Содержание к диссертации
Введение
Глава 1 Состав, функции и иммунологические факторы биологический секретов урогенитального тракта мужчин и женщин (обзор литературы) 12
1.1 Иммунные показатели цервикального секрета при воспалительных заболеваниях нижнего отдела урогенитального тракта 13
1.2 Показатели эякулята при воспалительных заболеваниях нижнего отдела урогенитально тракта 18
1.3. Взаимодействие секретов урогнитального тракта мужчин и женщин 23
Глава 2 Материалы и методы исследования 30
2.1. Материалы исследования 30
2.2. Забор клинического материала .32
2.3. Микроскопические методы исследования .32
2.3.1. Микроскопическое исследование эякулята 32
2.3.2 Микроскопия влагалищного, цервикального, уретрального отделяемого .36
2.4. Микробиологические методы исследования .36
2.5. Молекулярно-биологический метод 37
2.6. Иммунологические методы исследования 38
2.6.1. Определение количества и жизнеспособности нейтрофилов цервикальной слизи 38
2.6.2. Определение лизосомальной активности нейтрофилов цервикальной слизи 38
2.6.3. Метод оценки внутриклеточного кислородзависимого метаболизма нейтрофильных гранулоцитов мукозальных секретов с помощью НСТ-теста
2.6.4. Метод исследования фагоцитарной активности, интенсивности фагоцитоза, фагоцитарного числа нейтрофилов цервикальной слизи 40
2.6.5. Определение внеклеточных ловушек нейтрофилов цервикальной слизи .41
2.6.6 Иммуноферментный метод определения активности ДНКазы семенной плазмы 42
2.7. Методы статистической обработки материала .43
Глава 3 Изучение показателей секретов урогенитального тракта женщин и мужчин 44
3.1. Клинико-лабораторное обследование мужчин с уретритом и мужчин без воспалительных заболеваний урогенитального тракта 44
3.2. Изучение показателей эякулята у мужчин с уретритом 48
3.3. Клинико-лабораторное обследование женщин с воспалительными заболеваниями урогенитального тракта и женщин без воспалительных заболеваний урогенитального тракта .50
3.4. Изучение функциональной активности нейтрофилов цервикальной слизи у женщин с воспалительными заболеваниями нижнего отдела урогенитального тракта 53
Глава 4. Влияние эякулята и его составляющих на функциональную активность нейтрофилов цервикального секрета
Заключение .70
Выводы .80
Практические рекомендации 81
Список наиболее часто используемых сокращений 82
Список литературы
- Показатели эякулята при воспалительных заболеваниях нижнего отдела урогенитально тракта
- Микроскопические методы исследования
- Метод оценки внутриклеточного кислородзависимого метаболизма нейтрофильных гранулоцитов мукозальных секретов с помощью НСТ-теста
- Клинико-лабораторное обследование женщин с воспалительными заболеваниями урогенитального тракта и женщин без воспалительных заболеваний урогенитального тракта
Показатели эякулята при воспалительных заболеваниях нижнего отдела урогенитально тракта
Шейка матки в норме является границей между бактериально обсемененным влагалищем и стерильной полостью матки. Она является важной линией защиты репродуктивной системы от инфекций [48,53,120]. Выполнение шейкой матки ее защитной функции происходит благодаря ряду механизмов противоинфекционной резистентности: анатомо-физиологическим особенностям органа, содержанию нормальной микрофлоры, клеточным и гуморальным звеньям иммунитета слизистой оболочки и цервикального секрета [16, 44, 48,53].
По данным литературы, на сегодняшний день состояние комплекса местной противоинфекционной резистентности урогенитального тракта женщин хорошо изучено [8,12, 16, 29, 31, 44, 48, 52, 53, 62]. Слизь, выделяемая шейкой матки, служит биологическим фильтром, препятствующим проникновению бактериальной флоры из влагалища в вышележащие отделы половой системы. Защитные свойства цервикального секрета обусловлены бактерицидностью, протеолитической активностью, иммунологической активностью [42,43].
Цервикальная слизь имеет гелевую консистенцию, плотная ее часть представлена крупными белковыми молекулами, именуемыми муцинами, состоящими из гликолизированных участков, разделенных гидрофобными белковыми цепочками [71, 72, 85, 109]. Муцин является мощным ингибитором бактериальной адгезии [19] и вырабатывается цилиндрическим эпителием шейки матки, покрывая ее поверхность, образуя густой стекловидный секрет [64, 81, 136].
Жидкая часть шеечной слизи включает белки, электролиты, аминокислоты, полисахариды и другие вещества, макромолекулы которых взаимодействуют с лигандами микроорганизмов, при этом меняют свойства поверхностных структур бактериальных клеток, создавая препятствие для связывания бактерий с рецепторами клеток-мишеней [48, 120]. К основным антимикробным компонентам шеечной слизи относятся дефенсины, ингибитор лейкоцитарной протеазы, лизоцим и лактоферрин [87, 105, 120, 122].
Важную роль в противоинфекционной резистентности играет нормальная микрофлора. Ее защитный эффект обусловлен стимуляцией лимфоидного аппарата, продукцией витаминов и других биологически активных веществ, обеспечении антиколонизационной активности репродуктивного тракта женщин. [5, 17, 24, 48].
Нейтрофилы цервикальной слизи по праву называют «главными стражами порядка на пути восходящей инфекции», поскольку они составляют около 96% всех клеток, обеспечивая важную линию противомикробной защиты [16, 48, 53]. Известно, что процент жизнеспособности, лизосомальная, эстеразная и НСТ активности нейтрофилов цервикального секрета значительно преобладают над аналогичными показателями функциональной активности нейтрофилов вагинальной слизи, что делает секрет шейки матки основным антимикробным буфером у женщин в течение менструального цикла. В отличие от нейтрофилов влагалища, полости матки и перитонеального экссудата нейтрофильные гранулоциты цервикальной слизи ближе по количеству и функциональной активности нейтрофилам периферической крови [53].
Нейтрофилы при выходе в кровоток являются окончательно дифференцироваными клетками, содержат богатый спектр противомикробных факторов и способны в короткие сроки реагировать на внедрение патогена[13]. Они обладают многогранным рецепторным аппаратом и готовы отвечать на малейшие изменения окружающей среды. [26, 51, 126]. Для осуществления своих функций нейтрофилы из кровеносного русла выходят на поверхность слизистых оболочек. Нейтрофилы, плотно приклеившись к эндотелию венулы, пропускают псевдоподии в промежутки между эндотелиальными клетками. При контакте гранулоцита с активированным эндотелием происходит мобилизация секреторных везикул, и нейтрофил превращается из пассивной клетки в активную, способную к миграции в ткани [80]. Доказано, что нейтрофилы, содержащиеся в секрете слизистой оболочки шейки матки, функционально полноценны [16,53]. Функциями нейтрофилов являются хемотаксис, адгезия и агрегация, образование гранул и дегрануляция, активация продукции АФК, фагоцитоз и уничтожение бактерий [13, 79]. Они первыми оказываются в очаге воспаления, встречаются с патогенами и реализуют свои защитные функции, осуществляя различные виды активности [63]. Активированный нейтрофильный гранулоцит готов к фагоцитозу и уничтожению патогена в фаголизосомах, а также выделению наружу содержимого своих гранул - бактерицидных продуктов: лизоцима, миелопероксидазы, эластазы, БПИ, дефенсинов и многих других [13].
Реализация функций нейтрофильных гранулоцитов как фагоцитирующих клеток заключается в их способности распознавать, поглощать, убивать и переваривать поглощенные частицы [13,14]. Для характеристики фагоцитарной функции нейтрофильных гранулоцитов используются следующие показатели: активность фагоцитоза, интенсивность фагоцитоза, фагоцитарное число [14].
Лизосомальная активность - это показатель, связанный с числом лизосом в цитоплазме нейтрофилов, показывает функциональную активность фагоцитов и их способность к реагированию на внешние воздействия [14, 15].
Показатели спонтанной и индуцированной НСТ-редуцирующей активности нейтрофилов отражают их внутриклеточный кислородзависимый метаболизм. При активации нейтрофилов в результате резкого усиления окислительного метаболизма происходит респираторный взрыв, в результате чего образуются первичные (перекись водорода, супероксидный анион, синглетный кислород, гидроксильный радикал) и вторичные (хлорамин, гипохлорная кислота) метаболиты, проявляющие бактерицидную активность. Респираторный взрыв происходит при сильном возрастании потребления кислорода, когда происходит связывание рецепторов нейтрофила с растворимыми лигандами или с поверхностью частиц. Основная роль в развязывании респираторного взрыва принадлежит НАДФ-оксидазе, которая реализует транспорт электронов от НАДФ цитозоля к молекулярному кислороду [14].
На сегодняшний день хорошо изучены показатели функциональной активности нейтрофилов цервикальной слизи в норме и их изменение при воспалительном процессе. В литературе описано состояние локального иммунного комплекса при воспалительных заболеваниях различных отделов гениталий, а также зарегистрированы изменения клеточного и гуморального звеньев иммунитета при инфекциях, вызванных некоторыми возбудителями [7, 8, 12, 16, 29, 50, 52, 53].
Полученные данные в работе Л.Ф. Телешевой (2000 г.) свидетельствуют о значительной автономности местного иммунитета слизистых оболочек репродуктивного тракта, а также позволяют предположить, что воспаление нижнего отдела гениталий регулируется, в основном, факторами локального иммунитета, так как при кольпитах и цервицитах в цервикальной слизи регистрируются признаки функционального возбуждения основной клеточной популяции секрета – нейтрофильных гранулоцитов [53].
По данным Долгушиной В.Ф. (1991 г.) и Волкова С.Л. (1999 г.) у женщин с воспалительным процессом гениталий различной этиологии отсутствуют значимые отличия в иммунологических показателях нейтрофилов цервикального секрета [7, 16].
По данным литературы, нейтрофилы в слизистой пробке характеризуются функциональным возбуждением, что выражается в увеличении спонтанного и активированного НСТ-теста, при этом функциональный резерв нейтрофилов падает [12, 29, 50, 53].
Характеризуя состояние нейтрофилов в цервикальной слизи при воспалительном процессе, большая часть исследователей отмечает повышение общего количества лейкоцитов, которое более выражено при остром процессе, а также увеличение абсолютного и относительного содержания жизнеспособных клеток [50,53]. При изучении фагоцитарной активности нейтрофилов Л.Ф. Телешевой было отмечено снижение и активности, и интенсивности фагоцитоза при хроническом воспалении, однако при остром воспалительном процессе анализируемые показатели оставались в пределах нормы [36,53].
Таким образом, при анализе данных литературы установлено, что воспалению репродуктивного тракта, независимо от распространенности воспалительного процесса, присущи общие изменения иммунологических показателей в цервикальном секрете при сравнении со здоровыми женщинами: повышение общего количества лейкоцитов, увеличение процента жизнеспособных клеток, усиление лизосомальной активности и внутриклеточного кислородозависимого метаболизма нейтрофилов, угнетение резерва их бактерицидной функции, а также снижение активности и интенсивности фагоцитоза [7, 8, 12, 50, 52].
Нейтрофильные внеклеточные ловушки (НВЛ) – одно из звеньев местной системы иммунной резистентности. Это явление было открыто в 2004 году группой ученых во главе с A. Zychlinsky в Институте инфекционной биологии им. Макса Планка в Берлине. Открытие НВЛ и установление их антимикробного эффекта, как важнейшего звена врожденного иммунитета, существенно расширило представление о жизненном цикле и функциях нейтрофильных гранулоцитов [49, 78].
Микроскопические методы исследования
У всех женщин и мужчин проводилось обследование на генитальную инфекцию с целью выявления этиологически значимого возбудителя и состава нормальной микрофлоры влагалища, шейки матки у женщин и уретры у мужчин Бактериологическое исследование материала из цервикального канала и влагалища у женщин, уретры у мужчин выполняли согласно методическим рекомендациям МЗ РФ «Совершенствование контроля за заболеваниями, передающимися половым путем» (Приказ №286 от 07.12.93 г.)
Идентификацию выделенных культур микроорганизмов проводили по морфологическим, культуральным и биохимическим признакам. Взятие вагинального, цервикального, уретрального отделяемого производилось с помощью ложечки Фолькмана, затем материал погружался в 1 мл жидкой транспортной среды, далее из него готовили серийные разведения из расчета 10:1(объем/вес) и затем по 0,1 мл высевали на на набор стандартных селективных питательных сред, позволяющих выявить максимально возможный спектр микроорганизмов (5% кровяной агар, ЖСА по Чистовичу, ДИФ-3, среда Сабуро, среда Бучина, среда МРС-2, среда Блаурокка). Идентификация выделенных культур производилась согласно общепринятым методикам.
Степень роста определялась в пересчете на 1 мл отделяемого (КОЕ/мл). Количество бактерий выражали в десятичных логарифмах. Этиологически значимым считался возбудитель, выделявшийся в титре 105 и выше.
Для обнаружения в материале из цервикального канала у женщин и уретры у мужчин хламидий, уреаплазм, микоплазм, вирусов простого герпеса, цитомегаловирусов применялся метод полимеразной цепной реакции (ПЦР). Для реализации ПЦР применяли: набор реагентов для одновременного выявления ДНК Chlamydia trachomatis, Ureaplasma (видов Parvum и Urealyticum) и Mycoplasma genitalium в клиническом материале методом ПЦР с гибридизационно - флуоресцентной детекцией «АмплиСенс C.trachomatis / Ureaplasma / M.genitalium- МУЛЬТИПРАЙМ-FL», набор реагентов для амплификации ДНК вируса простого герпеса (HSV) и цитомегаловируса (CMV) АмплиСенс HSV/ CMV - МУЛЬТИПРАЙМ- FL». ПЦР согласно инструкции включала три этапа: экстракцию ДНК из образцов клинического материала, амплификацию фрагмента ДНК данного микроорганизма и гибридизационно-флуоресцентную детекцию, которая производилась непосредственно в ходе ПЦР с помощью амплификатора «Rotor Gene» 3000 («Corbett Research», Австралия) с системой детекции флуоресцентного сигнала в режиме «реального времени».
После забора цервикальной слизи ее помещали в раствор Хенкса объемом 1,0 мл, тщательно суспендировали. К 0,2 мл суспензии добавляли 1% раствор трипанового синего в объеме 0,02 мл с целью подсчета общего количества лейкоцитов. Подсчет производился в камере Горяева по формуле: Х = А х 4000 х 106 х В , где N Х- количество лейкоцитов в 1 литре; N- количество малых квадратов;
Число лизосом в цитоплазме нейтрофилов - показатель, отражающий их функциональную активность и способность к реагированию на внешние воздействия [56,57].
Для определения лизосомальной активности эксперимент проводили следующим образом: к суспензии клеток в объеме 0,1 мл добавляли растворакридинового оранжевого в объеме 0,05 мл в концентрации 2 мкг/мл. Совмесная инкубация протекала в течении 30 минут при температуре 370С. Далее окрашенные клетки помещали на предметное стекло, после накрытия покровным стеклом и исследовали с помощью люминисцентрого микроскопа ECLIPSE 50i (Nikon, Япония). Производили определение лизосомальной активности – показателя % нейтрофилов, которые имеют лизосомальные гранулы, а так же подсчитывали лизосомы в клетках в “крестах” полуколичественным способом. Три креста (+++) присуждались нейтрофилам, у которых вся цитоплазма была заполнена гранулами лизосом, два креста - (++) – при заполнении цитоплазмы нейтрофила лизосомами на 50%, один крест (+) - при обнаружении в клетке единичных лизосом.
Определения лизосомальной активности нейтрофилов цервикальной слизи после 30-минутной совместной инкубации с эякулятом и его фракциями при температуре 370 С проводилось аналогичным образом.
Для проведения НСТ-спонтанного теста к 0,2 мл суспензии нейтрофилов в пробирке добавляли 0,2% раствор НСТ в объеме 0,1 мл и фосфатный буфер (pH 7,4) в объеме 0,1 мл. Инкубация реакционной смеси протекала в течении 30 минут при температуре 370С. Далее к ней добавляли 0,1 Н раствора соляной кислоты в объеме3 мл для остановки реакции. Центрифугирование пробирок проводили в течение 5 минут 1000 об/мин. Сливали полученную надосадочную жидкость, осадок использовали для приготовления мазков. Препараты высушивали, фиксировали метанолом и окрашивали 0,1% водным раствором сафранина. Мазки исследовали под иммерсионным микроскопом Zeiss Primo Star 90х10х1,5.
Для оценки индуцированного теста в качестве стимулятора использовали частицы латекса 1,7 мкм в концентрации 1х108 частиц/мл. С этой целью в пробирку с клеточной взвесью (200 мкл) и НСТ (100 мкл) добавляли 20 мкл монодисперсного полистирольного латекса. При учете реакции считали процент НСТ-позитивных клеток и определяли интенсивность реакции по формуле: А, В, С – число нейтрофилов с отложением диформазана, превышающим размеры ядра, занимающим более 1/3 площади цитоплазмы и менее 1/3 ее площади соответственно. Расчета функционального резерва нейтрофилов (ФРН), высчитывали как соотношение между коэффициентами интенсивности реакции НСТ-индуцированного и НСТ-спонтанного тестов.
Метод оценки внутриклеточного кислородзависимого метаболизма нейтрофильных гранулоцитов мукозальных секретов с помощью НСТ-теста
Микробный пейзаж в уретре мужчин без воспалительных заболеваний урогенитального тракта представлен нормальной микрофлорой: Staphylococcus epidermidis (36,7%), Corynebacterium spp. (23,3%), Enterococcus sрр. (16,7%), E.coli (16,7%).
У мужчин с воспалительным процессом в уретре выделялись следующие патогенные микроорганизмы: Chlamydia trachomatis у 25% обследованных мужчин, Mycoplasma genitalium - 8,3%, цитомегаловирус – у 5,6 % пациентов, вирус простого герпеса – у 2,7% пациентов. Из условно-патогенных микроорганизмов при воспалительном процессе гениталий наиболее часто обнаруживались Enterococcus sрр. (27,7%), Streptococcus agalactiae (16,7%), E.coli (15,2%), Staphylococcus aureus (10,3%) Staphylococcus epidermidis (18,9%), Escherihia coli (16,6%) и Gardnerella vaginalis (16,6%). Важно отметить, что в группе мужчин с уретритом в 52,7% случаев регистрировался полимикробный характер контаминации уретры. 3.2. Изучение показателей эякулята у мужчин с уретритом
Репродуктивная система мужского организма очень уязвима. Инфекционно-воспалительные заболевания урогенитального тракта – один из важнейших факторов, способствующих ее повреждению и приводящих к мужскому бесплодию [20, 60, 101].
На сегодняшний день статистика свидетельствует о возрастании мужского фактора в бесплодии [20, 28].
Семенная жидкость и ее качество – неотъемлемый фактор удачного оплодотворения. Анализ эякулята является главным методом лабораторно инструментального исследования при определении функционального состояния половых желез и фертильности мужчин. Он представляет важную клиническую информацию о сперматогенезе и функциональной компетентности сперматозоидов [60]. Стандартизированные исследования динамики показателей спермограмм здоровых мужчин выявили их ухудшение за последние 70 лет: отмечено уменьшение средней концентрации сперматозоидов в 1 мл эякулята, объема эякулята, содержания подвижных сперматозоидов, доли морфологически нормальных половых клеток [37, 60].
Спермограмма выполнялась по общепринятым методикам, ее параметры оценивались в соответствии с критериями ВОЗ [206]. Помимо стандартных исследований было проведено определение активности дезоксирибонуклеазы (ДНКазы) семенной жидкости методом ИФА [22]. Результаты сравнительного анализа спермограмм и результаты определения ДНКазы семенной жидкости по группам представлены в таблице 3.2. Таблица 3.2- Показатели спермограмм у мужчин без воспалительных заболеваний урогенитального тракта и мужчин уретритом, (М ± m)
Примечание для таблицы 3.2 - достоверность отличий между показателями эякулята у мужчин без воспалительных заболеваний урогенитального тракта и мужчин с уретритом При анализе полученных данных в группе мужчин с уретритом в сравнении с группой контроля были зарегистрированы следующие достоверные изменения: повышение количества лейкоцитов в эякуляте, снижение количества активноподвижных форм, повышение количества неподвижных сперматозоидов, снижение количества морфологически нормальных сперматозоидов и сперматозоидов с нормальной головкой. Важно отметить, что в обеих группах показатели спермограммы укладываются в нормативные значения согласно рекомендациям ВОЗ 2010 г. [206], однако отмечается достоверное снижение качественных показателей эякулята в группе мужчин с уретритом.
В результате сопоставления показателей ДНК-азной активности в семенной жидкости было определено, в группе мужчин с уретритом урогенитального тракта активность ДНК-азы имела тенденцию к снижению по сравнению с группой контроля.
Клинико-лабораторное обследование женщин с воспалительными заболеваниями нижнего отдела урогенитального тракта
В исследовании принимало участие 30 женщин без воспалительных заболеваний урогенитального тракта (группа контроля) и 35 женщин с воспалительными заболеваниями нижнего отдела урогенитального тракта.
У женщин группы контроля отсутствовали жалобы со стороны половых органов. Пациентки с воспалительным процессом гениталий в 57% случаев предъявляли жалобы на зуд и жжение в области половых органов, наличие выделений из половых путей. Необходимо отметить, что 43% случаев воспалительный процесс нижнего отдела урогенитального тракта характеризовался бессимптомным течением, однако был подтвержден кольпоскопическим, микробиологическим, молекулярно-биологическим методами обследования, а также цитологическим исследованием мазков с эндо- и экзоцервикса Результаты бактериологического исследования цервикального отделяемого женщин представлены в таблице 3.3. Таблица 3.3. Частота выделения различных микроорганизмов у обследованных женщин
Шейка матки является основным барьером на пути восходящей инфекции из влагалища и местом наибольшей иммунологической активности. Изучение именно нейтрофильных гранулоцитов объясняется тем, что они составляют подавляющее большинство иммуннокомпетентных клеток цервикального секрета – до 96% и являются важным звеном неспецифической резистентности организма к возбудителям инфекций, им принадлежит главная роль в противоинфекционной защите на местном уровне [16, 48, 53]. В исследовании были оценены жизнеспособность и функциональная активность нейтрофилов цервикальной слизи. Показалось особенно важным изучить роль открытого недавно внеклеточного механизма защиты нейтрофильных гранулоцитов путем образования НВЛ [78] в системе противоинфекционной защиты репродуктивной системы женщины.
На сегодняшний день воспалительные заболевания женской половой сферы по-прежнему занимают лидирующее положение в структуре гинекологической заболеваемости, представляют собой серьезную медико-социальную проблему, приводя к невынашиванию беременности, внутриутробному инфицированию плода и новорожденного, инфекционным осложнениям в родах и послеродовом периоде [33].
От местной иммунорезистентности женской половой сферы, состоятельности и эффективности функционирования локальных факторов противоинфекционной защиты напрямую зависит, в каких условиях будет происходить процесс зачатия, имплантации и развития плода, каким рискам будет подвержена успешность этих мероприятий [4].
Был исследован цервикальный секрет 30 женщин без воспалительных заболеваний урогенитального тракта и 35 женщин с воспалительными заболеваниями нижнего отдела урогенитального тракта в первую фазу менструального цикла по следующим показателям нейтрофилов цервикального секрета: общее количество, их жизнеспособность и функциональная активность (кислородзависимый метаболизм на модели спонтанного и индуцированного НСТ-теста, способность к поглощению частиц латекса, лизосомальная активность), а также определены нейтрофильные внеклеточные ловушки цервикального секрета. Результаты представлены в таблицах 3.4.1 и 3.4.2.
Клинико-лабораторное обследование женщин с воспалительными заболеваниями урогенитального тракта и женщин без воспалительных заболеваний урогенитального тракта
При изучении жизнеспособности нейтрофилов действие всех фракций эякулята однонаправлено, однако отличается выраженностью действия: во всех исследуемых группах после инкубации с эякулятом и его надосадочной фракцией отмечается снижение жизнеспособности нейтрофильных гранулоцитов, которое выражается в уменьшении процентного содержания живых клеток и тенденцией к повышению количества мертвых клеток, что является закономерным, т.к. увеличивается время пребывания клеток in vitro, однако при инкубации с осадочной фракцией данные показатели практически не меняются во всех группах и не зависят от наличия воспалительного процесса в урогенитальном тракте мужчины и женщины. Наши данные еще раз подтверждают сведения о том, что именно в бесклеточной, плазменной фракции эякулята – надосадочной жидкости содержатся активные сигнальные молекулы (простогландины, цитокины, росттрансформирующие факторы, интерлейкины и их растворимые рецепторы), способные повлиять на жизнеспособность иммуннокомпетентных клеток цервикальной слизи женщин [4, 164, 174]. Сперматозоиды самостоятельно не способны вызывать хемотаксис и активацию нейтрофилов, адсорбируют на своей поверхности защитные факторы, поэтому взаимодействие их с нейтрофильными гранулоцитами минимально, а, следовательно, они остаются максимально сохранными [10, 60, 88, 177, 212].
Однонаправленная тенденция к повышению образования НВЛ наблюдается во всех группах при инкубации нейтрофилов со всеми фракциями эякулята с наибольшей выраженностью при инкубации с цельным эякулятом. Статистическая значимость данного показателя наблюдается в группе, где женщина не имеет воспалительного заболевания, а мужчина имеет воспалительный процесс в уретре. Соответственно, активация образования НВЛ нейтрофилами цервикального секрета происходит при встрече с чужеродным генетическим материалом для организма женщины, содержащимся в эякуляте, что подтверждает уже имеющиеся в литературе данные исследований на животных [69, 115].Однако следует отметить, что повышение количества НВЛ происходит при одномоментной встрече с патогенами и их структурными компонентами [142, 160, 196], а так же АФК [102], антителами [138], комплексами антиген-антитело [106, 140], которые имеют место при воспалительном процессе в секрете урогенитального тракта мужчины. Полученные данные о более низком содержании ДНКазы семенной жидкости в группе мужчин с уретритом подтверждает наблюдения о повышенном образовании НВЛ в цервикальной слизи при инкубации с эякулятом данной группы мужчин.
При анализе полученных данных об изменении фагоцитарной функции нейтрофилов наблюдается однонаправленное действие цельного эякулята и его надосадочной фракции в отличие от действия осадочной клеточной фракции. Активация фагоцитарной функции нейтрофилов цервикальной слизи (активность и интенсивность фагоцитоза) происходит при воздействии цельным эякулятом и его надосадочной жидкостью, осадочная фракция эякулята, включающая в себя клеточные элементы, оказывает подавляющее действие на фагоцитарную функцию нейтрофилов цервикального секрета. Включение механизмов фагоцитоза отличается большей достоверностью в группе, где мужчина и женщина имеют воспалительные заболевания урогенитального тракта. Осадочная фракция эякулята во всех группах обладает подавляющим действием на фагоцитарную функцию вне зависимости от наличия воспалительного процесса у мужчины и женщины.
Активация фагоцитоза под действием семенной плазмы – надосадочной жидкости, вероятно, объясняется богатым содержанием в ней трансформирующего фактора роста 1 (ТФР-1), концентрация которого существенно превышает аналогичные сывороточные концентрации, свидетельствуя о важной роли в репродуктивной физиологии человека. Известно, что ТФР-1 стимулирует интенсивный иммунный ответ, сопровождающийся миграцией иммуннокомпетентных клеток, фагоцитирующих сперматозоиды и апоптозные мужские соматические клетки [4, 174, 188]. ТФР-1связывается с серинкиназными рецепторами на поверхности нейтрофила, что приводит к фосфорилированию внутриклеточных белков, называемых Smad [216].
Ослабление фагоцитарной функции нейтрофилов при инкубации с клеточной фракцией эякулята свидетельствует о том, что антигенные структуры сперматозоидов обладают иммунносупрессивными свойствами, проявляющимися в снижении фагоцитарной функции нейтрофилов. Известно, что на поверхности сперматозоидов адсорбированы такие иммунносупрессирующие факторы, как SCА-антиген (скафферин) [10, 60] и -дефенсин 126 [177], защищающие снаружи сперматозоиды от внешних факторов. Вероятно, протективный эффект скаферрина объясняется его сходством с АГ цервикальной слизи и внутриматочной среды («антигенная мимикрия» сперматозоидов) [10, 60]. Гликопротеид -дефенсин - секреторный белок придатка яичка - обволакивает сперматозоиды, обеспечивая защиту от распознавания иммунокомпетентными клетками [177].
Полученные данные об иммунносупрессивном действии клеточных элементов спермы подтверждают предыдущие исследования, в которых проводилась инкубация выделенных сперматозоидов человека с нейтрофилами крови отдельно и совместно с семенной плазмой. Результаты данных опытов свидетельствуют о том, что сперматозоиды не способны самостоятельно проявлять хемотаксическую активность в отношении нейтрофилов, в то время как добавление к ним семенной плазмы вызывает миграцию нейтрофильных гранулоцитов [88].
Отсутствие выраженной активности нейтрофилов при добавлении эякулята мужчин без воспалительных заболеваний урогенитального тракта объясняется толерантностью нейтрофилов цервикального секрета женщин без воспалительных заболеваний урогенитального тракта по отношению к эякуляту мужчин при отсутствии патогенов. При инкубации эякулята мужчин обеих групп с нейтрофилами цервикальной слизи женщин с воспалительными заболеваниями нижнего отдела урогенитального тракта отсутствует выраженная значимость изменений в связи с изначально высоким показателем НВЛ в группах женщин с воспалительными заболеваниями нижнего отдела урогенитального тракта и истощением компенсаторных механизмов нейтрофилов при встрече с новыми патогенами.
Полученные в работе результаты взаимодействия эякулята и его фракций с нейтрофилами цервикального секрета открывают перспективы дальнейшего изучения данной темы, в том числе в направлении разработки новых подходов повышения фертильности эякулята.