Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы .15
1.1. Современные представления о роли митохондрий в патологии человека .15
1.2. Многообразие метаболических отклонений при митохондриальной дисфункции. Общая характеристика биохимических маркеров нарушения функции митохондрий 19
1.3. Триметиллизин – продукт метилирования остатков лизина в белках и субстрат для биосинтеза эндогенного карнитина .26
1.4. PGC1a – ключевой фактор регуляции функции митохондрий .30
1.5. Нарушение функции митохондрий при сердечно-сосудистых заболеваниях 34
ГЛАВА 2. Материал и методы исследования 42
2.1. Пациенты 42
2.2. Материал исследования 43
2.3. Реактивы .43
2.4. Приборная база и расходные материалы 45
2.5. Определение уровня карбоновых кислот 46
2.5.1. Молочная кислота .46
2.5.2 Пировиноградная кислота .46
2.6. Определение концентрации белков .47
2.6.1 PGC1a .47
2.6.2. Цитохром С .48
2.6.3. ИФР-1 .49
2.6.4. РСБ-
4 2.7. Определение спектра аминокислот .50
2.8. Определение уровня триметиллизина .51
2.9. Рутинные биохимические показатели .57
2.10. Статистическая обработка данных 57
ГЛАВА 3. Результаты собственных исследований и их обсуждение .58
3.1. Значения стандартных биохимических показателей у обследованных пациентов 58
3.2. Метаболические проявления митохондриальной дисфункции у пациентов с начальной стадией сердечной недостаточности
3.2.1. Содержание молочной и пировиноградной кислот .58
3.2.2. Особенности аминокислотного спектра пациентов . 63
3.2.3. Выход цитохрома С в кровоток у пациентов 65
3.3. Уровни эндогенного метаболита, лимитирующего синтез карнитина и транспорт жирных кислот в тканях, – триметиллизина .67
3.4. PGC1a в качестве системного маркера функции митохондрий 72
Заключение .80
Выводы .84
Практические рекомендации .85
Список литературы
- Многообразие метаболических отклонений при митохондриальной дисфункции. Общая характеристика биохимических маркеров нарушения функции митохондрий
- Материал исследования
- Определение спектра аминокислот
- Особенности аминокислотного спектра пациентов .
Многообразие метаболических отклонений при митохондриальной дисфункции. Общая характеристика биохимических маркеров нарушения функции митохондрий
Множество заболеваний включают в себя нарушения клеточного энергообмена в качестве «вторичных» звеньев патогенеза, в том числе кардиомиопатии [Jarreta D., 2000; Huss J.M., 2005], сахарный диабет [Kim J.A., 2008], атеросклероз [Madamanchi N.R., 2007], печеночная недостаточность [Lee W.S., 2007], нейродегенеративные заболевания [Cabezas-Opazo F.A., 2015; Hang L., 2015] и др. Схожесть нарушений функции митохондрий при патологических состояниях разной этиологии [Jarreta D., 2000], позволяют ряду исследователей рассматривать МД, наряду с воспалением, лихорадкой, гипертрофией и проч., как типовой патологический процесс, который возникает при различной патологии, не имеет этиологической и нозологической специфики и является частным понятием по отношению к какой-либо конкретной болезни, включаясь в нее в качестве одного из ее элементов и механизмов [Лукьянова Л.Д., 2004; Васюк Ю.А., 2007]. С этой точки зрения, универсальность механизмов развития МД определяет перспективность использования митохондрий в качестве объекта цитопротекции при создании новых энерготропных лекарственных препаратов. В настоящее время помимо препаратов, направленных на восполнение или поддержание пула метаболитов, участвующих в энергообмене, включающих витамины, энергетические субстраты, а также компоненты дыхательной цепи, разработаны и внедряются в практику здравоохранения первые адресные, так называемые митохондриотропные лекарственные средства [Бакеева Л.Е., 2008]. Подход с нагрузкой субстратами в условиях нарушения функционирования митохондриона без коррекции этих нарушенных функций не всегда может быть оправдан, в то время как механизм действия таргетных митохондриальных антиоксидантов позволяет говорить уже о патогенетической терапии МД. С этой точки зрения также перспективным является направление стимулирования обновления митохондрий посредством разработки фармакологических субстанций, влияющих на сигнальные пути, вовлеченные в биогенез митохондрий [Wenz T., 2009].
Тем не менее, взгляд на МД как типовой патологический процесс, по всей видимости, требует уточнения, особенно с учетом новых данных о регуляции динамики и обновления митохондрий, так как при ряде патологических состояний все же наблюдаются характерные нарушения функции митохондрий. Ярким примером являются нейродегенеративные заболевания, для которых отличительной особенностью является нарушение «контроля качества» митохондрий с накоплением дефектных органелл [Dupuis L., 2014]. Торможение биогенеза митохондрий характерно для прогрессирования сердечной недостаточности (СН), а в эксперименте показано, что при разных способах моделирования СН наблюдаются различия в молекулярных механизмах нарушения работы дыхательной цепи митохондрий [Rosca M.G., 2013]. К тому же, несмотря на стереотипность нарушений энергетического обмена при действии патологических факторов различной этиологии, «восприимчивость» или порог чувствительности митохондриона к действию этих повреждающих факторов может варьировать между индивидуумами, и, таким образом, определять индивидуальные особенности течения заболевания. Для характеристики риска энергодефицита введено понятие «энергодефицитного диатеза» как скрытой формы относительной индивидуальной недостаточности цитоэнергетического статуса организма [Сухоруков В.С., 2011]. Также установлена связь между генетическими вариантами мтДНК, так называемыми «гаплотипами», и риском развития различных заболеваний, включая сердечно-сосудистые, онкологические и неврологические патологии [Urzaraslavia C.G., 2014].
Таким образом, понимание важной роли митохондрий в патологии человека привело к формированию такого направления науки и практики как митохондриальная медицина, которая включает в себя аспекты различных областей клинической мысли, объединяет и дополняет классические представления о патофизиологии заболеваний. Представления об автономии митохондрий, сложившиеся после обнаружения мтДНК, на сегодняшний день уступают место концепции ядерно-митохондриального взаимодействия и его ключевой роли в функционировании митохондриона. Все вышесказанное, а также создание первых митохондриотропных таргетных лекарственных препаратов, определяет актуальность разработки доступных и информативных диагностических тестов для оценки функции митохондрий и мониторинга эффективности проводимой терапии.
Накопленные данные о роли МД в патогенезе большого числа патологических процессов стимулируют развитие диагностических методик ее оценки. В диагностике наследственных митохондриальных болезней наиболее широко используются генетические и морфологические методы, включая гистохимическое исследование активности ферментов дыхательной цепи в препаратах скелетных мышц. Определение биохимического фенотипа пациента важно не только для отбора кандидатных генов для молекулярно-19 генетического исследования, но также предоставляет важную информацию, необходимую для интерпретации результатов генетического теста [Rodenburg R.J.T., 2011]. Для выявления вторичного нарушения функции митохондрий, ассоциированного с возрастом и многими социально-значимыми хроническими заболеваниями, биохимические диагностические тесты являются предпочтительными в силу ряда причин: (1) разнообразные клинические проявления МД не всегда включают показания для такого инвазивного вмешательства, как биопсия мышечной ткани; (2) отсутствие грубых генетических дефектов, а также узкий спектр известных генетических маркеров МД ограничивает применение молекулярно-генетических методов; (3) возможность определения широкого спектра аналитов в рамках одного метода биохимического исследования делает возможным проведение комплексной оценки состояния энергетического обмена. Существующие в настоящее время биохимические тесты (лактат, пируват, спектр аминокислот, органические кислоты) в качестве самостоятельных диагностических маркеров не являются достаточно специфичными для оценки функционирования митохондрий, однако их комплексное применение значительно повышает диагностическую информативность. Расширение панели для оценки функции митохондрий также возможно за счет протеомных маркеров, например, уровня циркулирующего цитохрома С [Radhakrishnan J., 2007] или белка FGF-21 [Liang C., 2014].
Материал исследования
Сбор клинического материала проводился с 2013 по 2014 годы на базе СЗФМИЦ им. В.А. Алмазова. Протокол исследования в соответствии с принципами Хельсинкской декларации был одобрен Этическим комитетом СЗФМИЦ им. В.А. Алмазова.
Были исследованы образцы крови от 94 пациентов (61 мужчина и 33 женщины) в возрасте от 30 до 77 лет с распределением по возрасту 61 (55-64) лет. Критерием включения в исследование было наличие I либо II функционального класса (ФК) сердечной недостаточности (СН) по классификации Нью-Йоркской кардиологической ассоциации (NYHA). Согласно Национальным рекомендациям Общества специалистов по сердечной недостаточности, Российского кардиологического общества и Российского научного медицинского общества терапевтов по диагностике и лечению хронической СН четвертого пересмотра для определения ФК СН специальных процедур и исследований не требуется [Мареев В.Ю., 2013]. I ФК по NYHA соответствует скрытой сердечной недостаточности, при которой ограничения физической активности отсутствуют. При II ФК по NYHA наблюдается незначительное ограничение физической активности, при этом в покое симптомы отсутствуют. 57 пациентов имели признаки СН соответствующие II ФК по NYHA (NYHA ФК II). Оставшиеся 37 пациентов составили подгруппу NYHA ФК I. Критериями исключения из исследования было наличие заболеваний почек, печени, а также эндокринных желез (за исключением сахарного диабета 2 типа).
Развитие СН у обследованных пациентов было обусловлено патологией выходного тракта левого желудочка сердца: аневризма восходящего отдела аорты (n=69) либо аортальный стеноз (n=25). Диагноз аортального стеноза и дилатации аорты верифицировался по результатам трансторакального эхокардиографического исследования на аппарате Vivid 7 (GE, США) согласно Европейским/Американским рекомендациям по эхокардиографии по стандартному протоколу [Baumgartner H., 2009]. Критерием постановки диагноза аортального стеноза была пиковая скорость на аортальном клапане более 4,0 м/с, аневризмы аорты – расширение восходящего отдела аорты более 45 мм. Аневризма аорты и аортальный стеноз этиологически были не связаны с атеросклерозом, инфекционными поражениями, последствиями травмы или хирургического вмешательства, а также наследственными заболеваниями соединительной ткани (синдром Марфана и др.). У части пациентов бикуспидальный аортальный клапан был причиной патологии выходного тракта левого желудочка сердца (треть пациентов с аневризмой аорты и половина пациентов с аортальным стенозом).
Результаты рутинных лабораторных тестов и клиническая характеристика пациентов получены ретроспективно.
В качестве группы сравнения исследованы образцы от 64 здоровых лиц (17 мужчин и 47 женщин) без признаков СН в возрасте от 18 лет до 61 года. Критериями включения в группу сравнения были удовлетворительное самочувствие, отсутствие хронических заболеваний в анамнезе, а также признаков острого воспалительного процесса. Материал исследования – плазма крови, взятой из кубитальной вены утром натощак в вакутейнеры с цитратом натрия или ЭДТА в качестве антикоагулянтов. В ходе работы строго выдержаны временной и температурный режимы процессирования биоматериала. Кровь после взятия помещали на лед (температура около 0 С). Процедуру отделения форменных элементов крови проводили в течение не более 20 минут от момента взятия крови. Кровь центрифугировали 15 минут при 580 g (3000 об/ мин). Образцы плазмы до анализа хранили порциями по 0,5-1,0 мл при температуре –80 С.
Реагенты, применяемые в ходе экспериментальной работы, были особо чистые и химически чистые (ОСЧ и ХЧ). При подготовке проб, реактивов и подвижных фаз для хроматографического анализа использовалась тридистиллированная вода, в остальных случаях – бидистиллированная вода. Растворы, приготовленные для ВЭЖХ-анализа, перед использованием подвергали вакуумной фильтрации через мембраны с порами до 0,2 мкм.
Определение уровня МК и ПВК. Набор реагентов для определения уровня МК энзиматическим колориметрическим методом (Витал Девелопмент Корпорэйшн, Россия). Для определения ПВК по методу Хохорста использовали: лактатдегидрогеназу (Sigma-Aldrich, США), НАДН (Reanal, Венгрия), пируват натрия (Sigma-Aldrich, США), а также компоненты для приготовления буферных растворов – трис-(гидроксиметил)аминометан (Реахим, Россия), динатриевую соль ЭДТА (ЛенРеактив, Россия), соляную кислоту (Вектон, Россия), натрия гидроокись (Реактив, Россия).
Определение концентрации белков. Содержание белков определяли с помощью коммерческих наборов реактивов для иммуноферментного анализа: PGC1а (Uscn Life Science Inc., КНР), CytC (Bender MedSystems GmbH, Австрия); инсулиноподобный фактор роста 1 (ИФР-1; DRG Instruments GmbH, Германия); ретинолсвязывающий белок 4 (РСБ-4; Immundiagnostik AG, Германия).
Определение спектра кодируемых аминокислот. Стандарт аминокислот (Fluka, Швейцария), ортофталевый альдегид в качестве агента дериватизации (Agilent, США), внутренний стандарт – норвалин (Sigma-Aldrich, США), метанол (Вектон, Россия). Подвижные фазы: ацетонитрил (Криохром, Россия), метанол (Вектон, Россия), натрий фосфорнокислый однозамещенный (НеваРеактив, Россия), натрия гидроокись (Реактив, Россия).
Определение спектра аминокислот
ТМЛ, АДМА и СДМА возникают в результате протеолиза белков, подвергшихся метилированию по остаткам Лиз и Арг, соответственно, в ходе посттрансляционной модификации [Servillo L., 2014]. В отличие от АДМА и СДМА, ТМЛ является исходным эндогенным метаболитом, используемым в биосинтетической цепи реакций образования карнитина [Vaz F.M., 2002]. В связи с этим, концентрация свободного ТМЛ в плазме крови зависит не только от протеолиза метилированных белков, но и от интенсивности образования эндогенного карнитина. Помимо этого, одной из причин разнонаправленного изменения уровня метилированных производных Лиз и Арг у пациентов с СН может быть также различие в белках-источниках, из которых преимущественно высвобождаются в ходе протеолиза метилированные производные. Метилирование Арг в ходе посттрансляционной модификации характерно для многих белков, в том числе для быстро обновляемых регуляторных белков и белков, связанных с процессом трансляции [Obianyo O., 2012]. В отношении ТМЛ, сайты метилирования по остаткам Лиз в большом количестве содержат гистоны [Paik W.K., 2014], а также важным источником ТМЛ с учетом массы мышечной ткани в организме, по-видимому, является миозин [Hardy M.F., 1970]. Как известно, гипометилирование ДНК [Zhong J., 2016], между метилированием которой и метилированием гистонов существует прямая взаимосвязь [Rose N.R., 2014], и саркопения [Kim T.N., 2013] наблюдаются при сердечно-сосудистой патологии и в ходе старения.
Реакция гидроксилирования ТМЛ, лимитирующая скорость синтеза карнитина [Rebouche C.J., 1986], протекает в матриксе митохондрий под действием фермента TMЛ-гидроксилазы и, следовательно, метаболизм ТМЛ связан с функцией митохондрий. В ходе корреляционного анализа между концентрацией ТМЛ и значениями отношения МК/ПВК обнаружена отрицательная связь (rs=-0,48; p=0,0001). Принимая во внимание результаты других авторов о том, что уровень ТМЛ в крови положительно коррелирует с концентрацией как свободного, так и общего карнитина [Ringseis R., 2010], допустимо предположить, что низкий уровень ТМЛ у пациентов с СН ограничивает возможность образования ацил-карнитинов и интенсивность окисления ЖК в митохондриях. В настоящей работе у пациентов с уровнем ТГ в пределах референтных значений, обнаружена положительная связь между ТМЛ и ТГ (rs=0,31; p=0,033, Рис. 12), не сохранявшаяся в условиях гипертриглицеридемии (rs=0,03; p=0,86). Полученные результаты указывают на то, что ТМЛ можно рассматривать в качестве одного из показателей нарушения метаболизма липидов, связанного с функцией митохондрий.
Таким образом, в ходе настоящей работы у пациентов с сердечнососудистой патологией и метаболическими признаками МД обнаружено снижение уровня ТМЛ, причем степень снижения ТМЛ соответствовала степени повышения показателя МК/ПВК. Уровень ТМЛ ниже значения 0,33 мкМ, ограничивающего референтный диапазон в группе сравнения, встречался у 70% пациентов, что превышает частоту выявленных отклонений для уровня МК (47%; 2=10,61; р 0,01). Для TMЛ, в отличие от МК, не характерен обмен между тканями через кровоток. В тканях идет образование TMЛ, но не происходит его захват из крови [Rebouche C.J., 1980]. Считается, что TMЛ, образовавшийся в клетке, преобразуется в бутиробетаин в пределах этой же ткани. ТМЛ, попавший в кровь, по всей видимости, выводится с мочой, так как у человека реабсорбция ТМЛ в почках не происходит [Lange H.W., 1973]. Принимая во внимание данные особенности метаболизма ТМЛ, можно ожидать большую стабильность уровня ТМЛ в крови в сравнении с МК, что, вероятно, и обуславливает более высокую частоту выявленных отклонений уровня ТМЛ от значений в группе здоровых лиц. Тем не менее, следует отметить, что среди нескольких пациентов (n=5), имевших уровень ТМЛ выше 0,67 мкМ, также были обнаружены признаки МД – один пациент имел гиперлактатемию и высокий уровень ПВК, а два пациента характеризовались обнаружением CytC в крови. Из этого можно сделать вывод, что прогностичность высокого уровня ТМЛ в отношении оценки функции митохондрий, по всей видимости, является невысокой. Тем не менее, метаболическое и диагностическое значение повышения уровня ТМЛ требует дальнейшего изучения. В ряде работ для когорты лиц с выраженным атеросклеротическим поражением сосудов получены результаты о неблагоприятном прогнозе в отношении прогрессирования заболевания и выживаемости пациентов при повышении уровня ТМЛ [Lland K.H., 2013; Skagen K., 2016], хотя механизм данной ассоциации остается не ясным.
Таким образом, у пациентов с начальной стадией развития СН обнаружено снижение концентрации ТМЛ. Уровень ТМЛ статистически связан с показателем функции митохондрий – соотношением МК/ПВК, но не с концентрацией метилированных производных аргинина – АДМА, СДМА. Отклонение уровня ТМЛ у пациентов от значений в группе здоровых лиц встречалось чаще в сравнении с повышением уровней МК, ПВК и CytC. Тем не менее, высокий уровень ТМЛ в крови не исключает наличия МД.
Особенности аминокислотного спектра пациентов .
В качестве потенциального маркера для оценки возможностей митохондрий к утилизации энергетических субстратов, а именно ЖК, был исследован уровень ТМЛ – эндогенного субстрата для биосинтеза карнитина. Для определения уровня ТМЛ была модифицирована ВЭЖХ-методика определения концентрации производных аргинина. Предел количественного определения данной методики составил 0,02±0,005 мкмоль/л. Методика характеризуется достаточной сходимостью и воспроизводимостью результатов (см. Главу 2).
Впервые определены значения концентрации ТМЛ в крови здоровых лиц российской популяции. В условиях развития СН обнаружено снижение уровня ТМЛ, которое выявлялось в 1,5 раза чаще, чем повышения уровня МК. Разнонаправленные изменения уровня ТМЛ и метилированных производных другой основной аминокислоты – аргинина (АДМА, СДМА), а также обратная связь уровня ТМЛ с соотношением МК/ПВК, с одной стороны, указывают на независимое метаболическое значение ТМЛ, и с другой, подтверждают его связь с функцией митохондрий. Выявленная статистическая связь между уровнями ТМЛ и ТГ в крови указывает на возможность использования ТМЛ в качестве показателя доступности эндогенного карнитина для транспорта ЖК в митохондрии.
В настоящей работе был впервые исследован уровень белка PGC1a в крови человека. PGC1a, выступая в качестве платформы для связывания транскрипционных факторов и ядерных рецепторов, регулирующих экспрессию генов митохондриальных белков [Rodgers J.T., 2008], является ключевым фактором биогенеза митохондрий [Ventura-Clapier R., 2008]. Изменение экспрессии гена PGC1а сопровождается МД, и обнаружено при ряде заболеваний, в том числе нейродегенеративных, сахарном диабете и СН, а также в ходе старения [Finck B.N., 2006; Schilling J., 2011; Wenz T., 2011; Austin S., 2012]. Обнаружение вариантов локализации данного белка, помимо ядра, также в цитоплазме (изоформа NT-PGC1а) [Chang J.S., 2010] и митохондриях [Aquilano K., 2010] указывает на наличие внутриклеточных транспортеров для PGC1а, что позволило нам предположить возможность существования системы переноса PGC1а из клетки. Полученные результаты подтвердили данное предположение, и указывают на возможность регистрации PGC1a не только в тканях, но и в крови.
У пациентов с СН обнаружено повышение концентрации PGC1а в плазме крови в среднем практически в 2 раза относительно здоровых лиц. Согласно нашим данным, повышение концентрации PGC1а в крови не связано с увеличением неспецифической проницаемости клеточных мембран, и, вероятно, объясняется более сложным механизмом, требующим дальнейшего изучения. Несмотря на начальную стадию развития СН, отклонение от значений в группе сравнения концентрации PGC1a, как и ТМЛ, у пациентов встречались достоверно чаще, чем повышение МК (в 1,5 раза), ПВК (в 5 раз) и случаи высокого уровня CytC (в 4 раза). Исходя из полученных данных, для ТМЛ и PGC1a можно ожидать более высокую диагностическую чувствительность, в сравнении с другими биохимическими показателями, использующимися в настоящее время для оценки функции митохондрий. Однако, выявленные закономерности в изменении уровня PGC1а относительно других показателей функции митохондрий (Рис. 14), а именно увеличение частоты случаев гиперлактатемии и выхода CytC в кровоток при низком уровне PGC1a у пациентов, характеризуют данный белок как показатель с невысокой прогностичностью отрицательного результата при использовании в качестве самостоятельного параметра. Аналогичные выводы, исходя их полученных данных, можно сделать и в отношении ТМЛ. Тем не менее, принимая во внимание недостаточное количество в настоящее время специфичных диагностических показателей для оценки МД, преаналитические и аналитические сложности определения таких распространенных показателей как МК и ПВК, ТМЛ и PGC1a являются перспективными маркерами для оценки функции митохондрий, требующими дальнейшего изучения. Для корректной интерпретации низкого уровня PGC1a может быть рекомендовано совместное определение концентраций данного белка и МК. Полученные результаты о присутствии белка PGC1a в системном кровотоке также имеют значение для разработки малоинвазивных способов мониторинга терапии энергодефицитных состояний, предполагающей воздействие на биогенез митохондрий [Wenz T., 2009].