Создание гипериммунного протективного антигена BACILLUS ANTHRACIS для иммунопрофилактики сибирской язвы» Щербинин Дмитрий Николаевич

Содержание к диссертации

Введение

ГЛАВА 1. Обзор литературы 17

1.1 Факторы вирулентности Bacillus anthracis 17

1.2 Особенности иммунного ответа к Bacillus anthracis 19

1.3 Клеточный иммунный ответ к сибиреязвенным бациллам 20

1.4 Подходы к созданию вакцин от сибирской язвы 22

1.5 Используемые в настоящее время противосибиреязвенные вакцины... 24

1.6 Рекомбинантный аденовирус человека пятого серотипа и его применение для генетической иммунизации 27

ГЛАВА 2. Собственные исследования 31

2.1 Материалы 31

2.1.1 Вирусыи бактериальные штаммы 31

2.1.2 Клеточные линии 31

2.1.3 Плазмидные векторы 31

2.1.4 Ферментыи другие реактивы 31

2.1.5 Лабораторные животные 33

2.1.6 Лабораторное оборудование 33

2.2 Методы исследования 34

2.2.1 Бактериологические методы 34

2.2.2 Генно-инженерные методы 36

2.2.3 Вирусологические методы 40

2.2.4 Молекулярно-биологические методы 42

2.2.5 Серологические методы 42

2.2.6 Методы работы с животными 45

2.2.7 Статистическая обработка результатов исследований 45

2.2.8 Биоинформатические методы 46

2.3 Результаты исследований 47

2.3.1 Дизайн генетических конструкций сРА, sPA, PA-Fc 47

2.3.2 Получение челночных плазмид pSh-cPA, pSh -sPA, pSh -PA-Fc 50

2.3.3 Получение рекомбинантных аденовирусов Ad-cPA, Ad-sPA, Ad-PA-Fc 52

2.3.4 Изучение экспрессии генов сРА, sPA, PA-Fc из состава рекомбинантных аденовирусов методом вестерн-блотта 55

2.3.5 Определение антиген-специфического лимфопролиферативного ответа к протективному антигену у мышей, иммунизированных рекомбинантными аденовирусами Ad-PA-Fc, Ad-sPA и Ad-cPA 56

2.3.6 Оценка индукции антител класса IgG к РА в сыворотках крови мышей, иммунизированных рекомбинантными аденовирусами, методом ИФА 57

2.3.7 Оценка методом ИФА подклассов антител IgG специфических к РА в сыворотках крови мышей 59

2.3.8 Изучение протективных свойств рекомбинантных аденовирусов Ad-cPA, Ad-sPA, Ad-PA-Fc против В. anthracis методом контрольного заражения лабораторных животных 61

2.3.9 Изучение длительности защитных свойств у лабораторных животных, интраназально иммунизированных рекомбинантными аденовирусами Ad-cPA, Ad-sPA, Ad-PA-Fc 62

2.3.10 Оценка методом ИФА индукции антител класса IgG к РА в сыворотках крови морских свинок, иммунизированных рекомбинантными аденовирусами 63

2.3.11 Оценка защитных свойств гипериммунного протективного антигена на модели летальной сибиреязвенной инфекции на морских свинках 64

2.3.12 Оценка напряженности иммунного ответа при иммунизации гипериммунным протективным антигеном 65

ГЛАВА 3. Обсуждение результатов 67

Выводы 79

Список литературы 80

• Подходы к созданию вакцин от сибирской язвы
• Генно-инженерные методы
• Определение антиген-специфического лимфопролиферативного ответа к протективному антигену у мышей, иммунизированных рекомбинантными аденовирусами Ad-PA-Fc, Ad-sPA и Ad-cPA
• Оценка методом ИФА индукции антител класса IgG к РА в сыворотках крови морских свинок, иммунизированных рекомбинантными аденовирусами

Введение к работе

Актуальность темы и степень ее разработанности: Сибирская язва - опасное зооантропонозное инфекционное заболевание, поражающее людей и животных. Возбудителем является Bacillus anthracis -грамположительный, спорообразующий микроорганизм, способный длительное время сохраняться в почве и на различных предметах. Ежегодно в разных регионах мира регистрируются многочисленные случаи сибиреязвенной инфекции. Данные мониторинга за развитием эпидемической ситуации в России свидетельствуют о неуклонном росте неблагополучных по сибирской язве территорий (Локтионова М.Н., 2011). Развитию такой ситуации способствуют меняющиеся социально-экономические условия жизни населения, а также действие ряда факторов природного и антропогенного характера, требующие дальнейшего изучения. По уточненным данным кадастра, в 2008 году в России отмечено 28 986 стационарно неблагополучных по сибирской язве населенных пунктов, 13 855 скотомогильников, из них 4 961 - не отвечают требованиям ветеринарно-санитарных норм, что составляет 35,8 %. Кроме этого на территории субъектов РФ имеется еще 15 664 места захоронения павших животных и 925 - сжигательных печей. В 14 субъектах Российской Федерации трупосжигательные печи отсутствуют. Более того, ежегодно регистрируются спорадические вспышки болезни среди людей, в том числе со смертельными исходами. По статистическим данным за период с 2001 по 2012 годы в РФ заболело 120 человек, из которых четверо умерло (Рязанова А.Г., 2010). В других странах мира ситуация по сибирской язве также остается напряженной (Рязанова А.Г., 2014). Таким образом, санитарно-эпидемиологическую обстановку по сибирской язве в России оценивают как неблагоприятную (Адилов Д.А., 1972, Ведерников В., 1995).

Постановлением Правительства Российской Федерации от 1 декабря 2004 г. №715 «Об утверждения перечня социально-значимых и перечня заболеваний, представляющих опасность для окружающих» сибирская язва отнесена к группе заболеваний, представляющих опасность для окружающих, наряду с чумой и холерой.

Высокая патогенность В. anthracis в сочетании с уникальной устойчивостью споровых форм к воздействию факторов внешней среды, ставят его в разряд крайне опасных биологических агентов относящихся ко второй группе патогенности и имеющих потенциальную угрозу применения в качестве оружия массового поражения (Spencer R.C., 2001, Redmond С,

1998). Центр по контролю и профилактике заболеваний США (CDC) относит В. anthracis к высшему классу (категория А) биотеррористических агентов (). Потенциал В. anthracis в качестве биологического оружия был продемонстрирован несколькими громкими инцидентами, произошедшими в последних три десятилетия. В 1979 году аварийный случай распыления спор произошел на военном объекте в городе Свердловске, который привел к 96 случаям заражения сибирской язвы, в том числе 68 случаям со смертельным исходом (Meselson М., 1994, Abramova F.A., 1993). С 1985 по 1991 год в Ираке разрабатывалось биологическое оружие на основе сибиреязвенных бактерий и могло быть использовано в любой момент в войне в Персидском заливе (Zilinskas R.A., 1997). В 1993 году Аум Синрикё распылили споры сибирской язвы на вершине здания в Токио (Takahashi Н., 2004). Этот инцидент можно считать первым документально зарегистрированным случаем использования сибиреязвенных бактерии в качестве аэрозольного оружия биотеррористами. Впоследствии было обнаружено, что используемый террористами штамм является вакцинным штаммом Sterne и был импортирован из США для использования в качестве вакцины для коров (Keim Р., 2001). Осуществленная в 2001 году рассылка зараженной спорами В. anthracis корреспонденции, вызвала панику среди населения США и привела к гибели пяти человек из одиннадцати от легочной формы заболевания (Jernigan J.А., 2001, Bush L.M., 2001, Brachman P.S., 2002).

Существуют различные пути передачи возбудителя сибирской язвы: через кишечник (поедание зараженной пищи), кожу (контакты с зараженными животными или их тушами), или через дыхательные пути (вдыхание спор). Следует заметить, что самой распространенной является кожная форма заболевания, которая протекает гораздо легче, чем другие формы болезни но, тем не менее, несмотря на проведение антибиотекотерапии сопровождается 5,5% летальностью, тогда как без лечения летальность достигает 20% (Ebensen Т., 2004). При проникновении возбудителя в организм человека через слизистые оболочки дыхательных путей или желудочно-кишечного тракта может развиваться септическая форма, которая часто приводит к смертельному исходу. Установлено, что при кишечной и легочной формах болезни летальность составляет приблизительно 50% и 90%, соответственно (Meselson М., 1994). Все это свидетельствует о высокой вирулентности сибиреязвенных бацилл, а также о необходимости контроля над данным заболеванием.

Иммунизация современными ослабленными живыми вакцинами является научно-обоснованным и эффективным способом профилактики сибирской язвы. Однако выпускаемые живые вакцины необходимо водить двукратно, с последующей ежегодной ревакцинацией. Считается, что существующие вакцины обладают слабой иммуногенностью (Splino М., 2005) и длительность сохранения поствакцинального иммунитета не превышает 6-8 месяцев (Маринин Л.И., 2008). Отчасти это можно объяснить неспособностью стандартизировать скарификационный путь введения вакцины. Другим недостатком живых вакцин является их реактогенность (Burgasov P.N., 1976), а также наличие противопоказаний к их применению. Более того, некоторые авторы показали, что живые вакцины не создают напряженного иммунитета против некоторых полевых изолятов сибиреязвенных бацилл циркулирующих на территории Российской Федерации (Auerbach S., 1955, Little S.F., 1986, Ward М.К., 1965).

Применяемые в США и Великобритании химические вакцины также имеют недостатки: для создания защитного иммунитета их требуется вводить шестикратно в течение 18 месяцев, что вызывает аллергизацию ревакцинируемого организма (Turnbull Р.С, 2000). Используемые в этих странах субъединичные вакцины ввиду особенностей технологии получения их компонентов из аттенуированных культур В. anthracis, неизбежно содержат минимальные примеси отечного и летального факторов (Turnbull Р.С., 1991, Baillie L.W., 1999). Именно с данными продуктами связывают развитие аллергических реакций, возникающих почти у 30 % вакцинированных в США людей (Swanson-Biearman В., 2001, Brachman P.S., 1962) и возникновение побочных эффектов наблюдается у 11% вакцинированных англичан (Enstone J.E., 2003). Как правило, побочные эффекты проявляются в виде покраснения кожи, уплотнения места иммунизации, болезненных ощущений, а также повышения температуры тела. Более того, у 1% вакцинированных людей наблюдаются серьезные побочные реакции (Splino М., 2005), в том числе в виде некроза тканей (Swanson-Biearman В., 2001).

С учётом вышесказанного задача совершенствования противосибиреязвенных вакцин является весьма актуальной, поэтому ведётся постоянный поиск новых средств для специфической профилактики сибирской язвы (Вгеу R.N., 2005). Основными критериями оценки качества вакцин являются: увеличение продолжительности иммунитета, повышение уровня продукции специфических антител к протективному антигену,

индукция клеточного иммунного ответа, индукция как общего гуморального иммунного ответа, так и иммунного ответа на слизистых оболочках, а также снижение частоты возникновения побочных реакции по сравнению с существующими вакцинами.

Применяемые живые вакцины вводят в организм человека путем скарификации, в то время как субъединичные вакцины вводятся подкожно (внутримышечно), что приводит к формированию преимущественно общего иммунного ответа. Поскольку входными воротами возбудителя сибирской язвы являются как кожные покровы, так и слизистые оболочки легочного и кишечного трактов, то будущие вакцины должны формировать стойкий как общий иммунитет, так и местный (на слизистых оболочках) иммунитет.

Одним из наиболее эффективных на сегодняшний день подходов для решения вышеуказанных проблем является использование генетических вакцин, базирующихся на аденовирусных векторах (Tutykhina I.L., 2011). При введении в организм таких вакцин происходит попадание генетического материала в клетки организма и экспрессия в них генов целевых белков патогена. В результате антигены распознаются иммунной системой хозяина, что приводит к индукции как гуморального, так и клеточного иммунного ответа (Карпов А.П., 2007, Knoblich H.V., 2000). На сегодняшний день одними из наиболее изученными и часто используемыми в генетической вакцинации являются рекомбинантные аденовирусные векторы. Вакцины на основе рекомбинантного аденовируса человека пятого серотипа имеют ряд преимуществ перед другими генетическими вакцинами. Во-первых, рекомбинантные аденовирусы являются репликативно-дефектными и не способны вызывать заболевания. Безопасность аденовирусных векторов с удаленными Е1 и ЕЗ областями генома подтверждается целым рядом проведенных клинических испытаний различных вакцинных и терапевтических препаратов на их основе (Van Kampen K.R., 2005, Li X., 2013). Во-вторых, использование рекомбинантных аденовирусов позволяет проводить интраназальную иммунизацию, и, как следствие, индуцировать образование иммунного ответа на слизистых оболочках. В-третьих, в настоящее время уже разработаны эффективные технологии получения рекомбинантных аденовирусов, позволяющие быстро реализовать масштабное производство различных вакцин на основе аденовирусных векторов на одной технологической линии, без ее переоборудования и изменения регламента (Tang D.C., 2009). Вышеперечисленные свойства делают рекомбинантные аденовирусы хорошей технологической платформой

б

для создания широкого спектра вакцин против различных патогенов, в том числе и вакцин для биологической защиты (Boyer J.L., 2005).

В связи с вышесказанным, изучение возможности использования рекомбинантного аденовируса человека пятого серотипа для создания препаратов для вакцинации против такого особо опасного патогена, как В. anthracis, представляет самостоятельный научный интерес.

Цель диссертационной работы

Создание гипериммунного протективного антигена Bacillus anthracis для иммунопрофилактики сибирской язвы.

В процессе выполнения работы предстояло решить следующие задачи:

1. Смоделировать и сконструировать последовательность, кодирующую химерный белок, в состав которых входит протективный антиген В. anthracis, а также иммуностимулирующая молекула, способная усилить гуморальный иммунный ответ к протективному антигену.

2. Определить in vivo основные параметры иммуногенности полученных генетических конструкций.

3. Исследовать защитные свойства рекомбинантного аденовируса, несущего гипериммунный протективный антиген, на лабораторной модели летальной экспериментальной сибиреязвенной инфекций с безкапсульным штаммом В. anthracis.

4. Исследовать защитные свойства рекомбинантного аденовируса, экспрессирующего гипериммунный протективный антиген, против капсульного, вирулентного штамма 71/12 В. anthracis.

Научная новизна

С помощью эффективной технологии получения рекомбинантных аденовирусов человека пятого серотипа, основанной на гомологичной рекомбинации в Е. coli, было сконструировано и получено четыре рекомбинантных аденовируса человека пятого серотипа, содержащих ген протективного антигена Bacillus anthracis: Ad-cPA, Ad-sPA, Ad-PA-Fc, Ad-Fc-PA.

Продемонстрирована способность полученных рекомбинантных аденовирусов вызывать антиген-специфическую пролиферацию Т-клеток лимфатических узлов.

Показана индукция гуморального иммунного ответа к В. anthracis у лабораторных животных, иммунизированных рекомбинантными аденовирусами Ad-cPA, Ad-sPA, Ad-PA-Fc.

Продемонстрировано защитное действие рекомбинантного аденовируса Ad-PA-Fc при интраназальной иммунизации мышей против В. anthracis штамма Steme. Иммунизация Ad-PA-Fc способна полностью защищать мышей от заболевания сибирской язвой в течение трех месяцев после иммунизации.

Впервые показано, что генетическая иммунизация (генно-инженерная конструкция, которая после введения в клетку обеспечивает продуцирование белков патогенов) рекомбинантным аденовирусом (Ad-PA-Fc) индуцирует защитный иммунный ответ против капсульного штамма В. anthracis.

Впервые продемонстрировано, что иммунизация генетической конструкцией, кодирующей, кроме антигена, иммуностимулирующую молекулу, значительно увеличивает защиту лабораторных животных от бактериальной инфекции.

Впервые показана возможность увеличения иммуногенности антигенов при генетической иммунизации против бактериальных инфекций. Таким образом, подобные антигены, экспрессируемые из состава вирусных векторов, могут рассматриваться как компоненты будущих противобактериальных вакцины.

Теоретическая и практическая значимость.

Работа представляет теоретический интерес в плане создания
антигенов с увеличенными иммуногенными свойствами, за счет слияния
антигенов с иммуностимулирующими молекулами. Более того,

сконструированные генетические конструкции представляют также практическую значимость. Полученные в результате работы рекомбинантные аденовирусы могут выступать как компоненты будущих противосибиреязвенных вакцин.

Результаты, полученные в ходе выполнения диссертации, вошли в патент Российской Федерации № 2444570 «Способ получения рекомбинантной вакцины», в MP 1.2.2522-09 «Выявление наноматериалов, представляющих потенциальную опасность для здоровья человека», а также в MP «Получение рекомбинантных аденовирусов человека пятого серотипа, экспрессирующих гены белков, обладающих токсичностью для эукариотических клеток».

Методология и методы исследования.

В диссертации использованы современные бактериологические методы (приготовление компетентных клеток Е. coli штаммов DH5a и BJ5183 и их трансформация, гомологичная рекомбинация в клетках Е. coli), генно-

инжинерные методы (выделение аналитических и препаративных количеств плазмидной ДНК, методы рестрикционного картирования, отбор рекомбинантных клонов и другие методы молекулярного клонирования), вирусологические методы (получение, накопление и очистка рекомбинантных аденовирусных векторов, выделение вирусной ДНК, титрование рекомбинантных аденовирусов), методы работы с животными и биоинформатические методы.

Степень достоверности и апробация результатов.

Для решения поставленных задач в работе использовались современные инструментальные методы. Обсуждение результатов проведено с учетом современных данных медицинской и биологической науки. Научные положения и выводы, изложенные в диссертации обоснованы и подтверждены фактическим материалом.

Результаты диссертационной работы были доложены на девятой межнациональной аденовирусной конференции «Development of recombinant adenoviruses expressing M. tuberculosis antigens, and transfection of dendritic cells. 9th International Adenovirus Meeting 26-30 April 2009, Dobogoko, Hungary» и XIV Всероссийском научном форуме с международным участием имени академика В.И. Иоффе «Экспрессия гипериммуногенного антигена М. tuberculosis Ag85B в рекомбинантном аденовирусном векторе». Апробация диссертации состоялась на научной конференции отделов иммунологии, медицинской микробиологии и генетики и молекулярной биологии бактерий ФГБУ «ФНИЦЭМ им. Гамалеи» МЗ РФ 09.04.2015 г.

Публикации.

По материалам диссертации опубликовано 22 научные работы, из них 8 статей в журналах рекомендованных ВАК, а также 1 патент, 2 методических указаний, 11 тезисов в научных конференциях.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 100 страницах машинописного текста и включает введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты собственных исследований, обсуждение результатов, выводы и список используемой литературы (187 источника, из которых 27 отечественных, 154 иностранных и 6 интернет ссылок). Работа содержит 12 таблиц и 13 рисунков.

Подходы к созданию вакцин от сибирской язвы

Основоположником разработки живой сибиреязвенной вакцины является Луи Пастер, который ещё в 1881 году аттенуировал капсульный вирулентный штамм В. anthracis путем выращивания его культур при повышенной температуре (42,5-43С) [153]. Вследствие тепловой нестабильности плазмиды pOXl [112] было предположено, что вакцина Пастера была аттенуированна путем потери плазмиды pOXl. Однако это представляется маловероятным, так как pOXl" штаммы являются не протективными [79,155], а также известны некоторые штаммы Пастера, которые содержат обе плазмиды. Сейчас широко распространено мнение, что вакцина Пастера была смешанной культурой, которая содержала некоторое количество бактерий экспрессирующих токсин [79,62]. Смешанная культура, по-видимому, содержит очень небольшой процент полностью вирулентных бактерий, возможно увеличивающих защиту, хотя иногда и вызывающих болезнь. На самом деле она не была неожиданной, и в редких случаях животное могло умереть от вакцины но, тем не менее, вакцинация давала коллективный иммунитет.

Вакцина Пастера в значительной степени была вытеснена в 1930 годы вакциной Sterne, которая не имеет плазмиды рОХ2. Было показано, что Sterne тип вакцин (рОХ1+, рОХ2 ) значительно лучше защищает животных, чем вакцины на основе штаммов pOXl", рОХ2+. Например в одном исследовании бактерии от двух штаммов рОХ2 защищали морских свинок от штамма Vollum IB, в то время, как ни один из трех штаммов pOXl" не оказывал протекции [79], таким образом, это доказывает, что pOXl достаточна для защиты, а рОХ2 нет.

В 1940 году в Советском Союзе разработали Sterne-подобную вакцину - СТИ-1 [133], которая с тех пор используется для вакцинации россиян. Turnbull et al. [150] показали, что Sterne и СТИ-1 индуцируют в морских свинках одинаковый уровень анти-РА антител и обеспечивает защиту от сибирской язвы. Также СТИ-1, подобно Sterne, продуцирует токсины и проявляет побочные эффекты при вакцинации. В одном исследовании, менее чем 1% вакцинированных людей, имели побочные эффекты [133], в то время как другие сообщают о частых проявлениях как общих, так и местных реакциях [138], возникающих как при первичной иммунизации, так и при ревакцинации. В одном исследовании отмечают локальные реакции в 87% случаев в месте инокуляции, 72% - при иммунизации путем скарификации и 14% - когда вакцину вводят подкожно [46].

Помимо вакцин типа Пастера и Sterne, существуют вакцинные штаммы, которые имеют обе плазмиды, и ослаблены посредством хромосомных мутаций. Они включают некоторые штаммы Пастера [155,103,49], итальянский вакцинный штамм Carbosap [59], аргентинский штамм А [49] и российский штамм Ценковского [5]. Осмысление механизмов аттенуации этих штаммов может помочь наиболее полно понять патогенез сибирской язвы и, возможно, привести к появлению новых вакцин и терапевтических агентов.

Стоит вспомнить российского ученого Льва Семёновича Ценковского, который уже через два года после Пастера разработал отечественную вакцину против сибирской язвы. Для того, чтобы бациллярные формы вакцин перевести в более устойчивые споровые, Ценковский разработал способ, совершенно отличный от пастеровского: бульонные культуры вакцин в состоянии спор он разбавлял раствором глицерина [186]. Глицерин консервировал вакцины, они длительное время сохраняли свои иммуногенные качества без изменений, что раньше никак не удавалось. Был разработан и свой, оригинальный, способ очистки вакцин от посторонних бактерий путем проведения вакцин через организм восприимчивых животных, для чего были широко использованы суслики и мыши. Вакцины Ценковского применяли в нашей стране в течение 80 лет.

После живых ослабленных вакцинных штаммов началась эра субъединичных вакцин, и уже в 1954 году, Wright G. и коллеги разработали первую субъединичную вакцину для людей на основе протективного антигена [169]. В настоящее время имеется две широко используемые субъединичные вакцины для людей, в США используется адсорбированная антракс вакцина (AVA), а в Великобритании применяется преципитированная антракс вакцина (AVP), обе вакцины основаны на культуральном фильтрате В. anthracis [33,93]. AVA вакцину получают из фильтрата некапсулированного штамма V770-NP1-R с низкой протеолитической активностью, который адсорбируется на гидроксиде алюминия [31]. AVP вакцину производят преципитацией культурального фильтрата на гидроксид алюминия, используя в качестве продуцента авирулентный, некапсулированный Sterne 34F2 штамм [33,93]. Защитный иммунный ответ индуцируется введением вакцины подкожно серией до шести первичных доз, за которыми следует ежегодная ревакцинация [93,43].

Для предотвращения заболевания людей и животных сибирской язвой применяют вакцинацию (Таблица 2). Однако вакцинации подвергаются только определенные группы людей, входящие в группу риска; такие, как работники предприятий по переработке кож, шерсти, убойных и разделочных цехов мясокомбинатов, военный персонал, а также лица, связанные с обслуживанием сельскохозяйственных животных на территориях, неблагополучных по сибирской язве [24]. Вакцинации подлежат лица старше 14 лет.

Для вакцинации КРС в большинстве стран мира используют бескапсульный штамм Sterne34F2 [168]. В России же для этих целей применяется штамм 55-ВНИИВВМ, полученный специалистами Всесоюзного научно-исследовательского института ветеринарной вирусологии и микробиологии на основе природного бескапсульного изолята [3,25].

Генно-инженерные методы

Определение титра IgG в сыворотках крови мышей и морских свинок проводили методом непрямого ИФА. В качестве антигена использовали очищенный белок протективного антигена, «Calbiochem». Для этого на 96-луночный планшет для ИФА («Corning», кат. № 9018) адсорбировали 0,1 мкг/лунку РА в 20 мМ калиево-фосфатном буфере, рН 8,0. Адсорбцию проводили на 4С в течение 12 часов. Далее лунки планшета промывали от не связавшегося антигена рабочим буфером (20 мМ калиево-фосфатном буфере, рН 8,0 с 0,05% Твин 20 (Sigma)). Далее в лунки планшета вносили исследуемые образцы сывороток крови в рабочем буфере. По окончании инкубации (1 час при 37С на шейкере) планшет отмывали и вносили антитела к мышиным IgG конъюгированные пероксидазой хрена, в разведении 1:5000 в рабочем буфере. После окончания инкубации лунки планшет промывали, после чего визуализировали при помощи ТМВ (3,3 ,5,5 -тетраметилбензидин). Реакцию останавливали 4М H2SO4 и оптическую плотность окрашенного продукта определяли при длине волны 450 нм.

Получение первичной культуры клеток лимфатических узлов Иммуногенность полученных конструкций оценивали с помощью антиген-специфического лимфопролиферативного ответа. Для получения культуры иммунокомпетентных клеток иммунизированные мыши были усыплены эфиром, после чего у них были забраны глегочные лимфатические узлы. Лимфоузлы были перенесены в 0,5 мл фосфатного буфера рН7,2-7,4 и гомогенизированы. Клеточная суспензия была проинкубирована 1-2 минуты при комнатной температуре и после доведения объема фосфатным буфером до 6 мл была центрифугирована при 10С 7 минут 1000 об/мин. После удаления супернатанта осадок клеток был разбит в 1 мл лизирующего буфера (0Д7М Трис смешали в соотношении 1:9 с 0,155 М МЇ4С1, рН 7,2-7,4) и инкубирован при комнатной температуре 2 минуты. Затем фосфатным буфером объем клеточной суспенизии был доведен до 6 мл и после этого клетки были осаждены центрифугированием при 10С в течение 7 минут при 1000 об/мин. Клеточный осадок был дважды промыт фосфатным буфером и разведен в среде RPMI-1640 («ПанЭко», 25 мМ бикарбонат натрия, 5% сыворотка интактных мышей, 50 мкМ меркаптоэтанол, 6 ед. акт./мл IL-2) в присутствии глутамина и смеси антибиотиков пенициллина и стрептомицина («ПанЭко», Россия). Взвесь лимфоцитов вносили по 100 мкл в 96-луночные культуральные планшеты («Costar», США) в количестве 3 000 000 клеток/мл.

Определение уровня пролиферации клеток лимфатических узлов мышей в ответ на введение антигена

В лунке культурального планшета, содержащего иммунокомпетентные клетки, добавляли по 10 мкг РА. Контрольными являлись лунки, содержащие взвесь клеток, но не обработанные антигеном. Планшеты с культурой лимфоцитов инкубировали при 37 С и 5% СО в течение двух дней. Далее в каждую лунку планшета вносили по 20 мкл раствора Н -тимидина («Amersham Biosciences», США) с удельной активностью 0,5 мкКи, и инкубировали 16-18 часов. Далее клетки осаждали центрифугированием, надосадочную жидкость удаляли и в лунки планшета вносили сцинтилляционную жидкость. Включение радиоактивной метки в ядра делящихся клеток оценивали на сцинциляционном счетчике Chameleon («Hidex», Финляндия), определяя степень включения изотопа водорода по числу импульсов в минуту (СРМ). 2.2.6 Методы работы с животными

Иммунизация лабораторных животных рекомбинантными аденовирусами Для иммунизации лабораторных мышей рекомбинантными аденовирусами животные были разбиты на группы не менее 10 особей и под эфирным наркозом интраназально, двукратно (с интервалом в две недели) иммунизированы аденовирусными векторами в дозе 109 БОЕ/мышь. В качестве контрольных использовались группы мышей, получавших рекомбинантный аденовирус человека пятого серотипа, не несущий трансгена - Ad5-null и физиологический раствор NaCl.

Заражение животных летальной дозой Bacillus anthracis Оценку защитных свойств рекомбинантных аденовирусов, от сибирской язвы на мышиной модели линии Balb/c, проводили путем интраперитонеальной инокуляции заражающей тест-культуры в дозе 4 LD5o-В качестве заражающей культуры использовали бескапсульный штамм Sterne Bacillus anthracis. Наблюдение за животными опытных и контрольных групп проводили в течение 10 суток после заражения [105,18].

Оценку защитных свойств рекомбинантных аденовирусов, от сибирской язвы на модели морских свинок, проводили с помощью подкожного заражения в область живота спорами капсулообразующего штамма 71/12 (второй вакцины Ценковского). Заражающая доза составила 2 LDioo, которую предварительно подтитровывали на интактных морских свинках. Объем инокулята составил 0,5 мл. Наблюдение за животными вели в течение 10 суток после заражения.

Все эксперименты с животными проводились в институте ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии.

Статистическую обработку результатов исследований проводили с помощью компьютерных программ «Excel» («Microsoft», США) и "Statistica 6" («StatSoft Inc.», США). Каждый эксперимент повторялся не менее двух раз. Результаты сравнения экспериментальных и контрольных групп считали статистически достоверными при р 0,05. Результаты по выживаемости оценивались с применением критерия Манна-Уитни.

Белковые и нуклеотидные последовательности четвёртого домена антигена РА были получены из UniProtKB/Swiss-Prot: PI3423 и GenBank: М22589.1. Анализ кодонов РА В. anthracis показал, что в геноме бацилл преобладают АТ-нуклеотиды. Для оптимальной экспрессии гена РА в клетках млекопитающих необходимо модифицировать кодоны под Mus musculus. Наиболее часто встречающиеся кодоны В. anthracis и Mus musculus были определены согласно базе данных используемых кодонов http://www.kazusa.or.jp/codon/. Для обеспечения высокого уровня продукции белка, кодоны были оптимизированы под экспрессию в клетках Mus musculus (Рисунок 1). Белковые и нуклеотидные последовательности Fc-фрагмента IgG2a были взяты из UniProtKB/Swiss-Prot: РОЇ863 и GenBank: V00798.1. Между РА антигеном и Fc-фрагментом антитела был встроен 12-ти членный глицин-сериновый спейсер.

Была разработана нуклеотидная последовательность гена PA-Fc с таким учетом, чтобы с помощью последовательного удаления нуклеотидных последовательностей можно было получить гены сРА и sPA. Нуклеотидная последовательность гена PA-Fc представлена ниже (Рисунок 2).

Сконструированный химерный ген, кодирующий протективный антиген слитый с Fc-фрагментом антитела, был синтезирован компанией ЗАО «Евроген» и доставлен нам в составе плазмиды pALA-PA-Fc.

Определение антиген-специфического лимфопролиферативного ответа к протективному антигену у мышей, иммунизированных рекомбинантными аденовирусами Ad-PA-Fc, Ad-sPA и Ad-cPA

Концепция введения генов, кодирующих один или несколько протективных антигенов, всё больше и больше привлекает специалистов к данному направлению создания вакцин. Стратегия генетической иммунизации ассоциируется с множеством преимуществ, например, биосинтетический механизм клетки хозяина является ответственным за продукцию антигена и, следовательно, гарантированы оптимальное гликозилирование и фолдинг белков.

Также отпадает необходимость в продукции и очистке индивидуальных антигенов, так как культивирование патогенов не требуется. Производство вакцин не связано с патогенными микроорганизмами, для которых необходимы специальные техники и оборудование для культивирования. Стоит заметить, что генетическая иммунизация может помочь в преодолении материнского иммунитета, таким образом, способствуя развитию вакцин для новорождённых.

Генетическая иммунизация привлекательна также с экономической точки зрения. Во-первых, данный подход позволяет снизить дозу вакцины, так как экспрессия антигена при иммунизации генами в среднем составляет один месяц. Во-вторых, для некоторых генетических вакцин уже разработаны экономически обоснованные технологии получения. В-третьих, один и тоже вектор можно использовать для создания вакцин к большому количеству патогенов, что позволяет на одном и том же производстве создавать вакцины против разнообразных микроорганизмов. В перспективе, генетические вакцины можно будет относительно легко и быстро приготовить в больших количествах в различных городах или странах, благодаря чему отпадает необходимость в длительной транспортировке или хранении.

Рекомбинантные аденовирусы применяются в 23,4% случаев клинических испытаний и зарекомендовали себя как наиболее перспективные векторы для доставки генов в клетки человека [183]. Достаточно хорошо изучен их геном, иммунный ответ при аденовирусной инфекции и на аденовирусный вектор. Целый ряд экспериментальных работ показывает, что они могут быть использованы и как будущие противовирусные вакцины, против таких вирусных патогенов как вирус гриппа [154,134,131], вирус болезни марека [8], вируса эбола [115,51], вируса бешенства [172,44] и т.д., и как будущие противобактериальные препараты, против таких бактериальных патогенов как Mycobacterium tuberculosis [27,128,129,122], Chlamydia trachomatis [45,180,9], Francisella tularensis [86] и т.д. Следовательно, поскольку аденовирусные векторы являются перспективным инструментом для генетической иммунизации, как против вирусных, так и против бактериальных патогенов, мы выбрали именно этот вектор как средство для доставки генетического материала.

Одним из успешных подходов к увеличению иммуногенности ДНК-вакцин заключается в оптимизации кодонов гена кодирующего антиген, с целью увеличения экспрессии гена в клетках млекопитающих. Некоторые сообщения показали, что оптимизация кодонов приводит к увеличению экспрессии трансгена, иммуногенности ДНК-вакцин, и, как следствие, повышение протективных свойств. Например, имеются работы с такими генами соответствующих инфекционных агентов, как Е7 вируса папиломы человека [52], gpl20 вируса иммунодифицита человека [29,70], гемагглютинин вируса гриппа человека [84], TetC Clostridium tetani [142], а так же Ag85B Mycobacterium tuberculosis [89]. На основании этих данных, а также факта преобладания АТ-нуклеотидов в геноме Bacillus anthracis [114], кодоны в гене протективного антигена были оптимизированы в наших конструкциях под экспрессию в клетках Mus musculus.

Вторым способом повысить иммуногенность протективного антигена заключалась в том, чтобы димеризовать единичные молекулы антигена, эксперссируемые из состава аденовирусного вектора. Способность к формированию димеров, позволяет двум антигенным детерминантам располагаться на одной частице, что повышает степень иммуногенности димеризованного антигена [135]. С этой целью в этой работе было решено использовать Fc-фрагмент IgG2a Mus musculus.

В третьих, Fc-фрагмент способен взаимодействовать с патерн-распознающими рецепторами на поверхности иммунокомпетентных клеток [102], а так же во внутриклеточном пространстве [110]. Более того, связывание с Fc-фрагментом антигена может повысить иммуногенность последнего по сравнению с «обычными» антигенами благодаря нескольким механизмам: перенос химерных антигенов с помощью неонатальных Fc-рецепторов в подэпителиальный слой слизистых тканей [175,120], активирование паттерн-распознающих рецепторов и рецепторов фагоцитоза антиген-презентирующих клеток [159,67], кросс-презентация антигенов [119], депонирование антигенов во вторичных лимфоидных органах [36,72,65], а также возможно более эффективное распознавание В-клетками связанных с мембраной антигенов вместо растворимых [48,66]. Все механизмы в совокупности, позволяют максимально увеличить иммуногенность антигена, создавая готовые иммунные комплексы которые распознаются иммунокомпетентными клетками. Следовательно, по отношению к антигену Fc-фрагмент выступает в роли «молекулярного адъюванта», который необходим для активирования приобретенного иммунного ответа посредством активирования врожденного [82].

Следовательно, мы сконструировали рекомбинантный аденовирус Ad-PA-Fc, содержащий ген, кодирующий секретируемый фьюжен-белок, одной частью которого является оптимизированный для экспрессии протективныи антиген, а второй частью является мышиный Fc-фрагмент. Также, были сконструировано два рекомбинантных аденовируса человека 5-го серотипа, содержащие различные модификации нуклеотидных последовательностей четвёртого домена протективного антигена. Один рекомбинантный аденовирус - Ad-cPA содержал несекретируемый протективныи антиген, в то время как в другой рекомбинантный аденовирус - Ad-sPA была встроена секретируемая форма протективного антигена [26].

После получения трех рекомбинантных аденовирусов Ad-cPA, Ad-sPA и Ad-PA-Fc, была показана экспрессия протективного антигена методом вестерн-блотта, а также подтверждено присутствие Fc-фрагмента в составе фьюжен-белка. Далее, мы провели иммунизацию мышей и обнаружили индукцию антиген-специфических иммуноглобулинов класса IgG, а так же исследовали их подклассовую принадлежность. Примечательна подклассовая принадлежность антител IgG к протективному антигену, индуцируемая при иммунизации всеми рекомбинантными аденовирусами. В наших экспериментах, были выявлены антитела подклассов IgGl, IgG2a и IgG2b, в то время как при использование неполного адъюванта Фрейнда индуцировался синтез подклассов IgGl и IgG2b. Возможно, благодаря данному факту, мыши, иммунизированные рекомбинантными аденовирусами в первом эксперименте по защите животных от сибирской язвы, обладали большей степенью защиты по сравнению с положительным контролем. Эти результаты согласуются с данными группы Tan Y. [146], который показал аналогичный профиль подклассов антител при аденовирусной иммунизации. Отличительной особенностью в наших результатах было лишь полное отсутствие иммуноглобулинов IgG3, в то время как у Y. Tan данный подкласс антител присутствовал, но в значительно меньших количествах, чем других подклассов IgG.

Оценка методом ИФА индукции антител класса IgG к РА в сыворотках крови морских свинок, иммунизированных рекомбинантными аденовирусами

Одной из проблем, связанных с превентивной антимикробной терапией, является риск развития нежелательных лекарственных реакций, возрастающих с увеличением продолжительности приема антибиотиков [11]. Так, осенью 2001 года в США регистрировали нежелательные реакции у лиц, которым в течение 60 дней проводили превентивную антибактериальную терапию. Из 3428 пациентов, получавших ципрофлоксацин, у 19% отмечали тошноту, рвоту, диарею и боли в животе; у 14% обморочные состояния и головокружение; у 7% изжогу и рефлюкс; у 6% сыпь различного характера, крапивницу и зуд кожи. У нескольких пациентов были зарегистрированы симптомы, возможно, связанные с анафилактическими реакциями (затруднение при дыхании, глотании, чувство сдавления в области шеи, отек губ, языка или лица) и потребовавшие медицинского наблюдения. 3% пациентов, находившихся под наблюдением, были вынуждены прекратить прием препарата из-за развития нежелательных реакций.

Профилактику иммуноглобулинами иногда сочетают с введением антибиотиков. Лицам с повышенной чувствительностью к белку лошадей глобулин не вводят, а назначают лишь антибиотики. В связи с высокой частотой развития тяжелых аллергических реакций противосибиреязвенный иммуноглобулин для экстренной профилактики в последние годы практически не используется [11,10].

Использование живой вакцины на основе штамма СТИ-1 не дает возможности одновременно с иммунизацией проводить экстренную профилактику и лечение сибирской язвы с помощью антибиотиков, чего чаще всего требует эпидемиологическая обстановка. Обычно вакцину вводят через два дня после окончания курса антибиотикотерапии, то есть не ранее восьми дней после контакта с возбудителем сибирской язвы [2,6]. Это связанно с тем, что антибиотики оказывают отрицательное воздействие на иммунологическую перестройку организма, тормозя развитие микробных клеток вакцинного штамма. Антибиотики, введенные за 6-120 часов и через два часа после иммунизации, угнетали формирование иммунитета при введении вакцинного штамма СТИ-1, и иммунитет не развивался [13,14,19].

Одновременное использование антибиотиков и вакцин при экстренной профилактике сибирской язвы считается наиболее эффективным средством, что доказано экспериментами на животных [75,63,158]. В настоящее время CDC рекомендует для пост-экспозиционной профилактики сибирской язвы, в течение 60 дней принимать ципрофлоксацин и доксициклин, в сочетании с тремя дозами AVA вводимые с интервалом в две недели [170]. Однако очевидно, что эта схема также далека от идеала, к тому же гуморальный иммунный ответ к РА при химической иммунизации развивается только на 3-4 неделе [41].

На основании вышесказанного следует, что необходимо развивать новые средств для специфической пост-экспозиционной профилактике сибирской язвы. Одним из таких средств экстренной профилактике может быть генетическая иммунизация на основе аденовирусных векторов. Показано, что после внутримышечного введения рекомбинантного аденовируса через две недели детектировались антитела к протективному антигену, и их было в 10 раз больше, чем при иммунизации химической вакциной [146]. Защита от инфекции на ранних сроках в сравнении с химической вакциной также увеличивалась в 2,7 раза. Таким образом, аденовирусный вектор может обеспечить более быструю защиту организма от В. anthracis при биотеррористических атаках.

В нашей лаборатории ранее также было показано, что при иммунизации мышей аденовирусным вектором специфические антитела к антигену определяются уже через две недели после иммунизации (данные не опубликованы). Следовательно, аденовирусный вектор является перспективным средством для формирования более быстрого гуморального иммунного ответа.

Стоит заметить, что экстренная профилактика эффективна, если она осуществляется в ранние сроки после контакта с инфекционным агентом, так как инкубационный период составляет от двух до восьми дней, чаще 2-3 дня. В этом случае также возможно использовать аденовирусный вектор, который, например, может экспрессировать моноклональные антитела к РА [85]. Kasuya с соавторами сконструировал рекомбинантный аденовирус несущий одноцепочечное антитело к РА, и показал, что иммунизация мышей такой конструкцией способна защищать их от гибели вызванной сибиреязвенным токсином [85].

Обобщая вышесказанное можно констатировать, что средством идеальной пост-экспозиционной профилактики сибирской язвы может быть рекомбинантный аденовирусный вектор, способный на ранних сроках обеспечивать пассивную защиту от инфекции, а в последующем формировать адаптивный иммунный ответ, состоящий как из гуморальных факторов защиты, так и из клеточных факторов иммунной протекции (Рисунок 13). В этой идеализированной вакцине может быть использован полученный в данной работе рекомбинантный аденовирусный вектор, несущий гипериммунный РА.