Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Содержание цитокинов/хемокинов в плазме крови обследованных лиц . 38
1.1. Содержание цитокинов/хемокинов в плазме крови больных хроническим вирусным гепатитом С 38
1.2. Особенности содержания цитокинов/хемокинов в плазме крови больных хроническим вирусным гепатитом С в зависимости от стадии фиброза печени 41
1.3. Особенности содержания цитокинов/хемокинов в плазме крови больных хроническим вирусным гепатитом С в зависимости от общелабораторных показателей 50
Глава 2. Содержание субпопуляций лимфоцитов, экспрессирующих CXCR3 и CCR6, в периферической крови обследованных лиц 52
2.1. Содержание субпопуляций лимфоцитов, экспрессирующих CXCR3 и CCR6, в периферической крови практически здоровых лиц и больных хроническим вирусным гепатитом С .52
2.2. Особенности содержания субпопуляций лимфоцитов, экспрессирующих CXCR3 и CCR6, в периферической крови больных хроническим вирусным гепатитом С в зависимости от стадии фиброза печени .57
2.3. Особенности содержания субпопуляций лимфоцитов, экспрессирующих CXCR3 и CCR6, в периферической крови больных хроническим вирусным гепатитом С в зависимости от общелабораторных показателей 63
Глава 3. Экспрессия мРНК генов CXCR3 и CCR6 и их лигандов в биоптатах печени больных хроническим вирусным гепатитом С 65
Гава 4. Обсуждение полученных результатов 67
Заключение 86
Выводы 89
Практические рекомендации 90
Перспективы дальнейшей разработки темы 90
Список сокращений и условных обозначений .92
Список литературы .
- Особенности содержания цитокинов/хемокинов в плазме крови больных хроническим вирусным гепатитом С в зависимости от стадии фиброза печени
- Особенности содержания цитокинов/хемокинов в плазме крови больных хроническим вирусным гепатитом С в зависимости от общелабораторных показателей
- Особенности содержания субпопуляций лимфоцитов, экспрессирующих CXCR3 и CCR6, в периферической крови больных хроническим вирусным гепатитом С в зависимости от стадии фиброза печени
- Особенности содержания субпопуляций лимфоцитов, экспрессирующих CXCR3 и CCR6, в периферической крови больных хроническим вирусным гепатитом С в зависимости от общелабораторных показателей
Особенности содержания цитокинов/хемокинов в плазме крови больных хроническим вирусным гепатитом С в зависимости от стадии фиброза печени
Вирус гепатита С (HCV), вызывающий заболевание, которое ранее относили к группе гепатитов ни А ни В, был идентифицирован в 1989 году Houghton M. и его коллегами [37]. В таксономической иерархии HCV принадлежит к роду Hepacivirus семейства Flaviviridae. HCV содержит однонитевую линейную РНК (длиной примерно 9030-9099 нуклеотидов), нуклеокапсид и белково-липидную оболочку. Геном имеет одну открытую рамку считывания, по краям которой расположены 5 - и 3 -концы нетранслируемого региона. Открытая рамка считывания кодирует полипротеин, длина которого варьирует от 3010 до 3033 нуклеотидов у разных изолятов вируса [37]. Этот полипротеин расщепляется вирусными и клеточными сигнальными протеиназами на 3 структурных и 6 неструктурных белков. К структурным относят ядерный белок (core) и гликопротеины оболочки E-envelope protein 1 и 2 (Е1 и Е2), к неструктурным - комплекс белков с ферментативной активностью (NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A, NS5B).
Для HCV характерна существенная генетическая вариабельность, приводящая к возникновению генетически близких, но иммунологически разграничиваемых популяций [11, 33]. В настоящее время выделяют 6 основных генотипов и более 100 субтипов HCV, для которых установлены географические различия в распространении разных генотипов. Генетическая вариабельность HCV позволяет ему «уклоняться» от иммунного ответа, а также обусловливает различия в течении, исходе заболевания и эффективности терапии.
Функционирование HCV в организме начинается со взаимодействия вируса и клеточных рецепторов с последующим проникновением вируса внутрь клетки. Важную роль в проникновении HCV в клетку играют: молекула CD81 -мембранный белок из семейства тетраспанинов, SR-B1 - скавенджер-рецептор, клаудин-1 и окклудин - белки плотных межклеточных контактов. Также в процесс проникновения HCV в клетку вовлечены липопротеиновые рецепторы низкой плотности, асиалогликопротеиновые рецепторы и глюкозаминогликаны [41]. Таким образом, используя широкий спектр рецепторов, которые экспрессированы на различных типах клеток, HCV способен инфицировать гепатоциты, стромальные клетки щитовидной железы, клетки слюнной и поджелудочной желез, эндотелиальные клетки, моноциты, лимфоциты (Т- и В-лимфоциты) и другие клетки [94]. Однако основное патогенное действие вирус оказывает на ткань печени, в результате которого развивается фиброз, цирроз печени, гепатоцеллюлярная карцинома.
Проникшие внутрь клетки вирусные частицы декапсулируются и вирусная РНК высвобождается в цитоплазму. РНК вируса приводит к изменению внутриклеточных мембран. В мембране эндоплазматического ретикулума формируются, так называемые, мембранные сети, где происходит репликация вирусной РНК [21]. Липидные плотики вовлечены в формирование репликативного комплекса, через белок-белковые взаимодействия белка хозяина hVAP-33 и неструктурных белков вируса - NS5A и NS5B [49]. В целом, мембранные сети представляет собой маленькие везикулы, встроенные в мембрану эндоплазматического ретикулума, и формируют мембран ассоциированный мультипротеиновый комплекс, содержащий все неструктурные белки HCV [44]. Синтез (+) цепи вирусной РНК инициируется с участка, комплементарного (+) 5 -нетранслируемого региона, который в данном случае выполняет роль 3 нетранслируемого региона. Кроме вирусных белков, этот 3 -регион взаимодействует также с рядом клеточных факторов, что может вносить вклад в эффективность регуляции процессов репликации и трансляции [4]. 5 -нетранслируемый регион отличается высокой консервативностью и обеспечивает инициацию трансляции. Специфически связываясь с рибосомами и факторами трансляции клетки-хозяина, он направляет рибосому к инициирующему кодону AUG, после чего начинается синтез полипротеина. Полипротеин процессируется комбинацией вирусных протеиназ и протеиназ клетки-хозяина.
Сборка вирусной частицы остается мало изученным процессом в жизненном цикле HCV. Полагают, что формирование вирусных частиц, начинается со взаимодействия core-белка HCV и вновь синтезированной РНК вируса. В результате достигается не только упаковка РНК, но и репрессия трансляции, что указывает на наличие потенциального механизма переключения «программы» с репликации/трансляции на сборку. При этом в первую очередь молекулы core-белка взаимодействуют друг с другом своими N-концевыми участками. Однако соответствует ли образующаяся структура вирусному нуклеокапсиду или она представляет собой относительно неспецифичный рибонуклеопротеидный комплекс, остается невыясненным.
Типичной особенностью поверхностных гликопротеинов HCV Е1 и Е2 при гетерологичной экспрессии в клеточных культурах является их локализация в эндоплазматическом ретикулуме. Локализация определяется сигнальными последовательностями в трансмембранных областях E1 и E2 [107]. Экспериментальные данные свидетельствуют о том, что присоединение оболочки к нуклеокапсиду происходит при миграции через мембрану эндоплазматического ретикулума. Можно полагать, что вирус выходит из клетки по классическому секреторному пути. Сложные N-гликаны обнаруживаются на поверхности частично очищенных вирусных частиц, что предполагает транзит вируса через аппарат Гольджи.
Таким образом, HCV не обладает прямым цитопатическим действием. Острое и хроническое повреждение клеток при гепатите С происходит, в основном, за счет реализации иммунных реакций в ответ на HCV. Характерной особенностью вирусного гепатита С является высокая частота хронизации инфекции и длительная персистенция вируса в организме. Несмотря на то, что HCV может инфицировать различные клетки организма, основные проявления гепатита С связывают с повреждением ткани печени.
Печень является уникальным органом, с точки зрения анатомии и иммунологии. Паренхима печени состоит из функциональных единиц – долек, в состав которых помимо гепатоцитов, внутридольковых синусоидных капилляров, входят звездчатые клетки (аналог фибробластов), резидентные иммунные клетки: клетки Купфера (макрофаги), дендритные клетки, NK и TNK– клетки, которые являются ключевыми компонентами врожденной иммунной системы [101].
Иммунный ответ при HCV-инфекции развивается также как и при вирусных заболеваниях другой этиологии, однако имеет ряд особенностей. В ответ на инфицирование защитная реакция организма начинается с секреции гепатоцитами IFNs I типа еще до того, как активируются клетки врожденной иммунной системы. При проникновении HCV в клетки-мишени организма вирус взаимодействует с паттерн-распознающими рецепторами, в частности с Toll-like рецепторами эпителиальных, стромальных и иммунных клеток [103]. Происходит активация клеток, в том числе усиливается секреция хемокинов, которая приводит к миграции лейкоцитов в очаг воспаления.
Активация системы врожденного иммунитета приводит к развитию реакций приобретенного иммунитета, представленного Т- и В-клетками. Клетки приобретенной иммунной системы имеют высокую специфичность к соответствующим антигенам, это достигается путем клональной экспрессии рецепторов, репертуар которых поддерживается в результате генетических перестроек. После активации Т- и В- лимфоциты начинают быстро пролиферировать. Ключевую роль в противовирусной защите играет клеточный иммунитет. Связь между системой врожденного и приобретенного иммунитета осуществляется в основном посредством дендритных клеток, которые захватывают вирусные антигены, мигрируют в лимфатические узлы и активируют наивные Т-клетки [64, 70].
Естественную элиминацию HCV связывают с успешным контролем инфекции иммунной системой. В этом случае формируется адекватный, интенсивный и высокоспецифический Т-клеточный ответ против антигенов HCV [27, 58]. Для выполнения своих эффекторных функций лимфоциты должны мигрировать в очаг воспаления, этот процесс контролируют хемокины. Однако в большинстве случаев острого гепатита С выздоровления не происходит, а у 70-80% больных развивается хроническая инфекция, которая, безусловно, является следствием нарушений противовирусного иммунитета. Хроническое воспаление часто сопровождается привлечением в печень неспецифических иммунных клеток.
Особенности содержания цитокинов/хемокинов в плазме крови больных хроническим вирусным гепатитом С в зависимости от общелабораторных показателей
При корреляционном анализе между показателями цитокинов/хемокинов в плазме крови и тяжести фиброза печени было установлено наличие статистически значимых прямых взаимосвязей концентраций TNF (r=0,48, р 0,0001), ССL2/MCP-1 (r=0,42, р 0,0001), CCL20/MIP-3 (r=0,35, р=0,0004), CXCL9/MIG (r=0,38, р=0,0001) с выраженностью фиброза печени. Наибольший коэффициент корреляции был установлен при описании прямой зависимости между уровнями CXCL10/IP-10 (r=0,70, р 0,0001) и CXCL11/ITAC (r=0,52; р 0,0001) в плазме крови и стадией фиброза печени (рисунок 1).
Актуальной задачей является разработка малоинвазивного способа диагностики стадии фиброза печени при ХВГС, который упростит процедуру диагностики и повысит точность определения стадии фиброза печени на ранних стадиях заболевания, что позволит подобрать адекватную терапию и тактику ведения больного, а также оперативно выявить группы риска.
Определение стадии фиброза печени на ранних этапах заболевания достаточно проблематично, поэтому наибольший интерес представляет поиск биомаркеров, с помощью которых можно дифференцировать ранние стадии фиброза печени (F0-1 и F2). С этой целью, был проведен ROC-анализ, построены характеристические ROC-кривые и определены ППК (рисунок 2). Проведенный анализ свидетельствуют о том, что среди исследованных нами цитокинов/хемокинов наиболее информативен уровень СXCL11/ITAC в плазме крови для разделения больных ХВГС со стадиями фиброза F0-1 и F2 (чувствительность 57,1%; специфичность 80,0%; ППК=0,71; критерий 232,1 пг/мл; р=0,02). Диагностическая значимость вирусной нагрузки была несколько ниже и составила: чувствительность 53,8%; специфичность 77,3%; ППК=0,69; критерий 2,9x105 МЕ/мл; р=0,04, медианные значения в группе FO-1: 8,0x104 (4,2х 103-3,4х Ю5) копий/мл, F2: 3,6хЮ5 (6,2х Ю4-5,3х Ю5) МЕ/мл.
При разделении стадий фиброза F2 и F3-4 был выявлен один информативный показатель – уровень TNF в плазме крови (чувствительность 60,3%; специфичность 80%; ППК=0,81; критерий 13,6 пг/мл; р=0,0063). Графическое изображение полученной ROC-кривой представлено на рисунке 3. TNFa
Данные ROC-анализа показали, что ни один из выделенных показателей по отдельности не обладает высокой чувствительностью при фиксированной специфичности (80%), что исключает возможность их изолированного использования целью дифференциальной диагностики стадий фиброза печени. Для решения вопроса о диагностической ценности комбинированного использования биомаркеров был применен метод многомерного статистического анализа данных деревьев классификации с целью определения принадлежности объектов к тому или иному классу в зависимости от значений признаков, характеризующих данный объект. Для решения этой задачи использовали статистическую программу JMP 11.0. В результате было установлено, что совместное определение трех цитокинов CXCL11/ITAC, TNF и CCL20/MIP-3 является достаточным для оценки стадии фиброза печени у больных ХВГС. Значения ППК для трех цитокинов были более 0,80, что говорит об очень хорошем качестве выбранной модели (рисунок 4). 4а 4б
ROC-кривые, характеризующие зависимость чувствительности и специфичности трех цитокинов CXCL11/ITAC, TNF и CCL20/MIP-3 при сравнении групп больных ХВГС с разными стадиями фиброза печени. 4а: ROC-кривые при сравнении групп больных ХВГС с F0-1 и F2. 4б: ROC-кривые при сравнении групп больных ХВГС с F2 и F3-4. Примечание. Sensitivity – Чувствительность; Specificity – Специфичность; ППК – площадь под характеристической ROC-кривой.
В результате анализа были получены следующие пороговые значения для дифференциальной диагностики F0-1 и F2: CXCL11/ITAC - 166,5 пг/мл, TNF -15,7 пг/мл, CCL20/MIP-3 - 10,6 пг/мл; для дифференциальной диагностики F2 и F3-4: TNF - 15,7 пг/мл, CXCL11/ITAC - 301,8 пг/мл, CCL20/MIP-3 - 15,5 пг/мл. Использование данного алгоритма для диагностики стадий фиброза печени позволяет повысить чувствительность метода до 70-90% при достаточной специфичности (70-90%). Сущность разработанного алгоритма определения стадии фиброза печени у больных ХВГС поясняется деревьями решений, представленными на рисунке 5. F0-1 и F 2
5а: дерево решений для разделения групп больных ХВГС с F0-1 и F2. 5б: дерево решений для разделения групп больных ХВГС с F2 и F3-4. 1.3. Особенности содержания цитокинов/хемокинов в плазме крови больных хроническим вирусным гепатитом С в зависимости от общелабораторных показат елей
При корреляционном анализе статистически значимых связей между уровнем вирусной нагрузки и содержанием цитокинов/хемокинов в плазме крови больных ХВГС не выявлено.
В то же время, положительная корреляционная зависимость обнаружена между стадией фиброза печени и уровнем вирусной нагрузки (r=0,75; p 0,0001) у лиц, инфицированных HCV. Следовательно, при прогрессировании ХВГС наблюдается тенденция к нарастанию вирусной нагрузки.
Содержание АЛТ и АСТ в крови являются широко используемыми маркерами поражения паренхимы печени и гепатоцеллюлярного некроза. Установлено, что в плазме крови больных ХВГС содержание АЛТ и АСТ в 2,7 и 1,7 раз (p 0,0001) превышало медианные значения практически здоровых доноров. При корреляционном анализе взаимосвязей между уровнями АЛТ и АСТ и содержанием цитокинов/хемокинов в плазме крови больных ХВГC выявлена прямая положительная связь между содержанием АСТ и концентрацией хемокина CXCL9/MIG (r=0,48; p=0,002), рисунок 6. Таким образом, при возрастании уровня АСТ наблюдается тенденция к увеличению концентрации хемокина CXCL9/MIG.
Корреляционная зависимость между содержанием АСТ и CXCL9/MIG в плазме крови больных ХВГС. Примечание. r – коэффициент корреляции Спирмена.
В зависимости от генотипа HCV у больных ХВГС обнаружено изменение концентрации одного показателя - хемокина CCL8/MCP-2 (рисунок 7). Так в плазме крови больных, инфицированных 1-м генотипом HCV, статистически значимо возрастало содержание CCL8/MCP-2 по сравнению с контрольной группой и группой больных, инфицированных другими генотипами HCV (2 и 3а) (р=0,0003 и р=0,01 соответственно). Таким образом, содержание CCL8/MCP-2 возрастает только в группе пациентов, инфицированных 1-м генотипом HCV.
Особенности содержания субпопуляций лимфоцитов, экспрессирующих CXCR3 и CCR6, в периферической крови больных хроническим вирусным гепатитом С в зависимости от стадии фиброза печени
Содержание основных субпопуляций лимфоцитов в крови практически здоровых лиц не выходило за референсные интервалы распределения данных субпопуляций.
В периферической крови больных ХВГС абсолютное количество лимфоцитов значительно превышало показатели здоровых доноров (р=0,0053): ХВГС - Ме=1974хЮ6/л (1393хЮ6/л; 2817хЮ6/л) лимфоцитов, контроль -Ме=1467хЮ6/л (1191хЮ6/л; 1814хЮ6/л) лимфоцитов. При этом, в группе больных ХВГС значительно возрастало количество Т-клеток (CD45+CD3+) Ме=1587хЮ6/л (1074хЮ6/л; 2361хЮ6/л), по сравнению с контрольной группой Ме=1089хЮ6/л (967,8хЮ6/л; 1393хЮ6/л) (р=0,0024). Среди Т-клеток у пациентов с ХВГС по сравнению со здоровыми лицами увеличивалось количество как Th-клеток (CD45+CD3+CD4+): ХВГС - Ме=846,ЗхЮ6/л (666,7хЮ6/л; 1313хЮ6/л); контроль - Ме=663,2хЮ6/л (551,2хЮ6/л; 915,7хЮ6/л); р=0,0083, так и ЦТЛ (CD45+CD3+CD8+): ХВГС - Ме=565,6х 106/л (362,0х Ю6/л; 793,8х Ю6/л); контроль -Ме=328,4хЮ6/л (240,9хЮ6/л; 397,5хЮ6/л); р=0,0003. Количество В-лимфоцитов, NK- и TNK-клеток не отличалось в исследованных группах. Таким образом, количество лимфоцитов у больных ХВГС увеличивалось за счет Т-клеток. Различий в соотношениях основных субпопуляций лимфоцитов у больных ХВГС и условно здоровых доноров не выявлено. Результаты определения количества субпопуляций лимфоцитов, экспрессирующих хемокиновые рецепторы CCR6 и CXCR3 в периферической крови практически здоровых доноров и больных ХВГС приведены в таблице 8. Из данных, указанных в таблице 8 видно, что все исследованные субпопуляции лимфоцитов условно здоровых лиц несут на своей поверхности хемокиновые рецепторы CXCR3 и CCR6. Причем, хемокиновый рецептор CCR6 в норме присутствует практически на всех В-лимфоцитах. Относительное содержание TNK-лимфоцитов, несущих хемокиновый рецептор CCR6 в крови больных ХВГС было в 1,9 раз меньше (р=0,01), чем в крови условно здоровых доноров. С другой стороны, абсолютное содержание ЦТЛ, экспрессирующих хемокиновый рецептор CCR6 в 4,4 раза превышало (р 0,0001) медианные значения в группе больных ХВГС по сравнению с условно здоровыми донорами.
В периферической крови больных ХВГС абсолютное количество CXCR3-положительных Т-клеток (CD45+CD3+CXCR3+) в 1,8 раз (р 0,0001) превышало количество данных клеток в группе условно здоровых доноров, при этом относительное содержание CXCR3+Т-лимфоцитов увеличивалось только в 1,1 раза (р=0,0087) по сравнению с контрольной группой.
Абсолютное количество Th-клеток, экспрессирующих молекулу CXCR3 (CD45+CD3+CD4+CXCR3+) в крови пациентов с ХВГС превысило в 1,8 раза значения контрольной группы (р 0,0001), относительное количество CXCR3+Th-клеток возрастало в 1,3 раза в группе больных ХВГС (р 0,0001). Абсолютное количество CXCR3-положительных ЦТЛ не отличались в исследованных группах, однако в крови больных ХВГС значительно (в 1,4 раза) уменьшилось содержание CD45+CD3+CD8+CXCR3+ клеток относительно ЦТЛ (р=0,0002) по сравнению с условно здоровыми донорами. Таблица 8 - Количественная характеристика субпопуляций лимфоцитов, экспрессирующих хемокиновые рецепторы CCR6 и CXCR3 в крови практически здоровых лиц и больных ХВГС
Примечание. Ме – медиана; Q1-Q3 - нижний и верхний квартили. Для сравнения двух выборок был использован тест Манна-Уитни. Медианные значения содержания В-клеток, экспрессирующих молекулу CXCR3, в крови пациентов с ХВГС статистически значимо в 3,3 раза превышало значения контрольной группы (р 0,0001), количество CD45+CD19+CXCR3+ клеток относительно В-лимфоцитов превышало значения группы условно здоровых доноров в 3,5 раза в группе больных ХВГС (р 0,0001).
Абсолютное количество NK-клеток, несущих на своей поверхности рецептор CXCR3 в периферической крови больных ХВГС не отличалось от значений в контрольной группе. Установлено, что содержание CXCR3+NK-клеток в крови инфицированных HCV относительно NK было в 2,4 раза ниже значений в группе здоровых доноров (р=0,0001).
Количество CXCR3+TNK-клеток в крови больных ХВГС оказался в 2 раза меньше, чем в группе условно здоровых лиц р=0,0026. Содержание TNK-клеток, экспрессирующих молекулу CXCR3 в группе больных ХВГС уменьшилось в 1,3 раза (р=0,0172) по сравнению с группой условно здоровых доноров.
Таким образом, в периферической крови больных ХВГС по сравнению с практически здоровыми лицами возрастает количество Тh-клеток и В-лимфоцитов, несущих молекулу CXCR3 и снижается количество ЦТЛ, NK и TNK, экспрессирующих данный рецептор.
Следующим этапом работы являлся корреляционный анализ для выяснения вопроса наличия взаимосвязи между концентрацией цитокинов/хемокинов в плазме крови и экспрессией хемокиновых рецепторов на субпопуляциях лимфоцитов у больных ХВГС. В результате анализа была обнаружена отрицательная корреляционная зависимость между содержанием IFN в плазме крови и количеством Т-клеток, экспрессирующих хемокиновый рецептор CXCR3 (r= -0,46; p=0,001), содержанием CXCR3+ЦТЛ (r= -0,40; p=0,004), CXCR3+NK-клеток (r= -0,38; p=0,009) и CXCR3+TNK-клеток (r= -0,32; p=0,02). Также была выявлена отрицательная зависимость между концентрацией TNF в плазме крови и количеством Т-лимфоцитов, экспрессирующих хемокиновый рецептор CXCR3 (r= -0,36; p=0,01). Интересно отметить, что в группе здоровых доноров подобных корреляционных связей не выявлено. Таким образом, у больных с ХВГС при возрастании уровней IFN и TNF в плазме крови наблюдается тенденция к снижению количества клеток, обладающих цитотоксической активностью, несущих на своей поверхности хемокиновый рецептор CXCR3.
Значимых корреляционных связей между стадией фиброза печени и содержанием основных субпопуляций лимфоцитов в крови больных ХВГС не выявлено. В то же время установлено, что у больных ХВГС с тяжелым фиброзом/циррозом печени (F3-4) значительно снижается абсолютное количество Т-клеток (р 0,0001) по сравнению с группой с умеренным фиброзом (F2). Так в группе F3-4 содержание Т-клеток снижалось в 2,5 раза и составило -Ме=930,3106/л (434,4106/л - 1934,0106/л) клеток, по сравнению с группой F2 – Ме=2361,0106/л (1619,0106/л - 4801106/л) клеток. При этом снижалось количество как Th-клеток, так и ЦТЛ (р 0,0001; р=0,0002). В группе F3-4 количество клеток составило: Th-клетки - Ме=666,7106/л (302,0106/л -1138,0106/л) и ЦТЛ - Ме=178,3106/л (112,8106/л - 640,1106/л), в группе F2 количество клеток составило Th-клетки – Ме=1313106/л (774,6106/л -2804106/л) и ЦТЛ – Ме=847,1106/л (565,6106/л -1430106). Таким образом, в крови больных ХВГС с выраженным фиброзом/циррозом печени существенно снижается количество Т-лимфоцитов (Th-клеток и ЦТЛ).
В таблице 9 представлены результаты сравнительного анализа содержания субпопуляций лимфоцитов, экспрессирующих хемокиновые рецепторы CCR6 и CXCR3 в периферической крови условно здоровых лиц и группах больных ХВГС с различными стадиями фиброза печени.
Особенности содержания субпопуляций лимфоцитов, экспрессирующих CXCR3 и CCR6, в периферической крови больных хроническим вирусным гепатитом С в зависимости от общелабораторных показателей
Проведенное в диссертационной работе комплексное исследование профиля некоторых цитокинов/хемокинов и рецепторов хемокинов CCR6 и CXCR3 в крови и ткани печени при различных стадиях ХВГС позволило уточнить иммунопатогенез заболевания и определить роль изученных факторов в лабораторной диагностике фиброза печени.
В качестве контрольной группы сравнения были исследованы образцы крови, полученные от практически здоровых лиц, у которых отсутствовали клинико-лабораторные и морфологические признаки поражения печени, соматические заболевания на момент проведения исследования. В этой группе были определены контрольные значения концентраций некоторых СС-хемокинов, лигандов рецептора CXCR3 и цитокинов, индуцирующих их продукцию, в плазме крови, а также контрольные значения содержания субпопуляций лимфоцитов, экспрессирующих хемокиновые рецепторы CCR6 и CXCR3 в периферической крови.
По сравнению с контрольной группой в плазме крови больных ХВГС статистически значимо увеличивалось содержание TNF и хемокинов CCL2/MCP-1, ССL8/MCP-2, CCL20/MIP-3, CXCL9/MIG, CXCL10/IP-10, CXCL11/ITAC. Обнаружены различия в содержании субпопуляций лимфоцитов, несущих хемокиновые рецепторы CCR6 и CXCR3. В периферической крови больных ХВГС выявлено статистически значимое увеличение содержания CXCR3+ CD4+Т-клеток и В-лимфоцитов, снижение количества CCR6+TNK-клеток, а также снижение количества CXCR3+ субпопуляций клеток, обладающих цитотоксической активностью: CD8+Т-лимфоцитов, NK и TNK-клеток, по сравнению с контрольной группой.
По мере прогрессирования фиброза печени у больных ХВГС отмечалось повышенное содержание в плазме крови хемокинов ССL2/MCP-1, CCL20/MIP-3, CXCL9/MIG, CXCL10/IP-10, CXCL11/ITAC, цитокинов TNF и IFN. Содержание цитокинов CCL20/MIP-3 и IFN не изменялось при слабом и умеренном фиброзе печени, наблюдалось резкое увеличение их концентраций при тяжелой стадии фиброза. Таким образом, возрастание содержания в плазме крови больных ХВГС CCL20/MIP-3 и IFN может служить неблагоприятным признаком развития заболевания.
Для более поздних стадий фиброза печени у больных ХВГС характерно увеличение количества CXCR3+В-клеток и снижение количества CXCR3+ ЦТЛ и NK-клеток в периферической крови. При тяжелой стадии фиброза печени (F3-4) количество CXCR3+CD4+ Т-клеток соответствует контрольным значениям. Таким образом, по мере развития хронической инфекции, вызванной HCV в периферической крови активируется В-клеточное звено и подавляется Т-клеточное. В частности, клетки, обладающие цитотоксической активностью – ЦТЛ и NK-клетки теряют рецептор CXCR3, что может косвенно указывать на их функциональную анергию.
Данное исследование подтверждает значимость цитокинов/хемокинов в иммунопатогенезе ХВГС, в том числе в процессах фиброгенеза и говорит в пользу информативности их определения в плазме крови больных в динамике развития заболевания. Суррогатными маркерами активности фиброза печени могут служить: TNF, ССL2/MCP-1, CCL20/MIP-3, CXCL9/MIG, CXCL10/IP-10, CXCL11/ITAC и количество В-клеток, экспрессирующих рецептор CXCR3, комплексное определение которых в крови можно использовать неоднократно для мониторинга развития заболевания.
В качестве лабораторного способа определения стадии фиброза печени разработан алгоритм, в основе которого лежит совместное определение трех биомаркеров крови TNF, CXCL11/ITAC и CCL20/MIP-3, позволяющий дифференцировать стадии фиброза печени. Данный алгоритм может быть использован для более точной диагностики стадии фиброза печени, в том числе, на ранних этапах заболевания, что позволит подобрать адекватную терапию и тактику ведения больного, а также оперативно выявить группы риска.
Таким образом, результаты данной работы дополняют знания об иммунопатогенезе ХВГС и говорят в пользу важной роли хемокинов и их рецепторов в развитии заболевания. В частности, наибольший интерес по результатам исследования представляют хемокины CXCL9/MIG, CXCL10/IP-10, CXCL11/IAC и их рецептор CXCR3. Результаты, полученные в ходе настоящего исследования, можно поместить в схему, иллюстрирующую иммунопатогенез ХВГС (рисунок 10). Однако стоит учитывать, что патогенез вирусного гепатита С является довольно сложным и зависит как от иммунного ответа организма хозяина, так и от метаболических процессов, влияющих на функции печени. Хемокины – ключевые медиаторы, опосредующие развитие реакций врожденного и адаптивного иммунитета, привлекают в очаг воспаления цитотоксические лимфоциты, играющие решающую роль в элиминации HCV, а также повреждения неинфицированных клеток печени. Кроме того, HCV активно вмешивается в развитие иммунного ответа и метаболические процессы. Для того, чтобы понять патогенез вирусного гепатита С необходимы дальнейшие исследования.