Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1 Обзор литературы 15
1.1 Современные взгляды на клинико-эпидемиологическую характеристику, этиологию, патогенез и клиническую картину системной красной волчанки 15
1.2 Эндотоксин и эндотоксин-связывающие факторы в норме и патологии 29
Резюме 41
ГЛАВА 2 Материалы и методы 43
2.1 Характеристика этапов исследования 43
2.2 Клиническая характеристика исследуемых групп 46
2.3 Методики иммунологического и биохимического исследования 55
2.4 Статистическая обработка данных 63
ГЛАВА 3 Результаты исследования 66
3.1 Результаты исследования клинико-эпидемиологической характеристики системной красной волчанки в Республике Крым 66
Резюме 74
3.2 Состояние общего иммунного статуса, ЭСФ и системного воспаления у больных СКВ 75
3.3 Результаты исследования общего иммунного статуса, ЭСФ и системного воспаления у больных различной степенью активности СКВ 91
Заключение.
Обсуждение полученных результатов 104
Выводы 123
Практические рекомендации 125
Дальнейшие перспективы развития исследования 125
Список сокращений и условных обозначений 126
Список литературы
- Эндотоксин и эндотоксин-связывающие факторы в норме и патологии
- Клиническая характеристика исследуемых групп
- Состояние общего иммунного статуса, ЭСФ и системного воспаления у больных СКВ
- Результаты исследования общего иммунного статуса, ЭСФ и системного воспаления у больных различной степенью активности СКВ
Введение к работе
Актуальность темы исследования
Системная красная волчанка (СКВ) является одним из наиболее тяжелых аутоиммунным воспалительных заболеваний соединительной ткани, приводящих к летальному исходу. Известно, что в течение 10 лет 28% больных СКВ умирают от поражений жизненно важных органов [GillJ.M.etal., 2003]. Частота встречаемости СКВ возрастает с каждым десятилетием: в период с 1950 по 1979 гг. она составила 1,51 на 100 тыс. населения, с 1980 по 1992 гг. - 5,56 на 100 тыс. населения [MakA. etal., 2012]. По данным российских исследований, распространенность данного заболевания колеблются в диапазоне от 4 до 250 случаев на 100 тыс.населения [Насонов Е.Л., 2013].В настоящее время болезнь имеет четкую тенденцию к манифестации в более раннем возрасте и характеризуется, как правило, тяжелым течением, нередко резистентным к проводимой базисной терапии [Клюквина Н.Г. 2015]. Данная патология неуклонно приводит к инвалидизации пациента, а учитывая ее гендерную предрасположенность к женскому полу, в дальнейшем, приводит к невозможности вынашиваемости плода, развитию антифосфо-липидного синдрома и вынужденному бесплодию [Ильина А.Я. и соавт. 2016].
Все это побуждает исследователей к поиску новых возможных механизмов самоподдержания органоспецифического аутоиммунного воспаления, а также поиску методов патогенетической коррекции.
В данное время, существует множество противоречивых теорий объясняющих этиологию и частные аспекты патогенеза данного заболевания, но современные исследования подтверждают мультифакториальность этиологии и патогенеза специфического волчаночного воспаления [MokC.C., LauC.S., 2002]. Одним из возможных факторов возникновения воспаления принято считать хронические инфекционные процессы. Таким фактором может выступать дисбаланс кишечной микрофлоры со смещением состава в сторону грамнегативных бактерий, гиперпродукциейлипополисахарида, поступление его в системный кровоток и развитие специфических иммунных нарушений, способных инициировать и поддерживать аутоиммунное воспаление [Яковлев М.Ю., 2015;SanderH., 2001]. Так в работах А.В. Караулова и соавт. (2015 г.) описано особое значение микрофлоры ротовой полости, в том числе и грамнегативной, в мукозальном иммунитете человека, и соответственно, в общей реактивности организма. Известно, что ЭТ является мощнейшим провоспалительным фактором и способен приводить к неспецифической поликлональнойВ- и Т-лимфоцитарной активации [KammerG.M. etal., 2002].
Его интегральный эффект определяется ЭТ-нейтрализующей силой организма. При этом существуют данные, что патологическое действие ЭТ обусловлены тем сильнее, чем в большей мере выраженность поступление ЭТ в системный кровоток. В вышей мере эндотоксинемия может привести к токсическому шоку при несостоятельности ЭТ- нейтрализующих систем организма [VanAmersfoortE.S., 2003; Яковлев М.Ю., 2015].
Отсутствие понимания пускового механизма и полной картины патогенеза данного
заболевания - определяют актуальность изучения новых возможных механизмов
самоподдержания аутоиммунного волчаночного воспаления, поиска недостающих
патогенетических звеньев с возможностью дальнейшего терапевтического влияния на них: все вышеперечисленное и определяет актуальность, теоретическую и практическую значимость выбранной темы.
Степень разработанности темы
Вопросами распространенности, клинического течения диагностики и вариантов лечения СКВ занимались С.К. Соловьев, Е.Л. Насонов, А.А. Новиков, Е.Н. Александрова (ФГБНУ «Научно-исследовательский институт ревматологии», г. Москва). Вопросы генетических и иммунологических факторов в развитии СКВ изучались О.А. Свитич, А.В. Власовой (ФГБУ «Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова», РАМН, г. Москва). Фундаментальные и клинические вопросы влияния эндотоксина на воспалительные процессы в организме человека исследовались М.Ю. Яковлевым, И.А. Аниховской (ФГБНУ «Научно-исследовательский институт общей патологии и патофизиологии», г. Москва). Вопросами частного влияния эндотоксина на органы и системы при отдельных заболеваниях и состояние антиэндотоксиного иммунного ответа изучали: В.Г. Лиходед (ФГБУ «Федеральный научно-исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи», г. Москва), Г.Р. Хасановой, О.Ю. Карпухин (ФГБОУ ВО «Казанский государственный медицинский университет», г. Казань), А.И. Гордиенко, К.В. Абрамова, Али МохамадТаха, Ю.В. Сульская (ГУ «Крымский государственный медицинский университет им. С.И. Георгиевского», г. Симферополь).
В ходе изучения имеющихся исследований, представленные научные школы не раскрывали влияния эндотоксин-связывающих факторов (ЭСФ) на патогенез и самоподдержание системного аутоиммунного воспаления, так же, как и не исследовалось влияние гуморального и клеточного звена ЭСФ непосредственно у больных с системной красной волчанкой. Исходя из вышеуказанного, выбранная тема диссертационного исследования представляет интерес, как с точки зрения фундаментального изучения влияния эндотоксин-связывающих факторов или систем на патогенетические механизмы при СКВ, так и с точки зрения практического применения полученных данных в диагностике состояния активности заболевания, что и обусловило выбранные цели и задачи данной работы.
Цель исследования
Определить системные показатели ключевых звеньев иммунитета у больных системной красной волчанкой во взаимосвязи с морфофункциональным состоянием клеточных и гуморальных эндотоксин-связывающих факторов, а также клинико-эпидемиологические особенности этого заболевания в Республике Крым.
Задачи исследования
-
Определить современные клинико-эпидемиологические особенности системной красной волчанки в Республике Крым.
-
Изучить системные показатели клеточного и гуморального иммунитета у больных СКВ разной степени активности в сравнении с таковыми у клинически здоровых лиц в крымской популяции.
-
Определить морфофункциональное состояние гуморальных и клеточных звеньев эндотоксин-связывающей системы у больных СКВ разной степени активности в сравнении с таковым у клинически здоровых лиц в крымской популяции.
-
Изучить взаимосвязь показателей гуморальных и клеточных звеньев эндотоксин-связывающей системы с показателями общего иммунного статусау больных СКВ.
-
Изучить взаимосвязь показателей гуморальных и клеточных звеньев эндотоксин-связывающей системы с биохимическими маркерами системного воспаления и степенью активности СКВ.
6. Сформулировать практические рекомендации по использованию клеточных и
гуморальных показателей эндотоксин-связывающей системы в целях прогноза течения СКВ.
Основные положения, выносимые на защиту
1. Клинико-эпидемиологические показатели заболеваемости СКВ в Республике Крым
характеризуются увеличением частоты распространенности в последнем десятилетии,
цикличностью темпа прироста, увеличением встречаемости в предгорных и степных зонах
полуострова, без четкой тенденции различий среди этнических слоев населения.
2. У больных СКВ выявлена девиация эндотоксин-связывающих систем, представленная в
снижении клеточных и увеличении концентрации гуморальных показателей данной системы,
наиболее выраженные изменения представлены у лиц с высокой степенью активности
заболевания.
3. Изменения показателей гуморальных и клеточных эндотоксин-связывающих систем
(антиэндотоксиновых антител, уровня экспрессии рецепторов CD14 и эндотоксин-связывающей
способностью нейтрофилов) периферической крови больных СКВ взаимосвязаны с показателями
системного воспаления (ЦИК, СРБ, индексом эндогенной интоксикации) и общего иммунного
статуса (уровнем общего сывороточного IgА, CD4+, CD8+, CD19+ и CD3+/16+/56+ лимфоцитами
и фагоцитарной активностью нейтрофилов).
4. Определение уровня антиэндотоксиновыхIgG в сыворотке крови и способности
моноцитов периферической крови связывать FITS-меченый липополисахарид у больных СКВ
может использоваться для прогноза течения заболевания.
Научная новизна
В работе впервые проанализированы и определены современные клинико-
эпидемиологические характеристики СКВ в Республике Крым. Впервые выявлены взаимосвязи
между гуморальным и клеточным звеном ЭСФ и общего иммунитета у больных СКВ в сравнении с относительно здоровыми лицами. Найдены общие патогенетические звенья аутоиммунного процесса и дисбаланса ЭСФ при СКВ. Сформулировано влияние и доказана взаимосвязь ЭСФ в поддержании аутоиммунного воспаления у больных I и II степенью активности СКВв Республики Крым. Выявлены взаимосвязи между гуморальными и клеточными ЭСФ и уровнем иммунной реактивности организма.Основываясь на полученных результатах, определены новые методы диагностики активности СКВ, включающие определение активности клеточных и гуморальных звеньев эндотоксин-связывающих систем.
Теоретическая и практическая значимость работы
По результатам исследования выявлена современная клинико-эпидемиологическая характеристика СКВ в Республике Крым являющаяся актуальной информацией, как в образовательном процессе, так и в практическом здравоохранении. Разработаны клинико-диагностические рекомендации по выявлению первичных случаев СКВ. На основе исследования разработаны теоретические аспекты взаимосвязи аутоиммунного волчаночного воспаления с ЭСФ, которые существенно дополняют патогенетическую картину СКВ. Выявлены корреляционные взаимосвязи между уровнем антиэндотоксиновыхIgG и показателями системного воспаления, при этом повышенный титр антител не обеспечивает адекватное уменьшение ЭТ-стимула на клеточные эндотоксин-связывающие системы. На основе чего предложены практические рекомендации по дополнительным критериям выявления факторов риска утяжеления течения волчаночного воспаления, включающие определение концентрации антиэндотоксиновых антител класса G и уровня экспрессии эндотоксин-связывающих рецепторов на моноцитах.
Методология и методы исследования
Методы исследования включали: общеклиническое обследование пациентов (107 человек) и доноров (40 человек), клинико-эпидемиологическое исследование распространенности и заболеваемости СКВ в Республике Крым, иммунологические исследования периферической крови (у 48 пациентов и 40 доноров): определение концентрации общих иммуноглобулинов классов A, M и G, определение специфических эндотоксин-связывающих антител классов A, M и G, концентрации С-реактивного белка, молекул средней массы и индекса эндогенной интоксикации, циркулирующих иммунных комплексов, фагоцитарной активности нейтрофилов и фагоцитарного числа методом твердофазного иммуноферментного анализа (тИФА) и его модификаций. Определение концентрации основных субпопуляций лимфоцитов (CD3+, CD19+, CD4+, CD8+, CD3 HLADR, CD3+/16+/56+, CD3-/16+56+), определение уровней экспрессии эндотоксин-связывающих рецепторов, меченных LPS-FITCи СD14 рецепторов на моноцитах и гранулоцитах методами проточной лазерной цитофлюорометрии.
Степень достоверности и апробация результатов
Научные положения, описанные данные, выводы и рекомендации, сформулированные в работе, базируются на исследовании 107 больных СКВ на ретроспективном этапе и 48 больных СКВ с их письменного согласия на проспективном этапе, при этом контрольную группу составили 40 относительно здоровых донора. Дизайн исследования включал клиническую оценку исследуемых, а так же современные лабораторные исследования. Исследование проводилось с использованием современных методик иммунологического анализа, а именно проточной цитофлоуметрии с определением экспрессии различных рецепторов на иммунокомпитентных клетках, а так же иммуноферментного анализа. В работе исследовано 23 специфических иммунологических параметра, которые проводились в лаборатории клинической иммунологии ЦНИЛ Медицинской академии им. С.И. Георгиевского ФГАОУ ВО «Крымский федеральный университет им. В.И. Вернадского» с 2011 по 2015, где автор был соисполнителем. Полученные данные были статистически обработаны в лицензионной программе «MedStat» (ТОВ «Альфа») а также «Statistica 6.0» (StatSoftInc.) с использованием параметрических и непараметрических методов оценки результатов. Учитывая вышесказанное, можно считать, что полученные научные положения, выводы и рекомендации, сформулированные в диссертации, являются достаточно обоснованными и достоверными.
Диссертационная работа прошла апробацию на проблемной комиссии по терапии и внутренней медицине (совместном заседании кафедр по терапевтическим дисциплинам: кафедры внутренней медицины №1 с курсом клинической фармакологии, кафедры внутренней медицины №2, кафедры внутренней медицины №3, кафедры пропедевтики внутренних болезней, кафедры гастроэнтерологии, кардиологии и общей врачебной практики (семейной медицины), кафедры фтизиатрии и пульмонологии, кафедры общественного здоровья и здравоохранения, кафедры лучевой диагностики илучевой терапии) Медицинской академии имени С.И. Георгиевского ФГАОУ ВО «КФУ им. В.И. Вернадского» 12 января 2017 г., г. Симферополь).
Основные положения и выводы диссертации были представлены автором на 84-ой
Международной научно-практической конференции студентов и молодых ученых
«Теоретические и практические аспекты современной медицины» (21-23 марта 2012 г., г.
Симферополь), Международном конгрессе студентов и молодых ученых «Актуальные проблемы
современной медицины»» (17-19 октября 2012 г., г. Киев), Всеукраинская научно-практическая
конференция ассоциации ревматологов Украины «Инновационные методы диагностики и
лечения ревматических заболеваний» (25-26 октября2012г, г. Киев),
AnnualCongressEuropeanAcademyofAllergyandClinicalImmunology (7–11 June 2014, Copenhagen,
Denmark), AnnualMeetingofAmericanCollegeofAllergy, Asthma&ImmunologyACAAI (6-10
November, 2014 Atlanta, Georgia, USA), III International conference of chemical engineering and
medicalscience (2-10 January, 2015, Dubai, UnitedArabEmirates), I научная конференция
профессорско-преподавательского состава, аспирантов, студентов и молодых ученых «Днинауки
Крымского Федерального Университета им. В.И. Вернадского» (28 октября 2015 г., г. Симферополь), Научно-практическая конференция молодых ученых и студентов «Молодая наука» (5- 6 ноября 2015 г., г. Евпатория), Научно-практическая конференция «Актуальные вопросы диагностики и лечения ревматологических заболеваний в общеклинической практике: возможности реализации персонифицированного подхода» (15 апреля 2016 г., г. Симферополь).Научно-практическая конференция молодых ученых и студентов «Молодая наука» (10-11 ноября 2016 г., пгт.Заозерное), Annual Scientific Meeting - American College Of Allergy, Asthma & Immunology ACAAI (10-15 November, 2016, San Francisco, USA).
Личный вклад автора
Автором самостоятельно проведен патентно-информационный поиск, анализ научной литературы по теме диссертации, определены цель и задачи, методы научно-исследовательской работы. Автором самостоятельно проводился набор пациентов для клинического и иммунологического обследования, формирование групп исследования, самостоятельный сбор крови для исследования, первичная лабораторная обработка полученных образцов, построение вариационных рядов полученных лабораторных показателей, статистическая обработка данных. Самостоятельно описаны результаты собственных исследований и обсуждений, сформулированы выводы, практические рекомендации, положения, выносимые на защиту. Диссертанту принадлежит основная роль в написании научных статей, которые опубликованы в соавторстве. Личный вклад автора составляет 90% при получении результатов и 75% при оформлении публикаций по теме диссертации.
Внедрение результатов в практику
Теоретические и практические данные результатов исследования внедрены на кафедру внутренних болезней №1 и №2 Медицинской академии имени С.И. Георгиевского (структурное подразделение) ФГАОУ ВО «Крымский федеральный университет имени В.И. Вернадского» в курс иммунологии и аллергологии и в цикл ревматологии. Практические данные работы внедрены в отделении ревматологии Государственного бюджетного учреждения здравоохранения Республики Крым «Клиническая больница имени Н.А. Семашко», г. Симферополь.
Соответствие диссертации научной специальности
Основные научные положения диссертации соответствуют паспорту специальности 14.03.09 – клиническая иммунология, аллергология, а именно области исследований: «Фундаментальные исследования, посвященные изучению строения, функционирования иммунной системы и механизмов иммунной защиты. Изучение патогенеза иммунозависимых заболеваний (иммунодефицитных состояний, аллергической и аутоиммунной патологии). Разработка и усовершенствование методов диагностики, лечения и профилактики аллергических и иммунопатологических процессов».
Публикации
Основные материалы и положения диссертационного исследования были изложены в 10 печатных работах, в том числе: 3 статьи в журналах рекомендованных ВАК Министерства образования и науки Российской Федерации, 1 статья в журнале рекомендованном ВАК Украины (приравнено к изданиям из перечня ВАК Министерства образования и науки Российской Федерации), 1 статья в зарубежном англоязычном журнале и 5 тезисов научных докладов.
Объем и структура диссертации
Эндотоксин и эндотоксин-связывающие факторы в норме и патологии
Исходя из данных описанных в предыдущей теории о прямой активации CD4+ и CD8+ лимфоцитов эндотоксином, можно предположить, что избыточная активация данных лимфоцитов может приводить к их функциональным нарушениям, что и является основным положением теории расстройства иммунологической регуляции. При этом сила функционального расстройства антагонистических лимфоцитов поддерживается хроническим влиянием ЭТ, что в последующем приводит и к органическим нарушениям рецепторного аппарата Т-лимфоцитов и закреплению стойких извращенных функциональных эффектов, где дальнейшее участие эндотоксина не является обязательным.
Другая теория нарушения идиотип-антиидиопатических взаимодействий (ИАВ), имеет отражение в генезе как аутоиммунных и ревматических заболеваний, так и СКВ в частности [43, 99], рассматривает сдвиг идиопатической сети в сторону аутоантительного образования у больных активной СКВ. При этом в периоды стойкой ремиссии такие нарушения не были найдены. Данная теория описанная N. Jerne (1974 г.) как: «Специфическое взаимодействия между антигенраспознающими молекулами и несущими их лимфоцитами на основе узнавания детерминант (идиотипов), локализованных в гипервариабельной области V-доменов иммуноглобулинов или Т-клеточных рецепторов» [190]. Основным иммунологическим субстратом в данной теории является образование аутоантител к собственным иммуноглобулинам, хотя и у здоровых лиц обнаруживаются данные антитела, по этому, описанные реакции считаются физиологическими [145]. Лишь стойкие нарушения в идиотипических детерминантах антиген-реактивных лимфоцитов, одновременно с активацией классического иммунного ответа, способно приводить к развитию аутоиммунного воспаления. При этом ИАВ обеспечивают саморегуляцию классического иммунного ответа на чужеродные агенты по типу обратной связи [45].
Современные исследования пускового механизма аутоантительного ИАВ, описано на примере возникновения ревматоидного фактора (аутоантител к IgG), аутоантител к коллагену II типа и антителами к антигену микроорганизмов, где доказано, что антиколлагеновые аутоклоны получают активационный сигнал опосредованно через идиотип-антиидиотипические взаимодействия с лимфоцитами, несущими ревматоидный фактор в качестве идиотипа [11, 170, 216]. При этом ведущую роль в данном взаимодействии опять отводят ЛПС, как кофактору данных реакций [189].
В теории инфекционного генеза аутоиммунных заболеваний ведущую роль относят вирусным и бактериальным инфекциям. По данным А.И. Дядыка и соавторов (2009 г.) : «В последние годы отмечается активация исследований возможной роли вирусной инфекции в развитии СКВ, что связано с установлением наличия отчетливых взаимоотношений молекулярной иммунологической мимикрии между протеинами вируса Эпштейна — Барр и некоторыми ауто-АТ при волчанке у человека и экспериментальных животных» [99]. Что подтверждается исследованиями по активации лимфопролиферативных заболеваний, а именно В-лимфоцитарной активации и влияния на CD8+ и CD4+ лимфоциты, в условиях наличия данной инфекции [142, 158]. Аналогичные влияния в развитии ревматоидных заболеваний, в том числе и СКВ, рассматриваются при участии цитомегаловирусов, вирусов простого герпеса 1 и 6 типов, вирусов гепатита В и С (HBV, HCV), вирусов Коксаки А13, аденовирусов, вирусов краснухи, паротита, парвовирусов В19 и др. [71, 188].
Существуют аналогичные данные и о бактериальных агентах в генезе аутоиммунных ревматических заболеваний [10]. Важную роль среди которых имеют и компоненты грамнегативной флоры кишечника, а именно E. coli, P. mirabilis и др. [67, 142, 161, 170].
При изучении аспектов теории мимикрии в возникновении СКВ, значение компонентов грамнегативной флоры не доказано. Хотя известно, что антигены грамотрицательных бактерий обладают высокой антигенной перекрестной активностью в организме человека. Так антигены белка РДС-Е2 E.coli перекрестно реагируют с пируватдегидрогеназным комплексом митохондрий гепатоцитов, вызывая развитие первичного биллиарного цирроза, считающегося аутоиммунной патологией [48, 219]. Вместе с тем, имеется достоверная прямая связь между первичным биллиарным циррозом и развитием аутоиммунного гастрита [131].
Современные исследования рассматривают участие грамнегативных бактерий Helicobacter pylori и Campylobacter jejuni, как самостоятельного звена в развитии аутоиммунного гастрита. Антитела к H.pylori действуют на париетальные клетки слизистой оболочки желудка, выступая в этой роли как мимикринные агенты [191, 207, 228].
Eight S.и соавторы (1996 г.) выделили особую форму аутоиммунного гастрита — «активный аутоиммунный гастрит», возникающий на фоне Н. рylori - инфекции [166]. Мoran A.P. и соавторы (2001 г.) в своих работах доказали, что в роли перекрестного антигена к клеткам желудочно-кишечечного тракта выступает именно ЛПС C. jejuni и Н. рylori [206]. По этому, недооценивать влияния компонентов бактериальной стенки грамнегативных бактерий в развитии аутоиммунного процесса посредством антигенной мимикрии и соответственно их место в теории молекулярной мимикрии не стоит.
Клиническая характеристика исследуемых групп
Определение субпопуляций лимфоцитов периферической крови проводили методом проточной лазерной цитофлуориметрии с использованием флуоресцентных коньюгатов моноклональных антител (МКА) фирмы «DakoCytomation, Denmark A/S» [198]. В соответствии с рекомендациями производителя МКА, к 100 мкл цельной гепаринизированной крови (50 Ед гепарина/мл крови) прибавляли по 10 мкл коньюгата соответствующих моноклональных антител с флюорохромом, тщательно перемешивали и инкубировали в течение 15 мин в темноте при комнатной температуре. Для лизиса эритроцитов к суспензии клеток крови добавляли по 100 мкл реагента А из набора для лизиса эритроцитов CyLyse (CyTecs GmbH, Germany), перемешивали и инкубировали в течение 10 мин в темноте при комнатной температуре. Затем прибавляли по 2,5 мл реагента В из набора для лизиса эритроцитов CyLyse, перемешивали и инкубировали в течение 20 мин в темноте при комнатной температуре. Анализ образцов проводили на проточном цитофлюориметре PAS-III (Parteс GmbH, Munster, Germany). Процентное содержание субпопуляций лимфоцитов определяли с помощью программного комплекса Partec FloMax Operation and Analysing SoftWare Version 2/4d (Parteс GmbH, Munster, Germany). 2.3.2 Методика определения уровня экспрессии рецепторов СD14 и эндотоксинсвязывающего потенциала (рецепоров LPS-FITS) на моноцитах и гранулоцитах
Уровень экспрессии рецепторов СD14 и ЛПС-связывающий потенциал (ЛПС-СП) моноцитов и гранулоцитов периферической крови определяли методом проточной лазерной цитофлуориметрии, используя в качестве флуоресцентного зонда коньюгат липополисахарида с флуоресцеинизотиоцианатом (ЛПС-ФИТЦ) [25]. Лейкоциты выделяли из образцов ПК 50 практически здоровых людей путем разрушения эритроцитов лизирующим раствором на основе хлорида аммония [28]. К 100 мкл цельной стабилизированной крови (использовали стандартный стабилизатор на основе цитрата (3,8%-й) прибавляли 3 мл рабочего разведения (1:10) лизирующего раствора, перемешивали и инкубировали в течение 10 мин при комнатной температуре (+18-20 С). Лейкоциты осаждали центрифугированием в течение 5 минут при 1000 оборотах в минуту, трижды промывали 3 мл 0,01 молярного фосфатного буфера (рН 7,4), содержащего 1%-й NaCl и 0,05%-й NaN3 (PBS-NaN3), после чего ресуспендировали в 100 мкл PBS-NaN3. При необходимости выделенные лейкоциты хранили не более 2 часов при комнатной температуре (+18-20 С). Затем к 25 мкл суспензии лейкоцитов прибавляли 12,5 мкл раствора коньюгата ЛПС-ФИТЦ в рабочем разведении 1:20 (концентрация ЛПС 50 мкг/мл) и 12,5 мкл бычьего сывороточного альбумина (0,6 мг/мл) (БСА; Sigma Chem. Co., USA). Для разведения ингредиентов использовали PBS-NaN3. Контролем служил PBS-NaN3. После тщательного перемешивания пробирки инкубировали в темноте в течение 30 минут при комнатной температуре (+18-20 С). Затем в пробирки вносили по 1 мл PBS-NaN3, снова перемешивали и анализировали на проточном цитофлуориметре PASIII (Partec GmbH, Munster, Germany). Для сбора и анализа результатов использовали программное обеспечение Partec FloMax V. 2.4d, а также WinMDI 2.8 (Joseph Trotter, Scripps Institute, La Jolla, CA). Для каждого образца регистрировали не менее 10 тысяч клеток, для которых фиксировали параметры переднего (Forward-scattered lіght, FSC) и бокового (Sіdе-scattered lіght, SSC) светорассеяния в линейном масштабе, а также флуоресценции по каналу FL1 в четырехразрядном логарифмическом масштабе. Средняя интенсивность флуоресценции моноцитов или гранулоцитов характеризует уровень экспрессии этими клетками ЛПС-связывающих рецепторов.
Фагоцитарную активность гранулоцитов периферической крови оценивали методом проточной лазерной цитофлуориметрии, используя в качестве тест-объекта суспензию бактерий Escherichia coli КЗО и Staphilococcus aureus конъюгированных с флуоресцеинизотиоцианатом (ФИТЦ; Isomer I, Sigma Chem. Co., USA). Лейкоциты выделяли из образцов ПК 50 практически здоровых людей путем разрушения эритроцитов лизирующим раствором на основе хлорида аммония [28]. К 100 мкл цельной стабилизированной крови (использовали стандартный стабилизатор на основе цитрата (3,8%-й) прибавляли 3 мл рабочего разведения (1:10) лизирующего раствора, перемешивали и инкубировали в течение 10 минут при комнатной температуре (+18-20 С). Лейкоциты осаждали центрифугированием в течение 5 минут при 1000 оборотах в минуту, трижды промывали 3 мл 0,01 молярного фосфатного буфера (рН 7,4), который содержит 1%-й NaCl, 3,8 ммолль KCl и 5 ммоль глюкозы (PBS-глюкоза), после чего ресуспендировали в 100 мкл PBS с глюкозой. При необходимости выделенные лейкоциты хранили не более 2 часов при температуре близкой к 0 С в водной бане, заполненной водой с кусочками льда. Для определения поглотительной активности фагоцитирующих клеток к 25 мкл суспензии лейкоцитов прибавляли 25 мкл разбавленной (1:600) суспензии Е. coli КЗО, предварительно убитых прогреванием при +50 С и конъюгированных с ФИТЦ. Для разведения ингредиентов использовали PBS с глюкозой. После тщательного перемешивания пробирки инкубировали в темноте в течение 30 минут при +37 С. Затем для остановки процесса фагоцитоза в пробирки вносили по 1 мл 0,01 молярного фосфатного буфера (рН 7,4), содержащего 1%-й NaCl и 0,05%-й NaN3, который содержит 5 ммоль ЭДТА-Na2, снова перемешивали и анализировали на проточном цитофлуориметре PASIII (Partec GmbH, Munster, Germany). Для сбора и анализа результатов использовали программное обеспечение Partec FloMax V. 2.4d. Для каждого образца регистрировали не менее 10 тысяч клеток, для которых фиксировали параметры переднего (Forward-scattered lіght, FSC) и бокового (Sіdе-scattered lіght, SSC) светорассеяния в линейном масштабе, а также интенсивность флуоресценции по каналу FL1 в четырехразрядном логарифмическом масштабе. Кластеры гранулоцитов выделяли с помощью функции [Polygon gаtіng rеgіоn] по характерным для любой с этих клеточных субпопуляций параметрам переднего (FSC) и бокового (SSC) светорассеяния. После этого на гистограммах интенсивности флуоресценции клеток по каналу FL1 для кластеров гранулоцитов с помощью функции [Gаtіng rеgіоn range] определи процентное содержание клеток, в которых интенсивность флуоресценции большее, чем 101. Данный показатель отражает процент клеток, которые поглотили как минимум один флуоресцентно меченный тест-объект, и отвечает фагоцитарному индексу (проценту клеток, которые вступили в фагоцитоз). Потом с помощью функции [Fіt Gauss Peaks], встроенной в процедуру [Peak аnаlуsіs] рассчитывали средний уровень флуоресценции тех клеток, которые поглотили флуоресцентно меченный тест-объект. Этот показатель эквивалентный фагоцитарному числу (среднему числу бактерий, которые находятся внутри фагоцита).
Состояние общего иммунного статуса, ЭСФ и системного воспаления у больных СКВ
Статистически значимые отрицательные умеренные взаимосвязи были обнаружены также между уровнем анти-ЭТ-IgG с одной стороны и концентрацией Т-хелперов (CD4+), СРБ, индексом ИЭ и уровнем палочкоядерных нейтрофилов с другой стороны. Уравнения регрессии приведены в Формулах 11-14. анти-ЭТ-IgG = (47,34- CD4) /10,45 (11)
Примечание. анти-ЭТ-IgG - уровень соответствующего антитела (ед.опт.пл), CD4 - концентрация CD4+ лимфоцитов (%). Коэффициент детерминации R=0,1 при p= 0,035. анти-ЭТ-IgG = (46,5 - СРБ) / 29,8 (12) Примечание. анти-ЭТ-IgG - уровень соответствующего антитела (ед.опт.пл), СРБ - концентрация СРБ (мг/мл). Коэффициент детерминации R=0,117, при p= 0,018. анти-ЭТ-IgG = (2,39 - ИЭИ) / 0,44 (13) Примечание. анти-ЭТ-IgG - уровень соответствующего антитела (ед.опт.пл), ИЭИ - индекс эндогенной интоксикации (ед.). Коэффициент детерминации R=0,1, при p= 0,045. анти-ЭТ-IgG = (10,24 - ПЯ) / 4,44 (14) Примечание. анти-ЭТ-IgG - уровень соответствующего антитела (ед.опт.пл), ПЯ - концентрация палочкоядерных нейтрофилов (%). Коэффициент детерминации R=0,095, при p= 0,037.
При исследовании корреляционной связи между иммунными и воспалительными показателями и дозой принимаемых ГКС у больных СКВ была выявлена статистически значимая прямая связь средней силы между дозой ГКС и СОЭ (r=0,54, p 0,01), а также очень слабые и слабые зависимости между дозой ГКС и уровнем экспрессии LPS-FITS на моноцитах (r= 0,23, p=0,02), с уровнем CD4+ лимфоцитов (r= 0,197, p=0,04), с уровнем CD3+ HLADR лимфоцитов (r=0,22, p=0,02), с фагоцитарным индексом (r= 0,29, p 0,01).
На этапе проспективного исследования, при сравнении иммунологических и воспалительных показателей у больных СКВ и лиц контрольной группы было выявлено, что показатели лейкоцитарной формулы у больных стремятся к лейкопении с характерным сдвигом лейкоцитарной формулы влево. В иммунограмме больных СКВ выявлено статистически значимое увеличение количества Т-лимфоцитов (CD3+), активированных Т-лимфоцитов (CD3+ HLADR+), цитотоксических лимфоцитов (CD8+), а также снижение В-лимфоцитов (CD19+), NK-клеток (CD3-/16+56+). Резко сниженными в группе СКВ оказались фагоцитарный индекс и число. При исследовании гуморального звена иммунитета достоверные отличия наблюдались в увеличении уровня общего IgG у больных СКВ. В исследовании ЭСФ у больных СКВ было выявлено статистически значимое снижение CD14 и LPS-FITS рецепторов, как на моноцитах, так и на гранулоцитах в сравнении со здоровыми лицами. При этом индекс соотношения данных рецепторов на исследуемых пулах клеток был ниже в группе СКВ. В гуморальном звене ЭСФ у больных СКВ наблюдалось резкое увеличение анти-ЭТ-IgG. Полученные данные свидетельствуют о депрессии клеточного и активации гуморального звена ЭСФ. Показатели системного воспаления (СРБ, ЦИК, СОЭ) были во много раз выше в группе СКВ, выше оказался и индекс эндогенной интоксикации. При изучении корреляционных связей между показателями ЭСФ с одной стороны и общего иммунного статуса, системного воспаления с другой и между собой, были выявлены связи между уровнем экспрессии эндотоксиновых рецепторов и ЦИК, фагоцитарным индексом и числом, уровнем лейкоцитов (умеренные прямые связи), а также с общим IgА, CD19+ и CD3+/16+/56+ лимфоцитов, СРБ, степенью активности СКВ (умеренные обратные связи). Корреляционные связи в гуморальном звене ЭСФ были выявлены между: анти-ЭТ-IgА и возрастом пациентов, анти-ЭТ-IgM и CD19+ лимфоцитами (умеренные прямые связи), а также между анти-ЭТ-IgM и CD8+ лимфоцитами, анти-ЭТ-IgG и CD4+ лимфоцитами, СРБ, индексом ИЭ, уровнем палочкоядерных нейтрофилов (умеренные обратные связи). На основе данных взаимосвязей были построены уравнения линейной регрессии (зависимости данных показателей). Наличие указанных корреляционных связей свидетельствует о тесном взаимном влиянии ЭСФ на механизмы формирования как общего иммунного ответа так и системного воспаления. Обнаруженные связи минимальной силы между уровнем дозы принимаемых ГКС и уровнем экспрессии LPS-FITS на моноцитах, уровнем CD4+ и CD3+ HLADR лимфоцитов, фагоцитарным индексом, свидетельствуют о незначительном влиянии применяемой стероидной терапии на указанные показатели.
Результаты исследования общего иммунного статуса, ЭСФ и системного воспаления у больных различной степенью активности СКВ
Повышенным на 51,1% у больных СКВ по сравнению с лицами контрольной группы, оказался и уровень цитотоксических лимфоцитов (CD8+), что полностью совпадает с литературными данными и патогенетической картиной СКВ [61, 183]. У больных со II степенью активности СКВ уровень данного клона лимфоцитов был выше, чем у больных I степенью СКВ на 8%. Данное изменение указывает на то, что с увеличением степени активности волчаночного процесса, усиливается и пролиферация CD8+ лимфоцитов, что также свойственно для патогенеза активности СКВ.
Известно, что в патогенезе СКВ, как основного представителя аутоиммунной нозологии, имеются выраженные признаки чрезмерной активации и пролиферации В-лимфоцитов и логично предположить, что у больных данной патологией должно быть выявлено увеличение субпопуляции данных клеток. Но современные исследования утверждают, что в патогенезе и лабораторной диагностике СКВ более важным является не столько общий уровень В-лимфоцитов, а сколько их качественный состав и функциональная активность [158]. В работах Lapter S. и соавт. (2011 г.) было показано, что патология CD74 рецепторного аппарата лимфоцитов, обнаруженная у больных СКВ, может приводить к снижению выживаемости B-лимфоцитов [132]. По данным N. Gao и соавт. (2014 г.), основным субстратом патогенеза аутоиммунного воспаления при СКВ является разнообразная, как органическая, так и функциональная патология В-клеточного звена иммунитета, где механизмами инициации и/или самоподдержания выступает Т-клеточное звено [172].
При определении уровня общих В-лимфоцитов (CD19+) в настоящем диссертационном исследовании в иммунограмме больных СКВ выявлено их статистически значимое снижение на 21,3%, что свидетельствует о В-лимфопении. При этом у лиц с низкой степенью активности заболевания, В-лимфопения была выражена намного сильнее (на 36%). Данное изменение, на основе вышеуказанных литературных данных, можно трактовать, как закономерное снижение данного иммунного показателя в связи с переходом нативных В-лимфоцитов (CD19+, CD27-) в активированные лимфоциты, а в последующем в плазматические клетки, которые утрачивают кластер дифференцировки CD19+. По мнению исследования H. Fan и соавт. (2014 г.), именно длительно живущие плазматические клетки возможны к синтезу ряда антител при СКВ, которые достаточно резистентны к проводимой иммунодепрессивной терапии [135]. В дальнейшем, с ростом активности заболевания, свойственно и с более длительным стажем данного процесса, уровень В-лимфоцитов увеличивается, но не достигает нормативных значений, что может свидетельствовать о том, что в инициальном патогенетическом периоде заболевания, идет активная пролиферация В-лимфоцитов, а при более высокой степени СКВ, с учетом полученных в исследовании данных о увеличении уровня общего IgG и антител к ЭТ того же класса, сдвигается в гуморальную сторону иммунного ответа, что и отражает усиление активности СКВ.
При исследовании уровня общих иммуноглобулинов, нами было определенно, что достоверных различий уровней IgA, IgM у больных СКВ и доноров не выявлено, при незначительном статистически значимом увеличении (на 5,3%, p=0,031) концентрации IgG по сравнению с лицами контрольной группы. При этом сопоставив данные об уровнях IgМ и IgG можно определить в каком направлении, а точнее, в каком временном промежутке антигенной нагрузки находится организм исследуемых пациентов. В данном исследовании можно с уверенностью сказать, что больные СКВ находятся на этапе иммунной хронизации воспалительных процессов. Незначительное увеличение IgG может быть результатом приема ГКС, которые могут подавить Т-лимфоцитарную индукцию в синтезе данного иммуноглобулина плазмоцитами. Изменений уровней иммуноглобулинов у больных с различной степенью активности не выявлено. Изучение врожденного звена иммунитета, а именно фагоцитарной активности лейкоцитов у больных СКВ показала резкое снижение, как фагоцитарного числа на 25,3% , так и индекса в 2,6 раза по сравнению с контролем. С возрастанием степени СКВ, снижается и активность фагоцитоза (на 4% фагоцитарного числа, на 6% индекса) Современные данные подтверждают, что фагоцитарную активность лейкоцитов непосредственно снижают провоспалительные цитокины (IL-8, TNF, IL-6, IL-1) [153, 229, 231], которые и являются патогенетическим субстратом аутоиммунного воспаления при СКВ, и именно данные цитокины выделяются при активации эндотоксином рецепторов CD14 на моноцитах и макрофагах [168, 226]. Также существуют достоверные данные, что посредством Toll-лайк рецепторов 4 типа (TLR4) происходит активация фагоцитоза [29]. Активация фагоцитоза необходимое условие для процессинга антигенного материала и его презентации в определенной иммуногенной форме. Персистирующее ЭТ-воздействие на данные фагоцитарные клетки и патология ЭСФ может приводить, по нашему мнению, к нарушению всех этапов обработки антигенного материала: от поглощения до презентации. Особым методом саморегуляции данного иммунного процесса является «замкнутый круг» - при увеличении фагоцитарной активности происходит активация клеток миелоидного ряда, которые в свою очередь выделяют цитокины снижающие данную активность. По этому интегральный эффект снижения фагоцитарной активности зависит в данном случаи, как и от активности волчаночного воспаления, так и от дисфункции ЭСФ. С учетом обнаруженных в данном исследовании корреляционных связей между фагоцитарной активностью с иными иммунными, воспалительными и антиэндтоксиновыми показателями, интегральная картина активации и угнетения врожденного звена иммунитета представлена на Рисунке 4.1.