Содержание к диссертации
Введение
ЧАСТЬ I. Обзор литературы 14
Глава 1. Механизмы врожденного иммунитета 14
1.1 Основные компоненты системы врожденного иммунитета 14
1.2 Распознающие рецепторы системы врожденного иммунитета 16
1.3 Лиганды toll-подобных рецепторов, их применение 20
ЧАСТЬ II. Собственные исследования 44
Глава 2. Материалы и методы 44
2.1 Материалы 44
2.2 Методы
2.2.1 Работа с культурами клеток 45
2.2.2 Выделение нуклеиновых кислот (ДНК и РНК) 47
2.2.3 Реакция обратной транскрипции 47
2.2.4 Полимеразная цепная реакция 47
2.2.5 Выделение мононуклеарных клеток из периферической крови и стимуляция клеток различными лигандами 49
2.2.6 Иммуноферментный анализ (ИФА)... 50
2.2.7 Статистические методы анализа 50
Глава 3. Результаты и обсуждение 51
3.1 Разработка систем ОТ-ПЦР в режиме реального времени для оценки экспрессии генов TLR3 и TLR7 51
3.2 Обоснование подбора лигандов TLRs, используемых в экспериментальных моделях 56
3.3 Анализ влияния природных и синтетических лигандов TLRs на экспрессионный профиль молекул врожденного иммунитета (TLR3, TLR7, TLR9, TNFa, IFNP, HBD-2) in vitro 60
3.4 Изменение экспрессии генов TLR9 и р дефенсина-2 (BD-2) в лейкоцитах периферической крови мышей линии BALB/c под действием природных и синтетических лигандов
TLRs 74
Заключение 79
Выводы 83
Список литературы
- Распознающие рецепторы системы врожденного иммунитета
- Работа с культурами клеток
- Выделение мононуклеарных клеток из периферической крови и стимуляция клеток различными лигандами
- Анализ влияния природных и синтетических лигандов TLRs на экспрессионный профиль молекул врожденного иммунитета (TLR3, TLR7, TLR9, TNFa, IFNP, HBD-2) in vitro
Распознающие рецепторы системы врожденного иммунитета
Одним из важнейших открытий в иммунологии последних лет стало открытие молекулярных механизмов функционирования системы врожденного иммунитета и ее роли в развитии ответа на патогены. Врожденный иммунитет обеспечивает быструю элиминацию патогенов и предотвращение инфекции на ранних этапах, когда механизмы адаптивного иммунитета еще не задействованы. Система врожденного иммунитета была сформирована эволюционно до приобретения способности организмов к перегруппировке генов иммуноглобулинов и Т-клеточного рецептора, к узнаванию “своего”, полноценной иммунной памяти. Реакции врожденного иммунитета играют большую роль на слизистых оболочках организма [15, 25, 58, 127, 185].
Врожденный иммунитет представлен следующими клеточными компонентами: моноцитами (Мо), дендритными клетками (ДК), нейтрофилами (НФ), макрофагами (МФ), эозинофилами, тучными клетками и др. Гуморальные факторы врожденного иммунитета представлены цитокинами, белками системы комплемента, белками острой фазы, катионными противомикробными пептидами и др. Основная функция врожденного иммунитета представлена преимущественно в узнавании чужеродных белков и углеводов инфекционной природы, которая активируется сразу после взаимодействия с инфекционным агентом и в элиминации патогена из организма. Если полная элиминация невозможна, то врожденный иммунитет начинает активировать механизмы адаптивного иммунитета (например, через активацию Т-лимфоцитов дендритными клетками) [8, 17, 22, 23]. Факторы врожденного иммунитета не изменяются в процессе жизни организма и контролируются генами зародышевой линии, которые передаются по наследству [99, 108, 131]. Подробная характеристика распознающих структур системы врожденного иммунитета будет представлена в следующих разделах. Известно, что механизмы врожденного и адаптивного иммунитета связаны между собой. В качестве примера можно привести тот факт, что дендритные клетки и макрофаги презентируют антигены Т- и В лимфоцитам. Цитокины, вырабатываемые клетками врожденного и адаптивного иммунитета оказывают взаиморегулирующее действие на системы врожденного и адаптивного иммунитета. [15, 39]. На эпителиальных клетках слизистых оболочек и клетках врожденного иммунитета (макрофагах, дендритных клетках, нейтрофилах и др.) экспрессируются различные паттерн-распознающие рецепторы (TLR 1 9). Эти рецепторы распознают общие молекулярные последовательности-паттерны и их активация стимулирует продукцию противовоспалительных цитокинов/хемокинов и интерферонов первого типа (IFN/) [30, 37, 97, 130]. В результате взаимодействия с рецепторами происходит активация сигнальных путей через ядерный фактор транскрипции NF-kB и увеличивается экспрессия генов провоспалительных цитокинов и интерферонов 1 типа. Плазмацитоидные дендритные клетки являются главными продуцентами интерферонов 1 типа, активирующих NK и NKТ лимфоциты. Изначально развивается локальная воспалительная реакция. Миелоидные дендритные клетки, пришедшие в очаг инфицирования, фагоцитируют разрушенные инфицированные клетки. Патогенные белки встраиваются в молекулы HLA- классов I и II, затем эти дендритные клетки созревают и мигрируют в ближайший лимфатический узел, где происходит презентация вирусных пептидов специфическим клонам CD8+ Т-лимфоцитам и Thо, соответственно [8, 132].
К основным распознающим структурам врожденного иммунитета относят паттерн-распознающие рецепторы (PRRs). Среди PRRs центральное место занимают Toll-подобные рецепторы. В 1992 году было обнаружено, что белок, кодируемый геном Toll, является трансмембранным рецептором, который участвует в регуляции дорзовентральной полярности насекомого Drosophila melanogaster. Позже было замечено, что данный белок участвует в защите от грибковой инфекции и мутантные по этому рецептору насекомые гибли от грибковой инфекции. Также было установлено, что активация Toll-рецептора приводит к экспрессии белков, участвующих в защите от грибов и бактерий. В конце 90-х годов аналог Toll-рецептора был обнаружен и у человека [9, 108].
TLRs можно разделить на две группы: поверхностные (TLR 1, 2, 4, 6 и др.) и эндосомальные (TLR 3, 7, 8, 9) рецепторы. С поверхностными структурами вирусов, бактерий, грибов, простейших, а также с некоторыми собственными антигенами связываются поверхностные TLRs, которые могут образовывать как гомо-, так и гетеродимеры [178]. Другая разновидность рецепторов – эндосомальные преимущественно распознают нуклеиновые кислоты: как ДНК, так и РНК патогенов. Считается, что на распознавание внутриклеточных микробов (например, вирусы) в основном нацелены TLRs, расположенные в эндосомах клеток [111, 171].
В основном, TLR состоит из двух доменов и трансмембранного участка. Существует внеклеточный домен - представлен повторяющимися последовательностями с высоким содержанием лейцина и участвует в распознавании патогена. Внутренний домен TLRs гомологичен с цитоплазматическим доменом рецептора IL-1 (TIR-домен - Toll/interleukin-1 receptor domain), участвет в передачи сигнала с рецептора внутрь клетки [15, 102, 155].
Специфичность Toll-подобных рецепторов. На сегодняшний день известно 10 Toll-подобных рецепторов человека. Специфичность рецепторов различна. Так, TLR2 характеризуется распознаванием широкого спектра лигандов: пептидогликан [93, 155], липотейхоевые кислоты, зимозан [174], бактериальные липопептиды [45], белки теплового шока и др. Данное разнообразие связано с тем, что TLR2 может образовывать как гомо-, так и гетеродимеры с рецепторами TLR1 и TLR6 [172, 184]. В результате детального изучения химической структуры этих лигандов было установлено, что гетеродимер TLR2/TLR1 отвечает за распознавание триацилированных липопротеинов, тогда как липопротеины с более длинными цепями могут распознаваться гомодимером TLR2/TLR2 независимо от TLR1 [45, 178]. В ряде работ показано, что TLR2 способен взаимодействовать с атипичными формами липополисахарида (ЛПС) Leptospira interrogans и Porphyromonas gingivalis. Другим членом подсемейства TLR2 является TLR10, следует отметить, что TLR распознают не только структуры микробных клеток и вирионов, но и эндогенные молекулы, которые образуются при повреждениях ткани.
Работа с культурами клеток
Доказательства причастности TLR2 при ишемии / реперфузии приводящей к повреждению органов и тканей явились предпосылкой для развития лигандов TLR2 с целью использования их в профилактике этого заболевания. На мышиной модели, с дефицитом TLR2, было показано уменьшение площади поражения сердечной мышцы при инфаркте миокарда, а также улучшение сердечной функции [181]. Блокирование TLR2 оказывает благоприятное воздействие на почечную ишемию / реперфузию полученную в результате травмы [121]. TLR2 экспрессируется на сердечной паренхиме, которая, как считается, ответственна за повреждения, полученные в результате ишемии миокарда [65, 120] (Рис. 3).
Препарат OPN305, разработанный Opsona Therapeutics, является человеческим антиLR2 моноклональным антителом, которые обладают способностью блокировать рецепторы как TLR2/1, так и TLR2/6. В результате происходит блокировка передачи сигналов и уменьшается производство TLR2 опосредованного провоспалительного цитокина. Обнадеживающие результаты для OPN305 были получены в исследованиях на свиной модели ишемии миокарда / реперфузии. У Животных, которым вводился внутривенно препарат OPN305 до реперфузии / инфаркта, были в менее выражены поражения миокарда [69]. В 2009 году препарату OPN305 был также присвоен статус офранного препарата, который может применяется для профилактики ишемии и реперфузионных повреждений, связанных с трансплантацией органов. Дополнительные исследования дали положительные доклинические данные OPN305 и показали возможность применения препаратапри ишемии / реперфузии почек, сепсисе и при лечении ревматоидного артрита [76, 144].
Другой препарат SMP105, который является агонистом TLR2 (Dainippon Sumitomo Pharma), представляет собой компоненты клеточной стенки Mycobacterium Bovis, Вакцина БЦЖ, применение которой планируется для лечения раковых заболеваний. Введение SMP105 приводит к повышению уровня цитотоксических Т-лимфоцитов и IFN-продуцирующих клеток, а также снижению роста опухолей у мышей [114].
TLR4 - наиболее изученный рецептор из семейства TLR, который распознает липидные компоненты клеточных стенок бактерий (ЛПС) совместно с рецепторами MD2, CD14 и LPS-связывающим белком (LBP) [104, 160]. Связывание ЛПС индуцирует образование димеров TLR4 и инициирует активацию каскада сигнальных путей. Моноклональные антитела к TLR4 препарата NI0101 обладают способностью связываться с эпитопом TLR4, и тем самым ингибирует TLR4 димеризацию, в следствие чего снижается производство провоспалительных цитокинов. Также эти антитела имеют несколько потенциальных показаний, включая острый респираторный дистресс-синдром, острое повреждение легких, ревматоидный артрит и астма, препарат все еще находится в доклинической стадии исследования.
Антагонист TLR4 препарат AV411 (Ibudilast) был определен как препарат, обладающий потенциальной полезностью при лечении неврологических заболеваний. На сегодняшний день, препарат уже используется в Азии для лечения астмы и постинсультных расстройств, применение препарата продемонстрировало эффективность в нескольких моделях невропатической боли [159]. Препарат AV411 был переведен на второй этап испытаний и его применение планируется для лечения невропатической боли и опиоидной абстиненции [115]. Опиоиды, как было показано, обладают агонистической свойствами к TLR4, которые могут быть заблокированы использованием TLR4 антагонистов [94]. TLR4 был вовлечен в качестве ключевого рецептора для лечения нейропатической боли [126]. Механизм препарата основан на высвобождении провоспалительных цитокинов, таких как TNF и IL-1b и после активации TLR4 повышается афферентные сенсорные сигналы, что приводит к обострению болезненных ощущений. Препарат
AV411 подавляет производство этих цитокинов в глиальных клетках in vitro и усиливает высвобождение противовоспалительного цитокина IL-10 и нейротрофических факторов [32]. Препарат Eritoran (E5564), который является синтетическим аналогом липида А (компонент липополисахарида) является еще одним TLR4-опосредованным терапевтическим препаратом. Структурные исследования TLR4-MD2 и его комплекса с Eritoran показало, что препаратс Eritoran воздействует на TLR4 как антагонист. В человеческих моноцитах, Eritoran уменьшает производство индуцированного ЛПС, TNF и IL-6 [92]. Первый Этап клинических испытаний показал, что Eritoran эффективно ингибирует производство цитокинов и снимает клинические симптомы в ответ на действие ЛПС [57, 146]. Вторая фаза клинических испытаний Eritoran показала, что препарат не обладает выраженной токсичностью и снижает риск смерти пациентов с сепсисом на 6,4% по сравнению с группой плацебо [48, 153]. Сейчас Eritoran успешно продвигается к третьей фазе испытаний для лечения тяжелого сепсиса [129]. Тем не менее, в январе 2011 года, на основе предварительных результатов испытаний Eisai Pharmaceuticals объявили, что не будут оформлять торговую лицензию на Eritoran для лечения тяжелого сепсиса.
Агонисты TLR4 в настоящее время продолжают изучаться. Препарат Pollinex Quattro (для лечения аллергии) является вакциной, содержащей адъювант MPL, который взаимодействует с TLR4, в сочетании с экстрактом пыльцы Амброзии и применяется для лечения сезонного аллергического ринита [150]. После получения положительных результатов в III фазе испытаний, препарат был представлен на утверждение в ЕС.
Выделение мононуклеарных клеток из периферической крови и стимуляция клеток различными лигандами
В работе использовались различные клеточные модели: клетки Vero и U937. Подбор клеточных культур осущевствлялся по данным литературы, в первую очередь интерес представляли клеточные культуры, с широким спектром Toll-подобных рецепторов, достоверно известно, что TLRs, широко представлены на клетках системы врожденного иммунитета, к которым относятся культуры U937 (лейкемическая моноцитарная лимфома человека). На эпиталиальных клетках культуры Vero (эпителий почки зеленой мартышки), как и на многих других эпиталиальных клетках, также были обнаружены TLRs. Второй фактор подбора клеточных культур был основан с учетом возможного применения у человека.
В 96-луночные планшеты помещали взвесь клеточные культуры, которые затем инкубировались при температуре 37оС в течение суток, затем в лунки планшета вносились известные концентрации лигандов. Планшет ставился в инкубатор при температуре 37 оС и в контрольные точки через один час, 3 часа, 12 часов и сутки клеточный монослой лизировался и замораживался. После из образцов выделялась НК, ставилась рекция обратной транскрипции и реациця ПЦР-РВ для определения изменения уровней экспрессии toll-подобных рецепторов, а также определялись уровни экспрессии эффекторных молекул. Эксперимент проводились в минимум трех повторах, воспроизведение некоторых экспериментах осущевстлялось до пяти раз, особенно в самомо начале исследований, это было связано с тем, что лиганды, у которых отсутствовала фосфотиоатная группа, были не усточивыми и быстро распадались в экспериментах in vitro. Ниже представлена схема эксперимента на клеточных культурах Vero (Рис. 6).
В результате получены данные об изменение уровней экспрессии генов рецепторов TLR3, TLR7, TLR9 и эффекторных молекул (IFN и TNF) в динамике. Общие закономерности следующие: эффект проявлялся в первый час с момента добавления лиганда в культуру (Таблица 6). Позже, чем через 3 часа достоверных отличий в показателях нами не было выявлено. В исследованиях было использовано несколько концентраций лигандов: 0,1 мкг, 10 мкг, 100 мкг и 1000 мкг на лунку (в объеме 100 мкл). Исходя из данных литературы и прикидочным экспериментам оставили концентрации 0 (отрицательный контроль), 10 и 100 мкг/0,1мл. - показатель достоверно от такового в группе контроля (без лигандов), р 0,05. В первую очередь можно отметить, что практически все природные лиганды давали достоверный положительный ответ относительно их рецепторов. Что касается лигандов синтетических – было все очень неоднозначно. Как и ожидалось, некоторые лиганды, содержащие РНК, приводили к опосредованному увеличению экспрессии гена TLR3. Т.е. мы можем предположить, что активация рецептора запускает его же экспрессию. По поводу лигандов, содержащих ДНК последовательности такой четкой закономерности нами не было определено. Большая часть представленных лигандов ДНК дозозависимо активировала TLR9, в меньшей степени - TLR7. Эффекторные молекулы TNF и IFN экспрессировались в культуре в основном также на первый день после действия лигандов (Рисунок 7).
На следующем этапе проводился анализ экспрессии исследуемых молекул в клеточной культуре в ответ на лизаты микроорганизмов и на отдельные компоненты (ДНК) на примере гриба кандиды и водоросли спирулины. Можно наблюдать следующий эффект – цельные (но разрушенные) микробы приводят к дозозависимому увеличению экспрессии исследуемых генов, в то время, как отдельные компоненты (в данном случае ДНК микроорганизмов) воздействуют только на TLR9. Рисунок 7. Экспрессия генов IFN и TNF через час после введения синтетических и природных лигандов in vitro (культура клеток Vero).
Показатель достоверно отличаются от показателя в группе сравнения (p 0,05) при увеличения показателя в 10 и более раз. По оси абсцисс – лиганды TLRs, по оси ординат – относительные единицы (отношение среднего значения показателя в опытной группе к среднему показателю в группе контроля). Экспрессия гена IFN была различна в зависимости от лиганда, который действовал на клеточную линию. Так, наибольшую экспрессию наблюдали при дествии РНК-содержащих лигандов и лизатов микробов – показатель экспрессии возрастал в 20-45 раз относительно показателя в интактных клетках. Клеточная линия Vero в большинстве случаев реагировала на воздействие лигандов экспрессией гена TNF. Так реагировали клетки практически на все ДНК-содержищие лиганды – экспрессия увеличивалась в 15 – 78 раз (в зависимости от последовательности лиганда).
Таким образом можно привести следующие заключения: - Клеточная линия Vero может быть использована в качестве модели для исследования спонтанной и индуцированной экспрессии генов TLRs и др. - Синтетические лиганды приводили к увеличению уровня экспрессии генов эндосомальных TLRs, эффект был дозозависим и неоднозначен. Наибольшей активностью относительно TLR9 обладали природные лиганды (ДНК C. albicans приводит к увеличению уровня экспрессии в 40 раз). На следующем этапе работы были проведены эксперименты in vitro с полученными лигандами, при этом в качестве культур были использованы мононуклеарные клетки, а также макрофогальная линия U937. Полученные результаты представлены на рисунке 9 - по действию лигандов на культуру клеток U937.
Анализ влияния природных и синтетических лигандов TLRs на экспрессионный профиль молекул врожденного иммунитета (TLR3, TLR7, TLR9, TNFa, IFNP, HBD-2) in vitro
В эксперименте было использовано 13 групп мышей. В одиннадцати группах мышей использовались лиганды. Животным из двенадцатой группы внутрибрюшинно вводили по 0,5 мл среды DMEM (группа сравнения 1). С мышами из тринадцатой группы не проводили никаких манипуляций (группа сравнения 2). Действие лигандов оценивали на 1-е, 7-е и 28-е сутки после их внутрибрюшинного введения по изменению уровня экспрессии генов TLR9 и BD-2 с помощью ПЦР в режиме реального времени (Рис.10).
На первом этапе нашей работы были подобраны лиганды TLRs, которые имели гомологию к вирусам кори, гриппа А и вируса простого герпеса 1-го типа (ВПГ-1). Синтетические лиганды были аналогичны природным лигандам по последовательности нуклеотидов (т.е. вирусной ДНК или РНК). Следует отметить, что некоторые лиганды содержали модифицированные нуклеотиды, а именно использовались модификации в виде фосфотиатов для стабилизации лигандов, по информации полученной из зарубежных научных статей, фосфотиоаты обеспечиваю более высокую стабильность лигандов в сывороски крови по сравнению с исходными. В таблице 5 представлены лиганды используемые в работе. Рисунок 10. Схема проведения экспериментов in vivo
Анализ динамики уровня экспрессии исследуемых генов показал, что основные изменения наблюдаются в первые сутки после введения лиганда. На 7-е и 28-е сутки исследуемые показатели статистически достоверно не отличались от таковых в группах сравнения. Возможно, полученный результат связан с тем, что реакция на введение лиганда TLR развивается в течение первых суток, когда происходит взаимодействие лиганда с соответствующим TLR.
Для сравнения стабильности фосфотиатов с фосфатами, которые входят в состав лигандов, были проведены исследования с двумя вариантами одного и того же лиганда TLR9: DNA_lig_5 (немодифицированный вариант) и DNA_lig_5ps (модифицированный вариант). Показано, что только фосфотиат обладал активностью – уровень экспрессии гена TLR9 увеличивался более, чем на порядок, а уровень экспрессии гена противомикробного пептида BD-2 увеличивался в два раза. Немодифицированный олигонуклеотид практически не влиял на уровни экспрессии исследуемых генов.
В качестве других лигандов TLR9 в работе были задействованы: DNA_lig_1ps, DNA_lig_2ps, DNA_lig_3ps, DNA_lig_4ps – последовательности ДНК гомологичные ДНК вируса герпеса простого. Нами была также использована для работы модификация представленных последовательностей: двухцепочечные молекулы ДНК (DNA_lig_1ps/DNA_lig_2ps, DNA_lig_3ps/DNA_lig_4ps). Для получения двухцепочечных структур одноцепочечные компоненты DNA_lig_1ps и DNA_lig_2ps, DNA_lig_3ps и DNA_lig_4ps были взяты в равных количествах по 40 мкг/мл каждого. Далее проводили отжиг олигонуклеотидов при температуре 75оС в течение 10 минут, далее медленно остужали смесь до 4оС.
В качестве РНК лигандов в работе использовались RNA_lig_1, RNA_lig_2, RNA_lig_3, где первые два лиганды комплементарны последовательности РНК вируса гриппа, а RNA_lig_3 – последовательности РНК вируса кори. Среди всех исследуемых лигандов TLR9 наиболее эффективным оказались лиганды DNA_lig_1ps и DNA_lig_2_ps. Для DNA_lig_1ps уровень экспрессии гена TLR9 увеличился в 62 раза, а для DNA_lig_2ps - в 18 раз. Для других лигандов с фософотиоатным остатком DNA_lig_5ps, DNA_lig_3ps, DNA_lig_4ps уровень экспрессии гена TLR9 увеличился в меньшей степени: в 14, 10 и 8 раз, соответственно (Рис.11). Рисунок 11. Изменение показателей экспрессии генов TLR9 и b-дефенсина 2 при действии ДНК- и РНК-содержащих лигандов TLRs.
По оси абсцисс – лиганды TLRs; по оси ординат – относительные единицы (отношение показателя в опыте относительно показателя в интактных клетках); - p0,05
Все представленные выше лиганды влияли на уровень экспрессии эффекторной молекулы BD-2, но изменения уровня ее экспрессии не были так выражены (как изменения показателя TLR9) и отличались в 2-5 раз относительно показателей в группах сравнения. При этом комплексы из ДНК лигандов (DNA_lig_1ps/DNA_lig_2ps, DNA_lig_3ps/DNA_lig_4ps) практически не обладали активностью, экспрессия исследуемых нами генов менялась незначительно. Можно предположить, что синтетические двухцепочечные структуры ДНК не индуцируют экспрессию противомикробного пептида BD-2 (Рис. 13).
Как и следовало ожидать, лиганды содержащие РНК не влияли на уровень экспрессии исследуемых генов. В ходе дальнейших экспериментов было показано влияние на экспрессию других эндосомальных TLRs.
В заключении можно отметить, что максимальной эффективностью обладают следующие лиганды: tgg-ccc-ccctggg-acc-gg, ccg-gtc-cac-aag-ggg-ggc-ca и tcgcgttgt-cgtgt-cg. В первые дни после введения лигандов наблюдалось резкое увеличение экспрессии гена TLR9 (в 62, 18 и 13 раз соответственно), но уровень экспрессии гена дефенсина при этом менялся незначительно. Через 20 и более дней статистически значимы отличий в уровнях экспрессии относительно групп сравнения нами не было выявлено. В дальнейших экспермента было показано влияние данных лигандов на уровень экспрессии других эндосомальных TLRs (TLR3, TLR7), а также увеличить спектр эффектроных молекул продуцируемых в ответ на введение исследуемых лигандов.
Таким образом, разработанный подход, основанный на определении экспрессии генов распознающих рецепторов TLR9 и эффекторной молекулы BD-2 в лейкоцитах мышей, которым внутрибрюшинно за 24 часа вводятся иммунотропные препараты, содержащие лиганды TLRs как синтетические, так и природные, может быть использован для оценки действия этих препаратов на систему врожденного иммунитета, а именно на активацию TLRs.