Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Состояние Т-клеточного иммунитета при ВИЧ моноинфекции и ВИЧ-инфекции в сочетании гепатитом C (обзор литературы) 14
1.1. Дефицит CD4+ T-клеток при ВИЧ-инфекции 14
1.2. Активация иммунной системы 20
1.3. Развитие хронического воспаления 27
1.3.1. TNF- и растворимые рецепторы sTNFR-I и sTNFR-II 27
1.3.2. Интерлейкин-6 28
1.3.3. Растворимый рецептор sCD14 29
1.3.4. Растворимый рецептор sCD163 30
1.3.5. Неоптерин 31
1.3.6. CXCL10 (IP-10) 33
1.3.7. D-димеры 1.4. Иммунитет на фоне антиретровирусной терапии 34
1.5. Иммунитет при ВИЧ/ВГС коинфекции 42
Глава 2. Материал и методы исследования 54
2.1. Пациенты 54
2.2. Взятие биологического материала и его обработка 61
2.3. Определение аналитов в плазме крови 63
2.4. Цитофлуориметрический анализ 64
2.5. Статистические методы исследования 68
Глава 3. Активация иммунной системы и развитие системного воспаления при ВИЧ/ВГС коинфекции 69
3.1. Активация T-клеток 69
3.2. Маркеры воспаления 79
Глава 4. Субпопуляции T-лимфоцитов крови и лимфатических узлов при ВИЧ/ВГС коинфекции 89
4.1. T-лимфоциты крови 89
4.2. T-лимфоциты лимфатических узлов 107
4.3. Морфология лимфатических узлов 118
Глава 5. Развитие ВИЧ/ВГС коинфекции на фоне нарушения ответа CD4+ T-лимфоцитов на антиретровирусную терапию 135
5.1. T-лимфоциты крови 136
5.2. Системное воспаление 139
5.3. Апоптоз 159
5.4. Истощение 162
5.5. Пролиферация 166
5.6. T-клетки лимфатических узлов 171
Заключение 193
Выводы 205
Список использованных сокращений 208
Литература 210
- Активация иммунной системы
- Активация T-клеток
- T-лимфоциты лимфатических узлов
- T-клетки лимфатических узлов
Введение к работе
Актуальность темы исследования и степень ее разработанности
Несмотря на многочисленные исследования в области изучения ВИЧ-инфекции (Карамов Э.В., Жернов Ю.В., Хаитов Р.М. Фармакологическая профилактика ВИЧ-инфекции // Физиол. и патол. иммунной системы. 2015. Т. 19, № 6. – С. 3-15; Онищенко Г.Г. Противодействие эпидемии ВИЧ/СПИД в восточной Европе и центральной Азии // ЖМЭИ. 2009. № 1. С. 16-21; Покровский В.В. Манифестация СПИДа в России // Эпидемиол. и инф. болезни. Актуальные вопросы. 2015. № 1. С. 42-47; Сидорович И.Г., Николаева И.А., Гудима Г.О. и соавт., Иммунотерапия ВИЧ-инфекции и СПИДа // Физиол. и патол. иммунной системы. – 2005. – Т. 9. № 8. – С. 80-89; Хаитов, Корнилаева Г.В., Куханова М.К., Карамов Э.В. Анти-ВИЧ-активность новых ациклических нуклеозидных фосфонатов // Иммунология. 2009. Т. 30. № 6. С. 336-337; Kozlov A.P., Shaboltas A.V., Toussova O.V. et al., HIV incidence and factors associated with HIV acquisition among injection drug users in St Petersburg, Russia // AIDS. 2006. Vol. 20, No 6. P. 901-906) проблема остается актуальной в связи с высоким уровнем заболеваемости и смертности. ВИЧ-инфекция больше, чем любое другое инфекционное заболевание претендует быть названной «болезнью коинфекций» (Boulougoura A., Sereti I. HIV infection and immune activation: the role of coinfections // Curr. Opin. HIV AIDS. 2016. Vol. 11, No 2. P. 191-200). Коинфекции могут существенно менять картину болезни и помимо усиления активации иммунитета (Appay V., Kelleher A.D. Immune activation and immune aging in HIV infection // Curr. Opin. HIV AIDS. 2016. Vol. 11, No 2. P. 242-249; Masia M., Robledano C., De La Tabla V.O. et al. Coinfection with human herpesvirus 8 Is associated with persistent inflammation and immune activation in virologically suppressed HIV-infected patients // PloS One. 2014. Vol. 9. e105442; Taiwo B., Barcena L., Tressler R. Understanding and controlling chronic immune activation in the HIV-infected patients suppressed on combination antiretroviral therapy // Curr. HIV/AIDS Rep. 2013. Vol. 10, No 1. P. 21-32), как правило, приводят к росту заболеваемости и смертности (Deffur A., Mulder N.J., Wilkinson R.J. Co-infection with Mycobacterium tuberculosis and human immunodeficiency virus: an overview and motivation for systems approaches // Pathog. Dis. 2013. Vol. 69, No 2. P. 101-113; Effros R.B. The silent war of CMV in aging and HIV infection // Mech. Ageing Dev. 2016. Vol. 158. P. 46-52; Matthews P.C., Geretti A.M., Goulder P.J., Klenerman P. // J. Clin. Virol. 2014. Vol. 61, No 1. P. 20-33). Из всех коинфекций, сопутствующих ВИЧ-инфекции, ведущее место по частоте встречаемости занимает гепатит C. Это обусловлено широким распространением обеих инфекций (в мире насчитывается около 40 млн. зараженных ВИЧ и около 120 млн.
зараженных вирусом гепатита C (ВГС)) и совпадением путей их передачи (Platt L., Easterbrook P., Gower E. et al. Prevalence and burden of HCV co-infection in people living with HIV: a global systematic review and meta-analysis // Lancet Infect. Dis. 2016. Vol. 16, No 7. P. 797-808; Webster D.P., Klenerman P., Dusheiko G.M. Hepatitis C // Lancet. 2015. Vol. 385, No 9973. P. 1124-1135). В Западной Европе и США доля пациентов с хроническим гепатитом C среди ВИЧ-инфицированных людей составляет 25-30 % (Alter M.J. Epidemiology of viral hepatitis and HIV co-infection // J. Hepatol. 2006. Vol. 44, No 1 Suppl. P. S6-S9), в Восточной Европе – более 50 % (Peters L., Mocroft A., Lundgren J. et al. HIV and hepatitis C co-infection in Europe, Israel and Argentina: a EuroSIDA perspective // BMC Infect. Dis. 2014. Vol. 14. Suppl. 6. S13). В России неконтролируемое потребление инъекционных наркотиков привело к значительному росту ВИЧ/ВГС коинфицирования. Его уровень среди наркопотребителей может достигать 93% (Rhodes T., Platt L., Judd A. et al. Hepatitis C virus infection, HIV co-infection, and associated risk among injecting drug users in Togliatti, Russia // Int. J. STD. AIDS. 2005. Vol. 16, No 11. P. 749-754). Важность проблемы определяется тем, что ВГС коинфекция вносит весомый вклад в увеличение СПИД-неассоциированной заболеваемости и смертности пациентов, инфицированных ВИЧ (Chen T.Y., Ding E.L., Seage Iii G.R., Kim A.Y. Meta-analysis: increased mortality associated with hepatitis C in HIV-infected persons is unrelated to HIV disease progression // Clin. Infect. Dis. 2009. Vol. 49, No 10. P. 1605-1615; Puoti M., Bruno R., Soriano V. et al. Hepatocellular carcinoma in HIV-infected patients: epidemiological features, clinical presentation and outcome // AIDS. 2004. Vol. 18, No 17. P. 2285-2293).
По сравнению с ВГС моноинфекцией при ВИЧ/ВГС коинфекции наблюдается ускоренное фиброзирование (Deng L.P., Gui X.E., Zhang Y.X. et al. Impact of human immunodeficiency virus infection on the course of hepatitis C virus infection: a meta-analysis // World J. Gastroenterol. 2009. Vol. 15, No 8. P. 996-1003; Macias J., Berenguer J., Japon M.A. et al. Fast fibrosis progression between repeated liver biopsies in patients coinfected with human immunodeficiency virus/hepatitis C virus // Hepatology. 2009. Vol. 50, No 4. P. 1056-1063) и развитие цирроза печени (Hernandez M.D. & Sherman K.E. HIV/hepatitis C coinfection natural history and disease progression // Curr. Opin. HIV AIDS. 2011. Vol. 6, No 6. P. 478-482). Кроме того, больные с коинфекцией имеют повышенный относительно ВГС-моноинфицированных субъектов риск развития гепатоцеллюлярной карциномы, которая возникает у них в более раннем возрасте и через более короткий промежуток времени после инфицирования ВГС (Brau N., Fox R.K., Xiao P. et al. Presentation and outcome of hepatocellular carcinoma in HIV-infected patients: a U.S.-Canadian multicenter study // J. Hepatol. 2007. Vol. 47, No 4. P. 527-537). Низкий уровень CD4+ T-лимфоцитов у ВИЧ/ВГС коинфицированных пациентов является негативным фактором в развитии фиброза печени (Reiberger T., Ferlitsch A., Sieghart W. et al.
HIV-HCV co-infected patients with low CD4+ cell nadirs are at risk for faster fibrosis progression
and portal hypertension // J. Viral. Hepat. 2010. Vol. 17, No 6. P. 400-409). Опираясь на
результаты различных исследователей и позицию ведущих специалистов, Европейское
клиническое общество СПИДа (European AIDS Clinical Society) рекомендует раннее
назначение антиретровирусной терапии (АРТ) пациентам с ВИЧ-инфекцией,
коинфицированным ВГС, не только для оптимизации лечения гепатита, но и для замедления развития фиброза.
Сложнее выглядит ситуация с оценкой влияния гепатита C на течение ВИЧ-инфекции, при которой основным объектом поражения являются T-лимфоциты. Одним из параметров, характеризующих такое влияние, является регенерация CD4+ T-клеток при назначении АРТ [1,2,3,]. К настоящему времени представлено немало работ, результаты которых свидетельствуют о нарушении процесса восстановления численности CD4+ T-лимфоцитов у ВИЧ-инфицированных субъектов с гепатитом C (Greub G., Ledergerber B., Battegay M. et al. Clinical progression, survival, and immune recovery during antiretroviral therapy in patients with HIV-1 and hepatitis C virus coinfection: the Swiss HIV Cohort Study // Lancet. 2000. Vol. 356, No 9244. P. 1800-1805; Potter M., Odueyungbo A., Yang H. et al. Impact of hepatitis C viral replication on CD4+ T-lymphocyte progression in HIV-HCV coinfection before and after antiretroviral therapy // AIDS. 2010. Vol. 24, No 12. P. 1857-1865; Santin M., Mestre M., Shaw E. et al. Impact of hepatitis C virus coinfection on immune restoration during successful antiretroviral therapy in chronic human immunodeficiency virus type 1 disease // Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 2008. Vol. 27, No 1. P. 65-73; Taye S., Lakew M. Impact of hepatitis C virus co-infection on HIV patients before and after highly active antiretroviral therapy: an immunological and clinical chemistry observation, Addis Ababa, Ethiopia // BMC Immunol. – 2013. – Vol. 14. – 23; Weis N., Lindhardt B.O., Kronborg G. et al. Impact of hepatitis C virus coinfection on response to highly active antiretroviral therapy and outcome in HIV-infected individuals: a nationwide cohort study // Clin. Infect. Dis. 2006. Vol. 42, No 10. P. 1481-1487). Однако не все исследователи согласны с тем, что ВГС-коинфекция оказывает негативное влияние на индуцированный лечением ответ CD4+ T-клеток (Rockstroh J.K., Mocroft A., Soriano V. et al. Influence of hepatitis C virus infection on HIV-1 disease progression and response to highly active antiretroviral therapy // J. Infect. Dis. 2005. Vol. 192, No 6. P. 992-1002; Yacisin K., Maida I., Rios M.J. et al. Hepatitis C virus coinfection does not affect CD4 restoration in HIV-infected patients after initiation of antiretroviral therapy // AIDS Res. Hum. Retroviruses. 2008. Vol. 24, No 7. P. 935-940). Еще одним фактором, характеризующим ВИЧ/ВГС коинфекцию является иммунная активация. Ее уровень обычно превышает таковой при ВИЧ моноинфекции (Gonzalez V.D., Falconer K., Blom K.G. et al. High levels of chronic immune activation in the T-cell compartments of patients
coinfected with hepatitis C virus and human immunodeficiency virus type 1 and on highly active antiretroviral therapy are reverted by alpha interferon and ribavirin treatment // J. Virol. 2009. Vol. 83, No 21. P. 11407-11411; Kovacs A., Al-Harthi L., Christensen S. et al. CD8+ T cell activation in women coinfected with human immunodeficiency virus type 1 and hepatitis C virus // J. Infect. Dis. 2008. Vol. 197, No 10. P. 1402-1407) и ВГС моноинфекции (Feuth T., Arends J.E., Fransen J.H. et al. Complementary role of HCV and HIV in T-cell activation and exhaustion in HIV/HCV coinfection // PLoS One. 2013. Vol. 8. e59302). Важную роль в развитии ВИЧ/ВГС коинфекции может играть системное воспаление, характерное, как для ВИЧ- (Raffetti E., Donato F., Casari S. et al. Systemic inflammation-based scores and mortality for all causes in HIV-infected patients: a MASTER cohort study // BMC Infect. Dis. 2017. Vol. 17. 193), так и для ВГС-инфекции (Ferri C., Ramos-Casals M., Zignego A.L. et al. International diagnostic guidelines for patients with HCV-related extrahepatic manifestations. A multidisciplinary expert statement // Autoimmun. Rev. 2016. Vol. 15, No 12. P. 1145-1160). Вместе с тем, механизмы влияния гепатита C на дисфункцию T-клеточного иммунитета и развитие системного воспаления у ВИЧ-инфицированных пациентов остаются малоизученными.
Цель работы
Исследование T-клеточного иммунитета у ВИЧ-инфицированных пациентов, коинфицированных вирусом гепатита C.
Задачи исследования
-
Оценить у ВИЧ инфицированных пациентов влияние коинфицирования вирусом гепатита С на активацию T-клеток и ее связь с другими параметрами иммунной системы;
-
Дать характеристику развития системного воспаления у ВИЧ инфицированных пациентов при коинфекции вирусом гепатита С;
-
Изучить изменения субпопуляционного состава CD4+ и CD8+ T-лимфоцитов крови ВИЧ инфицированных лиц коинфицированных вирусом гепатита С;
-
Исследовать сдвиги субпопуляционного состава CD4+ и CD8+ T-клеток лимфатических узлов ВИЧ инфицированных пациентов коинфицированных вирусом гепатита С, и сравнить их с соответствующими изменениями в крови;
-
Провести гистологическое и иммуноморфологическое исследование лимфатических узлов коинфицированных вирусом гепатита С субъектов и сравнить выявленные изменения с таковыми у ВИЧ моноинфицированных;
-
Исследовать развитие системного воспаления у коинфицированных вирусом гепатита С пациентов с дискордантным ответом CD4+ T-лимфоцитов на терапию;
-
Дать характеристику процессам апоптоза и истощения T-клеток у коинфицированных вирусом гепатита С лиц с дискордантным ответом CD4+ T-клеток на лечение;
-
Оценить процессы активации и воспаления в лимфатических узлах коинфицированных вирусом гепатита С субъектов с нарушением восстановления CD4+ T-лимфоцитов;
-
Исследовать связь между количеством CD4+ T-клеток крови и уровнем развития системного воспаления при коинфекции вирусом гепатита С и при ВИЧ моноинфекции.
Методология и методы исследования
Из 3696 ВИЧ-инфицированных пациентов, получающих лечение, путем тщательного отбора было сформировано 4 клинические группы с подавленной репликацией ВИЧ (2 группы ВГС коинфицированных лиц без интерферонотерапии и 2 группы с нарушением восстановления CD4+ T-клеток). Контролем служили показатели неинфицированных добровольцев. Методом проточной цитофлуориметрии оценивали численность субпопуляций T-лимфоцитов крови и лимфатических узлов, их функциональные характеристики. Проводили гистологическое и иммуноморфологическое исследование л/узлов, на основе биохимических параметров тестировали состояние печени, определяли маркеры системного воспаления и выраженность микробной транслокации из кишечника в общий кровоток. Применяли статистические методы исследования.
Степень достоверности, апробация результатов, личное участие автора
Достоверность результатов работы, обоснованность выводов и практических рекомендаций базируется на достаточном числе наблюдений и экспериментальных данных при использовании современных методов биологического исследования. Результаты получены на сертифицированном оборудовании. Применение статистического анализа материалов
исследования проводилось с использованием пакета программ «Statistica 6». Проверка первичных материалов независимой комиссией, созданной приказом (№ 1252/17) директора «ИЭГМ УрО РАН» чл.-корр. РАН, проф. В.А. Демакова, получила позитивное заключение.
Результаты диссертации представлены и обсуждены на III Конференции по вопросам ВИЧ/СПИДа в Восточной Европе и Центральной Азии (28-30 октября 2009, Москва); XVIII International AIDS Conference (July 18-23, 2010, Vienna, Austria); IV Всероссийской конференции «Иммунология репродукции с элементами научной школы для молодежи» (5-8 декабря 2010 г., Пермь); Международной конференции «Brokerage Event» ERA.Net RUS, (28 февраля – 2 марта 2011, Екатеринбург); 6th International AIDS Society Conference on HIV pathogenesis, treatment and prevention (July 17-20 2011, Rome, Italy); Объединенном иммунологическом форуме (30 июня – 4 июля 2013 г., Нижний Новгород); 2nd Annual bilateral meeting on collaborative research partnerships on the prevention and treatment of HIV/AIDS and co-morbidities (July 18-19, 2013, Moscow); VI Ежегодном Всероссийском конгрессе по инфекционным болезням (24-26 марта 2014 г., Москва); Российском научном форуме на Урале «Актуальные вопросы фундаментальной медицины» (23-25 октября 2014 г., Екатеринбург); Пермском научном форуме (2-4 июля 2015 г., Пермь); V Конференции по ВИЧ/СПИДу в Восточной Европе и Центральной Азии (23-25 марта 2016 г., Москва); Калининградском научном форуме (27-30 июня 2016 г., Калининград); 9th International AIDS Society Conference on HIV Science (July 23-26 2017, Paris, France); XIV Конференции иммунологов Урала (27-29 августа 2017 г., Челябинск).
Личный вклад автора состоит в непосредственном участии на всех этапах
диссертационного исследования. Основная идея, планирование научной работы, включая
формулировку рабочей гипотезы, определение методологии и общей концепции
диссертационного исследования проводились совместно с научным консультантом,
академиком РАН, доктором медицинских наук, профессором Черешневым Валерием
Александровичем. Анализ современной отечественной и зарубежной литературы по
изучаемой проблеме проведен лично диссертантом. Получение и интерпретация клинико-
анамнестических данных осуществлялись лично диссертантом. Стандартные лабораторные
исследования, определенные методическими документами Минздрава РФ для ВИЧ-
инфицированных лиц, проводились сотрудниками диагностической лаборатории
Государственного казенного учреждения здравоохранения Пермского края "Пермский краевой
центр по профилактике и борьбе со СПИД и инфекционными заболеваниями".
Экспериментальные исследования выполнены совместно с сотрудниками лаборатории
экологической иммунологии Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН.
Статистическая обработка первичных данных, интерпретация и анализ полученных
результатов, написание и оформление рукописи диссертации, осуществлялись соискателем лично. Представление результатов работы в научных публикациях и в виде докладов осуществлялись соискателем лично и в соавторстве с научным коллективом, лаборатории экологической иммунологии Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН. Автор выражает искреннюю благодарность за помощь в работе:
сотрудникам лаборатории экологической иммунологии «ИЭГМ УрО РАН» (г. Пермь) к.м.н. Л.Б. Королевской и к.б.н. Е.В. Сайдаковой;
доценту кафедры гистологии Пермского государственного медицинского университета им. акад. Е.А. Вагнера к.м.н. Н.И. Гуляевой;
Главному врачу Пермского краевого центра по борьбе со СПИД и инфекционными заболеваниями Е.В. Сармометову и заведующему диагностической лаборатории д.м.н. Звереву С.Я.
профессору Западного резервного университета Кейза (Кливленд, штат Огайо, США) М. Ледерману;
профессору университета Миннесоты (Миннеаполис, штат Миннесота, США)
Т. Шаккеру.
Положения, выносимые на защиту
-
При ВИЧ-инфекции, коинфекция вирусом гепатита С в большей степени, чем ВИЧ моноинфекция вызывает активацию CD8+ T-лимфоцитов и макрофагов, а также индуцирует развитие более выраженного системного воспаления.
-
При коинфекции вирусом гепатита С развивается более глубокий, чем при ВИЧ моноинфекции дефицит наивных CD4+ T-клеток, что обусловлено нарушением процесса их регенерации.
-
Формирование у коинфицированных вирусом гепатита С пациентов дискордантного ответа CD4+ T-лимфоцитов на антиретровирусную терапию связано с усилением деструкции печени и усилением системного воспаления.
-
При коинфекции вирусом гепатита С системное воспаление тесно связано с уровнем CD4+ T-клеток, чего не наблюдается при ВИЧ моноинфекции.
Научная новизна
Впервые у ВИЧ/ВГС коинфицированных пациентов в условиях вирусологически эффективной АРТ выполнено комплексное исследование T-клеточного иммунитета с анализом качественных изменений субпопуляционного состава CD4+ и CD8+ T-лимфоцитов
крови и лимфатических узлов. Проведен учет их активации, регенерации, истощения, старения и гибели на фоне усиления микробной транслокации из кишечника и развития системного воспаления. Выявлено отягощающее влияние гепатита C на формирование дефицита CD4+ T-клеток, основной мишенью которого оказались наивные элементы. Впервые показано, что происходящие в крови ВИЧ/ВГС коинфицированных субъектов сдвиги субпопуляционного состава CD4+ и CD8+ T-лимфоцитов являются отражением структурных и функциональных изменений всей иммунной системы организма. И в крови, и в лимфатических узлах зафиксировано уменьшение содержания наивных CD4+ T-клеток, увеличение количества CD8+ T-лимфоцитов памяти, усиление иммунной активации. При этом как у ВИЧ/ВГС коинфицированных, так и ВИЧ моноинфицированных пациентов в лимфоузлах отмечено выраженное развитие склероза, сокращение и опустошение паракортикальной зоны, увеличение содержания апоптотически измененных клеток. Эти изменения, главным образом, обусловлены ВИЧ инфекцией. Влияния гепатита C на структурные изменения лимфатических узлов, вызванные ВИЧ инфекцией, выявлено не было.
Впервые установлено, что важной особенностью ВИЧ/ВГС коинфекции, отличающей ее от ВИЧ моноинфекции является более интенсивное развитие системного воспаления, которое достигает максимального проявления на фоне дискордантного ответа CD4+ T-клеток на АРТ. Оно обусловлено деструкцией печеночной ткани и поступлением бактериальных продуктов из кишечника в кровь. Последнее определяется нарушением как кишечного, так и печеночного барьеров. В отличие от ВИЧ моноинфекции при ВИЧ/ВГС коинфекции число CD4+ T-лимфоцитов тесно связано с проявлением системного воспаления.
Впервые показано, что ослабление регенерации CD4+ T-клеток на фоне
вирусологически эффективной АРТ при ВИЧ/ВГС коинфекции определяется
преимущественно формированием состояния истощения как CD4+, так и CD8+ T-лимфоцитов, что реализуется в уменьшении концентрации IL-2 в крови и сокращении темпа пролиферации CD8+ T-лимфоцитов эффекторной памяти. В отличие от ВИЧ моноинфекции нарушение ответа на терапию при ВИЧ/ВГС коинфекции не сопровождается усилением апоптоза CD4+ T-клеток.
Теоретическая и практическая значимость работы
Работа носит фундаментальный характер, исследовано развитие
иммунопатологических процессов у ВИЧ инфицированных пациентов, коинфицированных вирусом гепатита С, на фоне антиретровирусной терапии с учетом иммунологической
эффективности антиретровирусной терапии. В процессе исследования выявлена негативная роль ВГС коинфицирования ВИЧ-позитивных лиц, определены особенности проявления у них иммунных нарушений и обоснованы патогенетические механизмы этих нарушений. С фундаментальных позиций важным является установление негативного влияния на течение ВИЧ инфекции вируса гепатита С на уровне наивных CD4+ T-лимфоцитов – снижение их численности и нарушение процессов пролиферации. В практическом плане большое значение имеет факт установления при сочетанной инфекции развития выраженного системного воспаления. С одной стороны, оно прямо связано с дефицитом CD4+ T-лимфоцитов, что требует максимально раннего начала антиретровирусной терапии для сохранения клеток, с другой – свидетельствует о высоком риске развития у этих больных сердечно-сосудистых осложнений. Эти сведения о патогенезе развития заболевания, на наш взгляд, являются весомым дополнением известных данных об увеличении СПИД-неассоциированных заболеваний на фоне АРТ и смертности ВИЧ-инфицированных индивидуумов при наличии у них ВГС коинфекции. С патогенетических позиций становится очевидной необходимость изменения стратегии ведения пациентов с ВИЧ/ВГС коинфекцией: назначение антиретровирусной терапии на ранних этапах ВИЧ инфекции, не допуская развития иммунодефицита; проведение профилактических мероприятий, направленных на минимизацию сосудистых и коронарных рисков; широкое применение противовирусной терапии гепатита.
Внедрение результатов исследования в практику
Материалы диссертации используются в работе клинико-экспертной комиссии
государственного казнного учреждения здравоохранения «Пермский краевой центр по
профилактике и борьбе со СПИД и инфекционными заболеваниями» при назначении
антиретровирусной терапии и интерферонотерапии ВИЧ инфицированным пациентам,
коинфицированным вирусом гепатита С. Полученные данные включены в лекционные курсы
кафедры иммунологии и кафедры инфекционных болезней Федерального государственного
бюджетного образовательного учреждения высшего образования «Пермский
государственный медицинский университет им. Е.А. Вагнера» министерства
здравоохранения Российской Федерации, а также в курс лекций «Фундаментальная иммунология» кафедры микробиологии и иммунологии биологического факультета Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего образования «Пермский государственный национальный исследовательский университет».
Конкурсная поддержка исследования
Работа выполнена при поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (№ проекта 12-04-91441-НИЗ_а), US Civilian Research & Development Foundation (CRDF Global; No of the project RUB1-31089-PE-12), программы Уральского отделения РАН (№ проекта 12–С–4–1033), Российского научного фонда (№ проекта 15–15–00016).
Публикации
Соискатель имеет 43 опубликованных работы. Из них по теме диссертации опубликовано 29 научных работ общим объемом 6,2, в том числе 1 глава в монографии, 17 публикаций в научных журналах и изданиях, которые включены в Перечень российских рецензируемых научных журналов и изданий для опубликования основных научных результатов диссертации, 3 статьи в зарубежных научных изданиях, входящих в базы Scopus, Elsevier. В материалах всероссийских и международных конференций опубликовано 8 работ.
Структура и объем диссертации
Диссертация изложена на 288 страницах, иллюстрирована 10 таблицами и 92 рисунками. Состоит из введения, обзора литературы, 4-х глав собственных исследований, заключения, выводов, списка цитированной литературы, включающего 649 источников, в том числе 7 работ отечественных и 642 – зарубежных авторов.
Активация иммунной системы
Накопленные к настоящему времени данные со всей очевидностью демонстрируют, что иммунная активация в значительной мере определяет потерю CD4+ T-клеток и развитие СПИДа у ВИЧ-инфицированных пациентов. Показатели активации иммунитета оказались явно весомее в прогнозировании наступления СПИДа [197, 637] и смерти [114, 239, 351] по сравнению с концентрацией вируса в крови. Кроме того, известно, что инфекция, обусловленная ВИЧ-2, характеризуется меньшей вирусной нагрузкой, более медленным прогрессированием болезни и большим уровнем CD4+ T-лимфоцитов в крови по сравнению с этими показателями при инфекции, вызванной ВИЧ-1 [375]. Как выяснилось, главным различием между заболеваниями, индуцированными разными типами вируса, оказалась менее выраженная активация иммунитета у пациентов, инфицированных ВИЧ-2 [119, 229]. Выше также отмечалось, что у природных хозяев ВИО, для которых нетипично развитие иммунной активации, дефицит CD4+ T-клеток не усугубляется в течение времени, а инфекция не реализуется в СПИД.
Активация врожденного и адаптивного иммунитета начинается уже в острую фазу ВИЧ-инфекции [221, 548]. В хроническую фазу также наблюдается рост продукции провоспалительных цитокинов (IL-1, IL-6, IL-8, интерфероны I типа), сывороточных маркеров воспаления (CRP, цистатин C, sCD14, D-димеры) и повышение коагуляции крови [113]. Интересно, что вместе с увеличением содержания провоспалительных медиаторов в крови у пациентов в хронический период отмечается подъем концентраций противовоспалительных цитокинов IL-10 и TGF-1, которые могут быть предикторами развития СПИДа [618]. У зараженных ВИЧ субъектов, не принимающих противовирусной терапии, установлено повышение в крови провоспалительных моноцитов (CD14+CD16+) [144, 574], а у ВИО-инфицированных макак усиление оборота моноцитов было более весомым показателем в предсказании СПИДа, чем уровень вирусной нагрузки [232]. Важно также отметить, что гуморальные индикаторы воспаления, являющиеся прогностическими факторами в отношении не ассоциированных со СПИДом заболеваемости и смертности, имеют выраженную корреляцию с параметрами активации моноцитов [620].
Среди других клеток врожденного иммунитета, на наш взгляд, следует обратить внимание на естественные киллеры. Известно, что NK-клетки у ВИЧ-инфицированных пациентов находятся в активированном состоянии [173, 436]. Уровень их активации возрастает с прогрессированием болезни и в большей степени касается цитолитической субпопуляции CD56dimCD16+ [322]. Авторы показали, что экспрессия на их поверхности CD38 коррелирует со снижением числа CD4+ T-лимфоцитов, ростом активации T-клеток (% CD38+HLA-DR+), повышением в крови концентрации sCD14 и развитием СПИДа.
При ВИЧ-инфекции T-лимфоциты также находятся в состоянии активации. Процесс затрагивает как CD4+, так и CD8+ T-клетки [324, 445]. Здесь необходимо подчеркнуть, что активированные CD4+ T-лимфоциты являются источником поддержания ВИЧ- и ВИО-инфекции, в то время как покоящиеся CD4+ T-клетки – нет [94, 549, 634]. Причиной системной иммунной активации могут быть различные факторы. Среди них выделяют сам ВИЧ, коинфицирующие агенты, гомеостатические механизмы, связанные с развитием лимфопении, микробную транслокацию из кишечника. Реакция на ВИЧ/ВИО способна реализоваться через TLR7/8 плазмацитоидных дендритных клеток [44, 397], а также другие рецепторы врожденного иммунитета [365, 626] с последующей передачей активационного сигнала T-лимфоцитам. Часть T-клеток стимулируется через TCR после распознавания чужеродных пептидов в составе MHC дендроцитов. Это могут быть пептиды ВИЧ, цитомегаловируса и других вирусов, репликация которых усиливается на фоне иммунодефицита [273]. Вышесказанное подтверждается данными об уменьшении иммунной активации после снижения вирусной нагрузки на фоне проведения АРТ [157, 578].
Развитие лимфопении при ВИЧ-инфекции сопровождается компенсаторной реакцией, направленной на восстановление численности лимфоцитов и получившей название «гомеостатической пролиферации» [569]. В настоящее время на основе экспериментальных работ, выполненных на мышах, выделяют два варианта гомеостатической пролиферации: медленный (одно деление клетки за 24-36 часов) и быстрый (одно деление клетки за 6-8 часов). Первый управляется фактором плотности клеточных элементов, второй – транслокацией кишечных бактерий [301, 406, 556]. Известно, что в ответ на лимфопению гомеостатической пролиферации подвергаются как наивные T-лимфоциты, так и T-клетки памяти. Наивные T-лимфоциты характеризуются медленным типом гомеостатической пролиферации, который запускается двумя сигналами: молекулами MHC I и MHC II соответственно для CD8+ и CD4+ T-клеток [204, 378, 561, 566] и IL-7 [182, 562]. Экспансия T-лимфоцитов памяти при лимфопении происходит быстрее [430]. Кроме того, для ее индукции, как правило, не требуются молекулы MHC [87, 422, 557]. Однако пролиферация CD8+ T-клеток памяти существенно зависит от IL-15 [285].
На фоне развития ВИЧ-инфекции деление T-лимфоцитов инициируется как гомеостатическими, так и вирусными факторами. При этом причиной пролиферации CD4+ T-клеток являются и лимфопения, и присутствие патогена, а CD8+ T-лимфоцитов, главным образом – вирус [80]. Вместе с тем, показано, что степень зависимости разных субпопуляций CD4+ T-клеток ВИЧ-инфицированных пациентов от двух представленных факторов может быть различной. Так, для наивных CD4+ T- лимфоцитов ведущим драйвером митотической активации выступает дефицит общей численности CD4+ T-клеток. На уровне CD4+ T лимфоцитов памяти пролиферация уже определяется влиянием и лимфопении, и вируса [81]. Следует отметить, что в отличие от гомеостатической пролиферации, протекающей в здоровом организме, при хронической вирусной инфекции регенерация дает короткоживущие клетки [220]. Кроме того, не все субпопуляции CD4+ T-лимфоцитов способны восстанавливаться в равной степени [441].
Выше уже отмечалось, что ВИЧ-инфекция вызывает выраженное опустошение лимфоидных структур пищеварительного тракта. Это сопровождается нарушением эпителиального барьера кишечника [408, 528] и поступлением в кровоток микробов и их продуктов [308].
Повышение проницаемости кишечника обусловлено прямым деструктивным действием ВИЧ на кишечный эпителий [427] с последующим развитием воспаления и тканевого ремоделирования [542]. Еще одна причина патологических изменений эпителиального барьера – дефицит лимфоцитов, продуцирующих IL-17 и IL-22, необходимых для поддержания целостности эпителиальной выстилки [208, 307]. Оценка нарушенной проницаемости кишечника может быть проведена после перорального назначения какого-либо инертного соединения путем определения его концентрации в моче [464, 606]. Однако обычно для этой цели используют определение в крови или моче кишечного протеина, связывающего жирные кислоты (intestinal fatty acid binding protein – I-FABP) [219, 455]. I-FABP синтезируется в энтероцитах кишечника. Его концентрация в крови возрастает при повреждении слизистой пищеварительного тракта [291]. Еще один подход, используемый для определения состояния барьерной функции кишечника, опирается на измерение в кровотоке содержания различных микробных компонентов: липополисахарида (LPS) [77], рибосомальной 16S ДНК [638], флагеллина [567].
Открытие роли микробной транслокации в активации иммунной системы произошло относительно недавно [66, 153, 367]. Вслед за этим появились публикации о том, что уровни LPS и свободного макрофагального рецептора CD14 (sCD14: способен связывать LPS) в крови ВИЧ-инфицированных пациентов могут быть использованы для прогноза развития заболевания и смертности [340, 368, 513]. Недавно на большой когорте ВИЧ-инфицированных пациентов, не получавших АРТ, были продемонстрированы ассоциативные связи между показателями LPS-зависимой активации иммунитета и уровнями в крови маркеров кишечного повреждения [457]. При этом зависимости между активацией иммунной системы и концентрацией вируса в крови обнаружено не было. Данные других исследователей, полученные при изучении индуцированной бактериями иммунной активации у больных с полностью подавленной вирусной нагрузкой, также подтверждают ее независимость от содержания ВИЧ в крови [281, 367. 370]. Предполагается, что активация иммунитета реализуется через Toll-подобные рецепторы (TLR) [72, 185, 439].
Активация T-клеток
Исследование активации T-лимфоцитов у пациентов с ВИЧ/ВГС коинфекцией показало, что доля как CD4+, так и CD8+ T-клеток, несущих одновременно на своей поверхности маркеры CD38 и HLA-DR, существенно превышает соответствующие показатели неинфицированных субъектов (рисунок 3.1). При этом следует отметить, что уровень активации T-лимфоцитов у ВИЧ моноинфицированных больных также был выше по сравнению с таковым у людей без инфекции.
Сравнение содержания активированных CD4+ T-клеток в группах ВИЧ+ВГС+ и ВИЧ+ВГС– не выявило существенных различий. В то же время, активация CD8+ T-лимфоцитов при ВИЧ/ВГС коинфекции статистически значимо превышала данный показатель при ВИЧ моноинфекции. И у коинфицированных, и у моноинфицированных пациентов CD8+ T-клетки были активированы в большей степени, чем CD4+ T-лимфоциты.
Ранее было отмечено, что феномен иммунной активации при ВИЧ инфекции является весомым негативным прогностическим фактором, а неблагоприятный прогноз развития заболевания связан как с активацией CD4+, так и CD8+ T-клеток. Исходя из того, что у всех обследованных нами пациентов репликация ВИЧ была полностью подавлена, мы не могли определить его влияние на активацию T-лимфоцитов. Исследование зависимостей активации CD4+ и CD8+ T-клеток от концентрации ВГС в крови коинфицированных пациентов не обнаружило значимых корреляционных связей. Вместе с тем, мы попытались оценить роль микробной транслокации и пролиферации в индукции активации T-лимфоцитов. Для понимания отрицательного значения этого явления у ВИЧ-инфицированных субъектов, коинфицированных ВГС, нами был также проведен анализ зависимостей развития состояния истощения и старения иммунокомпетентных клеток от активации T-клеток. Кроме того, мы исследовали влияние активации на экспрессию таких важных для функционирования T-лимфоцитов структур, как CD28 и IL-7R.
Деструкция интестинального эпителия оценивалась по уровню I-FABP в крови. В результате было установлено, что у ВИЧ/ВГС коинфицированных и ВИЧ моноинфицированных пациентов имеется нарушение кишечного барьера (рисунок 3.2а), следствием чего является повышенное поступление микробов и их продуктов в кровоток. Анализ зависимости активации T-клеток больных от уровня разрушения кишечного эпителия выявил следующее (рисунок 3.2б). У субъектов с ВИЧ моноинфекцией содержание CD4+ и CD8+ T-лимфоцитов, экспрессирующих CD38 и HLA-DR, прямо и статистически значимо коррелировало с концентрацией I-FABP в плазме крови. У ВИЧ/ВГС коинфицированных пациентов аналогичная зависимость была установлена только для CD4+ T-клеток. Активация их CD8+ T-лимфоцитов не зависела от транслокации бактерий и микробных компонентов в кровь. Исходя из того, что степень активации CD8+ T-клеток в группе ВИЧ+/ВГС+ была выше, чем в группе ВИЧ+/ВГС–, можно предположить, что у коинфицированных индивидуумов эти клетки находятся под воздействием других более сильных факторов. Скорее всего, главным из этих факторов является индуцированный ВГС инфекционный процесс.
Важным компонентом, необходимым для участия иммунокомпетентных клеток в ответе на антиген, является процесс пролиферации. Исследование зависимости активации T-лимфоцитов от уровня их пролиферации показало, что при ВИЧ/ВГС коинфекции состояние активации и CD4+, и CD8+ T-клеток имеет выраженную прямую связь с процессом клеточного деления (рисунок 3.3) У ВИЧ моноинфицированных больных такая зависимость была установлена только для CD4+ T-лимфоцитов. Она была менее выражена, чем при ВИЧ/ВГС коинфекции. Связь активации CD8+ T-клеток с их пролиферацией у пациентов с ВИЧ моноинфекцией не обнаружена. Полученные результаты подтверждают выдвинутое выше предположение о том, что в основе активации CD8+ T-лимфоцитов при ВИЧ/ВГС коинфекции лежит обусловленный ВГС инфекционный процесс, важной составляющей в котором является пролиферация CD8+ T-клеток. Таким образом, на основе приведенных данных можно заключить, что пациенты с ВИЧ/ВГС коинфекцией и ВИЧ моноинфекцией отличаются по степени активации CD8+ T-лимфоцитов. В условиях подавления репликации ВИЧ причиной их активации у моноинфицированных субъектов является микробная транслокация, у коинфицированных – реакция на заражение ВГС.
Корецепторная молекула CD28 имеет важное значение в реализации иммунного ответа T-лимфоцитов [54, 152]. Взаимодействуя с CD80 и CD86 антигенпрезентирующих клеток, CD28 проводит в T-клетку дополнительный к импульсу, идущему от TCR, стимулирующий сигнал.
Это сопровождается запуском продукции IL-2, экспрессией генов выживания и индукцией пролиферации. Отсюда, оценивая негативную роль иммунной активации при ВИЧ-инфекции, нам представлялось важным исследовать ее связь с наличием на мембране T-лимфоцитов молекулы CD28. Проведенный корреляционный анализ показал (рисунок 3.4), что между активацией T-клеток и экспрессией CD28 существует обратная зависимость. Она реализовалась как при ВИЧ моноинфекции, так и при ВИЧ/ВГС коинфекции и была свойственна как CD4+, так и CD8+ T-лимфоцитам. Эти результаты свидетельствуют о том, что хроническая активация иммунитета у ВИЧ-инфицированных пациентов приводит нарушению способности иммунокомпетентных клеток эффективно отвечать на антиген. ВГС коинфекция не вносит существенных изменений в установленную зависимость.
Другой важной структурой мембраны, обеспечивающей выживание T-клеток, является рецептор к IL-7 [79]. Исходя из этого, информация о зависимости экспрессии IL-7R от уровня активации T-лимфоцитов может быть исключительно полезной для оценки негативной роли активации при ВИЧ-инфекции. Исследование связи экспрессии маркеров активации с присутствием на мембране IL-7R выявило обратную зависимость между этими показателями у ВИЧ-инфицированных субъектов (рисунок 3.5).
Установленная закономерность проявлялась у всех пациентов с ВИЧ инфекцией независимо от того, были они коинфицированы ВГС или нет.
Следует также отметить, что она реализовалась как на CD4+, так и на CD8+ T-клетках. Таким образом, можно заключить, что активация T-лимфоцитов при ВИЧ-инфекции оказывает отрицательное влияние на гомеостатический механизм поддержания их жизнеспособности.
Отсутствие сигнала с IL-7R особенно пагубно отражается на наивных T-клетках, приводя к их массовой гибели [525, 628].
T-лимфоциты лимфатических узлов
Известно, что 98% лимфоцитов в организме человека находится в лимфоидных органах [191, 582]. Циркулирующие кровь и лимфа обеспечивают клеткам перемещение между лимфоидными органами, а также между лимфоидными структурами и тканями. Т.е. присутствие лимфоцита в крови является краткосрочным транзиторным состоянием. Соответственно, изменение состава иммунокомпетентных клеток крови не всегда объективно отражает иммунный статус организма.
Исходя из вышесказанного, представлялось весьма актуальным оценить состояние CD4+ и CD8+ субпопуляций T-лимфоцитов лимфатических узлов у пациентов с ВИЧ/ВГС коинфекцией и провести сопоставление выявленных изменений с теми, которые были выявлены в крови. Кроме того, эффективность функционирования любого органа зависит от состояния его структуры. Понимание этого потребовало проведения морфологических и иммуноморфологических исследований л/узлов. Здесь необходимо отметить, что иммунофенотипическое исследование лимфоидных органов имеет свою специфику. В отличие от крови, в которой можно рассчитать численность конкретных клеток в определенном объеме, при работе с лимфоидными образованиями можно получить только относительные показатели. Например, у одного индивидуума лимфатические узлы могут сильно различаться по размерам и учет общего количества клеток в конкретном органе теряет смысл. Что касается исследования функциональных маркеров лимфоцитов, то, как правило, и в крови, и в лимфоидных структурах обычно ведется учет относительных параметров и с этих позиций можно достаточно объективно провести их сопоставление. Еще одним ограничением становится объединение морфологических данных с иммуноцитометрией. Гистологическая обработка препаратов (фиксация, окраска) резко сокращает возможности иммунохимического типирования. С другой стороны, проточная цитометрия с использованием флуоресцирующих антител позволяет достаточно эффективно дифференцировать клетки, но лишает возможности соотнести полученные результаты со структурными изменениями в ткани. В связи с приведенными выше методическими препятствиями мы применили оба подхода. Часть ткани лимфатического узла была использована для гистологических и гистоиммунохимических исследований, а из другой части выделяли клетки и подвергали их цитофлуориметрическому анализу.
Исследование уровней основных субпопуляций T-клеток л/узлов (наивных лимфоцитов, клеток центральной и эффекторной памяти) показало (рисунок 4.13), что в лимфоидных органах ВИЧ/ВГС коинфицированных пациентов, как и в их крови, отмечается сниженное по сравнению с ВИЧ моноинфицированными субъектами содержание наивных CD4+ T-лимфоцитов. При этом оно находилось ниже значения соответствующего показателя, установленного у людей без инфекции. Кроме того, при сочетанной инфекции было установлено повышение доли CD4+ T-клеток эффекторной памяти. Доля CD8+ T-клеток среди лимфоцитов л/узлов в обеих выборках ВИЧ-инфицированных индивидуумов оказалась повышенной (рисунок 4.14), а в группе ВИЧ+/ВГС+ она была максимальной. У ВИЧ/ВГС коинфицированных пациентов также зарегистрирован существенный дефицит наивных CD8+ T-лимфоцитов и рост содержания CD8+ T-клеток эффекторной памяти.
Представленные результаты полностью совпадают с данными, полученными нами при исследовании субпопуляционного состава CD4+ и CD8+ T-лимфоцитов периферической крови. Исходя из этого, можно заключить, что более глубокий дефицит наивных CD4+ T-клеток и увеличение численности CD8+ T-лимфоцитов эффекторной памяти у ВИЧ/ВГС коинфицированных пациентов по сравнению с ВИЧ моноинфицированными субъектами является не локальным явлением, а отражением состояния всей иммунной системы организма.
Причиной снижения уровня наивных клеток в лимфатических узлах при ВИЧ/ВГС коинфекции может быть их апоптоз. Однако исследование экспрессии этими клетками антиапоптотического фактора Bcl-2 показало, что как среди CD4+, так и среди CD8+ наивных T-лимфоцитов доля клеток, несущих данный маркер, составляет более 98%. То же самое было установлено для наивных CD4+ и CD8+ T-лимфоцитов, полученных из лимфоузлов пациентов с ВИЧ моноинфекцией. Что касается клеток центральной и эффекторной памяти, то необходимо отметить, что Bcl-2 позитивных элементов в этих субпопуляциях было существенно меньше.
Особенно выделяются CD8+ T-клетки эффекторной памяти. В группе ВИЧ+/ВГС+ менее 90% этих элементов содержали антиапоптотический фактор. Другой причиной дефицита наивных T-клеток у коинфицированных субъектов может быть нарушение процесса их самоподдержания – гомеостатической пролиферации. Ранее проведенные нами на клетках крови исследования показали, что как у здоровых, так и ВИЧ-инфицированных индивидуумов из всех субпопуляций T лимфоцитов наивные клетки обладают наименьшей пролиферативной 111 активностью. Однако в лимфоузлах ситуация оказалась иной. Уровни пролиферации наивных CD4+ и CD8+ T-клеток при ВИЧ-инфекции и при ВИЧ/ВГС коинфекции были значительно выше, чем в крови (рисунок 4.15; рисунок 4.16) и статистически не отличались от соответствующих показателей носителей иммунологической памяти. Высокая пролиферативная активность наивных T-лимфоцитов в лимфатическом узле, вместе с тем, не может быть однозначно интерпретирована как отражение гомеостатической пролиферации. Исследование уровня пролиферации этих клеток в л/узлах неинфицированных людей также 67+ T- продемонстрировало их высокую митотическую активность (медиана наивных CD4+Ki-лимфоцитов превышала 4%, а наивных CD8+Ki-67+ T-клеток – 7%), что не позволяет исключить реакцию на другой (отличный от ВИЧ и ВГС) антиген. Следует также отметить, что в крови среди элементов с фенотипом наивных CD4+ T-лимфоцитов присутствуют наивные Treg, которые значительно интенсивнее (более чем в 10 раз) пролиферируют по сравнению с другими наивными CD4+ T-клетками; в лимфоидных органах темпы митозов наивных Treg еще выше ( в 4 раза) [538].
T-клетки лимфатических узлов
При оценке морфологических и иммуногистохимических параметров лимфатических узлов у ВИЧ инфицированных пациентов нами были выявлены существенные нарушения в структуре лимфоидных органов. При этом не удалось обнаружить выраженного влияния ВГС коинфекции на изменения, вызванные ВИЧ-инфекцией. То же самое можно сказать и о проявлении дискордантного ответа на АРТ: гистологическая картина иммунологических респондеров и нонреспондеров не имела явных различий. Однако проведение цитофлуориметрических исследований клеток лимфатических узлов позволило установить ряд особенностей, которые характеризуют нарушение процессов регенерации CD4+ T-лимфоцитов, как у ВИЧ/ВГС коинфицированных, так и у ВИЧ моноинфицированных субъектов.
Известно, что во время ВИЧ-инфекции множество клеток погибает без инфицирования после процесса активации, который усиливает экспрессию на их мембранах рецепторов и лигандов TNF-семейства [471]. Одним из основных рецепторов, определяющих гибель клетки является Fas (CD95). В его составе содержится домен смерти и после взаимодействия со своим лигандом (FasL) данный рецептор может индуцировать внутриклеточный сигнальный каскад, который приводит к запуску апоптоза [6]. Исследование, проведенное на T-лимфоцитах крови, показало, что нарушение регенерации CD4+ T-клеток после назначения АРТ может характеризоваться повышением уровня апоптоза CD4+ T-лимфоцитов. Но это наблюдается только у ВИЧ моноинфицированных пациентов. При ВИЧ/ВГС коинфекции дискордантный ответ на терапию не сопровождается усилением программной гибели CD4+ T-клеток. В то же время, и у ВИЧ моноинфицированных, и у ВИЧ/ВГС коинфицированных лиц в лимфатических узлах было отмечено широкое распространение апоптотических процессов. Исходя из этих сведений, нами было проведено определение экспрессии CD95 на клетках лимфатических узлов для оценки роли этого рецептора в формировании дефицита CD4+ T-лимфоцитов. В результате были получены следующие данные (рисунок 5.27). У ВИЧ/ВГС коинфицированных пациентов со стандартной реакцией на лечение доля Fas-позитивных CD4+ T-клеток была статистически значимо выше, чем у ВИЧ моноинфицированных субъектов, с эффективным восстановлением иммунитета после приема АРТ. Рассмотрение уровня экспрессии CD95 по субпопуляциям CD4+ T-лимфоцитов показало, что наиболее существенные различия между подгруппами «ВИЧ+ВГС+ Ответ» и «ВИЧ+ВГС– Ответ» наблюдались среди клеток памяти (как центральной, так и эффекторной). Соответствующие сдвиги были менее выраженными при сравнении терминальных эффекторов, а влияние гепатита C на содержание наивных CD4+CD95+ T-клеток оказалось статистически не валидным. Сравнение подгрупп «ВИЧ+ВГС+ Ответ» и «ВИЧ+ВГС+ Неответ» не выявило значимых отличий по уровню CD4+CD95+ T-лимфоцитов в лимфоузлах (данные не приводятся). Вместе с тем, у ВИЧ моноинфицированных лиц развитие дискордантного ответа на лечение сопровождалось усилением экспрессии CD95 на CD4+ T-клетках (рисунок 5.28). Эффект реализовался на клетках памяти и терминальных эффекторах. Здесь важно отметить, что доля Fas-позитивных элементов среди CD4+ T-лимфоцитов памяти превышает 85%, а среди CD4+ терминальных эффекторов и наивных CD4+ T-клеток в 2-3 ниже. Столь высокое их содержание в пуле лимфоцитов памяти говорит о том, что клетка, несущая CD95, хоть и может подвергнуться апоптозу после взаимодействия с другой FasL+ клеткой, но совершенно необязательно, что такой контакт должен привести к ее смерти. Т.е. маркер CD95 не является фатальным индикатором программной гибели клетки. Данное положение подтверждается также уровнем экспрессии Fas на лимфоцитах лимфатических узлов неинфицированных индивидуумов: среди клеток памяти доля CD95 позитивных элементов обычно у них составляет около 90%. Естественно, возникает вопрос: если сигнал через Fas не всегда вызывает апоптоз, то какие еще клеточные акты он может индуцировать? К настоящему времени установлено, что «Fas-FasL» взаимодействие способно приводить к активации транскрипции провоспалительных генов, запуску, пролиферации и дифференцировки клетки, стимуляции ее миграции [537]. Таким образом, присутствие CD95 на поверхности клетки свидетельствует не столько о ее предрасположенности к гибели, сколько демонстрирует ее активированное состояние. Кроме того, было обнаружено, что T-лимфоциты с фенотипом наивных клеток, экспрессирующие CD95, трансформируются в стволовые клетки памяти [171, 194].
Исследование содержания Fas-позитивных элементов среди CD8+ T клеток лимфатических узлов, полученных от ВИЧ/ВГС коинфицированных пациентов, полноценно отвечающих на АРТ, не выявило отличий от соответствующего показателя ВИЧ моноинфицированных субъектов со стандартной реакцией на лечение (рисунок 5.29). Однако при рассмотрении субпопуляций CD8+ T лимфоцитов было установлено, что наличие гепатита C вызывает статистически значимое повышение доли экспрессирующих CD95 наивных CD8+ T-клеток (стволовые клетки памяти) и CD8+ T-лимфоцитов центральной памяти. Сравнение между собой ВИЧ/ВГС коинфицированных респондеров и нонреспондеров не обнаружило существенных различий в содержании CD95-позитивных элементов ни в общей популяции CD8+ T-клеток, ни в отдельных их субпопуляциях (данные не представлены). В то же время, при ВИЧ моноинфекции у лиц с дискордантным ответом на терапию доля лимфоцитов, экспрессирующих Fas, была повышена во всех субпопуляциях CD8+ T-клеток относительно соответствующих значений в подгруппе «ВИЧ+ВГС– Ответ» (рисунок 5.30). Полученные результаты демонстрируют влияние двух факторов, повышающих содержание CD95-несущих элементов среди CD4+ и CD8+ T-лимфоцитов лимфатических узлов при ВИЧ-инфекции. Это может быть, как ВГС коинфекция, так и нарушение регенерации иммунитета на фоне АРТ. Действие обоих факторов не дает суммации эффектов. При этом главной мишенью воздействия являются клетки памяти.