателей подвижности сперматозоидов, а также повышении уровня ДНКазы I в семенной жидкости.
Впервые установлено изменение функциональной активности нейтрофилов, выделенных из периферической крови женщин, при воздействии семенной жидкости и ее компонентов: снижение фагоцитарной активности, кислородзависимого метаболизма и увеличение лизосомальной активности. Показано разнонаправленное влияние цельной семенной жидкости и ее компонентов на уровень внеклеточных сетей, образованных интактными и активированными нейтрофилами, выделенными из периферической крови
женщин: низкое количество нейтрофильных внеклеточных ловушек отмечено при взаимодействии с цельной семенной жидкостью и надосадочной жидкостью, а высокий уровень внеклеточных сетей зафиксирован при взаимодействии с клеточными элементами эякулята, независимо от активации пирогеналом.
Впервые проведено изучение показателей функциональной активности нейтрофилов, выделенных из периферической крови женщин, при инкубации с семенной жидкостью и ее компонентами, характеризующейся вискозипатией, лейкоцитоспермией и низкой концентрацией ДНКазы I эякулята.
Теоретическая и практическая значимость
В теоретическом плане проведенное исследование расширяет представления о функциональном ответе иммунокомпетентных клеток - нейтрофилов при взаимодействии с семенной жидкостью. Установлено, что результат этого взаимодействия зависит от показателей семенной жидкости: характера вязкости, количества лейкоцитов, концентрации ДНКазы I.
Полученные in vitro результаты исследования расширяют понимание иммунных процессов, протекающих in vivo в женском репродуктивном тракте при попадании семенной жидкости.
Практическая значимость заключается в адаптации метода определения концентрации ДНКазы I для семенной жидкости тест-системой «DNase ELISA Kit». В работе приводятся данные по концентрации ДНКазы I семенной жидкости для практически здоровых мужчин, не имеющих отклонений в спермограмме, для лиц с повышенным уровнем фрагментации ДНК сперматозоидов. Впервые показано, что у лиц с повышенной фрагментацией ДНК сперматозоидов отмечаются более высокие значения концентрации ДНКазы I.
Внедрение результатов исследования в практику
Результаты исследования внедрены в лабораторную практику НИИ иммунологии
ГБОУ ВПО «Южно-Уральский государственный медицинский университет»
Министерства здравоохранения Российской Федерации; используются в учебном
процессе на кафедре микробиологии, вирусологии, иммунологии и клинической
лабораторной диагностики при проведении практических занятий по теме
«Неспецифические факторы врожденного иммунитета», курсе лекций «Инфекция и иммунитет» ГБОУ ВПО ЮУГМУ.
Публикации
Соискатель имеет 24 опубликованные работы, из них по теме диссертации - 16
научных работ общим объемом 1,94 печатных листов, в том числе 12 публикаций в научных журналах и изданиях, которые включены в перечень российских рецензируемых научных журналов и изданий для опубликования основных научных результатов диссертаций (статей - 9, тезисов - 3); 4 работы опубликованы в материалах всероссийских и международных конференций.
Структура и объем диссертации
Фрагментация ДНК сперматозоидов
При этом оптимальные стратегии лечения идиопатического В настоящее время бесплодие является актуальной медицинской и социальной проблемой. Бесплодие, определяется как неспособность зачатия сексуально активной парой в течение 1 года регулярной половой жизни без контрацепции. По данным Минздрава РФ доля бесплодных пар в России превышает 15 %, и тенденции к снижению не наблюдается [31]. По данным литературы бесплодные браки связывают как с женским, так и с мужским фактором в равной степени [72]. Мужской фактор является причиной в 20 – 50 % случаев [92, 103, 143]. Этиология нарушений мужской фертильности многофакторна. Особое опасение вызывают случаи идиопатического бесплодия или бесплодия неясного генеза, что в последнее время фиксируется довольно часто [100]. Несмотря на технологический прогресс, причина мужского бесплодия остается неизвестной в 25 % этих случаев. Бесплодие неясного генеза в соответствии с качеством семенной жидкости классифицируется на идиопатическое мужское бесплодие и необъяснимый фактор мужского бесплодия [143]. Идиопатическая мужское бесплодие называется идиопатической олигоастенотератозооспермией, что свидетельствует о том, что мужчины имеют необъяснимое снижение качества спермы. В отличие от этого, необъяснимый фактор мужского бесплодия определяется как бесплодие мужского бесплодия также остаются неизвестными [112].
Среди данных, охватывающих проблему мужского репродуктивного здоровья, особое внимание привлекают стандартизированные исследования, посвященные изучению динамики параметров спермограммы среди доноров семенной жидкости. Результаты подобных исследований выявляют снижение показателей спермограммы в течение последних 70 лет [67]. В частности, указывается, что в США и других западных странах концентрация сперматозоидов при анализе спермограммы ежегодно снижается на 1,5 млн/мл, а в Европе ситуация ещ более катастрофична: отмечено снижение на 3 млн/мл [55]. Авторы подобных исследований указывают на глобальную дисфункцию процессов сперматогенеза [58]. При этом другие группы исследователей не обнаруживают подобной критической тенденции, более того, они представляют противоположные результаты [57, 124].
Данные о качестве семенной жидкости носят дискутабельный характер. В связи с этим мониторинг качества эякулята должен включать точные методы для оценки фертильности [71].
Несмотря на то, что до конца неизвестны причины снижения качества семенной жидкости, выделяют основные факторы, оказывающие негативное действие: радиационное излучение, химические соединения, лекарства, инфекции половых путей, наркомания, курение, алкоголизм [38]. У большинства пациентов снижение фертильности носит идиопатический характер. Общими механизмами нарушений, возможно, являются усиление окислительного стресса и сбой метаболической функции. Данные механизмы могут главным образом затрагивать незрелые сперматозоиды и лейкоциты. Высокое содержание в мембране сперматозоидов полиненасыщенных жирных кислот, связанных с фосфолипидами, делает их более чувствительными к перекисному повреждению. В результате разрыва или повреждения мембраны сперматозоиды теряют свою состоятельность для реализации репродуктивного потенциала. Этот процесс приводит к нарушению качества эякулята, изменению показателей семенной жидкости, фрагментации ДНК и функциональным расстройствам, влияющим на способность сперматозоидов к пенетрации и взаимодействию с ооцитом. В рутинной клинической практике для оценки мужской репродуктивной функции используется анализ семенной жидкости [54, 110]. 1.2. Изучение параметров семенной жидкости
Семенная жидкость является многокомпонентным продуктом мужской половой системы. Она представляет собой концентрированную суспензию сперматозоидов, которая хранится в придатках яичка, при эякуляции смешивается с секретами добавочных желез мужской половой системы. Состав спермы представлен совокупностью сперматозоидов, секретов добавочных желез мужской половой системы, и клеток, не относящихся к половым [5]. Сперматозоиды являются результатом сложных гормонально регулируемых биологических процессов. Их созревание проходит по узкоспециализированной программе, инициированной в период полового созревания, и длится в течение всей жизни мужчины в циклическом режиме.
Семенная плазма представляет около 90 % объема эякулята и состоит из секрета простаты, семенных пузырьков; в меньшей степени, секретов бульбоуретральных желез и придатков яичка [168]. Семенная плазма является уникальной средой для созревания, питания и защиты мужских половых клеток [97]. Секрет предстательной железы содержит большое количество цинка, цитрата, фосфатов, протеаз и ПСА (простатспецифический антиген). Секрет семенных пузырьков содержит ионы, фруктозу, простогландины, пептиды, плазматические белки: трансферрин, лактоферрин, фибронектин, специфические белки: семеногелин (служит субстратом для образования ПСА) [13].
Биологическая роль семенной жидкости заключается в реализации успешного оплодотворения. Самым простым и доступным инструментом для оценки фертильности в настоящее время является анализ семенной жидкости – спермограмма [128]. Именно с анализа эякулята начинается установление мужского фактора в бесплодной паре [69]. Установлено, что качество семенной жидкости широко варьирует не только между разными изучаемыми группами, но и внутри отдельно выделенных выборок мужчин [80, 131]. Изменение показателей спермограммы является чувствительным индикатором состояния окружающей среды, образа жизни, гормональных изменений и др. [47].
В настоящее время все чаще прибегают к поиску новых параметров семенной жидкости для объективной оценки фертильности мужчин, поскольку сдвиги в результатах спермограммы являются лишь косвенным показателем репродуктивной функции [141]. Одним из таких параметров является определение уровня фрагментации ДНК сперматозоидов [82].
Исследования, позволяющие определить целостность генома мужских гамет, актуальны для оценки мужского фактора при бесплодии. Изучение степени фрагментации ДНК сперматозоидов возникло с развитием вспомогательных репродуктивных технологий. Определение целостности ДНК мужских половых клеток является способом оценки компетентности мужских гамет. В настоящее время все чаще прибегают к данному анализу в качестве дополнительного теста к стандартной спермограмме [132]. Изучение уровня фрагментации ДНК сперматозоидов используется для повышения эффективности методов ВРТ [120].
Хроматин мужских половых клеток представляет собой комплекс ДНК с белками, организованный особым образом, в отличие от соматических клеток организма. Высокая конденсация ДНК сперматозоидов обеспечивается негистоновыми белками-протаминами [70]. Плотная упаковка ДНК образуется при последовательном созревании сперматозоидов. Установлено, что ДНК сперматозоидов упакована в 6 раз плотнее, чем в соматических клетках, что необходимо для сохранности генетического материала.
Активация нейтрофилов, выделенных из периферической крови женщин, пирогеналом
Изучение способности нейтрофилов периферической крови к фагоцитозу проводили по методу Фрейдлин И.С (1986 г.). К 0,2 мл взвеси клеток в физиологическом растворе добавляли 0,02 мл суспензии латекса в концентрации 108 частиц/мл (d = 1,7 мкм). После получасовой инкубации при 37оС готовили мазок. Мазки высушивали, фиксировали этанолом и окрашивали по Романовскому-Гимзе. При анализе фагоцитоза рассчитывали процент фагоцитов (фагоцитарная активность), число поглощенных объектов в 100 подсчитанных нейтрофилах, поделенное на 100 (интенсивность фагоцитоза) и среднее число частиц латекса, поглощенных одним активным нейтрофилом (фагоцитарное число).
Нейтрофилы, выделенные из периферической крови на двойном градиенте фиколла-урографина, инкубированные с семенной жидкостью и ее компонентами, и/или активированные пирогеналом, наносили на обезжиренное предметное стекло, высушивали, фиксировали 96 % этиловым спиртом и окрашивали 0,04 % раствором акридинового оранжевого. Учет проводили с помощью люминесцентного микроскопа, используя фильтры, обеспечивающие возбуждающий свет с длиной волны не более 490 нм и эмиссию с длинной волны 520 нм. При этом способе окраски оценивали процентное содержание нейтрофилов с неизмененными ядрами, с недифференцированными ядрами и нейтрофильных внеклеточных ловушек [34].
Согласно данному методу определяемые морфологические формы нейтрофила соответствуют стадиям преобразования нейтрофила во внеклеточную ловушку. Первую категорию составляют клетки с сегментированным ядром, что соответствует классической форме ядра и свидетельствует о неизменном состоянии клетки (рисунок 5-а). Во вторую категорию объединены клетки с недифференцированным ядром – это активированные клетки, которые утратили сегментированную структуру ядра вследствие гомогенизации эу- и геторохроматина, оболочки мембран ядра и гранул дезинтегированы [63, 78]. Фибриллы деконденсированного хроматина вступают в прямой контакт с компонентами гранул [91]. Визуализируется данный этап преобразования в НВЛ как обособленные клетки, у которых внутреннее содержимое равномерно распределено по всему объему клетки (рисунок 5-б). Финальным этапом являются непосредственно нейтрофильные внеклеточные ловушки, вид которых соответствует тонкой волокнистой структуре с гранулами на поверхности (рисунок 5-в). Фибриллярная структура НВЛ обусловливает захват и фиксацию патогенов. Угнетение факторов вирулентности и полный лизис микроорганизмов реализуется благодаря высокой локальной концентрации адсорбированных белков на поверхности НВЛ [62]. Проводился подсчет 100 визуализируемых структур, и определялось процентное содержание каждой морфологической единицы. Морфологические формы нейтрофилов представлены на рисунке 5. а)
Для всех участников исследования проводилось обследование на генитальную инфекцию. Для определения качественного состава патогенной микрофлоры половых путей осуществлялось молекулярно-биологическое исследование методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме реального времени (Realime). Использовались соответствующие тест-системы производства ФГУН «ЦНИИЭ» Роспотребнадзора (г.Москва). Амплификация и детекция проводилась на приборах «Rotor-Gene» 3000 и «Rotor-Gene» 6000 («Corbett Research», Австралия). Забор материала проводили в соответствии с методическими рекомендациями «Забор, транспортировка, хранение клинического материала для ПЦР-диагностики», разработанными ФГУН «ЦНИИЭ» Роспотребнадзора (г.Москва) и утвержденными МЗ РФ [22].
Для обработки взятого клинического материала и выделения ДНК использовался набор реагентов «ДНК-сорб-АМ» производства ФГУН «ЦНИИЭ» Роспотребнадзора (г.Москва). Для проведения амплификации и детекции ИППП использовались наборы реагентов для выявления ДНК Chlamydia trachomatis, Ureaplasma spp. (видов Parvum и Urealyticum), Mycoplasma genitalium, Virus Herpes simplex I, II, Cytomegalovirus в клиническом материале методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с гибридизационно-флуоресцентной детекцией: «Апмлисенс Chlamydia тгасгютатІ8-РЬ»,«Апмлисенс RUreaplasma spp.-FL», Апмлисенс Mycoplasma genitalium -FL», «Апмлисенс RHSVI, II -FL», «Апмлисенс R CMV -FL».
Полученные данные интерпретировались с помощью программного обеспечения приборов по наличию пересечения кривой флуоресценции с установленной на соответствующем уровне пороговой линией.
Для количественных показателей рассчитывали: средние значения, стандартное отклонение, 95%-ый доверительный интервал для среднего (95% ДИ) [17]. Расчт 95% ДИ проводили с помощью процедуры бутстрепа (п=9999), а для показателей, выраженных в процентах - по р-преобразованным данным с последующей ретрансформацией в исходную шкалу процентов [173]. Сравнение групп пациентов по количественным показателям проводили с помощью U-критерия Манна - Уитни. Для оценки различий процентного содержания морфологических форм нейтрофилов (в том числе НВЛ, %) под действием
Определение концентрации ДНКазы I семенной жидкости
Для реализации поставленной цели семенная жидкость, полученная от обследуемых мужчин, была детально изучена. Был проведен стандартный спермиологический анализ, определение концентрации ДНКазы I, изучение уровня фрагментации ДНК сперматозоидов, а также тест на антиспермальные антитела. Изучение базовых характеристик эякулята позволило обоснованно оперировать полученными результатами относительно функциональной активности нейтрофильных гранулоцитов при инкубации с семенной жидкостью и ее компонентами.
В лабораторных руководствах Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) приводится описание стандартных условий забора семенной жидкости, ее транспортировки и стандартных лабораторных исследований [169]. Исследование эякулята включает: изучение как макроскопических параметров или оценку физико-химических свойств эякулята, так и изучение микроскопических параметров. Согласно референтным значениям, установленным ВОЗ нормальным показателем объема семенной жидкости является 1,5 мл и более; при этом образец спермы содержит, как минимум, 15106 в 1 мл и 39106 сперматозоидов в общем объеме эякулята, 50 % из которых характеризуются прогрессивной или непрогрессивной подвижностью в течение 1 часа после эякуляции [44, 59].
У обследуемых мужчин были получены следующие результаты. Средние значения показателей спермограммы соответствовали нормативным: объем, вязкость, pH, количество сперматозоидов в 1 мл, общее количество сперматозоидов, показатели, относящиеся к подвижности половых клеток, жизнеспособность сперматозоидов, количество морфологически нормальных сперматозоидов и доля сперматозоидов с дефектами. Лейкоциты, преимущественно нейтрофилы, присутствуют практически всегда в эякуляте [161, 104]. В качестве нормативного значения в Руководстве ВОЗ указана пороговая концентрация 1 млн/мл, если значение лейкоцитов превышает указанную величину, говорят о лейкоцитоспермии. При этом некоторые исследователи находят данное значение слишком низким [170], в то время как другие, считают высоким [136, 152]. Полученное в ходе исследовательской работы среднее значение уровня лейкоцитов для обследуемых лиц превышает норму, установленную ВОЗ. Такое значение формируется за счет группы лиц (n=26), у которых, несмотря на основательное обследование на инфекции урогенитального тракта, фиксировалась лейкоцитоспермия. Данные о концентрации лейкоцитов мужчин группы 2 представлены в таблице 1. Таблица 1 – Концентрация лейкоцитов в семенной жидкости у мужчин репродуктивного возраста, М±m
Мужчины сфизиологическимуровнем лейкоцитов,n=61 Мужчины слейкоцитоспермией,n=16 0,69±0,19 6,38±1,99 Детальное изучение патологических форм сперматозоидов в эякуляте является более полезным, чем простое определение доли морфологически нормальных половых клеток [106, 56]. Результаты спермиологического анализа для всех обследованных лиц представлены в таблице 2.
В настоящее время для оценки репродуктивного здоровья мужчины используются многочисленные тесты. Анализ семенной жидкости занимает ключевую позицию, однако его прогностическая ценность ограничена [131]. Этим определяется необходимость в поиске новых маркеров бесплодия, новых показателей [135]. Одним из известных, но малоизученных ферментов семенной жидкости является ДНКаза I.
Концентрация ДНКазы I семенной жидкости у обследуемых мужчин составила 5,51±1,70 нг/мл. Однако характер распределения данных, представленный на рисунке 6, имеет ненормальный вид, что дало возможность выдвинуть предположение о функционально разнородных по данному признаку группах. На основании данных описательной статистики были определены диапазоны значений для концентрации ДНКазы I, представленные в таблице 3.
Группы мужчин Низкаяконцентрацияn=12 Средняяконцентрацияn=34 Высокаяконцентрацияn=14 Концентрация ДНКазы, нг/мл 2,17 - 4,25 4,26 - 6,82 6,83 - 8,79 В настоящее время количественное выражение концентрации ДНКазы I эякулята можно обозначить как новый параметр для характеристики семенной жидкости. Помимо стандартного спермиологического анализа и концентрации ДНКазы I для обследуемых мужчин было проведено определение степени фрагментации ДНК мужских половых клеток.
Наличие 30 % сперматозоидов с фрагментированной ДНК является критическим значением для реализации оплодотворяющей способности семенной жидкости. Этим подкрепляется важность и многочисленность исследований, направленных на определение уровня фрагментации ДНК мужских половых клеток. Было обнаружено, что у 29,58 % (n=11) обследованных мужчин группы 1 (n=77) фиксировались повышенные значения индекса фрагментации сперматозоидов. Было проведено сравнение групп мужчин с нормальным и повышенным уровнем фрагментации ДНК сперматозоидов по количественным показателям спермиологического анализа и концентрации ДНКазы I семенной жидкости, результаты которого представлены в таблице 4.
Влияние клеточных элементов эякулята, характеризующегося повышенной вязкостью, на функциональную активность нейтрофилов, выделенных из периферической крови
Анализ морфологических форм нейтрофилов, выделенных из периферической крови, под действием клеточных элементов эякулята, полученных из семенной жидкости, обладающей низкой концентрацией ДНКазы I, выявил следующие особенности. При сравнении с группой нейтрофилов, инкубированных с физиологическим раствором, обнаружено более низкое количество нейтрофилов с сегментированным ядром, более высокое число нейтрофилов с недиффренцированным ядром и высокое число НВЛ. Однако при сравнении данных показателей с группой нейтрофилов, инкубированных с клеточными элементами эякулята, полученными из семенной жидкости с нормальной концентрацией ДНКазы I, обнаружено статистически значимое увеличение процентного соотношения НВЛ и тенденция к снижению числа нейтрофилов с сегментированным ядром. Данный факт указывает на то, что часть ДНКазы I находилась в полученном при центрифугировании осадке. Возможно, это связано с локализацией фермента на клетках эякулята. Кроме того, при выбранном режиме центрифугирования сохранялась эндонуклеазная активность ДНКазы I.
Влияние надосадочной жидкости на функциональную активность нейтрофилов, выделенных из периферической крови, в зависимости от концентрации ДНКазы I семенной жидкости
Данные о функциональной активности нейтрофилов, выделенных из периферической крови, под действием надосадочной жидкости в зависимости от концентрации ДНКазы I семенной жидкости представлены в таблице 23.
Примечание - p1-2 – статистически значимые различия при сравнении группы нейтрофилов, инкубированных с физиологическим раствором с группой нейтрофилов, инкубированных с надосадочной жидкостью эякулята с нормальной концентрацией ДНКазы I;p1-3 – статистически значимые различия при сравнении группы нейтрофилов, инкубированных с физиологическим раствором с группой нейтрофилов, инкубированных с надосадочной жидкостью эякулята с низкой концентрацией ДНКазы I;p2-3 – статистически значимые различия при сравнении группы нейтрофилов, инкубированных с надосадочной жидкостью эякулята с нормальной концентрацией ДНКазы I по сравнению с нейтрофилами, инкубированными с надосадочной жидкостью эякулята с низкой концентрацией ДНКазы I
При сравнении показателей функциональной активности нейтрофилов, выделенных из периферической крови, под действием надосадочной жидкости, полученной при центрифугировании эякулята с низкой и нормальной концентрацией ДНКазы I, статистически значимых различий не обнаружено. Анализ исследуемых показателей нейтрофильных гранулоцитов выявил различия с группой нейтрофилов, инкубированных с физиологическим раствором, аналогичные тем, которые были зарегистрированы при воздействии на нейтрофилы надосадочной жидкости, полученной из семенной жидкости с нормальной концентрацией ДНКазы I.
Соотношение морфологических форм нейтрофилов, выделенных из периферической крови, под действием надосадочной жидкости в зависимости от концентрации ДНКазы I представлено в таблице 24.
Под действием надосадочной жидкости, полученной из эякулята с низкой концентрацией ДНКазы, фиксировались более высокие уровни НВЛ при сравнении с показателями группы нейтрофилов, инкубированных с надосадочной жидкостью, полученной из эякулята с нормальной концентрацией ДНКазы. Это указывает на то, что в in vitro условиях ДНКаза I, содержащаяся в семенной жидкости, активна в отношение хроматиновых образований. Кроме того при сравнении с показателями активированных и интактных нейтрофилов, фиксировались статистически значимые различия в уровне НВЛ в группе нейтрофилов, инкубированных с надосадочной жидкостью из эякулята с низкой концентрацией ДНКазы I. Отмечен низкий уровень внеклеточных сетей. Данное обстоятельство указывает на то, что, несмотря на низкую концентрацию ДНКазы I, происходило расщепление хроматиновых ловушек, хотя и не так эффективно, как в группе нейтрофилов, инкубированных с надосадочной жидкостью с нормальной концентрацией ДНКазы I. Возможно, данный процесс связан, в том числе, с эндонуклеазной активностью семенной жидкости за счет других ферментов.
Таким образом, инкубация нейтрофильных гранулоцитов с семенной жидкостью и ее компонентами оказывала различное влияние на функциональную активность изучаемых клеток. Причем воздействие зависело от свойств самой семенной жидкости. Так, в отношении лизосомальной активности, отмечено увеличение значений под действием семенной жидкости с повышенной вязкостью и клеточных элементов эякулята, обладающего низкой концентрацией ДНКазы I, но снижение под действием семенной жидкости и надосадочной жидкости, полученной от эякулята с повышенным содержанием лейкоцитов и семенной жидкостью с низкой концентрацией ДНКазы I. В отношении показателей кислородзависимого метаболизма нейтрофилов отмечено, что семенная жидкость, характеризующаяся вискозипатией, лейкоцитоспермией и низкой концентрацией ДНКазы I обуславливала увеличение значений. Клеточные элементы эякулята, полученные из семенной жидкости, характеризующейся лейкоцитоспермией, низкой концентрацией ДНКазы I способствовали увеличению показателей НСТ-теста. Надосадочная жидкость, полученная из эякулята с вискозипатией и лейкоцитоспермией, обуславливает увеличение показателей НСТ-теста. Общим для всех изучаемых групп стало значительное снижение показателей фагоцитарной активности нейтрофилов под действием семенной жидкости и ее компонентов.