Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Теоретические основы изучения роли моноцитов с онкогенной мутацией JAK2 V617F в развитии фиброза костного мозга при миелопролиферативных неоплазиях 15
1.1. Современные представления о механизмах миелофиброза 15
1.1.1. Патогенез миелофиброза 15
1.1.2. Роль JAK2 V617F 17
1.2. Модели для изучения миелофиброза 22
1.2.1. TPOhigh модели 22
1.2.2. GATA-1low модель 25
1.2.3. JAK2 V617F–модель 27
1.2.4. MPL W515L-модель 28
1.3. Роль макрофагов в развитии фиброза 30
1.4. Молекулярные механизмы возникновения и развития миелофиброза 32
1.4.1. Металлопротеиназы и их ингибиторы в развитии миелофиброза 32
1.4.2. Ростовые факторы в развитии миелофиброза 33
1.4.3. Галектин-3 в развитии миелофиброза 37
1.4.4. Пентраксин-3 в развитии миелофиброза 38
1.5. Лабораторная диагностика миелофиброза 40
1.5.1. Гематологические показатели 40
1.5.2. Кариотипические изменения 41
1.5.3. Молекулярная диагностика 41
1.5.4. Биохимические показатели 42
Глава 2. Материалы и методы 43
2.1. Экспериментальная работа с культурой клеток 43
2.1.1. Создание трансгенной клеточной линии 43
2.1.2 Секвенирование по Сэнгеру 44
2.1.3. Культуральные методы 46
2.1.4. Проточная цитофлуориметрия 48
2.1.5. Анализ молекулярно-генетического профиля и кондиционированных сред от клеточных линий 49
2.2. Исследование материала от пациентов 53
2.2.1 Взятие образцов и отбор пациентов для исследования 53
2.2.2 Исследование мутационного статуса 53
2.2.3. Исследование факторов, участвующих в развитии фиброза костного мозга 56
2.3. Статистическая обработка данных 56
Глава 3. Результаты собственных исследований и их обсуждение 58
3.1. Механизмы активации макрофагов под влиянием активации JAK-STAT пути 58
3.1.1. Характеристика полученных линий после трансдукции 58
3.1.2. Оценка количества живых клеток 59
3.1.3. Экспрессия макрофагами с активированным и неактивированным JAK2 металлопротеиназ и их ингибиторов при культивировании в различных условиях 60
3.1.4. Уровень экспрессии макрофагами с активированным и неактивированным JAK2 ростовых факторов, пентраксина-3 и галектина-3 при культивировании в различных условиях 66
3.1.5. Содержание TGFb, VEGF и ММП-9 в кондиционированных средах от макрофагов с активированным и неактивированным JAK2 в различных условиях культивирования 70
3.1.6 Зависимость эффектов человеческого тромболизата на макрофаги от активности Янус-киназы 72
3.1.7. Влияние сывороточного амилоида А на эффект человеческого тромболизата 73
3.2. Обследование пациентов с МПН 75
3.2.1. Характеристика обследованных пациентов 75
3.2.2. Уровень матриксных металлопротеиназ в сыворотке пациентов с МПН 76
3.2.3. Уровень ростовых факторов в сыворотке пациентов с МПН 77
3.2.4. Уровень галектина-3 в сыворотке пациентов с МПН 79
3.3. Создание лабораторного алгоритма дифференциальной диагностики миелопролиферативных неоплазий 81
3.3.1. Определение уровня ММП-9 и галектина-3 в сыворотке крови для дифференциальной диагностики эссенциальной тромбоцитемии и первичного миелофиброза 81
3.3.2. Клинический случай 84
Заключение 86
Выводы 90
Практические рекомендации 92
Перспективы дальнейшей разработки темы 93
Список сокращений 94
Литература 95
- Роль JAK2 V617F
- Анализ молекулярно-генетического профиля и кондиционированных сред от клеточных линий
- Экспрессия макрофагами с активированным и неактивированным JAK2 металлопротеиназ и их ингибиторов при культивировании в различных условиях
- Клинический случай
Введение к работе
Актуальность исследования
Актуальной проблемой клинической лабораторной диагностики является определение лабораторных диагностических маркеров гематологических заболеваний (Мартынкевич И. С., 2010; Грицаев С. В., 2011; Кисиличина Д. Г., 2012; Обухова Т. Н., 2012; Фидарова З. Т., 2012; Никитин Е. А., 2012; Луговская С. А., 2013; Абдулкадыров К.М., 2014, 2015; Наумова Е.В., 2014; Хвастунова А. Н., 2015; Плеханова О. С., 2016;). Одним из важных направлений является поиск дифференциально-диагностических маркеров при миелопролиферативных неоплазиях (МПН), к которым относят хронический миелоидный лейкоз (ХМЛ), истинную полицитемию (ИП), эссенциальную тромбоцитемию (ЭТ), первичный миелофиброз (ПМФ) и некоторые другие более редкие заболевания (Абдулкадыров К. М., 2013). Развивающийся при МПН фиброз костного мозга приводит к замещению кроветворной ткани соединительной, что приводит к полной либо частичной его функции. При ПМФ фиброз костного мозга является ведущим состоянием, определяющим течение заболевания, при ИП и ЭТ может развиваться как осложнение, что существенно ухудшает течение и прогноз (Agarwal, 2015). При этом механизмы стромальной регуляции при фиброзе костного мозга остаются неясными, что делает актуальным изучение этиопатогенетических механизмов развития миелофиброза с использованием морфологических, генетических, молекулярно-биологических и экспериментальных методов исследования. Считается, что основными продуцентами цитокинов, стимулирующих миелофиброз, являются мегакариоциты и клетки моноцитарно-макрофагального ряда (Wagner-Ballon, 2006), при этом предполагается, что макрофаги активируются во вторую очередь под действием факторов, вырабатываемых патологическими мегакариоцитами. Основным патогенетическим механизмом развития Ph-негативных МПН является активация JAK-STAT-сигнального пути, которая происходит в результате мутаций в генах JAK2, MPLи CALR (Baxter, 2005; Kralovics, 2005; Levine, 2005; Pardanani, 2006; Pikman, 2006; Nangalia, 2013; Klampfl, 2013). Самой распространенной мутацией является JAK2 V617F (Cross, 2011).
В настоящее время все более широкое распространение получают патогенетические препараты для терапии фиброза костного мозга, такие как ингибиторы Jak и цитокинов, опосредующих фиброз (Harrison, 2012; Verstovsek, 2015). Однако существующие протоколы терапии недостаточно эффективны и необходимо искать новые возможности предотвращения и регрессирующего воздействия на формирование фиброзных изменений, что пробуждает интерес к расширению понимания цитокиновой регуляции изменений стромы костного мозга при этом состоянии.
Создание модельного объекта необходимо для исследования локальных клеточных и молекулярных взаимодействий на уровне стромы костного мозга и глубинного понимания роли отдельных клеточных элементов в наблюдаемом патологическом процессе и является актуальной задачей экспериментальной и лабораторной медицины.
На данный момент не существует специфических маркеров развития фиброза костного мозга. Определенную сложность может иметь дифференциальная диагностика ЭТ и раннего ПМФ – оба заболевания могут протекать с небольшим повышением количества лейкоцитов, тромбоцитозом, анемией легкой и средней тяжести, повышением активности сывороточной ЛДГ и одинаковым мутационным профилем. Основным методом диагностики является визуальный морфологический анализ биоптата костного мозга, однако по современным представлениям методы клинической лабораторной диагностики должны быть автоматизированы, иметь возможность проведения независимого контроля качества и исключать возможность двоякой интерпретации результатов. Это обуславливает разработку на основании клиниколабораторных исследований теоретической базы для поисковых диагностических программ дифференциальной диагностики ЭТ и ПМФ, что является актуальной задачей современной клинической лабораторной диагностики.
Степень разработанности темы исследования
Современные проблемы понимания патогенетических механизмов миелофиброза, его дифференциальной диагностики с другими МПН нашли свое отражение в отечественных и зарубежных исследованиях (Абдулкадыров К. В., 2013; Саврилова А. М., 2014; Булычева Е. Н., 2013; Ковалева Л. Г., 2012, Ольховский И. А., 2014, Дьяконов Д. А., 2015; Мещерякова Л. М., 2011; Vannucchi, 2002; Toki, 2005; Kreipe, 2012; Vytrva, 2014; Wagner-Ballon, 2006, Verstovsek, 2016; Passamonti, 2016; Agarwal, 2015).
Прорывом в понимании молекулярно-генетических основ развития МПН явилось открытии в 2005 году мутации в гене Янус-киназы 2 JAK2 V617F (Baxter, 2005; Kralovics, 2005; Levine, 2005), после чего в 2006 году была обнаружена мутация в гене тромбопоэтинового рецептора MPLW515 (Pardanani, 2006; Pikman, 2006) и в 2013 году – мутации в гене кальретикулина CALR (Nangalia, 2013; Klampfl, 2013). Все эти мутации тем или иным путем приводят к лиганд-независимой активации JAK-STAT сигнального пути, что в конечном итоге приводит к усилению клеточной пролиферации.
Фиброз костного мозга является цитокин-опосредованным состоянием, возникающим в результате клонального злокачественного перерождения в мультипотентной гемопоэтической стволовой клетке и характеризуется усилением продукции белков экстрацеллюлярного матрикса.
Основными продуцентами цитокинов и других активных молекул, опосредующих миелофиброз, считаются мегакариоциты и клетки моноцитарно-макрофагального ряда. Существует достаточно большое количество работ, посвященных изучению роли мегакариоцитов в развитии миелофиброза (Vannucchi, 2002; Toki, 2005; Kreipe, 2012; Vytrva, 2014), однако исследований, посвященных клеткам моноцитарно-макрофагального ряда, гораздо меньше и полученные в результате них данные противоречивы (Wagner-Ballon, 2006, Verstovsek, 2016). Интерес к клеткам моноцитарно-макрофагального ряда еще более возрос после появления данных о существовании в костном мозге пациентов с ПМФ коллаген- и фибронектин-продуцирующих фиброцитов, которые имеют моноцитарное происхождение (Verstovsek, 2016).
В настоящее время описано достаточно большое число моделей миелофиброза на животных и на клеточных культурах. Самые распространенные из них – животные с высоким уровнем тромбопоэтина (Kakumitsu, 2005), низким уровнем экспрессии транскрипционного фактора GATA-1 (Vannucchi, 2002; Centurione, 2004; Vannucchi, 2005), мутациями JAK2 V617F (Lacout, 2006; Wernig, 2006), MPLW515L (Pikman, 2006) и мутациями в гене CALR (Luo, 2013; Cabagnols, 2015; Marty, 2016), описаны модели с культивированием клеток в присутствии тромболизата (Булычева Е. Н., 2013). При этом не описаны модели для исследования вклада клеток моноцитарно-макрофагального ряда с патогенетической мутацией в патогенез миелофиброза.
Современные рекомендации ВОЗ по диагностике миелофиброза включают в себя клинические, гематологические, биохимические и молекулярные критерии, но главную роль продолжает играть морфологическое исследование биоптатов костного мозга (Passamonti, 2016). В классических случаях ПМФ, протекающих с гепатоспленомегалией, лейкоэритробластической картиной крови, периферической цитопенией, каплевидными эритроцитами и фиброзом костного мозга постановка диагноза не составляет труда, но на ранних стадиях диагностировать заболевание очень сложно. При этом другие МПН – истинная полицитемия (ИП) и эссенциальная тромбоцитемия (ЭТ) могут осложняться миелофиброзом, и все три заболевания могут трансформироваться в острый миелолейкоз (Agarwal, 2015). Между тем различить раннюю стадию миелофиброза при ИП и ЭТ необычайно важно для проведения адекватной терапии (Абдулкадыров К. М., 2013). В настоящее время точная постановка диагноза возможна только при морфологическом анализе трепанобиоптата костного мозга, что вносит субъективный компонент в установление диагноза и в большой мере зависит от квалификации врача-морфолога, а также требует госпитализации пациента с целью взятия биопсии
высококвалифицированными врачами гематологами. Препятствием на пути быстрой и высокоточной малоинвазивной диагностики является отсутствие маркеров, которые возможно было бы с высокой чувствительностью и специфичностью определять в сыворотке крови пациентов для проведения дифференциальной диагностики МПН. Таким образом, актуальной областью исследования таких наук, как клиническая лабораторная диагностика и гематология и переливание крови является поиск новых способов объективной оценки состояния больного с целью установления ему правильного диагноза на ранних стадиях заболевания, обладающих малой инвазивностью и возможностью взятия материала вне стационарных условий персоналом со средним медицинским образованием.
Цель исследования: оценить роль клеток моноцитарно-макрофагального ряда с мутацией JAK2 V617F в продукции факторов, участвующих в развитии фиброза костного мозга, для создания лабораторного алгоритма дифференциальной диагностики миелопролиферативных неоплазий.
Задачи исследования
-
Создать клеточные линии моноцитарно-макрофагального ряда с экспрессией мутации V617F в гене JAK2 (клеточная линия mut) и гиперэкспрессией гена JAK2 «дикого типа» (клеточная линия wt).
-
Оценить влияние тромбоцитарного лизата как активатора продукции факторов, участвующих в развитии фиброза костного мозга, в созданных клеточных линиях: трансформирующий фактор роста (TGF), галектин-3, матриксные металлопротеиназы (MMP) 2, 9, 12, 13, тканевые ингибиторы матриксных металлопротеиназ (TIMP) 1, 2, 3, 4, фактор роста эндотелия сосудов (VEGF), основной фактор роста фибробластов (bFGF), пентраксин-3.
-
Определить уровень факторов, участвующих в развитии фиброза костного мозга, в сыворотке крови пациентов с миелопролиферативными неоплазиями.
-
Сформировать лабораторный алгоритм дифференциальной диагностики миелопролиферативных неоплазий на основании обнаруженных различий уровня факторов, участвующих в развитии фиброза костного мозга, в сыворотке крови пациентов с истинной полицитемией, эссенциальной тромбоцитемией и первичным миелофиброзом.
Научная новизна
В результате проведенного исследования впервые были созданы клеточные линии моноцитарно-макрофагального ряда с экспрессией мутации V617F в гене JAK2 и гиперэкспрессией гена JAK2 «дикого типа», изучено влияние мутации JAK2 V617F на способность макрофагов к активации под воздействием тромболизата, были определены количественные изменения молекулярно-генетических факторов, участвующих в развитии миелофиброза (в том числе трансформирующего фактор роста (TGF), галектин-3, матриксные металлопротеиназы (MMP) 2, 9, 12, 13, тканевые ингибиторы матриксных металлопротеиназ (TIMP) 1, 2, 3, 4, фактор роста эндотелия сосудов (VEGF), основной фактор роста фибробластов (bFGF), пентраксин-3) в созданных клеточных линиях.
В периферической крови пациентов с миелопролиферативными неоплазиями проанализировали молекулярные маркеры, участвующие в развитии фиброза костного мозга и впервые выявлены отличия между истинной полицитемией, эссенциальной тромбоцитемией и первичным миелофиброзом по содержанию ММП-9 и галектина-3 в сыворотке крови.
Теоретическая и практическая значимость работы
Результаты работы способствуют пониманию фундаментальной роли клеток моноцитарно-макрофагального ряда в развитии фиброза костного мозга и влияние мутации JAK2 V617F на их способность к активации и экспрессии про- и антифибротических факторов.
Создана стабильная клеточная линия моноцитарно-макрофагального ряда с экспрессией мутации V617F в гене JAK2 и гиперэкспрессией гена JAK2 «дикого типа», которая позволяет исследовать локальные клеточные и молекулярные механизмы развития заболеваний, к которым приводит активация JAK-STAT, а также может быть использована как объект для тестирования новой таргетной терапии.
Показано потенциирующее влияние человеческого тромболизата на активность клеток моноцитарно-макрофагального ряда in vitro, что раскрывает молекулярные механизмы взаимодействия «мегакариоцит/макрофаг» в условиях патологических изменений при фиброзе костного мозга.
Разработана теоретическая база по модификации существующего диагностического протокола МПН на основании установленных связей между мутационным статусом, нозологией и молекулярными маркерами, имеющими потенциальную диагностическую значимость для миелофиброза у пациентов с МПН.
Создан лабораторный алгоритм дифференциальной диагностики миелофиброза и эссенциальной тромбоцитемии с чувствительностью 75% и специфичностью 68,18%.
Положения, выносимые на защиту
-
Созданная клеточная линия моноцитарно-макрофагального ряда с экспрессией мутации V617F в гене JAK2 (клеточная линия mut) и гиперэкспрессией гена JAK2 «дикого типа» (клеточная линия wt) является основой для экспериментальной части поисково-диагностических программ исследования патогенетических механизмов миелопролиферативных заболеваний с активацией JAK2.
-
Макрофаги с мутацией V617F в гене JAK2 и гиперэкспрессией гена JAK2 «дикого типа» под воздействием тромболизата усиливают продукцию ферментов и ростовых факторов, способствующих развитию миелофиброза, в то время как неизмененные макрофаги реагируют на воздействие тромбоцитарных факторов снижением продукции этих агентов.
-
Матриксная металлопротеиназа 9 и галектин-3 в сыворотке крови пациентов с миелопролиферативными неоплазиями могут использоваться как дополнительные диагностические маркеры при дифференциальной диагностике миелофиброза и эссенциальной тромбоцитемии.
Методология и методы исследования
В работе использованы теоретические (анализ и синтез), лабораторные (молекулярно-биологические, культуральные и иммунохимические) и статистические (параметрические и непараметрические критерии сравнения групп и определения связей, построение ROC-кривых) методы.
Степень достоверности и апробация результатов
Степень достоверности результатов определяется достаточным и адекватным объемом выборки, использованием современных лабораторных методов и статистических методов обработки полученных данных.
Материалы исследования неоднократно доложены на Всероссийских и Международных конференциях: 19-ой Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «БИОЛОГИЯ – НАУКА XXI ВЕКА» (г. Пущино, Московская обл., 2015 г.), 1-ом Российском онкологическом научно-образовательном форуме «Белые ночи-2015» (г. Санкт-Петербург, 2015 г.), 20th Congress of European Hematology Association (EHA) (Vienna, Austria, 2015), Cellular and molecular mechanism of tumour–microenvironment crosstalk (Tomsk, Russia, 2015), XXI Wilsede meeting (Wilsede, Germany, 2016), 46th Annual Scientific Meeting International Society for Experemental Hematology (Frankfurt, Germany, 2017).
Проведение исследования одобрено этическим комитетом федерального государственного бюджетного учреждения «Национальный Медицинский
Исследовательский Центр имени В.А. Алмазова» Министерства Здравоохранения Российской Федерации.
Результаты, полученные в процессе выполнения диссертационной работы, внедрены в образовательный процесс Института медицинского образования ФГБУ «НМИЦ им. В.А. Алмазова» МЗ РФ и в научно-исследовательскую и клиническую работу клинических подразделений и Института гематологии ФГБУ «НМИЦ им. В.А. Алмазова» МЗ РФ.
Личный вклад автора
Автором был проведен анализ литературных данных о молекулярных и клеточных механизмах развития миелопролиферативных неоплазий и миелофиброза, в частности, лабораторной диагностике миелофиброза, существующих моделях для изучения миелофиброза. Cформулирована цель, определены методы и задачи исследования, разработан план исследования. Автором лично были проведены все лабораторные исследования как на материале от пациентов, так и клеточных линиях, создание клеточной линии, статистический анализ полученных данных с последующим описанием и интерпретацией. Сформулированы выводы и даны практические рекомендации.
Публикации по теме диссертации
По теме диссертационной работы опубликовано 10 статей и тезисов, 3 из которых изданы в рецензируемых изданиях, входящих в список ВАК.
Структура и объем диссертации
Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов экспериментальных исследований и их обсуждения, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы. Работа изложена на 121 странице машинописного текста, иллюстрирована 23 рисунками и 8 таблицами. Список литературы включает 215 источников (25 на русском языке и 190 на иностранном).
Роль JAK2 V617F
Общим в патогенезе всех МПН является активация тирозинкиназ (Radich, 2010). Первой открытой мутацией для Ph(-) МПН была транслокация в гене BCR-ABL, которая приводит к активации пролиферации, ингибирует апоптоз и снижает активность ингибиторов тирозинкиназ, что может существенно ухудшить течение болезни (Radich, 2010). Молекулярные повреждения, характерные для ИП, ЭТ и ПМФ оставались неизвестными до 2005 года, когда были опубликованы данные о найденной точечной мутации в гене Янус-киназы (JAK2), вызывающей замену валина на фенилаланин в 617 положении полипептидной цепи (Baxter, 2005; Kralovics, 2005; Levine, 2005). Мутация была найдена в половине случаев заболеваний ЭТ и ПМФ и почти во всех случаях ИП (Kiladjian, 2012). JAK2 V617F является соматической мутацией, характерной для гемопоэтической ткани (Ross, 2008).
Семейство Янус-киназ включает в себя JAK1, JAK2, JAK3 и TYK2. Каждая из них содержит 7 гомологичных доменов. JH1 домен, расположенный на С-конце, является каталитическим доменом, а JH7 на N-конце представляет собой домен, ассоциированный с цитокиновым рецептором (Chen, 1997). Домены JH5-JH6-JH7 составляют FERM-фрагмент, а домены JH3-JH4 – SH2-фрагмент (Constantinescu, 2013). Показано, что N-терминальный фрагмент FERM-SH2 выполняет функцию стабилизации JAK2-рецептора на поверхности клетки (Huang, 2001; Radtke, 2002; Ragimbeau, 2003). Валин 617 находится в домене JH2, или псевдокаталитическом домене, который имеет стуктуру, гомологичную JH1, но не обладает при этом киназной активностью. Это делает механизм активации JAK2 в результате мутации V617F не совсем ясным. Однако, существуют данные об активации JAK2 в результате делеции JH2 (Saharinen, 2002). Основываясь на подобных наблюдениях, можно предположить, что домен JH2 осуществляет негативную регуляцию киназной активности JH1, подобно аутоингибирующему действию юкстамембранного домена в тирозинкиназных рецепторах, например, FLT3 (Griffith, 2004). Расчетная модель структуры рецептора JAK2 показала, что валин 617 тесно ассоциирована с активационной шпилькой в JH1 (Lindauer, 2001).
В отсутствие лиганда в нормальных условиях комплекс JAK2-рецептор неактивен. При связывании цитокина или ростового фактора происходит изменение конформации рецептора, что вызывает образование димеров JAK2-рецепторов (Constantinescu, 2001; Brown, 2005). При этом происходит аутотрансфосфорилирование тирозинов в цитозольном домене JAK2. Термин аутотрансфосфорилирование указывает на то, что киназа в рецепторе фосфорилирует не свой тирозин, а соседний в димере, приставка «ауто» означает, что для фосфорилирования не требуются дополнительные кофакторы (Petsko, 2009). Фосфорилированная Янус-киназа активирует сигнальные протеины STAT, Ras/MAPK и PI3K/Akt/mTOR, которые переносят сигнал в ядро (Brown, 2005; Haan, 2006; Seubert, 2003; Witthuhn, 1993).
Янус-киназы, связанные с цитокиновыми рецепторами и рецепторами тирозинкиназ, играют ведущую роль в восприятии и передаче сигнала от цитокинов в клетках млекопитающих. Многочисленные молекулярные и биологические данные указывают, что активация JAK2 вызывает и усиление цитокинового сигнала в разной степени для различных цитокиновых рецепторов, что объясняется способностью разных цитокинов действовать на рецепторы различных Янус-киназ. Большинство цитокиновых рецепторов ассоциированы с более чем одной Янус-киназой, но существуют данные, что на клетки предшественницы миелоидного ряда, дефицитные по JAK2, не действуют эритропоэтин, тромбопоэтин и гранулоцито-макрофагальный колониестимулирующий фактор, что в конечном счете приводит к нарушению эритропоэза (Parganas, 1998). Эти наблюдения указывают, что JAK2 является главной Янус-киназой, участвующей в развитии и дифференцировке клеток миелоидного ряда. Это подтверждается также и тем, что мутации, нарушающие функцию JAK2, наблюдаются в целом ряде миелопролиферативных заболеваний (Levine, 2005; Jelinek, 2005; Steensma, 2005), а клетки, позитивные по JAK2 V617F, гиперчувствительны к цитокиновой стимуляции (Levine, 2005; James 2005).
Открытие мутации JAK2 V617F позволило по-новому взглянуть на патогенез МПН, но также и поставило новые важные вопросы. Первым и самым важным из них явился вопрос о том, как одна и та же мутация может вызывать три пусть и родственных, но клинико-патологически различных миелопролиферативных заболевания. Данные генетического анализа указывают, что мутация JAK2 V617F имеет дозозависимый эффект на фенотип МПН (Baxter, 2005; Kralovics, 2005; Levine, 2005; James, 2005). Так, у большинства пациентов с ИП, даже с низкой аллельной нагрузкой, имеется эритроидный клон, гомозиготный по JAK2 V617F, но подобная картина крайне редко наблюдается у пациентов с ЭТ (Scott, 2006). Данные о зависимости фенотипа МПН от дозы JAK2 V617F подтверждаются и на мышиных моделях. Первые исследования in vivo показали, что оверэкспрессия JAK2 V617F в гематопоэтическом компартменте вызывает полностью пенетрантный фенотип МПЗ с полицитемией и лейкоцитозом без ассоциированного тромбоцитоза (Wernig, 2006; Lacout, 2006). В данных работах была описана прямая зависимость между аллельной нагрузкой JAK2 V617F и степенью лейкоцитоза и миелофиброза. Позднее две группы исследователей создали трансгенные модели для изучения JAK2 V617F-позитивных МПН (Tiedt, 2007; Xing, 2008). Более низкий уровень аллельной нагрузки в этих моделях ассоциировался с ЭТ-подобным фенотипом, но не с ИП. При высокой аллельной нагрузке наблюдался фенотип ИП, впоследствии переходящей в МФ (Tiedt, 2008; Lacout, 2006). Исследования на «knock-in» моделях показывают, что гетерозиготы фенотипически проявляют ИП (Marty, 2010). Будущие исследования на «knock-in» моделях, в которых JAK2 V617F экспрессировался бы под эндогенным промотором, и на образцах от пациентов должны показать, что сигналинг в гомо- и гетерозиготных образцах существенно отличается.
В добавление к этому, существуют данные, указывающие на то, что дополнительные наследуемые аллели способствуют развитию МПН. Особенно хорошо это просматривается на примере семей, имеющих наследственную предрасположенность к МПН. У многих из этих семей наследственные паттерны наследуются по аутосомно-доминантному типу с неполной пенетрантностью, у других наследственный характер предрасположенности менее доказуем (Kralovics, 2003; Bellanne-Chantelot, 2006). На основе этих данных была высказана гипотеза, что мутация JAK2 V617F является наследственной, но благодаря жесткому отбору JAK2 V617F-позитивные миелоидные предшественники не могут пролиферировать и в результате этого не всегда образуют патологический клон (Levine, 2008).
Кроме того, существует возможность, что наследуется модификации генома, которые увеличивают вероятность возникновения мутации JAK2 V617F. В работе Pardanani проанализированы 32 полиморфизма в генах JAK2, MPL, EPOR и GCSFR и было обнаружено, что один специфический SNP в гене JAK2 ассоциирован с фенотипическим проявлением ИП и ЭТ (Pardanani, 2008).
Также имеются причины подозревать наличие некоторых дополнительных мутаций, которые могут являться первичными по отношению к JAK2 V617F, т.е. вызывать такие модификации генома, которые приводят к увеличению вероятности возникновения этой мутации. Эти же мутации могут являться факторами, вызывающими бласттрансформацию МПН. К таким мутациям относятся TET2, ASXL1, CBL, IDH и IKZF1 (Tefferi, 2010). Выяснение механизмов патогенного влияния данных мутаций в настоящее время является темой множества исследований.
Необходимо также отметить, что далеко не все случаи МПН являются JAK2-позитивными. JAK2 V617F определяется у 95% пациентов с ИП и у 50-60% пациентов с ЭТ и ПМФ (Cross, 2011). У 5 % пациентов с ИП определяются другие мутации JAK2, находящиеся в 12 экзоне, что свидетельствует о ведущей роли активации JAK2 в развитии ИП (Tefferi, 2007). У пациентов с ЭТ и ПМФ мутации JAK2 в 12 экзоне не обнаружены (Levine, 2008). У 5-10% этих пациентов была детектирована мутация в гене тромбопоэтинового рецептора MPL W515 (Pardanani, 2006; Pikman, 2006). В экспериментах in vitro было продемонстрировано, что мутация MPL W515 конститутивно активирует JAK2 и даун-регуляцию сигнальных путей, что наблюдается и при мутации JAK2 V617F. Исследования in vivo показали, что экспрессия MPL W515 приводит к формированию ЭТ- и ПМФ-подобного фенотипа (Staerk, 2006).
Эти данные свидетельствуют об активации JAK2 как об общем патогенетическом событии в развитии ИП, ЭТ и ПМФ, и что могут быть обнаружены другие мутации, приводящие к активации JAK2.
Анализ молекулярно-генетического профиля и кондиционированных сред от клеточных линий
Оценка уровня экспрессии генов, имеющих отношение к развитию миелофиброза
Выделение тотальной РНК производилось с использованием набора ExtractRNA (Evrogen, Россия) согласно рекомендациям производителя. Синтез кДНК осуществлялся при помощи набора MMLV RT kit (Evrogen, Россия). Полученная кДНК была разведена в 4 раза.
Амплификация была проведена на приборе Applied Biosystems 7500 (Life Technologies), финальный объем реакционной смеси составил 25 мкл.
Для всех маркеров были использованы одинаковые условия амплификации (табл. 4).
Уровень экспрессии рассчитывался относительно образца немодифицированных клеток, инкубированных в среде в присутствии сыворотки. Уровень экспрессии этого образца был принят за 1. Расчет производился с использованием нормализующего фактора для каждого образца, который основывался на значении уровня экспрессии контрольного гена – гена «домашнего хозяйства», в качестве которого использовался ген гипоксантин-гуанин фосфорибозилтрансферазы (HPRT). Последовательность праймеров была взята из опубликованной ранее литературы либо составлена с использованием онлайн-ресурсов Primer3web (version 4.0.0) и Primer-Blast (NCBI) (табл. 5).
Иммуноферментный анализ
Концентрация TGF1 определялась с помощью набора Human TGF-beta 1 DuoSet ELISA kit (R&D Systems), который предназначен для определения только активной формы. Образцы были проанализированы после обработки кислотой согласно инструкции производителя, что позволяет определить общую концентрацию TGF.
Концентрации VEGF и MMP9 определялись с помощью наборов Human VEGF DuoSet ELISA kit (R&D Systems) и Human MMP9 DuoSet ELISA kit (R&D Systems) согласно инструкции производителя.
Экспрессия макрофагами с активированным и неактивированным JAK2 металлопротеиназ и их ингибиторов при культивировании в различных условиях
При сравнении трех групп при рутинном культивировании в присутствии сыворотки повышение уровня экспрессии у модифицированных клеток относительно контроля наблюдалось для ММП-13 (р=0,03), а понижение – для ММП-9 (р=0,019) и ММП-12 (р=0,02).
ММП-2 имела значимое повышение уровня экспрессии в клетках, экспрессирующих мутантный JAK2, при культивировании в присутствии тромболизата в концентрации 10% по сравнению с немодифицированными клетками и клетками с оверэкспрессией JAK2 (p=0,003, p=0,042).
Относительный уровень экспрессии ММП-9 значимо повышался в клетках с мутацией по сравнению с немодифицированными при культивировании в присутствии тромболизата в концентрации 10%. Также было отмечено статистически значимое снижение уровня экспрессии ММП-9 в присутствии тромболизата в концентрации 5, 10 и 15% по сравнению с рутинным культивированием у контрольных клеток (р=0,004; р=0,012; р=0,004). У модифицированных клеток, напротив, наблюдалась тенденция к повышению уровня экспрессии ММП-9.
Уровень экспрессии ММП-12 был значимо повышен у клеток, экспрессирующих мутантный JAK2, при культивировании в присутствии тромболизата в концентрации 10% по сравнению с немодифицированными клетками (p=0,015). Также, ММП-12 имела значимо повышенный уровень экспрессии в клетках с оверэкспрессией нормального JAK2 при культивировании в присутствии тромболизата в концентрации 15% по сравнению с немодифицированными клетками (p=0,029). Кроме того, было отмечено статистически значимое снижение уровня экспрессии ММП-12 в присутствии тромболизата в концентрации 5, 10 и 15% по сравнению с рутинным культивированием у контрольных клеток (р=0,004; р=0,001; р=0,004).
Значимых различий в уровне экспрессии ММП-13 не наблюдалось (рис.6).
Было отмечено увеличение уровня относительной экспрессии у модифицированных клеток относительно немодифицированных (рис.7).
При рутинном культивировании и в присутствии тромболизата значимых различий в экспрессии ТИМП отмечено не было (рис.8).
У модифицированных клеток отмечено увеличение уровня экспрессии ТИМП-1 относительно немодифицированных (рис. 9).
Взаимодействия металлопротеиназ и их ингибиторов играют ключевую роль в возникновении и регрессии фиброза. Повышение соотношения ТИМП/ММП было показано ранее для пациентов с МПН (Vadikolia, 2011), также как повышение уровня ТИМП-1 и -2 в сыворотке (Wang, 2002; Jensen, 2003; Vadikolia, 2011) и плазме (Murate, 1997), но уровень металлопротеиназ в сыворотке был значительно снижен (Vadikolia, 2011) или оставался без изменений (Jensen, 2003). В описанной в данной работе модели было отмечено увеличение уровня экспрессии как металлопротеиназ, так и их ингибиторов. Это может быть объяснено ТИМП-опосредованным ингибированием металлопротеиназ как результат увеличения экспрессии их ингибиторов. Это отчасти подтверждается данными о повышении уровня комплексов ТИМП-1/ММП-9 в сыворотке пациентов с миелофиброзом.
Существуют данные, указывающие на увеличение экспрессии ММП-2 и -9 при фиброзе почки (Wiercinska, 2011). Это происходит в результате активации сигнального пути TGF/Smad, а также может быть результатом активации P38 MAPK и Notch (Li, 2014; Tang, 2009; Young,2009). Также известно, что гипоксия, часто наблюдаемая при развитии фиброза, вызывает увеличение экспрессии ММП-2 (Ying,2012), но при этом снижает ее активность (Li, 2011).
Важную роль в развитии миелофиброза играют фиброциты (Verstovsek, 2016) – это фибробластоподобные клетки, имеющие моноцитарное происхождение и ассоциированные с фибротическими изменениями (Bucala, 1994; Auffray, 2009; Reilkoff, 2011). Эти клетки продуцируют большое количество ММП-2 и -9, а также ММП-8, что способствует их миграции в очаг фиброза (Garcia-de-Albo, 2010).
Кроме того, эти металлопротеиназы могут активировать латентныйTGF (Yu, 2000).
Клинический случай
Пациент Л., дата рождения 01.01.1945
В августе 2010 года госпитализирован в кардиологическое отделение больницы РЖД в связи в выявленным ОИМ. При обследовании выявлен тромбоцитоз до 807 тыс., лейкоцитоз до 19,3 тыс., Нв - 166 г/л. Других отклонений от нормы не выявлено.
Выявлена мутация JAK2.
С августа 2010 года получал терапию гидроксимочевиной (от 1 до 4 капс/сут)
С 27.09.10 по 05.10 находился на госпитализации в гематологическом отделении больницы РЖД. Выполнена трепанбиопсия костного мозга (выписка и результаты трепанбиопсии не представлены). Диагноз: эссенциальная тромбоцитемия.
КАК от 04.10.10: Нв - 143 г/л, тромб - 400 тыс., лей - 9,8 тыс., п/я - 1, с/я - 70, базо -2, лимф - 26, моно-1.
Ответ на терапию гидреа получен. В связи с молодым возрастом пациента с 08.2011 г. начата терапия реафероном 3 млн 3 раза в неделю в комбинации с гидреа с ее постепенным снижением. Отмечались пирогенные реакции на препарат, снижение фон настроения.
В настоящий момент доза гидреа - 0,5 гр/сут через день.
Планируется переход на терапию пегилированным интерфероном, отмена гидреа.
ДИАГНОЗ УТОЧНЕННЫЙ ОСНОВНОЙ: C94.7
Другой уточненный лейкоз Характер заболевания: хроническое, известное ранее
Описание диагноза: Хроническое миелопролифкративное заболевание JAK2+: эссенциальная тромбоцитемия.
Методом ИФА выполнена оценка уровня галектина-3 и ММП-9 в сыворотке крови. Получены следующие значения: галекин-3 – 1109 пг/моль, ММП-9 – 7,23 нг/моль.