Роль Toll - подобных рецепторов 9 типа (TLR9) в реализации иммунотропных эффектов натриевой соли ДНК эукариот в системе in vitro Русинова Татьяна Викторовна

Введение к работе

Актуальность темы исследования и степень ее разработанности

Интерес к нуклеиновой кислоте как к лекарственному средству обусловлен тем, что
нуклеиновые кислоты являются одним из важнейших компонентов иммунного гомеостаза
организма (Серебряная Н.Б., Калинина Н.М. Нуклеотидная регуляция иммунного ответа:
теоретические основы и практические возможности. Мед. иммунология. 2006. Т.8, №2–3.
С.462–463), обладают широким спектром общебиологических и иммунотропных эффектов
(Пак В.Г. и др. Сравнительная оценка естественных и синтетических

олигодезоксинуклеотидов на основе CpG ДНК. Rus. J. Immunol. 2004. Vol. 9. P. 20), а
расстройства нуклеинового обмена являются причиной индукции иммунопатологических
процессов (Федянина Л.Н. и др. Лекарственные препараты и биологически активные добавки
к пище на основе нуклеиновых кислот различного происхождения. Тихоокеанский
медицинский журнал. 2007. № 4. С. 9–12). При этом известны иммунотропные эффекты
препаратов нуклеиновых кислот микробного (нуклеинат натрия, ридостин, ларифан),
животного (деринат, ферровир) происхождения, а также искусственно синтезированных
нуклеиновых кислот (полудан), что позволяет считать их иммуномодуляторами [1]. Между
тем сохраняет актуальность углубленное изучение иммунотропных эффектов данных
препаратов, выявление их активного действующего начала и возможных механизмов их
действия, с точки зрения которых большой интерес представляют Тoll–подобные рецепторы
(TLRs), играющие важную роль в формировании как врожденного, так и приобретенного
иммунитета (Takeda K., Akira S. Toll–like receptors in innate immunity. Int Immunol. 2005. Vol.
17. P.1–14), [2]. Среди 13 типов TLRs человека, особый интерес представляют Toll-
подобные рецепторы 9–го типа (TLR9), представляющие собой эндосомальный рецептор,
распознающий неметилированные нуклеотиды CpG, обычно встречающиеся в

бактериальных и вирусных геномах, а также синтетические олигодезоксирибонуклеотиды (O'Mahony D.S. et al. Differential constitutive and cytokine-modulated expression of human Toll– like receptors in primary neutrophils, monocytes, and macrophage. Int J Med Sci. 2008. Vol. 5(1). P. 1–8). Благодаря способности стимулировать иммунную систему позвоночных и усиливать иммунный ответ на антигены, препараты на основе ДНК, содержащей CpG–мотивы, могут быть использованы для лечения и профилактики таких заболеваний, как астма, аллергия, некоторые виды опухолей, бактериальные и вирусные инфекции и др., а также в качестве адъюванта для ряда вакцин (Francois S. et al. Inhibition of neutrophil apoptosis by TLR agonists in whole blood: involvement of phosphoinositide 3-kinase/Akt and NF-B signaling pathways, leading to increased levels of Mcl-1, A1, and phosphorylated Bad. J Immunol. 2005. Vol. 174 (6). P. 3633–3642). Ранее считалось, что ДНК позвоночных, в отличие от ДНК прокариотов, не оказывает на организм иммунотропного действия, поскольку в ней отсутствуют CpG– мотивы (Касьяненко Ю.И. и др. Получение и свойства производных ДНК из молок лососевых. Известия ТИНРО. 1997. Т. 120. С. 37–43). Однако сегодня известно, что ДНК эукариотов содержит небольшое количество потенциально иммунотропных CpG мотивов (Каплина Э.Н., Вайнберг Ю.П. Деринат – природный иммуномодулятор для детей и взрослых – М., 2005), доказана способность низкомолекулярной ДНК из молок лососевых рыб, повышать функциональную активность фагоцитов, участвовать в регуляции антиоксидантного действия, что подтверждает значение экзогенных нуклеиновых кислот любого происхождения в поддержании гомеостаза и перспективность их применения в качестве иммунокорректоров при состояниях, сопровождающихся развитием вторичной иммунологической недостаточности (Серебряная Н.Б. Нуклеотиды как регуляторы иммунного ответа. Иммунология. 2010. №5. С. 273–281). В частности, отечественный иммунотропный препарат Деринат, как натриевая соль нативной ДНК, выделенной из молок осетровых рыб (Вайнберг Ю.П. и др. Активность лекарственных средств, полученных на основе нативной ДНК в отношении РНК– и ДНК– содержащих вирусов. Медицина. 1995. №6. С. 3–6) преимущественно содержит короткие и средние цепи ДНК, оканчивающиеся

CpG-мотивом (Федянина Л.Н. Влияние дезоксирибонуклеиновой кислоты из молок лососевых рыб на секрецию цитокинов клетками крови здоровых доноров. Медицинская иммунология. 2005. Т. 7, №5–6. С. 617–619), но, несмотря на широкое использование Дерината в клинической практике при различных инфекционных, воспалительных, дегенеративных и других заболеваниях, не до конца изучены факторы, определяющие его иммунотропные свойства, типы отвечающих иммунокомпетентных клеток и механизмы их активации. В этой связи интерес представляет исследование возможного участия ТLR9 в иммунотропных эффектах Дерината, как препарата натриевой соли ДНК эукариот в системе in vitro не только в отношении интактных клеток врожденного иммунитета, но и при их функциональных дефектах, обнаруживаемых при остром инфекционном процессе вирусной и бактериальной этиологии.

Цель исследования

В эксперименте in vitro определить роль Toll-подобных рецепторов 9 типа (TLR9) в иммунотропных эффектах препарата нуклеиновых кислот животного происхождения (Дерината) в отношении функциональной активности фагоцитов периферической крови здоровых лиц и пациентов с острой вирусной и острой бактериальной инфекцией.

Задачи исследования

1. Определить относительное содержание фагоцитов (нейтрофильных гранулоцитов и моноцитов) в периферической крови условно здоровых лиц и пациентов с острой вирусной и бактериальной инфекцией, экспрессирующих TLR9 (CD289), а также характер (поверхностный, внутриклеточный) и плотность их локализации в фагоцитах.

2. Провести сравнительную оценку влияния Дерината и агониста TLR9 (ODN2395) на функциональную активность фагоцитирующих клеток периферической крови здоровых субъектов и пациентов с острой вирусной и бактериальной инфекцией по показателям их рецепторной, фагоцитарной, микробицидной (показатели спонтанного и стимулированного NBT–теста) функции, а также на уровень продукции некоторых провоспалительных цитокинов в системе in vitro.

3. Изучить влияние блокады TLR9 с помощью его антагониста (ODN–TTAGGG) на иммунотропные эффекты Дерината и агониста TLR9 (ODN2395) в отношении нейтрофильных гранулоцитов периферической крови условно здоровых лиц и пациентов с острой вирусной и бактериальной инфекцией, а также на уровень продукции провоспалительных цитокинов клетками периферической крови в системе in vitro.

4. На основе анализа и систематизации полученных данных обосновать возможность TLR9–опосредованного механизма иммунотропных эффектов препарата нуклеиновых кислот животного происхождения (Дерината) у условно здоровых лиц и пациентов с острой вирусной и бактериальной инфекцией.

Методология и методы исследования

Работа носит характер сравнительного экспериментального исследования in vitro. Методология исследования основывалась на позициях диалектического материализма и данных доказательной медицины. В работе использованы иммунологические и статистические методы исследования.

Степень достоверности, апробация результатов, личное участие автора

Достоверность полученных результатов обоснована объемом фактического материала, арсеналом использованных методов исследования. Исследования выполнены на сертифицированном оборудовании (микроскоп «Primo Star Carl Zeiss Microscopy», Германия; проточный цитометр Сytomics FC–500 «Веckman Coulter», США; иммуноферментный анализатор ASCENT, Финляндия; СО₂–инкубатор «New Brunswick Scientific Galaxy 170S», Великобритания.

Основные положения диссертации обсуждены на XII научно–практической конференции молодых ученых и студентов юга России, (г. Краснодар, 2014), на IV съезде физиологов СНГ (г. Сочи – Дагомыс, 2014), на II всероссийской научно–практической конференции с международным участием «Социально–значимые и особо опасные

инфекционные заболевания», (г. Сочи, 2015), на XV всероссийском научном Форуме с международным участием имени академика В.И. Иоффе «Дни иммунологии в Санкт– Петербурге», (г. Санкт–Петербург, 2015).

Личный вклад соискателя состоит в непосредственном участии на всех этапах выполнения диссертационной работы. Основная идея, планирование научной работы, включая формулировку рабочей гипотезы, определение методологии и общей концепции диссертационного исследования проводились совместно с научным руководителем Колесниковой Натальей Владиславовной. Цель и задачи, дизайн исследования сформулированы совместно с научным руководителем. Анализ современной отечественной и зарубежной литературы по изучаемой проблеме проведен лично диссертантом. Проведение научных лабораторных исследований и интерпретация их результатов проводились совместно с сотрудниками центральной научно-исследовательской лаборатории ФГБОУ ВО «Кубанский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения России Г.А.Чудиловой, Л.В.Ломтатидзе, С.В.Ковалевой, С.В.Сторожуком; материалы для исследования (периферическая кровь пациентов с острым инфекционным мононуклеозом, ассоциированным с вирусом Эпштейн-Барр, острым бактериальным тонзиллитом и условно здоровых добровольцев) и их клинико-лабораторная характеристика предоставлена сотрудником ГБУЗ «Специализированная клиническая инфекционная больница» (г. Краснодар) врачом-инфекционистом 1 категории Триско А.А.

Положения, выносимые на защиту:

5. Выявлены различия в характере экспрессии рецептора TLR9 нейтрофильными гранулоцитами и моноцитами периферической крови при острой Эпштейн-Барр-вирусной инфекции (инфекционный мононуклеоз) и при острой бактериальной инфекции (острый бактериальный тонзиллит): моноциты имеют как поверхностную, так и внутриклеточную локализацию данного рецептора, тогда как нейтрофильные гранулоциты отличает только внутриклеточная локализация TLR9 и отсутствие данного рецептора на поверхности как интактных клеток, так и инкубированных в системе in vitro с Деринатом.

6. Деринат и агонист TLR9 (ODN2395) оказывают преимущественно сходное по направленности иммуномодулирующее влияние на функциональную активность фагоцитирующих клеток пациентов с инфекционными заболеваниями бактериальной и вирусной природы при инкубации цельной крови в условиях in vitro, что дает основание предполагать существование общего TLR9–опосредованного механизма их действия.

7. Доказательством существования TLR9–опосредованного механизма иммунотропных эффектов натриевой соли ДНК эукариот (Дерината) является их отмена в условиях предварительной блокады TLR9 его антагонистом ODN–TTAGGG.

Научная новизна

8. Получены новые данные о различиях в характере и плотности локализации Toll-подобного рецептора 9 типа (CD289) у нейтрофильных гранулоцитов (внутриклеточная локализация TLR9) и у моноцитов (внутриклеточная и поверхностная локализация TLR9) периферической крови пациентов с острой Эпштейн-Барр-вирусной и острой бактериальной инфекцией.

9. Впервые в системе in vitro выявлено сходство направленности иммунотропных эффектов препарата нуклеиновых кислот животного происхождения (Дерината) и агониста TLR9 (ODN2395) по отношению к ряду показателей функциональной активности фагоцитов периферической крови здоровых лиц и пациентов с острой вирусной (инфекционный мононуклеоз, ассоциированным с вирусом Эпштейн-Барр) и острым бактериальным заболеванием (острый бактериальный тонзиллит), что может обуславливать, в качестве одного из механизмов влияния Дерината на клетки врожденного иммунитета, TLR9-опосредованный путь иммунорегуляции.

10. Впервые в эксперименте in vitro установлено, что предварительная блокада TLR9 фагоцитов периферической крови условно здоровых лиц и пациентов с острой вирусной (инфекционный мононуклеоз, ассоциированным с вирусом Эпштейн-Барр) и бактериальной

(острый бактериальный тонзиллит) инфекцией антагонистом TLR9 (ODN–TTAGGG) нивелирует иммунотропные эффекты Дерината и агониста TLR9 (ODN2395).

4. Впервые в экспериментальных исследованиях in vitro определена возможность TLR9–опосредованного механизма влияния препарата нуклеиновых кислот животного происхождения (Дерината) на функциональную активность фагоцитов цельной крови здоровых лиц и больных острой вирусной (инфекционный мононуклеоз, ассоциированный с вирусом Эпштейн-Барр) и бактериальной (острый бактериальный тонзиллит) инфекцией.

Теоретическая и практическая значимость работы

Теоретическая значимость настоящей работы состоит в уточнении сведений об экспрессии TLR9 с учетом плотности и характера их локализации макро- и микрофагоцитами периферической крови в норме и при инфекционном процессе, а также в установленном участии TLR9 в иммунотропных эффектах натриевой соли ДНК эукариот (Дерината). Уточнение механизма иммунотропных эффектов препаратов нуклеиновых кислот позволит расширить спектр их применения и определить новые мишени для направленной иммунокоррекции клеток врожденного иммунитета.

Практическая значимость работы заключается в возможности использования выявленных отличий в субпопуляционном составе нейтрофильных гранулоцитов (Положительное решение на выдачу патента «Способ дифференциальной экспресс-диагностики острых вирусных и бактериальных тонзиллитов» у взрослых (заявка № 2015130135/15(046419) от 21.07.2015) в практическом здравоохранении для уточнения этиологии и клинической тяжести инфекционного процесса. Наряду с этим разработанные методологические подходы являются теоретической базой для научно обоснованного поиска и рационального отбора новых иммуномодулирующих препаратов нуклеиновых кислот в рамках научных исследований.

Внедрение результатов исследования в практику

Результаты исследования внедрены в деятельность отдела клинико-

экспериментальной иммунологии и молекулярной биологии ЦНИЛ ФГБОУ ВО «Кубанский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации; используются в учебных программах образования слушателей циклов последипломного образования, клинических интернов, ординаторов, а также студентов в области фундаментальной иммунологии на кафедре клинической иммунологии, аллергологии и лабораторной диагностики ФПК и ППС и на кафедре инфекционных болезней и фтизиопульмонологии ФПК и ППС ФГБОУ ВО КубГМУ Минздрава России при проведении практических занятий по теме «Врожденный иммунитет», и в курсе лекций по дисциплине «Иммунология»; в практику работы ООО «СП Плюс» Медицинский центр» г. Краснодара и ГБУЗ «Специализированная клиническая инфекционная больница» г. Краснодара.

Публикации

Соискатель имеет 9 опубликованных работ, из них по теме диссертации опубликовано 8 научных работ общим объемом 1,18 печатных листов, в том числе 4 работы (1 статья, 3 тезиса) в научных журналах и изданиях, которые включены в перечень российских рецензируемых научных журналов и изданий для опубликования основных научных результатов диссертаций, а также 1 работа в зарубежных научных изданиях, 3 работы в материалах региональных, всероссийских и международных конференций.

Объем и структура диссертации