Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1 Современное представление о специфической сенсибилизации при инфекции и методах ее выявления (обзор литературы) 14
1.1 Бруцеллез, значение аллергии в патогенезе болезни 14-19
1.2 Современное состояние проблемы гуморально- и клеточно-опосредованной сенсибилизации организма, обусловленной инфекцией 20-28
1.3 Современные методы определения сенсибилизации организма in vivo и in vitro 29-35
Собственные исследования
Глава 2 Материалы и методы исследования 36-39
2.1 Материалы исследования 36-37
2.2 Методы исследования 37-39
ГЛАВА 3 Комплексная оценка интенсивности специфической сенсибилизации организма приостром бруцеллезе 40
3.1 Разработка метода количественного учета степени IgE-зависимой специфической сенсибилизации при остром бруцеллезе 40-47
3.2 Разработка метода учета интенсивности лимфоцит-опосредованной специфической сенсибилизации при остром бруцеллезе 48-56
ГЛАВА 4 Анализ связи интенсивности специфической сенсибилизации с компенсаторными и патологическими изменениями в системе иммунитета у больных острым бруцеллезом 57
4.1 Изучение особенности активации базофилов при взаимодействии in vitro с антигенами бруцелл 57-59
4.2 Определение реактивности сенсибилизированных лимфоцитов при взаимодействии in vitro с антигенами бруцелл 60-62
4.3 Изучение корреляции интенсивности реагин- и клеточно обусловленной сенсибилизации с компенсаторными и патологическими изменениями в иммунном статусе у больных острым бруцеллезом 63-64
4.3.1 Выявление связи степени IgE-опосредованной специфической сенсибилизации с нарушениями в иммунном статусе у больных острым бруцеллезом 64-74
4.3.2 Выявление связи интенсивности лимфоцит-зависимой специфической сенсибилизации с изменениями в иммунном статусе у больных острым бруцеллезом 75-82
Обсуждение результатов и заключение 83-92
Выводы 93
Практические рекомендации 94
Список литературы 95-1
- Современное состояние проблемы гуморально- и клеточно-опосредованной сенсибилизации организма, обусловленной инфекцией
- Методы исследования
- Разработка метода учета интенсивности лимфоцит-опосредованной специфической сенсибилизации при остром бруцеллезе
- Изучение корреляции интенсивности реагин- и клеточно обусловленной сенсибилизации с компенсаторными и патологическими изменениями в иммунном статусе у больных острым бруцеллезом
Введение к работе
Актуальность темы исследования. Бруцеллез – инфекционное, особо опасное зоонозное заболевание, вызываемое бактериями рода Brucella. Бруцеллы не имеют классических факторов вирулентности, действующих подобно токсинам, приводящим к прямому повреждению клеток хозяина (Кулаков Ю. К., 2016; Wattam A. R. еt al., 2014; O' Callaghan D. еt al., 2011), для бруцелл характерно индуцирование супрессии системы врожденного иммунитета у больных (Barquero-Calvo E. еt al., 2007; Martirosyan A. еt al., 2011; Ben Tekaya H. еt al., 2013). Ключевой фактор па-тогенности бруцелл – IV тип секреторной системы, который способствует внутриклеточному распространению и персистенции бруцелл (Кулаков Ю. К., 2016; Whatmore A. M. еt al., 2014). Ведущий механизм иммунологической защиты от бруцеллеза – клеточно-опосредованный иммунитет, который реализуется через антиген-презентирующих фагоцитов, Th1-клеток и цитотоксических лимфоцитов. Однако эволюционно обусловленная способность бруцелл к длительному эндоцитоби-озу обусловливает устойчивость патогена к факторам врожденного и адаптивного иммунитета. Доказано, что бруцеллы моделируют работу иммунной системы хозяина, провоцируя формирования реакций гиперчувствительности немедленного и замедленного типов (Вершилова П. А., Чернышова М. И., Князева Э. Н., 1974; Barquero-Calvo E. еt al., 2007; De Song M. F., 2010; Smith S. A., 2013; Durward M., 2012; Skendros P., 2013).
Основу сенсибилизации (аллергизации) при бруцеллезе составляют иммунологические реакции, которые, с одной стороны, направлены на защиту организма от воздействия внешних факторов, с другой – часто сопровождаются повреждением клеток и тканей организма (Мелких А. А., 1935; Вершилова П. А. с соавт., 1954; Адо А. Д., 1978; Овсянников В. Г., 1989; Сепиашвили Р. И., 2000; Кирдей Е. Г. с со-авт., 2003; Барсуков В. И. с соавт., 2007; Хаитов Р. М., 2009; Raue H. P. et al., 2013).
Известно, что бактериальная аллергия при бруцеллезе и степень ее интенсивности могут выступать в качестве основного патогенетического фактора при формировании очаговых специфических органных поражений. Метастазирование ин-фекта, в том числе и вторичное, при бруцеллезной инфекции чаще происходит на фоне выраженного ослабления иммунитета (Сиротинин Н. Н., 1961; Здродовский П. Ф., 1969; Вершилова П. А. с соавт., 1954; 1968; 1974; Цирельсон Л. Е. с соавт., 2012; Кашутин С. Л. с соавт., 2013; Chukwu C. C. et al., 1987; Dobracki W. et al., 1991; Almajid F. M. et al., 2011).
Имеются предположения о наличии причинно-следственной связи интенсивности реагин- и клеточно-опосредованной специфической сенсибилизации с изменениями иммунологической резистентности у больных бруцеллезом (Здродовский П. Ф., 1969; Вершилова П. А. 1974;).
В доступной литературе имеются сообщения о разработке in vitro тестов для выявления повышенной чувствительности к патогену, основанных на антигенной (аллергенной) активации лейкоцитов (Дубровина В. И. с соавт., 2008; Кашутин С. Л. с соавт., 2013; Laudat P. et al., 1993; Weynants V. et al., 1995; Almajid F. M. et al., 2011). Взаимодействие специфического антигена с антигенраспознающими рецепторами клеток инициирует их активацию, которая может сопровождаться экспрес-
сией маркеров активации, синтезом биологически активных веществ, морфологической и иммунофенотипической трансформацией, что указывает на сенсибилизацию организма (De Weck A. L. et al., 2010; Siracusa M. C. et al., 2010; Деркач М. И. с со-авт., 2013). Наиболее перспективные объекты исследования для выявления гуморально- и клеточно-опосредованной сенсибилизации – базофилы и лимфоциты (Sainte-Laudu et al., 1994; De Weck A. L. et al., 2010; Джаманова Г. И., 2007; Уханова О. П., 2010).
Несмотря на длительную историю изучения бруцеллеза, проблема индивидуальной специфической гиперчувствительности при инфекции требует дальнейшего исследования. Одна из причин этого – отсутствие точного и пригодного для практического внедрения метода количественного определения интенсивности клеточ-но- и гуморально-обусловленной специфической сенсибилизации организма, позволяющего оценить степень компенсаторных и патологических изменений при бруцеллезе.
Комплексный анализ специфической сенсибилизации организма при бруцеллезе, реализуемой гуморальными и клеточными факторами иммунитета, с применением модифицированных методов количественной оценки позволит выявить связь интенсивности специфической сенсибилизации с изменениями в иммунном статусе у больных бруцеллезом.
Таким образом, разработка методов количественной оценки интенсивности специфической сенсибилизации и изучение связи степени аллергизации с изменениями в иммунном статусе при бруцеллезной инфекции являются актуальной задачей, которая позволит количественно оценить параметры иммунобиологической реактивности у больных бруцеллезом
Степень разработанности темы исследования. Отечественные ученые Здродовский П. Ф. (1969), Вершилова П. А. с соавт., (1954; 1963; 1970; 1974), Чали-сов И. А. (1939), Беклемишев Н. Д. (1968) одни из первых подробно описали особенности специфических аллергических реакций при бруцеллезе. На сегодняшний день имеются сведения о формировании у больных бруцеллезом выраженного им-муносупрессивного состояния (Тавасиева Э. В., 2008; Нурпейсова А. Х., 2009; Skendros Р. еt al., 2013). Однако некоторые аспекты бактериальной аллергии при бруцеллезе требуют дальнейшего изучения, в частности выявление уровня корреляции интенсивности IgE- и лимфоцит-зависимой специфической сенсибилизации с изменениями показателей иммунного статуса у больных бруцеллезом.
Опираясь на существующие знания о роли базофилов в развитии аллергических реакций немедленного типа, J. Sainte-Laudu (1994) и A. L. De Weck et (2010) разработали метод in vitro аллергодиагностики в проточно-цитометрическом формате, который позволяет выявлять у людей IgE-обусловленную аллергию на различные лекарства, продукты питания и пищевые добавки, бытовую химию, яды насекомых, однако, тест не адаптирован для диагностики бактериальной аллергии.
Учитывая, что лимфоциты выполняют основную функцию в реализации явле
ний гиперчувствительности замедленного типа в организме D. Hungerford с соавт.
(1959) и P. Nowell (1960) разработали реакцию бласт-трансформации лимфоцитов
(РБТЛ), которая позволяет оценить степень выраженности клеточно-
опосредованной сенсибилизации организма.
С целью получения объективных количественных данных об интенсивности специфической сенсибилизации при бруцеллезе необходима разработка методов, позволяющих изучить вопросы обусловленности и связи уровня сенсибилизации с патологическими изменениями в иммунном статусе у больных бруцеллезом.
Цель исследования: разработать и усовершенствовать методы количественной оценки интенсивности специфической сенсибилизации, изучить связь степени аллергизации с изменениями в иммунном статусе у больных бруцеллезом.
Задачи исследования:
-
Изучить качественные характеристики интенсивности активации базофилов у больных острым бруцеллезом при взаимодействии in vitro с антигенами бруцелл.
-
Оценить реактивность сенсибилизированных лимфоцитов у больных острым бруцеллезом в антиген-стимулированных реакциях in vitro.
-
Разработать комплексный, информативный методический подход для количественной оценки интенсивности специфической сенсибилизации у больных острым бруцеллезом, основанный на технологии проточной цитофлуориметрии.
-
Провести комплексную оценку степени сенсибилизации организма при остром бруцеллезе на основе антигенспецифической активации лейкоцитов.
-
Установить связь интенсивности реагин- и клеточно-опосредованной сенсибилизации с изменениями в иммунном статусе у больных острым бруцеллезом и на основании комплексного анализа степени сенсибилизации определить значение интенсивности IgE- и лимфоцит-обусловленной сенсибилизации в патогенезе бруцеллеза.
Научная новизна исследования:
Впервые выявлена связь степени интенсивности реагин- и клеточно-опосредованной специфической сенсибилизации с формированием у больных острым бруцеллезом иммуносупрессивного состояния. Установлено, что, чем выше уровень IgE-зависимой и ниже – лимфоцит-обусловленной гиперчувствительности, тем более выражены патологические изменения в иммунном статусе.
Предложен методический подход для количественной оценки специфической сенсибилизации у людей больных бруцеллезом, основанный на методе антигенспе-цифической активации клеток in vitro и технологии проточной цитофлуориметрии.
Приоритетность полученных данных подтверждена патентами РФ на изобретения: № 2574207 «Способ дифференциации поствакцинного и инфекционного бруцеллезного процессов по степени повышенной чувствительности организма к бруцеллам в условиях in vitro» и № 2582395 «Способ оценки реакции бласттранс-формации лимфоцитов (РБТЛ) методом проточной цитометрии при специфической активации антигеном».
Теоретическая и практическая значимость работы. Теоретическая значимость работы заключается в получении новых знаний о влиянии интенсивности IgE-и лимфоцит-зависимой сенсибилизации на показатели иммунного статуса у больных бруцеллезом.
В результате выполнения исследований разработан методический подход для количественной оценки степени специфической реагин-опосредованной сенсибилизации при бруцеллезе, который можно применять для экспресс-диагностики (аллер-годиагностики) бруцеллеза iv vitro.
Усовершенствован метод количественного учета интенсивности специфической клеточно-опосредованной сенсибилизации при бруцеллезе.
Материалы проведенных исследований использованы при разработке следующей нормативно-методической документации:
-
«Методические рекомендации по оценке in vitro степени аллергизации организма людей бруцеллезным и сибиреязвенным антигеном». Одобрены ученым советом и утверждены директором ФКУЗ Ставропольский противочумный институт Ро-спотребнадзора от 13.12.2013 г.
-
«Применение проточной цитометрии для оценки степени аллергизации и напряженности иммунитета у лиц, подлежащих вакцинации/ревакцинации против бруцеллеза». Одобрены ученым советом и утверждены директором ФКУЗ Ставропольский противочумный институт Роспотребнадзора от 28.08.2014 г.
Результаты работы используются в лекционном материале для слушателей, функционирующих при ФКУЗ Ставропольский противочумный институт Роспо-требнадзора курсов профессиональной переподготовки по программе «Бактериология. Инфекционные болезни, требующие проведения мероприятий по санитарной охране территории Российской Федерации» и «Эпидемиология. Инфекционные болезни, требующие проведения мероприятий по санитарной охране территории Российской Федерации».
Положения, выносимые на защиту:
-
Разработан методический подход к комплексной оценке степени специфической сенсибилизации, позволяющий проводить лабораторную диагностику бруцеллеза и количественно определять уровень интенсивности специфической реагин- и лимфоцит-зависимой аллергизации.
-
Степень интенсивности IgE-обусловленной аллергизации у больных острым бруцеллезом имеет прямую связь с формированием иммуносупрессивного состояния.
-
Повышение уровня лимфоцит-опосредованной специфической сенсибилизации при остром бруцеллезе имеет обратную связь с выраженностью патологических изменений в иммунном статусе.
Личный вклад автора в получении научных результатов. Полученные в работе данные являются результатом экспериментальных исследований, выполненных самостоятельно диссертантом. Автором проведен патентно-информационный поиск, анализ актуальности и степени изученности проблемы, определены направления исследований, цель и задачи диссертационной работы, методологические подходы, в соответствии с которыми применены методики.
Выбор и разработка эффективных методов для решения поставленных задач осуществлялись автором совместно с кандидатом биологических наук Пономаренко Д. Г.
Автором в полном объеме выполнены все клинико-лабораторные исследования, первичная подготовка к исследованию биоматериала, анализ и систематизация полученных результатов, их статистическая обработка, разработаны основные положения диссертации, обоснованы и сформулированы научные выводы.
Степень достоверности и апробация результатов. Высокая степень достоверности результатов проведенных исследований подтверждается использованием
современного, поверенного и сертифицированного оборудования с привлечением статистических методов обработки данных.
Разработанный метод in vitro аллергодиагностики бруцеллеза с использованием проточной цитофлуориметрии внедрен в работу отделения по диагностике, лечению и экспертизе профпатологии бруцеллеза ГБУЗ СК «Городская клиническая больница № 2» г. Ставрополя (Акт внедрения от 28. 10. 2016 г.).
Материалы диссертации докладывались и обсуждались на научных конференциях:
-
Региональной научно-практической конференции молодых ученых «Актуальные проблемы эпидемиологии, микробиологии и паразитологии» (Ставрополь, 2013);
-
Региональной научно-практической конференции с международным участием «Актуальные вопросы обеспечения санитарно-эпидемиологического благополучия в Причерноморском регионе» (Ставрополь, 2013);
-
VI Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых и специалистов Роспотребнадзора «Актуальные проблемы эпидемиологии и профилактической медицины» (Ставрополь, 2014);
-
VII Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых и специалистов Роспотребнадзора «» (Санкт-Петербург, 2015);
-
(Москва, 2015);
-
Региональной научно-практической конференции «Инновационные идеи молодежи Ставропольского края – развитию экономики России», аккредитованной в рамках программы Федерального фонда содействия развитию малых форм предприятий в научно-технической сфере «Участник молодежного научно-инновационного конкурса» («УМНИК») в 2015 году, (Ставрополь, 2015);
-
II Российском конгрессе лабораторной медицины (Москва, 2016);
-
III Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Социально-значимые и особо опасные инфекционные заболевания» (Сочи, 2016).
Апробация диссертации состоялась на межлабораторной конференции ФКУЗ Ставропольский противочумный институт Роспотребнадзора, протокол № 1 от 14 июля 2016 г.
Публикации. Основное содержание диссертационной работы отражено в 21 опубликованной работе, 4 из них – в изданиях, рекомендованных Высшей аттестационной комиссией при Министерстве образования и науки Российской Федерации, 1 статья – в зарубежном реферируемом журнале, 16 публикаций – в сборниках научных трудов, материалах научных и научно-практических конференций.
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 117 страницах компьютерного текста, содержит 10 таблиц и 17 рисунков, состоит из введения, обзора литературы, 3 глав собственных исследований, включающих описание материалов и методов исследований, и глав с изложением результатов исследования, заключения, выводов, практических рекомендаций. Список литературы включает 224 источника, из них – 120 отечественных и 104 зарубежных.
Современное состояние проблемы гуморально- и клеточно-опосредованной сенсибилизации организма, обусловленной инфекцией
Феномен сенсибилизации начал активно изучаться с конца XIX века; в начале XXI века этот тип иммунной реакции стал объектом интенсивных научных исследований de novo (Пацула Ю. И., 2000; Yаvuz T. A. еt al., 2004; Almajid F. M. еt al., 2011; Bosque A. et al., 2011; Engler J. B. еt al., 2011; Daenthanasanmak et al., 2012; Wensveen F. M. et al., 2012; Al-Attiyah R. еt al., 2012; Raue H. P. et al., 2013).
Основными направлениями в области изучения закономерностей взаимодействия антигенов с иммунокомпетентными клетками, разработки методов, и подходов к оценке результатов антигенной стимуляции клеток in vitro в настоящее время являются: – выявление «продуктов» (доказательств) непосредственной реакции между клеткой и антигеном; – изучение специфических морфофункциональных изменений клеток иммунной системы; – определение медиаторов иммунного ответа при воспалительной реакции как проявление реакций между клеткой-мишенью и антигеном; – выявление признаков специфического воздействия клеток-эффекторов на антигенсодержащие клетки (Борисов А. Г. с соавт., 2008; Галактионов В. Г., 2009; Луговская С. А. с соавт., 2009).
В результате взаимодействия организма с аллергенами (антигенами) возникает сенсибилизация – повышенная специфическая чувствительность, которая используется в лабораторной диагностике как маркер, указывающий на имеюшийся контакт организма с чужеродными субстанциями (Галактионов В. Г., 2009; Gamboa P. M. еt al., 2009). Иммунитет при ряде инфекций, например, при бруцеллезе, не может формироваться без аллергических реакций. Степень сенсибилизации организма может выступать как показатель повышенной реактивности иммунной системы, устойчивости к данной инфекции (Тайгибова А. Г. с соавт., 2010; Campos М. et al., 2004; Kinikli S. еt al., 2005). Анализ литературы показал, что перспективным объектом исследования для выявления степени сенсибилизации организма in vitro являются базофилы, которые играют центральную роль в реакциях гиперчувствительности немедленного типа.
Базофильные гранулоциты, или базофилы представляют собой популяцию лейкоцитов периферической крови (0,5-1 % всех лейкоцитов), содержащих цитоплазматические гранулы, которые окрашиваются основными красителями. В состав цитоплазматических гранул входят пероксидаза, гистамин, медиаторы воспаления и другие вещества, выброс которых в месте активации вызывает развитие аллергических реакций немедленного типа. Как и другие лейкоциты, они могут покидать кровоток, но их способность к амебоидному движению ограничена. Образуются в костном мозге, после чего попадают в кровь, где циркулируют несколько часов. Из крови они мигрируют в ткани и находятся там 8–12 дней. Подобно тучным клеткам, базофильные гранулоциты имеют высокоаффинные рецепторы, перекрестная сшивка которых соответствующими антигенами (аллергенами) приводит к дегрануляции и высвобождению множества медиаторов, общих для обеих клеточных линий. Эти реакции приводят также к синтезу и секреции лейкотриенов, цитокинов, медиаторов воспаления, вызывающих симптомы аллергии (Базанов Г. А., 2009; Уханова О. П., 2009, 2010; Schroeder J. T. et al., 2011; Pignatti P. еt al., 2011).
Базофилы являются одними из важных эффекторных и иммунорегуляторных клеток, селективно мигрирующих в очаг аллергического воспаления в барьерных тканях (Moreno-Lafont M. G. еt al., 2003).
Продолжительное время работы по локализации и анализу данной клеточной популяции находились вне области применения проточной цитометрии, что было связано с незначительным содержанием этих клеток в периферической крови (до 0,5 %). Однако существует целый ряд специфических параметров, которые можно измерить на базофилах. Это, прежде всего мембранный IgE и экспрессия CD63-молекулы. Анализ мембранного IgE представляет достаточно сложную задачу вследствие значительных различий его экспрессии у отдельных индивидуумов. В связи с этим недавно описанные маркеры базофилов заняли важное положение среди используемых параметров для анализа аллергической реакции in vitro – это CD203с и CD294.
Данные последних лет расширили представление о роли базофильных гранулоцитов в аллергических заболеваниях и иммунной защите. Немного известно о регулировании апоптоза в базофилах, которые представляют наименьшую популяцию гранулоцитов, но выполняют важнейшую эффекторную функцию при аллергическом воспалении. Провоспалительная и иммуномодулирующая деятельность базофилов включают выделение гистамина, лейкотриена C4 и синтез ИЛ-4, ИЛ-13, Th2-цитокинов, крайне важных для развития аллергии. Нарушение базофильного апоптоза влияет на продолжительность и тяжесть аллергических заболеваний. ИЛ-3 – единственный цитокин, который способствует ингибированию апоптоза базофилов (Durward M. et al., 2005; Matsumoto K., Maeda A., Bochner B. S., 2008; Feldman K. E. et al., 2013).
Более того, было показано, что стимуляция праймированных ИЛ-3 базофилов компонентом комплемента С5а вызывает многочасовую активацию этих клеток. Активированные клетки продуцируют ИЛ-4 и ИЛ-13, что обостряет течение аллергического воспаления. Данные гранулоциты являются главными продуцентами этих цитокинов при аллергическом воспалении (Akbulut H. еt al., 2007; Matsumoto K., Maeda A., Bochner B. S., 2008; Min B. еt al., 2008; Gwida M. et al., 2010; Gomes E. еt al., 2013).
Способность базофилов к продолжительной продукции лейкотриена С4 и цитокинов обусловливает развитие хронического аллергического воспаления. Отмечено, что костимуляция С5а на фоне действия ИЛ-3 вызывает дегрануляцию базофилов, независимо от активации IgE-рецептора (Matsumoto K. еt al., 2008; Sarrat А. et al., 2013). Это дает основания предполагать важную роль базофилов в неаллергических процессах, вызываемых инфекционными агентами и IgG-иммунными комплексами (Уханова О. П., 2009).
Методы исследования
Анализ данных корреляции выявил прямую связь высокой степени специфической сенсибилизации со снижением относительного количества CD3+ клеток (r = 0,914), CD3+CD4+ лимфоцитов (r = 0,957), повышением уровня IgА (r = 1,01), (p0,01), CD3+CD8+ клеток (r = 0,725), увеличением уровня циркулирующих иммунных комплексов (r = 0,408), (p0,01), в меньшей степени – со снижением иммунорегуляторного индекса (r = 0,215), (p0,1), комплементарной активности сыворотки крови (r = 0,246), (p0,01), количества CD19+ клеток (r = 0,162), (p0,1) и уровня иммуноглобулина G (r = 0,264), (p0,01) и IgM (r = 0,164), (p0,01). Анализ данных выявил прямую слабую связь высокой степени специфической сенсибилизации со снижением фагоцитарной активности нейтрофилов крови (r = 0,291), относительным содержанием субпопуляций CD16++56+ лимфоцитов (r = 0,213), (p0,01), а также обратную связь (r = - 0,482) с повышением функциональной активности нейтрофилов крови, (p0,01).
Сравнительный анализ результатов иммунологического обследования у больных со средней (умеренной) и высокой степенью реагин-обусловленной специфической сенсибилизации (таблица 8), показал, что у обследуемых 3-й группы имеет место снижение относительного содержания лимфоцитов CD3+ – 51,0 ± 1,15 % (p 0,001) и CD3+CD4+ - 25,8 ± 1,7 % (p 0,01), по сравнению с данными второй группы - 82,9 ± 1,16 %, 55,6 ± 0,94 % соответственно, и тенденция к увеличению количества В-лимфоцитов - 12,5 ± 1,2 %, IgM - 1,51 ± 0,15 мг/мл, относительно показателей в группе сравнения - 8,54 ± 0,27 %, 1,42 ± 0,06 мг/мл (р 0,05). При сравнении количества NK-клеток (5,8 ± 0,37 %), показателей фагоцитарной (50,5 ± 2,3 %) и функциональной (19,1 ± 1,3 %) активности нейтрофилов крови, уровня IgA - 4,03 ± 0,17 мг/мл, IgG - 15,5 ± 0,73 мг/мл, ЦИК - 69,8 ± 3,4 Ед, комплементарной активности сыворотки крови - 69,7 ± 2,1 Ед, ИРИ - 0,65 ± 0,86 у.е., по сравнению с иммунологическими данными у больных второй группы - 50,0 ± 1,26 %, 18,42 ± 0,97 %, 4,18 ± 0,41 мг/мл, 15,5 ± 0,81 мг/мл, 64,0 ± 0,92 Ед, 68,75 ± 1,9 Ед и 1,27 ± 0,05 у.е. соответственно, статистически достоверной разницы не выявлено (р 0,1).
Показатели иммуного статуса больных острым бруцеллезом со средней (группа № 2) и высокой (группа № 3) степенью реагин-опосредованной специфической сенсибилизации, (М±т) Показатели, ед. измерения Группа № 2 (п = 56) Группа № 3 (п = 39) Р, уровень достоверности межгрупповыхразличий Т-лимфоциты (CD3+), % 82,9±1,16 51,0±1,15 р 0,001 Т-хелперы (CD3+CD4+), % 55,6±0,94 25,8±1,7 р 0,01 Т-цитотоксические (CD3+CD8+), % 43,6±0,88 39,6±0,24 р 0,05 NK-клетки (CD16+±CD56+), % 6,65±0,37 5,8±0,37 р 0,05 В-лимфоциты (CD19+), % 8,54±0,27 12,5±1,2 р 0,05 ИРИ, у.е. 1,27±0,05 0,65±0,86 р 0,1 Фагоцитарная активность нейтрофилов крови, % 50,0±1,26 50,5 ± 2,3 р 0,1 Функциональная активность (НСТ-тест), % 18,42±0,97 19,1±1,3 р 0,1 IgA, мг/мл 18,42±0,97 19,1±1,3 р 0,1 IgM, мг/мл 1,42±0,06 1,51±0,15 р 0,05 IgG, мг/мл 15,5±0,81 15,5±0,73 р 0,1 ЦИК, Ед 64,0±0,92 69,8±3,4 р 0,1
Комплементарная активность сыворотки крови, Ед 68,75±1,9 69,7±2,1 р 0,1 Полученные данные представлены на рисунке 13, на котором отражены показатели иммуного статуса у больных острым бруцеллезом со средней (группа № 2) и высокой (группа № 3) степенью реагин-опосредованной специфической сенсибилизации.
Сравнительный анализ некоторых показателей иммунного статуса у больных острым бруцеллезом со средней (группа № 2) и высокой (группа № 3) степенью реагин-опосредованной специфической сенсибилизации
Таким образом, у больных бруцеллезом с низкой степенью IgE-зависимой специфической сенсибилизации наблюдаются незначительные изменения в основных показателях иммунного статуса, не имеющие патологического характера. У обследованных больных со средней (умеренной) степенью реагиновой гиперчувствительности были выявлены компенсаторные изменения иммунологических показателей: повышение количества Т-лимфоцитов, субпопуляции CD3+CD4+, CD3+CD8+, дисбаланс субпопуляций Т-клеток, повышение функциональной активности нейтрофилов, увеличение уровня сывороточных IgA и IgG, ЦИК и комплементарной активности сыворотки крови. На фоне приспособительных процессов иммунной системы были выражены и дезадаптивные изменения, которые выражались в снижении количества естественных киллеров, B - лимфоцитов, значительном ослаблении фагоцитарной активности нейтрофилов. У больных бруцеллезом с высокой степенью специфической сенсибилизации, по реагиновому типу на фоне компенсаторных процессов (повышение переваривающей способности фагоцитов крови, содержание уровня IgA и IgG, ЦИК и комплементарной активности сыворотки крови) выражены явные дисфункциональные изменения, имеющие иммуносупрессивный характер: снижение количества Т-клеток CD3+, Т-хелперов – CD3+CD4+, натуральных киллеров, фагоцитарной активности нейтрофилов.
Корреляционный анализ данных сравнения средней и высокой степени специфической сенсибилизации с иммунологическими показателями, выявил наличие прямой связи со снижением количества CD3+ клеток (r = 0,895), CD3+CD4+ лимфоцитов (r = 0,500), популяции натуральных киллеров CD16++56+ (r = 0,425) и CD3+CD8+ клеток (r = 0,628), (p0,01). В ходе исследования показана обратная связь относительно увеличения циркулирующих иммунных комплексов (r = - 0,757) и уровня иммуноглобулина G (r = - 0,475) в обследуемых группах (p0,1). У больных бруцеллезом выявлена прямая связь интенсивности IgE-обусловленой сенсибилизации с комплементарной активностью сыворотки крови (r = 0,244), (p0,1), динамики повышения количества CD19+ клеток (r = 0,262) и уровня иммуноглобулина А (p0,01). Анализ данных в группах сравнения выявил прямую зависимость снижения фагоцитарной (r = 0,384) и функциональной активности нейтрофилов крови (r = 0,440), (p0,01) относительно степени интенсивности инфекционной аллергии при бруцеллезе.
Вышеизложенное указывает на то, что интенсивность реагин опосредованной специфической сенсибилизации у больных бруцеллезом имеет прямую патогенетическую связь с формированием иммуносупрессивного состояния.
Учитывая, что применение проточно-цитометрического анализа позволяет количественно учесть уровень гиперчувствительности организма к возбудителю бруцеллеза, метод антигенной активации лейкоцитов in vitro можно использовать для изучения интенсивности аллергизации, в качестве маркера при оценке эффективности этиопатогенетической терапии бруцеллеза, ранней диагностике.
Разработка метода учета интенсивности лимфоцит-опосредованной специфической сенсибилизации при остром бруцеллезе
В Российской Федерации эпидемиологическая ситуация по бруцеллезу остается достаточно напряженной: по официальным статистическим данным Федерального центра гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора («Сведения об инфекционных и паразитарных болезнях (форма 1)» в 2015 году зарегистрировано 393 случая впервые выявленного бруцеллеза у людей; показатель заболеваемости бруцеллезом на 100 тысяч населения составил 0,27. Вероятно, истинное количество заболевших бруцеллезом превышает официальные данные, что обусловлено низкой обращаемостью сельского населения за медицинской помощью, трудностью диагностики, связанной с полиморфизмом клинических проявлений на всех стадиях инфекционного процесса, а также первично-латентной формой болезни (Ющук Н. Д. с соавт., 2003; Русанова Д. В., 2011; Желудков М. М. с соавт., 2009; 2012).
В течение длительного времени, в Северо-Кавказском и Южном федеральных округах наблюдается напряженная эпидемическая ситуация по бруцеллезу, на протяжении многих десятилетий бруцеллез в регионе занимает доминирующее положение среди зоонозных инфекций, составляющих региональную инфекционную патологию (Ющук Н. Д. с соавт., 2003; Русанова Д. В., 2011; Манин Е. А., 2012; Лямкин Г. И. с соавт., 2012, 2013, 2014, 2015). Известно, что характерной особенностью бруцеллезной инфекции является длительное волнообразное течение с рецидивами и обострениями, многообразие клинических проявлений и стертое течение. Недостаточная эффективность существующих методов диагностики, часто поздняя или неадекватная этиопатогенетическая терапия бруцеллеза ведет к хронизации инфекции, в ходе которой формируются необратимые анатомо-физиологические изменения со стороны различных органов и систем, прежде всего со стороны опорно-двигательного аппарата, что приводит к временной или стойкой утрате трудоспособности и определяет социально-экономическую значимость проблемы (Жуманбаев К. А. с соавт., 1989; Лобзин Ю. В. с соавт., 2003; Маколкина О. Н., 2006; Плиева Ж. Г., 2010; Сафонов А. Д., 2011; Al Dahouk еt al., 2003; Galinska E. M., Zagorski J., 2013).
Эволюционно сложившийся биологический цикл бруцелл в организме хозяина, в условиях воздействия на микроорганизм факторов индуцированного патогеном иммунного ответа (в естественных для патогена условиях), характеризуется длительностью течения. Продолжительный инкубационный период (от 1 недели до нескольких месяцев) обусловлен ингибированием активности врожденного иммунитета, в первую очередь фагоцитарных факторов, что способствует формированию «иммунологического окна», персистенции возбудителя, колонизации патогенами макрофагов (Вершилова П. А. с соавт., 1954; 1963; 1974; Здродовский П. Ф., 1969). Соответственно, формирование иммуносупрессии при инфицировании возбудителем бруцеллеза начинается до начала продромального периода и клинического проявления болезни.
Длительность инкубационного периода преимущественно обусловлена несколькими факторами: видом бруцелл, количеством инвазированного патогена в организм, механизмом проникновения и исходным состоянием (реактивностью) иммунитета (Вершилова П. А. с соавт., 1968; 1974; Здродовский П. Ф., 1969; Memish Z. A., Balkhy H. H., 2004; Galinska E. M., Zagorski J., 2013).
Патогенетической основой практически закономерной трансформации острой стадии инфекции в хроническую является индуцированная патогеном несостоятельность специфического иммунитета в отношении бруцелл с созданием условий для незавершенного фагоцитоза и долгосрочного внутриклеточного паразитирования (Жумадилова З. К., 1989; Mantur B. G. еt al., 2007).
Прогноз при бруцеллезе определяется, прежде всего, состоянием именно клеточного иммунитета, так как инфекция часто протекает на фоне достаточно высокого уровня циркулирующих антител, которые не обеспечивают защиту макроорганизма и не препятствуют формированию бактерионосительства (Борисов Л. Б. с соавт., 2005; Кишкун А. А., 2007; Пономаренко Д. Г. с соавт., 2012). Несмотря на длительную историю изучения бруцеллеза, проблема индивидуальной специфической гиперреактивности в отношении возбудителя бруцеллеза изучена недостаточно. Причиной этого является отсутствие объективных методов количественной оценки степени интенсивности специфической сенсибилизации при бруцеллезе. Соответственно, углубленное изучение количественных аспектов IgE- и клеточно-опосредованной специфической сенсибилизации при бруцеллезе является своевременным и перспективным направлением исследований. Благодаря модернизации методов лабораторной диагностики и внедрению новых технологий, появилась возможность детального изучения патофизиологических особенностей качественных и количественных параметров основных популяций иммуннокомпетентных клеток, субпопуляционного состава с помощью проточной цитофлуориметрии.
В соответствии с вышеизложенным, разработка принципиально новых для бруцеллезной инфекции методов оценки специфической сенсибилизации макроорганизма in vitro, изучение связи степени реагин- и клеточно-зависимой гиперреактивности с изменениями в иммунном статусе больных бруцеллезом имеет фундаментальное и прикладное значение.
С целью реализации комплесного подхода к изучению специфической сенсибилизации при бруцеллезе необходимо было исследовать и клеточно-зависимый механизм гиперчувствительности.
Учитывая, что наличие и выраженность клеточно-опосредованной сенсибилизации обеспечено активностью специфических клонов лимфоцитов, данные клетки представляют собой наиболее объективную модель для изучения клеточной гиперреактивности при бруцеллезе.
Изучение корреляции интенсивности реагин- и клеточно обусловленной сенсибилизации с компенсаторными и патологическими изменениями в иммунном статусе у больных острым бруцеллезом
В ходе математического анализа результатов исследования была установлена сильная степень коррелятивной связи снижения реагин-зависимой специфической сенсибилизации с повышением функциональной активности нейтрофилов крови. Очевидно, это связано с тем, что нейтрофильные гранулоциты первыми мобилизуются в очаг воспаления и от их фагоцитарной и функциональной активности во многом зависит эффективность противомикробной защиты организма (Саидова Б. М. с соавт., 2004; Магомедов Р. К., 2007; Benoit M. еt al., 2008; Mantovani A. еt al., 2011).
По данным литературы, известно, что активированные нейтрофилы сами становятся мощными эффекторами пусковых и регуляторных механизмов каскадных реакций, обеспечивающих развитие воспаления. Они способны не только в качестве эффекторов продуцировать цитотоксические молекулы и осуществлять фагоцитоз, но и, как регуляторные клетки, синтезировать широкий спектр различных цитокинов (Йегер Л., 1990; Рабсон А., 2006).
У пациентов с высокой степенью реагин-опосредованной аллергизации изменение многих показателей иммунного статуса носило более выраженный характер. При этом высокая и умеренная коррелятивная связь прослеживается с ключевыми показателями иммунного статуса: Т-лимфоцитами, Т-хелперами, Т-цитотоксическими, уровнем IgA, содержанием ЦИК.
Выявленная динамика количества субпопуляций лимфоцитов периферической крови у больных в период антителогенеза и нарастание специфической сенсибилизации, возможно, связаны с интенсивной миграцией (перераспределением клеточного пула) этих клеток из периферического кровотока в ткани и их участием в процессе санации, а также в развитии специфического для бруцеллеза воспаления – формировании очагов моноцитарно-лимфоцитарной пролиферации (гранулем). Полученные данные показали, что повышение степени IgE-зависимой специфической сенсибилизации при бруцеллезе ассоциировано с формированием выраженной иммуносупрессии, что в свою очередь характеризуется изменением количества и дисфункцией иммунокомпетентных клеток, угнетением естественной реактивности организма, коррелирующим с тяжестью заболевания. Соответственно, чем выше уровень IgE-зависимой гиперчувствительности, тем более выражены изменения в иммунном статусе.
В ходе дальнейшего анализа степени зависимости интенсивности лимфоцит-опосредованной сенсибилизации с выраженностью изменений в иммунном статусе, больные были разделены на 3 группы: с низкой степенью специфической сенсибилизации – 2 - 8 % , со средней (умеренной) степенью – 9 – 15 % и высокой – более 15 %.
У больных с низкой клеточной гиперреактивностью установлено снижение ключевых показателей иммунного статуса: уровня Т-лимфоцитов, субпопуляций Т-хелперов и Т-цитотоксических, общего IgG, фагоцитарной активности нейтрофилов крови. У обследуемых со средней и высокой степенью сенсибилизации не выявлено дисфункциональных изменений; динамика показателей иммунитета носила, в большей степени компенсаторный характер.
При изучении особенности клеточно-опосредованной специфической сенсибилизации у больных бруцеллезом выявлена определенная связь степени интенсивности сенсибилизации и изменений в иммунном статусе. При этом в отличие от реагин-обусловленной гиперреактивности наиболее выраженные именения, в т.ч. имеющие патологический характер, выявлены в группе больных с низкой степенью лимфоцит-зависимой сенсибилизации.
Известно, что первичная генерализация бруцеллезной инфекции обычно протекает на фоне отрицательных кожно-аллергических проб (Курманова Г. М. и др., 2002), соответственно, отсутствие или низкая специфическая сенсибилизация лимфоцитов на фоне подавленного фагоцитоза обусловливает несостоятельность клеточного иммунитета. В свою очередь, нозогенная иммуносупрессия, инициированная возбудителем, является причиной массивной бактериемии с формированием вторичных очагов инфекции – «микробное депо» (лимфотические узлы, селезенка, костный мозг). Учитывая внутриклеточный паразитизм бруцелл, возбудитель длительно персистирует в организме хозяина, вызывая его специфическую сенсибилизацию за счет образования эндотоксина, продуктов жизнедеятельности, антигенемии – инициируя патофизиологическую стадию развития аллергической реакции.
Реакция гиперчувствительности замедленного типа, обусловленная клеточными факторами иммунитета – преимущественно лимфоцитами, по своей сути – специфический иммунный механизм защиты, который направлен на локализацию и дальнейшую элиминацию инфекта через специфическое гранулематозное воспаление. Соответственно, интенсивность специфической реактивности лимфоцитов является отражением интенсивности (силы) противобруцелезного клеточного иммунитета. Исходя из вышеизложенного, можно заключить, что высокий уровень специфической клеточно-опосредованной сенсибилизации не ассоциирован с формированием иммуносупрессии при бруцеллезе. По нашему мнению, это обусловлено тем, что активность клеточных механизмов иммунитета, в частности лимфоцитов, является определяющей при бактериальных инфекциях с внутриклеточным паразитированием, соответственно высокая интенсивность лимфоцит-зависимой сенсибилизации в большей степени отражает устойчивость к патогену.
Учитывая полученные результаты, можно предположить, что наиболее опасным при остром бруцеллезе, с точки зрения генерализации этиологического агента (возбудителя бруцеллеза) с переходом в хронический бруцеллез, а также большого риска активизации условно патогенной микрофлоры или вторичного наслоения патогенных микроорганизмов, является течение болезни с высокой степенью реагин-зависимой и низкой интенсивностью клеточно-опосредованной специфической сенсибилизации. Соответственно, больным бруцеллезом с выраженной IgE-обусловленой аллергизацией необходима более длительная антибактериальная терапия с включением в схему лечения десенсибилизирующих средств и иммуномодуляторов, а больным с низкой интенсивностью лимфоцит 92 зависимой сенсибилизации – назначение стимуляторов клеточного иммунитета и естественной резистентности, в частности – фагоцитарной активности.
Таким образом, в результате проведенных исследований разработан комплексный, информативный методический подход для количественной оценки интенсивности специфической сенсибилизации у больных острым бруцеллезом, основанный на технологии проточной цитофлуориметрии, который позволяет проводить in vitro аллеродиагностику бруцеллеза, количественно определять степень IgE - и лимфоцит-зависимой специфической аллергизации.
Полученные новые знания о значении специфической аллергизации в формировании компенсаторных и патологических изменений в иммунном статусе больных бруцеллезом позволят оптимизировать тактику ведения больных, прогнозировать осложнения инфекции.