Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 14
1.1. Активация, дифференцировка и свойства моноцитов и макрофагов (Мф) 14
1.2. TLR/RLR-рецепторы и их сигнальные реакции
1.3 Антивирусные препараты с иммуномодулирующей активностью 33
1.4 Гриппозная инфекция в иммунокомпетентных клетках 44
1.5 Иммунное узнавание вирусов гриппа А 54
1.6 Противогриппозные вакцины – активаторы сигнальных реакций врождённого иммунитета 62
1.7 Заключение 65
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования 67
Материалы 67
2.1. Препараты и TLR-агонисты 67
2.2 Факторы клеточной пролиферации и дифференцировки 68
2.3 Гриппозные вакцины 68
2.4 Вирусы гриппа А 69
2.5 Клетки крови и клеточные культуры 70
2.6 Химические реактивы 71
2.7 Олигонуклеотидные ПЦР-праймеры 72
Методы исследования 72
2.8 Дифференцировка моноцитов в макрофаги (Мф) in vitro 72
2.9 Обработка ТНР-макрофагов TLR –агонистами 2.10 Постановка опытов с противогриппозными вакцинами на клетках крови и ТНР-1. 73
2.11 Заражение клеток вирусами гриппа А 74
2.12 Титрование инфекционности вирусов гриппа А 74
2.13 Количественное определение экспрессии генов 75
2.14 Методы количественной иммунометрии 77
2.15 Лабораторное оборудование 78
ГЛАВА 3. Результаты исследований 80
3.1. Стимуляция интерферонами (ИФН), ИФН-индукторами и иммуномодуляторами сигнальных TLR/RLR-реакций в клетках человека 80
3.1.1 Сравнение уровней экспрессии TLR/RLR-генов в клетках моноцитарной лейкемии ТНР-1 и аденокарциномы толстого кишечника 80
3.1.2 Сигнальные механизмы действия Ридостина в опухолевых клетках 83
3.1.3 Влияние препаратов на СD-фенотипы клеток ТНР-1 84
3.1.4 Сигнальные механизмы иммуномодулирующего и антивирусного действия препаратов Ингавирин и Тимоген в клетках крови и ТНР-1 86
3.2. TLR/RLR-механизмы дифференцировки моноцитов в макрофаг-подобные клетки in vitro.. 90
3.2.1. Индукция дифференцировки ТНР-1 моноцитов комплексом митогенов 90
3.2.2 Активность и дифференцировка ТНР-1 моноцитов обработкой форбол-миристат-ацетатом (РМА) 94
3.2.3 Действие TLR/RLR-агонистов на ТНР-РМА дифференцированные макрофаги 97
3.2.4 Индивидуальные TLR/RLR-реакции моноцитов крови доноров на гранулоцитмакрофаг-колониестимулирующий фактор (GM-CSF) 100
3.3. Взаимодействие вирусов гриппа А с иммунокомпетентными клетками 102
3.3.1 Инфекция лимфоцитов крови доноров рекомбинантным вирусом гриппа A/PR8
H1N1/ H5N1 и его «эскейп» мутантом m13(13) 103
3.3.2. Инфекция пандемическим «свиным» вируса гриппа А H1N1 (Москва, 2009)
моноцитарных GM-макрофагов 110
3.3.3 Чувствительность ТНР-1 моноцитов к пандемическому «свиному» вирусу H1N1 (Москва, 2009) 115
3.3.4 Абортивная инфекция ТНР-РМА макрофагов вирусами гриппа подтипов Н1, Н5 и Н9 117
3.4. Иммунные сигнальные механизмы действия противогриппозных вакцин «Гриппол», « Инфлювак» и «Ваксигрип» 126
3.4.1. Стимуляция экспрессии генов врождённого и адаптивного иммунитета вакцинами 127
3.4.2. Цитокиновый ответ клеток крови на вакцины 130
Глава 4. Обсуждение 132
Выводы 151
Приложение 152
Список литературы 156
- Гриппозная инфекция в иммунокомпетентных клетках
- Вирусы гриппа А
- Сравнение уровней экспрессии TLR/RLR-генов в клетках моноцитарной лейкемии ТНР-1 и аденокарциномы толстого кишечника
- Индивидуальные TLR/RLR-реакции моноцитов крови доноров на гранулоцитмакрофаг-колониестимулирующий фактор (GM-CSF)
Введение к работе
Актуальность темы и степень ее разработанности
Изучение сигнальных реакций врождённого иммунитета с участием TLR/RLR-рецепторов необходимо для раскрытия механизмов «узнавания» патогенов и активации клеточных генов, кодирующих воспалительные цитокины и интерфероны (ИФН) [T.Kawai, S.Akira, 2011; S. Tartey, O. Takeuchi, 2017]. Доказана ИФН-регуляция генов рецепторов врожденного иммунитета [J.J. Khoo et al., 2011]. Особое значение имеет изучение активности TLR/RLR-рецепторов и экспрессии их генов в процессах клеточной дифференцировки, гематопоэза и опухолевой прогрессии [J. Cannova et al., 2015; J. Wang et al., 2015; S. Pandey et al., 2015].
Поиск и создание препаратов - стимуляторов транскрипции TLR/RLR-генов является одной из
основных задач современной иммунофармакологии [M.J. Paul-Clark et al., 2012; S O.
2017]. Сегодня ряд созданных препаратов агонистов ТLR/RLR–рецепторов уже
применяются в онкологии и вакцинологии как лечебные препараты и иммуноадъюванты [M. J.
Paul-Clark et al., 2012; M. Hedayat et al., 2012]. В связи с этим большой интерес представляют
противовирусные препараты, которые сочетают свойства интерфероногенов и
иммуномодуляторов. Среди них группа известных отечественных противовирусных препаратов: Реаферон, Ридостин, Циклоферон, Иммуномакс, Ингавирин и Тимоген, впервые изученные нами как регуляторы сигнальных реакций TLR/RLR-рецепторов врождённого иммунитета на моделях опухолевых клеток ТНР-1 (острая моноцитарная лейкемия) и НСТ-116 (аденокарцинома толстого кишечника). Информация о сигнальных реакциях врождённого иммунитета необходима и для оценки иммуномодулирующей активности, применяемых в России вакцин «Гриппол», «Инфлювак» и «Ваксигрип».
В последние годы изучение механизмов молекулярного патогенеза при вирусных инфекциях проводится на моделях иммунокомпетентных клеток. Макрофаги (Мф) имеют определяющее значение в ранних защитных реакциях на вирусные патогены и вносят существенный вклад в секрецию воспалительных цитокинов, оказывая влияние на дендритные клетки (Дк) и функции Ти В-лимфоцитов [U. Juhas et al., 2015]. На моноцитах и Мф представлен широкий спектр разных видов рецепторов, в т.ч. TLR/RLR-рецепторы врождённого иммунитета [S. Gordon, 2007].
На моделях моноцитарных макрофагов (ММф) интенсивно изучаются механизмы регуляции вирусами гриппа А реакций врождённого иммунитета и клеточной толерантности при инфекции вирусами гриппа А [R. Medzhitov et al., 2012; A. Iwasaki, P. S. Pillai, 2014; B. Pulendran, M.S. Maddur, 2015]. Большой интерес представляют исследования с вирусами гриппа А разной патогенности и рецепторной специфичности [K.R. Short et al., 2012; S.A. Marvin et al., 2017]. В настоящей работе такие сравнительные исследования впервые выполнены на 2-х моделях дифференцированных Мф: первичных моноцитарных, имеющих сходство с альвеолярными макрофагами (АМф), и полученных из моноцитов ТНР-1 обработкой РМА (ТНР-РМА Мф). Инфекция в этих Мф вызвана актуальными штаммами вирусов гриппа: пандемическим «свиным» вирусом гриппа H1N1(Москва, 2009 г.) и вирусами гриппа птиц рекомбинантом PR8/H5N1, H5N2 и H9N2, являющимися возможными источниками инфекций у человека. Механизмы развития гриппозной инфекции в Мф, влияющие на патогенез и состояние толерантности пока остаются неизвестными и требуют дальнейшего изучения на клеточном и молекулярном уровнях.
Изучение экспрессии генов TLR/RLR-рецепторов врождённого иммунитета и процессов сигнальной трансдукции проводится при многих видах иммунной патологии, связанных с вирусными и бактериальными инфекциями, онкологическими и аутоиммунными заболеваниями [A. Pizzolla et al., 2017; J. Wang et al., 2015]. Получены доказательства роли TLR/RLR-сигналов в процессах клеточной дифференцировки, противовирусном и воспалительном ответах и индукции синтеза ИФН. Определены молекулярные структуры TLR/RLR-рецепторов и механизмы взаимодействия их с лигандами разной природы, в т.ч. вирусными и клеточными РНК и ДНК [M. J. Paul-Clark et al., 2012; M. , , 2017].
В предшествующих работах лаборатории интерфероногенеза НИИЭМ им.Н.Ф.Гамалеи показана стимуляция экспрессии генов TLR/RLR-рецепторов и генов системы ИФН под действием препаратов ИФН и ИФН-индукторов на клетках крови человека и в опухолевых клетках НСТ-116 [Т.М. Соколова и др., 2015, 2016; А.Н. Шувалов, 2016 г., канд. дис.]. Эти исследования продолжены на модели ТНР-1 моноцитов с более широким спектром противовирусных иммуномодулирующих препаратов и показано их влияние на клеточную дифференцировку клеток миелоидного лейкоза.
В литературе имеется обширная информация о структуре вирусов гриппа А, механизмах их генетической изменчивости и вызываемых эпидемиях, применяемых противовирусных препаратах и вакцинах [О.И. Киселёв, 2011; M.L. Shaw, P. Palese, 2013; А. Loregian, 2014]. Однако изучение механизмов репродукции вирусов гриппа в основном проведено на чувствительных клетках респираторного тракта и клетках эпителия. Данные о характере взаимодействия вирусов гриппа человека и птиц с иммунокомпетентными клетками, в первую очередь с Мф и Дк, остаются во многом противоречивыми и дискуссионными [K.R. Short et al., 2012; S.A. Marvin et al., 2017]. Важное значение для чувствительности к гриппозной инфекции имеют патогенность и рецепторная специфичность вирусов гриппа, а также TLR/RLR-реакции и дифференцировка иммунокомпетентных клеток. Для решения этих задач необходимо получение подходящих клеточных моделей и изучение в них механизмов иммунного ответа.
Диссертационная работа выполнена в рамках Государственного задания ФБГУ «ФНИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России по разделу «Механизмы регуляции врождённого и адаптивного противоинфекционного иммунитета» (2013-2016 гг.).
Цель исследования – показать роль сигнальных TLR/RLR-реакций врождённого иммунитета
в иммуномодулирующем действии противовирусных препаратов и резистентности
иммунокомпетентных клеток к инфекции вирусами гриппа А.
Задачи:
-
Определить транскрипционную активность генов TLR/RLR-рецепторов и СD-фенотипы опухолевых клеток ТНР-1 и НСТ-116 и оценить корригирующее действие препаратов (рекомбинантные ИФН, Ридостин, Циклоферон, Иммуномакс, Ингавирин и Тимоген).
-
Показать регуляцию TLR-агонистами и факторами дифференцировки (GM-CSF, РМА и митогенами) активности сигнальных факторов врождённого иммунитета и цитокиновых реакций на моделях моноцитов и Мф.
-
Сравнить проникновение структур вирусов гриппа А подтипов H1, H5 и Н9 в иммунокомпетентные клетки и определить при развитии абортивной инфекции TLR/RLR-зависимые цитокиновые реакции врождённого иммунитета и процессы с деструкцией клеток.
-
Оценить иммуномодулирующие свойства современных противогриппозных вакцин (Гриппол, Инфлювак и Ваксигрип) по уровням и профилям индукции генов врождённого и адаптивного иммунитета и секретируемых цитокинов в клетках крови человека и чувствительной модели моноцитов ТНР-1.
Научная новизна
Впервые:
- показано стимулирующее действие препаратов Реаферон, Генфаксон, Инфибета, Ридостин,
Циклоферон, Иммуномакс, Ингавирин и Тимоген, широко применяемых в отечественной
медицине, на гены сигнальных TLR/RLR-рецепторов иммунного ответа и дифференцировку
опухолевых клеток ТНР (острая моноцитарная лейкемия);
- определена активация факторами клеточной дифференцировки (GM-CSF и РМА)
транскрипции генов TLR/RLR-рецепторов врождённого иммунитета и индукция воспалительных
цитокинов в моноцитах и Мф;
- проведен сравнительный анализ развития абортивной инфекции вирусами гриппа А
подтипов H1, H5 и H9 в дифференцированных ТНР-РМА Мф и определены реакции генов TLR7 и
RIG1 на проникновение вирусных РНК и нуклеопротеинов;
сделана оценка действия современных противогриппозных вакцин «Гриппол», «Инфлювак» и Ваксигрип» на сигнальные факторы врождённого иммунитета и синтез цитокинов в клетках крови и моноцитах человека.
препараты Ингавирин и Тимоген изучены как активаторы экспрессии генов врождённого иммунитета и антивирусного ответа (OAS1и MxA) в клетках крови человека и моноцитарной лейкемии ТНР-1.
Теоретическая и практическая значимость работы
Показано участие TLR/RLR-рецепторов врождённого иммунитета в иммуномодулирующем действии большой группы противовирусных препаратов, в регуляции процессов клеточной дифференцировки моноцитов и Мф и механизмах их резистентности к инфекции вирусами гриппа A. Данные, полученные в опухолевых линиях клеток ТНР-1 и НСТ-116, свидетельствуют о нарушениях в процессах транскрипции генов TLR/RLR-рецепторов и показывают возможность повышения их генной активности высокими концентрациями препаратов ИФН, индукторов ИФН (Ридостин, Циклоферон) и иммуномодулятором Иммуномакс. Изучение препаратов -стимуляторов транскрипции TLR/RLR-генов является актуальным направлением современной иммунофармакологии [M.J. Paul-Clark et al., 2012; S O. 2017].
Методология и методы исследования
Полученные из моноцитов крови и ТНР-1 клеточные модели дифференцированных Мф применены для изучения абортивной инфекции, при действии пандемического «свиного» вируса гриппа А H1N1 (Москва, 2009 г.) и птичьих вирусов H5N2 и H9N2. Данные, полученные методами сравнительного анализа генной активности, секреции воспалительных цитокинов и степени гибели Мф, указывают на потенциальную опасность птичьих вирусов гриппа А в случае инфицирования людей. Полученная информация расширяет наши знания о механизмах взаимодействия вирусов гриппа разной патогенности и рецепторной специфичности с ММф и АМф. В работе широко использована ПЦР-РВ, которая является высокотехнологичным количественным методом анализа генной экспрессии и позволяет детектировать содержание РНК в биопробах с высокой специфичностью и чувствительностью. В настоящей работе этим методом выполнен системный анализ экспрессии 3-х десятков клеточных и вирусных генов, связанных с регуляцией системы врождённого иммунитета и системы ИФН, при действии противовирусных препаратов и вирусов гриппа А. Иммунометрические исследования включали методы количественного измерения цитокинов с использованием ИФА-наборов фирмы «Вектор-бест», определение показателей клеточной дифференцировки (CD-антигенов) проточной цитометрией и вирусных нуклеопротеинов (NP-антигенов) иммунофлюоресценцией.
Личный вклад автора
Научные результаты, содержащиеся в диссертации, получены при личном участии автора и
представляют собой законченное самостоятельное научное исследование. Автор ставил
эксперименты с применением вирусологических, молекулярно-биологических и
иммунологических методов исследования на культурах опухолевых и иммунокомпетентных клеток, оптимизировал методики дифференцировки моноцитов в Мф, участвовал в обработке полученных результатов, написании статей и подготовке рукописи диссертационной работы. Опубликованные и представленные на научных конференциях данные включены Полосковым В.В. в диссертацию.
Существенную помощь в обеспечении приборами и клеточными культурами оказана сотрудниками лаборатории экспериментальной диагностики и биотерапии опухолей НИИ ЭДиТОФГБУ «РОНЦ им.Н.Н. Блохина» МЗ РФ в.н.с, к.б.н. Буровой О.С. и Соколовой З.А.
Штаммы вирусов гриппа А H1N1/Moscow/IIV01/2009, рекомбинантный A/Puerto Rico/8/34 H1N1/H5N1 A/Vietnam/1203/04 и его эскейп-мутант m13(13), H5N2/Mallard/Pennsylvania/10218/84-MA и H9N2/Swine/Hong Kong/9/98 - MA приготовлены в лаборатории физиологии вирусов зав., к.б.н. Т.А. Тимофеевой и в.н.с. и к.б.н. И.А. Рудневой (Подразделение НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России).
В исследованиях по выявлению NP- белков вируса гриппа А в Мф использованы МКА, предоставленные сотрудниками лаборатории клеточной инженерии в.н.с., д.б.н. Масаловой О.В. и Климовой Р.Р. (руководитель - профессор, д.б.н. Кущ А.А. (Подразделение НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России).
Препараты противогриппозных вакцин «Гриппол», «Инфлювак», «Ваксигрип» получены от проф., д.м.н. М.П.Костинова, зав. лабораторией вакцинопрофилактики и иммунотерапии аллергических заболеваний ФГБНУ НИИВС им. И.И. Мечникова.
Все перечисленные сотрудники являются соавторами публикаций.
Внедрение результатов исследования
На основании полученных данных разработаны две методические рекомендации, утверждённые на «Совете по внедрению научных разработок в практику здравоохранения и серийное производство» ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи»:
«Использование модельной системы иммунокомпетентных клеток для изучения действия антигриппозных препаратов на гены рецепторов врождённого иммунитета» (2017 г.) и «Оценка стимуляции интерферонами, индукторами интерферонов и вакцинами экспрессии TLR-генов в пробах крови человека методом ОТ-ПЦР в реальном времени» (2015 г.).
Апробация работы
Результаты диссертационной работы доложены на Конференции молодых ученых ФГБУ «ФНИЦЭМ им Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России (Москва 2014 г.); Научно–практической конференции – биеннале «Грипп: вирусология, эпидемиология, профилактика и лечение» (Санкт-Петербург, 2014 г.) и представлены в материалах ХVII международной научно-практической конференции «Современные концепции научных исследований» (Москва 28-29 августа 2015 г.) и ХХV международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы в современной науке и пути их решения» (Москва, 26.05.2016 г.); XV Всероссийском научном форуме с международным участием имени академика В.И.Иоффе «Дни иммунологии в С.-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2015 г.).
Апробация диссертации состоялась 20.06.2017г. на совместной научной конференции Отдела интерферонов и Отдела иммунологии ФГБУ «ФНИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России (Протокол № 10).
Публикации
Материалы диссертации опубликованы в 14 печатных работах, из них 9 в журналах, рекомендованных ВАК, и 3 тезисах научных конференций с международным участием.
Структура и объем диссертации:
Гриппозная инфекция в иммунокомпетентных клетках
Получение моноцитарных Мф
Описано несколько способов активации моноцитов и дифференцировки их в Мф с участием гранулоцитмакрофаг-колониестимулирующего фактора (GM-CSF) или макрофаг-колониестимулирующего фактора (М-CSF), в ряде случаев в комбинации с ИФН-гамма, LPS и IL4 (рис 5 a, b). (a) MACS-изолированные CD14+ человеческие моноциты дифференцируются в Мф культивированием с GM-CSF или M-CSF 7 дней. Моноцитарные Дк можно получить из CD14+моноцитов культивированием 7 дней с GM-CSF+IL-4. Созревание Дк дополнительно вызывается добавлением LPS через 48 ч. (b) Контрольное окрашивание изолированных CD14+ моноцитов и полученных популяций клеток с CD14 mAb (MEM-18 - красные гистограммы по сравнению с изотипами контрольных mAb – голубые гистограммы). В организме М-CSF действует как фактор дифференцировки стволовых клеточных монобластов в моноциты до их высвобождения в периферическую кровь. Получение ТНР-1 макрофагов ТНР-1 клеточная линия, полученная из периферической крови годовалого ребенка с острой лейкоцитарной лейкемией [S. Tsuchiya et al.,1980], стала применяться как удобная модель моноцитов in vitro для оценки активности иммуномодулирующих препаратов [W. Chanput et al., 2014]. Клетки ТНР-1 имеют преимущества перед первичными моноцитами: ТНР-1 могут храниться в жидком азоте многие годы и имеют постоянный генный состав и морфологию, что обеспечивает хорошую воспроизводимость результатов на протяжении 25 пассажей. Кроме клеток ТНР-1 и другие клеточные линии моноцитов U937, ML-2, HL-60 и MonoMac 6 также применяются в иммунологических исследованиях [Т.Д. Смирнова и др., 2015]. По сравнению с ними клетки ТНР-1 наиболее близки по свойствам к первичным моноцитам крови. Реакции ТНР-моноцитов на иммуномодулирующие препараты имеют сходство с ответами моноцитов донорской крови [W. Chanput et al, 2010]. Обработка LPS повышает в них уровни экспрессии генов IL1-, IL6, IL8, IL10 и TNF-alpha. Ответы являются быстрыми, выявляются уже через 1 ч и сохраняются более 6 ч. Процесс сопровождается активацией транскрипционного фактора NFkB.
Последние годы фирмой InvivoGen (США) созданы специальные генно-инженерные варианты клеток ТНР-1 для изучения сигнальных механизмов действия лекарственных препаратов ТНР-1BlueNFkB, ТНР-1BlueISG.
ТНР-1 моноциты могут быть дифференцированы в Мф-подобный фенотип под действием РМА (форбол-миристат-ацетат) или витамина D3 [M. Daigneault et al. 2010; H. Schwende et al., 1996]. Оптимальные дозы РМА для достижения максимальной степени дифференцировки составляют 50-100 нг/мл. Дифференцированные ТНР-РМА Мф, по сравнению с D3-Мф, более похожи на моноцитарные Мф по фагоцитирующей активности, маркёрам дифференцировки, морфологии и продукции провоспалительных цитокинов IL1 и TNF-alpha. Культивирование клеток в течение 5 дней повышает уровень экспрессии маркеров Мф и увеличивает их сходство с моноцитарными Мф.
В дальнейшем для получения Мф разной степени чувствительности к разным видам стимулов были предложено использовать для дифференцировки более низкие концентрации РМА 10-20 нг/мл [M.B. Mae et al., 2014; M.E. Lund et al., 2016]. Образованные в этих условиях Мф являлись незрелыми или слабоактивированными и могли быть использованы для поляризации в М1 и М2 фенотипы. Высокая фагоцитирующая активность и экспрессия поверхностных маркеров клеточной дифференцировки CD14, CD35, TLR2 и CD11b/CD18 показывают высокий уровень дифференцировки ТНР-Мф.
Показано, что протенкиназа С (PKC) играет ключевую роль в осуществлении адгезии ТHP-1 моноцитов, однако детальные механизмы индуцированных процессов в полной мере неизвестны (рис.6). Сигнальный каскад РМА-РКС-актин включает несколько видов сигнальных протенкиназ AMPK, Syk, Src и ERK. Рис.6. Сигнальный PMA-механизм активации и адгезии ТНР-1 моноцитов [M-Y. Chang et al., 2012]. PKC-зависимая активация группы киназ индуцирует координированный сигнал перестройки цитоскелета и клеточной адгезии.
Таким образом, обработка РМА является эффективным способом получения ТНР-1 Мф разной степени зрелости, похожим по свойствам, но не идентичным моноцитарным Мф. Недостатком исследований на клеточных моделях остаётся отсутствие микроокружения в тканях и нарушения в трансформированных линиях клеток сигнальных процессов. Сокультивирование Мф с другими видами клеток (адипоциты и Т-лимфоциты), в какой-то мере компенсирует недостаток микрокружения in vitro/
В определенных условиях культивирование дифференцированных ТНР-Мф позволяет получать тканевые Мф, выделенные из организма при хроническом воспалении. Например, имитируя условия диабета, ТНР-Мф культивируют в среде, содержащей 25 мМ глюкозы (повышенный уровень) [G.P. Fadini et al., 2013]. Эти исследования показывают возможность применения ТНР-клеточной модели в клинических исследованиях для изученя ряда видов патологий.
Результаты сравнения профилей цитокинов в цельной крови, лимфоцитах и моноцитах [A.Schildberger et al.,2013] указывают на различия в воспалительных реакциях разных клеточных моделей. Факторы, образуемые клетками крови при обработке LPS и PHA (фитогемагглютинин), индуцируют в трофобластах фосфорилирование транскрипционных факторов Stat1 и Stat2 и активацию MAPK-киназ [K. Jiang et al., 2007].
Вирусы гриппа А
Проводили в культуральных жидкостях на чувствительных опухолевых клетках CaCo-2 микрометодом в 96-луночных плато по методике. Разведения культуральных вирусов вносили в лунки плато в среде RPMI-1640, дублируя пробы, и инкубировали 2-3 дня при 37С в атмосфере 5% СО2. Под световым микроскопом учитывали результат появления токсического действия (ТЦД50). Величины обратного разведения считали титром и выжали в log2 или log4. Реакцию гемагглютинации (РГА) куриных эритроцитов (0,75 % взвесь в физиологическом растворе NaCl pH 7,0) с разведениями образцов «аллантоисных» и культуральных вирусов делали в круглодонных микроплатах стандартным методом.
Определение токсичности (тест МТТ) использовали для оценки токсических факторов, секретируемых ТНР-РМА Мф в динамике инфекции [X. Yu et al., 2014]. В 96-луночные плато с монослоем клеток Саco-2 вносили разведения культуральных жидкостей, на срок 48 ч. Затем в лунки с клетками добавляли 20 мкл реагента МТТ 1 мг/мл (Sigma-Aldrich) и инкубировали 4 ч при 37С. Планшеты центрифугировали при 1500 об/мин 5 мин и супернатант отсасывали. В лунки добавляли по 150 мкл раствора ДМСО (ПанЭко, Россия) и встряхивали на шейкере при 37С 7 минут для растворения кристаллов формазана. Восстановленный МТТ измеряли при 450 нМ (микропланшетный фотометр модель «Anthos 2010»). Токсичность выражали как величину обратную разведению, дающую снижение ОЕ-поглощения на 50% по сравнению с контролем.
Суммарную РНК выделяли из лизатов клеток, замороженных с реагентом PureZol при- 70С. К оттаявшим лизатам добавляли хлороформ, интенсивно перемешивали и разделяли при 4С центрифугированием 10 тыс об/мин согласно инструкции. Собирали водную фазу и осаждали РНК изопропанолом при – 20 С. Осадки промывали 75% этиловым спиртом 2 раза и подсушивали. РНК растворяли и обрабатывали ДНКазой по инструкции производителя (набор RNA-free «Ambion»). После получения РНК свободной от ДНК сразу проводили реакцию обратной транскрипции. Реакция обратной транскрипции (ОТ)
Реакцию ОТ ставили с универсальными праймерами random и олиго(dT)15 на матрицах суммарной клеточной РНК в объеме 30 мкл при 42 С в течение 1 ч на водяной бане. Смешивали 5 мкл РНК с 2 мкл праймеров (1 ОЕ/мл) и нагревали 5 мин при 90С. К РНК добавляли реакционную смесь 23 мкл, которая содержала четыре вида dNTP (dАТ P, dGТP, dТТP, dCТP) по 500 мкМ, фермент обратную транскриптазу (RT МMuLV) 300 ед, ингибитор РНК-азы (RNAsin) 50 ед (реактивы фирмы «Promega», США). Реакцию ОТ останавливали нагреванием проб до 95С. Полученные кДНК хранили при – 70С.
ПЦР в реальном времени (ОТ-ПЦР-РВ)
Проводили на амплификаторе CFX-96 с готовой 2-х кратной смесью SsoFast EvaGreen Supermix (Bio-Rad, США) в микропробирках с оптически-проницаемыми крышками на 0,2 мл (SSI, Россия). В ПЦР-боксе смешивали 2 мкл специфических пар праймеров (прямой и обратный) с 3 мкл кДНК (разведение 2-100 раз) и 5 мкл 2х-кратной смеси SsoFast EvaGreen Supermix. Каждая проба исследовалась в 2-3х повторах. Программа ПЦР: 96С 2 мин (1 цикл), далее 50-55 циклов 94С 10 сек, 55-60С 20 сек, 72С 30 сек. Программа плавления в конечной точке 65–95 С, шаг 0,5 С 10 сек. На экране компьютера (в реальном времени) регистрировались уровни флюоресценции, интеркалирующего в ДНК красителя EvaGreen в виде кривых накопления ДНК-амплификатов. Количество оценивалось по пороговым циклам (Cq) начала логарифмической фазы синтеза. Негативный контроль (проба, не содержащая кДНК) не давал специфических ПЦР-продуктов.
Расчёты уровней экспрессии генов и их статистическая обработка Обработка данных амплификации выполнена в программе CFX Manager Software «Gene expression analysis» (Bio-rad, США) в автоматическом режиме. Определены стандартные отклонения величин Cq±SD логарифмической фазы и изменения уровней в опытных пробах (дельтаCq±SD). Гены «домашнего хозяйства» (актин-бета, В2М, глицеральальдегид-фосфат дегидрогеназа, рибосомальная РНК) не всегда было возможным использовать как стабильные референс-нормализаторы генной экспрессии, т.к. их уровни менялись после обработки препаратами и в заражённых вирусами клетках [B. Kozera, М. Rapacz, 2013]. Оценку изменений генной активности (2дельтаСq) делали относительно контроля, принятого равным 1. В ряде опытов, где изменения референс-гена были не более 2-х раз, сделана нормализация данных (2 дельта Cq) на референс 18S рибосомальную РНК [K.J. Livak, T.D. Schmittgen, 2001]. Эффективность (Е) амплификации кДНК колебалась от 90 до 100%, что считается допустимым в сравнительном анализе. Cпецифичность ДНК-продуктов устанавливали по Т-плавления и дополнительно электрофорезом в агарозном геле по молекулярным размерам.
Достоверность различий в сравниваемых группах оценены с применением критерия Стьюдента с вероятностью более 95% в программе МеdCalc. Стандартные отклонения (SD) в повторных образцах представлены на рисунках опытов. Электрофорез ПЦР-продуктов в агарозном геле Гозиронтальный электрофорез ПЦР-продуктов проводили в 1,5% агарозном геле на буфере ТBЕ (tris-boric acid-EDTA) рН 8,0 в мини-камере (длина геля 10 см). К пробам ПЦР-продуктов 10 мкл добавляли 2 мкл буфера нанесения (глицерол с красителем бром-феноловый синий). Время электрофореза 1-2 ч при 75 V и комнатной температуре. Гели просматривали в УФ – трансиллюминаторе (Biometra, Германия) и фотографировали с помощью устройства «Gel Imager» (Invitrogen, США). Подвижность ДНК-амплификатов в геле сравнивали с маркёрами DNA-ladder 100 (Promega, USA).
Сравнение уровней экспрессии TLR/RLR-генов в клетках моноцитарной лейкемии ТНР-1 и аденокарциномы толстого кишечника
По биологическим свойствам и генетической структуре вирусы гриппа рекомбинантный A/Puerto Rico/8/34 H1N1/H5N1 и его «эскейп» мутантом m13(13) вирусы были изучены ранее [N.V. Kaverin, I.A. Rudneva et al., 2007]. Исследованный вирус является созданным методом обратной генетики из высопродуктивного штамма A/Puerto Rico/34 (H1N1) (VCH5N1-PR8/CDC-RG R. Donis Centers for Disease Control and Prevention, Atlanta GA). Гены ГА и нейраминидазы заменены на птичьи H5N1 A/Vietnam/1203/04. «Эскейп» мутант m13(13) A/Vietnam/1203/04 имеет аминокислотную замену S145F, локализованную на поверхности ГА в антигенном сайте 1. Эта мутация позволяет вирусу ускользать от действия моноклональных антител (МКА) и может оказаться существенной для патогенеза. В настоящей работе впервые исследованы свойства рекомбинантного вируса A/Puerto Rico/8/34 H1N1/ H5N1 /Vietnam/1203/04 и его «эcкейп» мутанта m13(13), связанные с индукцией генов врожденного и адаптивного иммунитета и синтеза воспалительных цитокинов в лимфоцитах человека.
Возможность размножения птичьего вируса H5N1(A/Vietnam/1203/04) и его «эскейп» мутанта m13(13) в клетках крови человека неизвестна. Предстояло выяснить происходит ли накопление вирионной РНК в инфицированных лимфоцитах и освобождение инфекционных вирионов и HA в среду культивирования. На рис. 34 показаны данные ПЦР-уровней вирионной РНК (ген HА, фрагмент S4) в лимфоцитах 2-х доноров и показатели инфекционности и PГА в культуральной жидкости в динамике инфекции (сроки 2, 24, 48 и 72 ч). Hа сроках инфекции с 2-х до 48 ч в лимфоцитах присутствует вирионная РНК и её количество меняется незначительно (у донора 1 пороговые циклы Сq=32-33 и у донора 2 Cq=28-30), немного снижаясь к 72 ч (рис. 34 а). Рассчитанные праймеры к гену HA вируса A/Vietnam/1203/04 и его «эскейп-мутанту» m13(13), дают один специфический ПЦР-продукт 314 н.п. с характерной Т-плавления 80С (рис. 34 б). Показатели инфекционности и ГА-активности находятся на низком уровне (порядка 4-5 log2 ТЦД50/ 2-4 ед ГА) и мало изменяются в динамике наблюдения (рис. 34, таблица).
Согласно данным приведенным ниже, этого вполне достаточно для выраженных эффектов рекомбинантного вируса A/PR8H1N1/H5N1 и его «эскейп» - мутанта m13(13) на сигнальные реакции иммунитета в лимфоцитах человека. (а, б). Инфекция рекомбинантным вирусом A/PR8 H1N1/H5N1 и «эскейп» мутантом m13(13) лимфоцитов доноров (а) – ОТ-ПЦР-уровни вирионной НА-РНК в лимфоцитах. По оси абсцисс циклы, по оси ординат - уровни флюоресценции синтезированных ДНК продуктов на разных сроках исследования. (б) - пики плавления специфических ПЦР-продуктов. По оси абсцисс Т плавления ДНК-амплификатов, по оси ординат — производная флюоресценции. В таблице на рис. 34 приведены показатели инфекционности и PГА культуральных вирусов.
Нами определена экспрессия 4-х генов TLR/RLR-рецепторов врождённого иммунитета, которые участвуют в «узнавании» вирусов гриппа А. Bирионная 5 pppРНК и РНП взаимодействует с эндосомальным рецептором TLR7 или TLR8 и хеликазой RIG1 [S.S. Diebold et al., 2004; M. Weber et al., 2013]. На гликолипопротеиды оболочки реагирует мембранный рецептор TLR4. На рис. 35 (а, б, в, г, д, е) показаны изменения экспрессии этих рецепторных генов в лимфоцитах 2-х доноров на разных сроках исследования.
Наблюдается очень ранняя (2 ч инфекции) стимуляция вирусами генов «узнающих» рецепторов. В обоих случаях за активацией следует падение генной активности (исключением являются гены TLR7 и RIG1 у донора 2, которые продолжают быть активироваными вирусами до 24 ч). Следует отметить, что мутантный вирус m13 в ряде случаев опережает исходный вирус по уровню и времени генной активации, что особенно заметно в случае мембранного рецептора TLR4. У донора 1 стимулирующее действие обоих вирусов на экспрессию генов TLR4 и RIG1 достигает высоких 100-кратных уровней, тогда как у донора 2 не превышает 10 раз. Оба вируса стимулируют экспрессию генов TLR7 и TLR8 в лимфоцитах донора 2. Действие рекомбинантного A/PR8/H5N1 и его «эскейп» мутанта на экспрессию генов TLR4, RIG1 TNF-alpha на поздних сроках инфекции является ингибирующим. (а, б, в, г, д, е). Стимуляция рекомбинантом A/PR8H1N1/H5N1 Vietnam и «эскейп» мутантом m13(13) транскрипции генов TLR4, TLR7 и TLR8 в лимфоцитах двух доноров. По оси абсцисс - сроки исследования в часах, по оси ординат - кратность стимуляции транскрипции относительно контролей принятых равными 1. Исходный вирус (белые столбики) и эскейп» - мутант m13 (черные столбики).
Реакция гена TNF-alpha на вирусы была повышенной у 2-х доноров, но постепенно ослабевающей (рис. 36 а, б). У донора 1 наблюдалось более длительное стимулирующее действие исходного рекомбинантного вируса на цитотоксический ген по сравнению с мутантом m13. Экспрессия рибосомальной РНК также снижается в процессе вирусной инфекции в заражённых лимфоцитах, возможно отражая их гибель (рис. 36 в, г). Образование в лимфоцитах, заражённых рекомбинантным A/PR8 H1N1/ H5N1 и его эскейп мутантом m13, специфических ПЦР-продуктов подтверждается электрофорезом в 1,5% агарозном геле (рис. 37).
Индивидуальные TLR/RLR-реакции моноцитов крови доноров на гранулоцитмакрофаг-колониестимулирующий фактор (GM-CSF)
Линия перевиваемых клеток ТНР-1 получена от ребенка с острой миелоидной лейкемией [S. Tsuchiya S. et al., 1980]. Клетки ТНР-1 имеют основные морфологические и фенотипические свойства моноцитов периферической крови, но в них нарушены процессы гематопоэза и клеточной дифференцировки [A.F. McGettrick, L.A.J. O Neill, 2007]. В геноме клеток ТНР-1 обнаружены мутации, приводящие к снижению функциональной активности группы рецепторов [R.J. Critchleyhorne et al, 2009]. Клетки THP-1 рассматривают как удобную модель ин витро для изучения действия иммуномодулирующих препаратов [W. Chanput et al., 2014; K.A. Remer et al., 2006]. Преимущества моноцитов ТНР-1 состоят в лёгкой доступности необходимых количеств генетически однородного клеточного материала, что позволяет избежать индивидуальных различий в ответах на препараты клеток донорской крови.
Сравнили эффекты препаратов ИФН и ИФН-индукторов на экспрессию TLR/RLR-генов и транскрипционного фактора NFkB в клетках ТНР-1 и НСТ-116 и сопоставили с данными, полученными ранее на клетках крови здоровых доноров. В линиях опухолевых клеток уровни экспрессии исследованных TLR/TLR-генов оказались значительно ниже, чем в клетках крови здоровых доноров. Практически не выявляемыми оказались транскрипты генов рецепторов TLR3, TLR7, TLR9 и в клетках НСТ-116, дополнительно ген TLR4. Все эти рецепторы необходимы для запуска сигнальных путей противовирусного иммунитета и ведут к синтезу ИФН и регуляторных цитокинов [J. Cannova et al., 2015; S. Pandey et al., 2015].
В 2-х линиях клеток ТНР-1 и НСТ-116, полученных из разных типов опухолей, имеются определённые отличия как в конститутивных, так и в индуцированных спектрах TLR/RLR-генов. Уровни экспрессии генов TLR2 и TLR4, и гена фактора NFkB выше в клетках моноцитарной лейкемии ТНР-1. Ген TLR8 активен в обоих типах опухолевых клеток. В клетках ТНР-1 препараты Ридостин, Циклоферон, Инфибета и Иммуномакс сильнее активировали гены TLR4, TLR8 и NFkB. В клетках НСТ-116 реакция генов TLR7, TLR8, TLR9 и NFkB на эти препараты также была стимулирующей, но менее выраженной.
Стимулирующий эффект препаратов в опухолевых клетках был выше при низком или не выявляемом уровне экспрессии TLR-генов. Следует отметить нестабильную транскрипционную активность исследованных генов в пассажах опухолевых линий клеток ТНР-1 и НСТ-116. Такие нарушения в генной активности согласуется с изменениями в рецепторных свойствах и сигнальных реакциях раковых клеток [L. Zitvogel, 2015; O Shea, J.J. et al., 2013; D. Savitsky et al., 2010]. Обнаружение в составе ПЦР-продуктов опухолевых клеток дополнительных ДНК-амплификатов меньшего размера, даёт основание предполагать нарушения в процессинге зрелых форм мРНК. Такие аномальные ПЦР-продукты отсутствовали в пробах мРНК TLR/RLR генов клеток крови здоровых доноров при использовании тех же пар праймеров.
Таким образом, исследованные препараты в опухолевых клетках и ТНР-1 и НСТ-116 обладают иммуномодулирующей активностью и являются активаторами определённых видов сигнальных TLR/RLR-рецепторов на транскрипционном уровне [Т.М. Соколова, В.В. Полосков и др., 2016]. Позитивная регуляция TLR/RLR-генов демонстрирует возможность коррекции нарушений в сигнальных механизмах иммунного ответа в опухолевых клетках.
Наиболее сильным активатором транскрипции генов TLR-рецепторов оказался препарат Ридостин, поэтому его действие на сигнальные процессы в опухолевых клетках изучено в работе более подробно. Механизмы взаимодействия дсРНК и осРНК со структурами рецепторов TLR3, TLR7, RIG1 и MDA5 установлены на модели комплекса полиИЦ и некоторых вирусных РНК [L. Alexopoulou et al., 2001; M. Tatematsu et al., 2014; T. Matsumiya, D.M Stafforini, 2010]. Противоопухолевое действие синтетического комплекса полиИЦ и Ридостина во многом обусловлено действием на апоптотические и антипролиферативные факторы [Y-S. Cheng et al., 2010; Т.М. Соколова и др., 2011]. По нашим данным Ридостин (смесь дсРНК и осРНК киллерных штаммов дрожжей) – активатор транскриппции несколькихTLR/RLR-сигнальных путей в клетках человека и группы генов системы ИФН в фибробластах человека [Т.М. Соколова и др., 2013, 2015]. Эти свойства подтверждены в исследованиях на опухолевых клетках ТНР-1 и НСТ-116. В опухолевых клетках ТНР-1 и НСТ-116 препарат Ридостин показал себя эффективным стимулятором ряда рецепторных генов. В клетках моноцитарной лейкемии ТНР-1 препарат индуцировал широкий спектр генов TLR2, TLR4, TLR8, RIG1, MDA5 и фактор транскрипции NFkB. Не активированным оставался только ген рецептора TLR3. В клетках аденокарциномы НСТ-116 Ридостин также оказывал стимулирующее действие на широкий спектр генов, но эффект был несколько слабее. В составе активированных генов в этом случае присутствовал ген TLR3, но отсутствовал ген TLR9.
Активация сигнальных рецепторов сопровождается изменением CD-фенотипов ТНР-1 клеток моноцитарной лейкемии. Препараты Циклоферон, Иммуномакс, Реаферон снижают уровень миелоидных супрессоров CD38, Ридостин повышает маркёр макрофагов CD11b, Реаферон приводит к росту HLA DR. ИФН-индукторы повышают уровень маркёра природных киллеров СD7. Пока остаётся не ясным, в какой мере снижение уровня миелоидного супрессора связано с активацией генов иммунных TLR/RLR рецепторов. Для ответа на этот вопрос требуются дополнительные исследования c разными TLR-агонистами и мутантными клетками [S. Kaczanowska S.et al., 2011].
В настоящей работе впервые изучено действие препарата Ингавирин (Дикарбамин) на большую группу генов рецепторов врождённого иммунитета и генов системы ИФН в клетках крови доноров и в клетках лейкемии ТНР-1. Гемопротективные эффекты препарата Ингавирин были обнаружены ранее у больных раком крови и затем выявлены при других видах злокачественных опухолей [В.Е. Небольсин и др., 2011]. Ингавирин оказывает антивирусное действие, снижая инфекционность и нарушая ультраструктуру вирусов гриппа [В.В. Зарубаев и др., 2011]. Препарат Ингавирин в настоящее время широко применяется при вирусных инфекциях как противогриппозный препарат (Л.В. Колобухина и др., 2009).