Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Современные представления о гликогеновой болезни (обзор литературы) 13
Глава 2. Объем и методы исследования 25
2.1. Клиническая характеристика обследованных больных 25
2.2. Лабораторные методы обследования пациентов 27
Иммунофенотипирование лимфоцитов периферической крови 28
Метод мультиплексного количественного определения цитокинов с использованием проточной цитометрии 29
Методы оценки метаболической активности лимфоцитов 32
Раs-реакция определения гликогена в лимфоцитах 32
Метод количественного определения активности дегидрогеназ 33
Метод иммуноцитохимического определения активности СДГ в популяциях лимфоцитов 36
2.3. Статистические методы 40
Глава 3. Результаты собственных исследований 42
3.1. Возрастная динамика показателей клеточного иммунитета у пациентов с ГБ 42
3.2. Оценка показателей клеточного и гуморального иммунитета в зависимости от типа заболевания 64
3.3. Возрастные особенности малых популяций лимфоцитов у пациентов с ГБ 87
Глава 4. Цитокиновый профиль пациентов с ГБ 92
Глава 5. Оценка клеточного метаболизма у пациентов с ГБ 107
5.1 Содержание гликогена в лимфоцитах периферической крови 107
5.2. Активность внутриклеточных ферментов периферической крови в общей популяции лимфоцитов 110
5.3 Активность СДГ в популяциях лимфоцитов 121
5.4. Биохимические показатели сыворотки крови у пациентов с разными типами ГБ 129
5.5. Взаимосвязь иммунологических параметров, метаболической активности лимфоцитов, биохимических показателей крови и стадии фиброза печени у пациентов с ГБ 155
Глава 6. Алгоритм пошаговой диагностики определения типа гликогеновой болезни 165
Заключение 174
Выводы 205
Практические рекомендации 207
Перспективы дальнейшей разработки темы 208
Список литературы 209
Список сокращений 236
- Метод мультиплексного количественного определения цитокинов с использованием проточной цитометрии
- Возрастная динамика показателей клеточного иммунитета у пациентов с ГБ
- Активность внутриклеточных ферментов периферической крови в общей популяции лимфоцитов
- Биохимические показатели сыворотки крови у пациентов с разными типами ГБ
Метод мультиплексного количественного определения цитокинов с использованием проточной цитометрии
Определение концентрации циркулирующих цитокинов выполняли мультиплексным количественным методом с использованием проточной цитофлуориметрии (CYTOMICS FC500). Биологические образцы (плазму крови) получали методом центрифугирования цельной крови и хранили при температуре -70С. В работе использовали наборы реагентов FlowCytomix Human Th1/Th2 11plex (BMS810FF), Human IL-17A FlowCytomix Simplex (BMS82017FF), Human TGF-beta1 FlowCytomix Simplex (BMS8249FF).
Протокол исследования соответствовал инструкции производителя (BenderMed Systems GmbH, Германия). Оценивали концентрации цитокинов IL-2, IL-8, IL-5, IL-1, IL-4, IL-6, IL-12р70, IL-10, IFN-, IL-17А, TNF-, TNF- в плазме крови.
Мультиплексный анализ позволяет одновременно количественно определить концентрации нескольких цитокинов в одном биологическом образце.
Метод основан на принципе иммуноанализа типа «сэндвич», при котором на первом этапе анализа исследуемые вещества связываются с антителами на поверхности микрочастиц (или микросфер), затем добавляются вторичные антитела, конъюгированные с биотином, которые связываются с уже образованным комплексом аналит-микросфера. На следующем этапе добавляется стрептавидин-фикоэритрин, который связывается с биотином, образуется структура типа «сэндвич» и формируется флуоресцентный сигнал (канал FL2).
В анализе используются 2 типа микрочастиц, отличающихся по размеру: популяция А - 5,5 мкм, популяция В - 4,4 мкм. Разделение частиц по размерам осуществляется по коэффициенту прямого светорассеяния. Микросферы типа A и типа B также различаются по интенсивности флуоресценции (по каналу FL4), что позволяет разделить частицы типа A на 11 популяций, а частицы типа B на 9 (длина волны испускания - 690 нм, длина волны возбуждения - 488 нм, аргоновый лазер).
Для каждого образца плазмы крови оценивали интенсивность флюоресценции по каналу FL2 и рассчитывали значения концентрации цитокинов, исходя из построенных калибровочных кривых (рис. 2.2).
Полученные данные обрабатывали с помощью программного обеспечения FlowCytomix Pro v 6.0 (BenderMed Systems GmbH, Германия).
В работе определяли концентрации IL-2, IL-8, IL-5, IL-1, IL-4, IL-6, IL-12р70, IL-10, IFN-, IL-17А, TNF-, TNF- в плазме крови.
В качестве референсных значений для концентраций цитокинов были использованы данные исследований, выполненных мультиплексным количественным методом [38, 222].
Возрастная динамика показателей клеточного иммунитета у пациентов с ГБ
Для описания возрастной динамики показателей клеточного иммунитета данные иммунограммы 170 наблюдений пациентов с ГБ были разделены на 5 возрастных групп в соответствии с возрастными диапазонами, рекомендованными для оценки иммунологических показателей: 1-2 года (12 набл.), 3-5 лет (57 набл.), 6-8 лет (29 набл.), 9-11 лет (34 набл.), 12-16лет (38 набл.). Группу сравнения составили практически здоровые дети, сопоставимые по возрасту: 1-2 года (6 набл.), 3-5 лет (21 набл.), 6-8 лет (11 набл.), 9-11 лет (17 набл.), 12-16лет (26 набл.).
Проведенный анализ показал, что возрастная динамика общего количества лимфоцитов у пациентов с ГБ была схожа с таковой в группе сравнения, то есть количество лимфоцитов достоверно уменьшалось с возрастом (табл. 3.1, рис.3.1). Однако, количество лимфоцитов у пациентов с ГБ во всех возрастных группах было достоверное выше, чем в группе сравнения (р 0,001). (табл. 3.1, рис.3.1)
У пациентов с ГБ, так же как и у детей группы сравнения, отмечается достоверное увеличение относительного количества Т-лимфоцитов с возрастом на фоне снижения их абсолютного числа (табл.3.1, рис.3.2, рис.3.3). У детей с ГБ выявлено достоверное увеличение относительного и абсолютного количества Т-лимфоцитов в 5-й возрастной группе (дети старше 12 лет) относительно группы сравнения.
В группе сравнения увеличение количества Т-клеток обусловлено увеличением относительного количества цитотоксических Т-лимфоцитов на фоне снижения количества Т-хелперов, что согласуется с нормативными показателями (рис. 3.4). В отличие от группы сравнения, у пациентов с ГБ увеличение относительного количества Т-клеток происходило, в основном, этом относительное не за счет увеличения количества Т-хелперов, содержание цитотоксических Т-лимфоцитов с изменялось (рис. 3.5).
Выявлено, что процент отклонения от возрастных диапазонов относительного количества Т-хелперов у пациентов с ГБ достоверно увеличивается с возрастом (рис. 3.6). Помимо этого, при пересчете данных в процентах отклонения от референсных значений, было выявлено, что не у всех пациентов наблюдались отклонения количественных характеристик Т-хелперов в сторону увеличения. Так, выявлена группа пациентов, характеризующаяся снижением их количества ниже границ возрастной нормы. Стоит отметить тот факт, что с возрастом процент отклонения относительного количества Т-хелперов от нормативных показателей увеличивается: у детей от 1 до 2-х лет он составляет от -25 до 60%, а у пациентов старше 12 лет - от -80 до 280% (рис. 3.6).
Процент отклонения от возрастных диапазонов относительного количества Т-цитотоксических лимфоцитов у пациентов с ГБ также очень неоднороден: у детей младше 2-х лет относительное количество цитотоксических Т-лимфоцитов не выходит за границы референсных значений, а в более старшем возрасте наблюдается снижение данного показателя ниже референсных значений. Несмотря на достоверное снижение относительного количества Т-цитотоксических лимфоцитов с возрастом, у большинства пациентов с ГБ этот показатель находился ниже референсных значений. Стоит отметить, что у некоторых пациентов старше 12 лет наблюдалось существенное увеличение относительного количества цитотоксических Т-лимфоцитов до 160% выше возрастного референсного интервала (рис. 3.7).
Возрастная динамика количества В-лимфоцитов у пациентов с ГБ совпадает с динамикой у условно здоровых пациентов. С возрастом происходит достоверное снижение относительного и абсолютного количества В-лимфоцитов, при этом различий между пациентами с ГБ и группой сравнения во всех возрастных диапазонах выявлено не было (табл.3.1, рис. 3.9, 3.10).
Кроме анализа количественных характеристик В-лимфоцитов, были проанализированы отклонения содержания иммуноглобулинов классов G, A и M (IgG, IgA и IgM) в сыворотке крови от возрастных референсных значений и возрастная динамика данных показателей у пациентов с ГБ.
Анализ возрастной динамики уровня IgG у пациентов с ГБ показал достоверное увеличение его концентрации с возрастом (рис.3.12А), что соответствует и возрастной динамике референсных значений, однако, анализ процента отклонения концентрации IgG от референсных значений показал, что с возрастом увеличивается процент пациентов с повышенным уровнем IgG (рис. 3.12Б).
Анализ возрастной динамики уровней IgА и IgМ также показал достоверное увеличение их количества с возрастом (рис. 3.13А, рис. 3.14А), что соответствует возрастной динамике референсных значений, однако, анализ процента отклонения количества этих класссов иммуноглобулинов от референсных значений показал, что с возрастом увеличивается процент пациентов с повышенным уровнем IgА (рис. 3.13Б). Анализ процента отклонения количества IgМ от референсных значений показал, что у большинства пациентов уровень IgМ соответствует возрастной норме (рис. 3.14Б).
Абсолютное количество NK-клеток снижается с возрастом и у пациентов с ГБ и в группе сравнения, повторяя динамику снижения общего количества лимфоцитов с возрастом. Несмотря на снижение относительного содержания NK-клеток у пациентов с ГБ в 5-й возрастной группе, их абсолютное количество не отличается от показателей группы сравнения из-за повышенного общего количества лимфоцитов у них (табл. 3.1, рис.3.18).
Анализ динамики относительного количества NК-клеток у пациентов с ГБ показал увеличение количества пациентов со сниженными значениями данного показателя с возрастом (рис.3.19). Относительное количество NК-клеток у детей старше 12 лет (5-я возрастная группа) достоверно ниже данного показателя в группе сравнения (табл.3.1).
Анализ соотношения субпопуляционного состава В-клеток выявил возрастные изменения соотношения В1- и В2- популяций у пациентов с ГБ по сравнению с группой сравнения. В группе сравнения относительное количество В1-клеток (% от всех В-лимфоцитов) достоверно снижалось с возрастом (рис. 3.16). У пациентов с ГБ такой зависимости выявлено не было. Кроме того, у пациентов с ГБ старше 12 лет (5-я возрастная группа) выявлено достоверное повышение абсолютного и относительного количества В1-лимфоцитов (р=0,007 и р=0,018, соответственно), при этом в структуре В-клеток доля В1-лимфоцитов достигала 41 % (рис. 3.16).
Активность внутриклеточных ферментов периферической крови в общей популяции лимфоцитов
Врожденный генетический дефект у пациентов с ГБ приводит к накоплению гликогена в лимфоцитах, что отражается на активности внутриклеточных ферментов, изменяя интенсивность биохимических процессов на внутриклеточном уровне. Показатели активности внутриклеточных ферментов, отражающих интенсивность работы дыхательной цепи митохондрий (СДГ, НАДН-Д), гликолиза (ЛДГ), глицерофосфатного челночного механизма (ГФДГ) представлены в табл.5.3.
Было выявлено достоверное снижение активности СДГ у пациентов с ГБ по сравнению с группой сравнения, причем снижение общей активности фермента происходило за счет снижения количества очагов ферментной реакции (рис. 5.4А) и за счет снижения площади ферментной реакции (рис. 5.4Б). Оптическая плотность фермента достоверно не отличалась от таковой в группе сравнения (табл. 5.3).
Отмечен большой разброс показателей активности СДГ в группе пациентов с ГБ. При анализе возрастной динамики показателей общей активности СДГ, достоверных отличий, связанных с возрастом пациентов выявлено не было (рис. 5.5).
Активность ГФДГ в общей популяции лимфоцитов была достоверно снижена у пациентов с ГБ по сравнению с группой сравнения (рис. 5.6). Снижение было характерно для 100% пациентов с ГБ. При этом, достоверных отличий, связанных с возрастом пациентов не выявлено.
У пациентов с ГБ достоверно снижена активность НАДН-Д по сравнению с группой сравнения (р=0,000, критерий Манна-Уитни). Снижение активности НАДН-Д происходило за счет снижения площади очагов ферментной реакции и не затрагивало оптическую плотность гранул при выявлении фермента. Отмечен большой разброс показателей активности НАДН-Д у пациентов с ГБ, выделяется группа пациентов с повышенной активностью этого фермента (рис. 5.7).
Не смотря на то, что не было получено достоверных отличий между III и VI-IX типами, соотношение активностей ферментов, которое можно рассматривать как преобладание того или иного пути метаболизма в клетке достоверно отличаются между типами (табл. 5.5). Было выявлено, что соотношение СДГ/НАДН-Д достоверно снижено при всех типах заболевания по сравнению с группой условно здоровых детей. Причем, у пациентов I типа и III этот индекс достоверно отличался от такового у пациентов VI-IX типов.
Соотношения НАДН-Д/ЛДГ у всех пациентов с ГБ были достоверно выше, чем в группе сравнения из-за меньшего снижения активности НАДН-Д относительно группы сравнения, чем активности ЛДГ. Достоверных отличий между III и VI-IX типами, а также между I и III типами выявлено не было.
Соотношение СДГ/ЛДГ достоверно отличалось от группы сравнения только у пациентов I типа ГБ, это обусловлено в большей степени снижением активности СДГ относительно группы сравнения.
Сумма активностей ферментов, которую можно рассматривать как общую метаболическую активность клетки, была достоверно ниже у пациентов всех типов ГБ по сравнению с группой сравнения (табл. 5.5). При этом получены достоверные различия между I и III типами и между I и VI-IX типами ГБ.
Для сравнения метаболического профиля у пациентов с разными типами ГБ активность всех ферментов нормировали по отношению к активности СДГ в группе сравнения, уровень которой приняли за 100% (рис. 5.12). Наиболее измененный метаболический профиль выявлен при I типе ГБ, отмечается наибольшее снижение активности СДГ лимфоцитов относительно группы сравнения, причем, снижение СДГ более выражено, чем снижение активности НАДН-Д, следствием этого соотношение СДГ/НАДН-Д становится меньше 1 (табл. 5.5). Наименьшие отклонения в метаболическом профиле выявлены при VI-IX типах заболевания.
Исследование соотношения активности СДГ (как наиболее изменчивого показателя) и количества Pas-позитивных лимфоцитов (лимфоцитов, содержащих гликоген) при разных типах ГБ показало, что существует обратная зависимость между данными показателями: чем больше количество клеток, содержащих гликоген, тем ниже активность СДГ, что возможно объясняется токсическим действием накапливающегося гликогена на активность митохондриальных дегидрогеназ (рис. 5.13.).
Таким образом, полученные нами данные свидетельствуют об изменениях активности внутриклеточных ферментов периферической крови в общей популяции лимфоцитов у пациентов с ГБ, которые затрагивают не только обмен гликогена (гликогенез, глюкогенолиз и глюконеогенез), но и ферменты, участвующие в цикле Кребса, дыхательной цепи и гликолизе. Снижение активности ферментов наблюдается у пациентов с ГБ вне зависимости от возраста, однако выявлены достоверные различия между разными типами ГБ, наибольшие изменения метаболического профиля выявлены при I типе заболевания.
Биохимические показатели сыворотки крови у пациентов с разными типами ГБ
Биохимический анализ крови – метод лабораторной диагностики, позволяющий довольно точно судить о функциональном состоянии большинства жизненно важных органов человеческого организма. Показатели биохимического анализа крови играют решающую роль в диагностике целого ряда серьезных заболеваний. Особую диагностическую ценность биохимическое исследование крови имеет при заболеваниях сердца, печени, почек и эндокринной системы.
Традиционными маркерами тяжести состояния пациентов с ГБ служат изменения биохимических параметров. У пациентов с ГБ достаточно часто отмечается снижение рН, гипогликемия, повышение концентрации лактата, повышение содержания триглицеридов («хилезная» сыворотка), общего холестерина, повышение сывороточных концентраций аланинаминотрансферазы (АЛТ), аспартатаминотрансферазы (АСТ), щелочной фосфатазы (ЩФ), гамма-глутамилтрансферазы (ГГТ), лактатдегидрогеназы (ЛДГ).
Анализ биохимических показателей у обследованных пациентов также выявил, что течение ГБ сопровождается повышением сывороточных концентраций АЛТ, АСТ, ГГТ, ЛДГ, повышением концентрации лактата, триглицеридов, общего холестерина по сравнению с референсными значениями данных параметров и степень изменений данных показателей зависела от типа заболевания (табл. 5.7). Так синдром цитолиза был характерен для 50% пациентов, причем в некоторых случаях максимальные значения АЛТ и АСТ достигали 600 Ед/л (рис. 5.20). У пациентов с III типом ГБ синдром цитолиза был максимально выражен (табл. 5.7, рис. 5.20, рис. 5.21).
Концентрация АЛТ в сыворотке крови у пациентов с III типом ГБ была достоверно выше, чем при I и VI-IX типах (табл.5.7, рис. 5.20). Однако у части пациентов с ГБ VI-IX типов наблюдались достаточно высокие показатели АЛТ (рис. 5.20).
Концентрация АЛТ была повышена у 62% пациентов с ГБ вне зависимости от типа. Анализ распределения пациентов по концентрации АЛТ в сыворотке в зависимости от типа ГБ показал, что 50% пациентов с VI-IX типами и 43% пациентов с I типом имели значения, не выходящие за пределы референсных значений, при III типе процент пациентов со значениями АЛТ, соответствующими референсным значением, составлял только 13% (рис. 5.21). У пациентов с I типом максимальные концентрации АЛТ не превышали 280 Ед/л, у пациентов с III типом не превышали концентрации 400 Ед /л, а максимальные концентрации АЛТ при VI-IX типах достигали уровня 580 Ед/л.
Для оценки степени тяжести биохимических нарушений была введена балльная шкала, учитывающая степень отклонения показателей от референсных значений.
Для концентраций АЛТ максимальный балл - 4 был присвоен показателям, соответствующим референсному интервалу (0 - 40 Ед/л), при увеличении концентрации АЛТ до 120 Ед/л присваивался балл - 3, значения в интервале 121-200 Ед/л соответствовали баллу - 2, больше 201 - 1 балл, все значения более 280 Ед/л- 0 баллов.
Анализ распределения пациентов по концентрации АСТ в сыворотке в зависимости от типа ГБ показал, что 47% пациентов с VI-IX типом, 39% пациентов с I типом пациентов имели значения, не выходящие за пределы референсных значений, при III типе процент с пациентов с референсными значениями АСТ составлял только 13% пациентов (рис. 5.23), при этом максимальные концентрации АСТ отмечались у пациентов с III типом и достигали уровня 600 Ед/л.
По аналогии с АЛТ, была сформирована балльная шкала оценки тяжести биохимических изменений для концентраций АСТ: максимальный балл - 4 был присвоен показателям, соответствующим референсному интервалу ( 42 Ед/л), при увеличении концентрации АЛТ до 126 Ед/л присваивался балл - 3, значения в интервале 127-210 Ед/л соответствовали баллу 2, значения в интервале 211-294 Ед/л соответствовали баллу 1, все значения более 294 Ед/л- 0 баллов.
Концентрация глюкозы находилась в пределах референсных значений у 67% пациентов, незначительное повышение отмечалось у 5% пациентов, снижение концентрации было отмечено в 29% наблюдений (рис. 5.25). Причем, стоит обратить внимание, что уровень глюкозы в сыворотке у пациентов с концентрациями соответствующими референсным значениям был ближе к нижней границе. Достоверных отличий по концентрации глюкозы, связанных с типом заболевания выявлено не было.
Анализ распределения пациентов по концентрации лактата в сыворотке в зависимости от типа ГБ показал, только 13% пациентов с I типом имели значения, не выходящие за пределы референсных значений, что достоверно реже, чем при VI типе - 35%, и при III типе - 45% пациентов (рис. 5.27). Для I типа характерны также и максимальные значения концентраций лактата, достигающие уровня 13 ммоль/л.
Балльная шкала оценки биохимических изменений для концентрации лактата: максимальный балл 4 был присвоен показателям, соответствующим референсному интервалу ( 2,2 ммоль/л), при концентрации лактата от 2,3 до 4,4 ммоль/л присваивался балл 3, значения от 4,5 до 6,6 ммоль/л соответствовали баллу 2, от 6,7 до 8,8 ммоль/л - 1 балл, значения более 8,8 ммоль/л - 0 баллов.
Процент пациентов с концентрациями ГГТ в сыворотке, соответствующими референсному интервалу, у пациентов с VI типом составлял 77%, тогда как при I типе - 60%, а при III типе - 53% (Рис. 5.29).
Балльная шкала оценки биохимических изменений для концентраций ГГТ: максимальный балл - 4 был присвоен показателям, соответствующим референсному интервалу ( 35 Ед/л), при концентрации а от 35 до 70 Ед/л присваивался балл - 3, значения от 70 до 105 Ед/л соответствовали баллу - 2, от 105 до 140 Ед/л - 1 балл, все значения более 140 ммоль/л - 0 баллов.
Достоверных различий по уровню холестерина у пациентов с разными типами ГБ получено не было (табл.5.7, рис. 5.32А). Повышенные концентрации холестерина отмечались у 35% пациентов с ГБ (рис. 5.32Б).
Балльная шкала оценки биохимических изменений для концентраций холестерина: максимальный балл 4 был присвоен показателям, соответствующим референсному интервалу ( 5,2 ммоль/л), при концентрации а от 5,3 до 10,4 ммоль/л присваивался балл - 3, значения от 10,4 до 15,6 Ед/л соответствовали баллу – 2.