Содержание к диссертации
Введение
Глава 1 Обзор литературы 14
1.1 Иммунотропные препараты в инфекционной патологии 14
1.2 Биологические свойства тритерпеноидов 19
1.2.1 Иммунотропная активность тритерпеноидов 19
1.2.2 Антимикробные свойства тритерпеноидов 21
1.2.3 Биологические свойства тритерпеноида милиацина 24
1.3 Сальмонеллезная инфекция – модель для изучения протективного эффекта иммунотропных средств 25
1.3.1 Общие закономерности течения экспериментального инфекционного процесса на мышах 25
1.3.2 Особенности взаимодействия сальмонелл с организмом хозяина 27
Глава 2 Материалы и методы исследования 44
2.1 Методы оценки влияния милиацина на параметры инфекционного процесса 45
2.1.1 Модель экспериментальной сальмонеллезной инфекции 45
2.1.2 Бактериологическое исследование печени и селезенки мышей 46
2.1.3 Определение количества ядросодержащих клеток в органах иммуногенеза 46
2.2 Методы оценки влияния милиацина на иммунологические показатели 47
2.2.1 Определение спонтанной и индуцированной продукции про- и противовоспалительных цитокинов в супернатантах культур спленоцитов экспериментальных животных 47
2.2.2 Определение титра антител (РПГА) в сыворотке крови животных 47
2.3 Методы оценки влияния милиацина на биохимические показатели 48
2.3.1 Определение уровня эндотоксинемии и кортикостерона в крови экспериментальных животных 48
2.3.2 Определение уровня перекисного окисления липидов в крови экспериментальных животных 48
2.4 Методы оценки влияния милиацина на формирование функционального фенотипа макрофагов 49
2.4.1 Выделение перитонеальных макрофагов мышей 49
2.4.2 Оценка влияния милиацина на интенсивность фагоцитоза и метаболическую активность перитонеальных макрофагов мышей 49
2.4.3 Определение влияния различных доз милиацина на продукцию оксида азота перитонеальными макрофагами мышей in vitro 50
2.4.4 Определение влияния милиацина на продукцию оксида азота и ИЛ-12 перитонеальными макрофагами мышей in vivo 50
2.5 Методы оценки влияния милиацина на биологические свойства микроорганизмов 51
2.5.1 Определение влияния милиацина на рост сальмонелл 51
2.5.2 Определение влияния милиацина на уровень антилизоцимной активности сальмонелл 52
2.5.3 Определение влияние милиацина на биопленкообразование сальмонеллами 53
2.6 Статистический анализ 55
Глава 3 Оценка влияния милиацина на параметры инфекционного процесса, иммунологические и биохимические показатели при экспериментальном сальмонеллезе 56
3.1 Влияние милиацина на параметры инфекционного процесса 57
3.1.1 Оценка летальности 57
3.1.2 Оценка влияния на уровень обсемененности печени и селезенки 57
3.1.3 Оценка влияния на клеточный состав органов иммуногенеза 58
3.2 Влияние милиацина на иммунологические показатели 60
3.2.1 Оценка спонтанной и индуцированной продукции про- и противовоспалительных цитокинов в супернатантах культур спленоцитов экспериментальных животных 60
3.2.2 Оценка гуморального иммунного ответа (титр АТ в РПГА) 64
3.3 Влияние милиацина на биохимические показатели 64
3.3.1 Определение уровня эндотоксинемии и кортикостерона в крови экспериментальных животных 64
3.3.2 Определение уровня перекисного окисления липидов в крови экспериментальных животных 65
3.4 Обсуждение результатов 66
Глава 4 Оценка влияния милиацина на формирование функционального фенотипа макрофагов 73
4.1 Оценка влияния милиацина на интенсивность фагоцитоза и метаболическую активность перитонеальных макрофагов мышей 73
4.2 Оценка влияния милиацина на продукцию оксида азота и ИЛ-12 перитонеальными макрофагами мышей 74
4.2.1 Влияние различных концентраций милиацина на продукцию оксида азота перитонеальными макрофагами мышей in vitro 74
4.2.2 Влияние милиацина на функциональную активность макрофагов in vivo 76
4.3 Обсуждение результатов 77
Глава 5 Оценка влияния милиацина на биологические свойства сальмонелл 80
5.1 Влияние милиацина на рост сальмонелл 80
5.2 Влияние милиацина на уровень антилизоцимной активности сальмонелл 81
5.3 Влияние милиацина на биопленкообразование сальмонеллами 82
5.4 Обсуждение результатов 87
Заключение 89
Выводы 107
Список сокращений 109
Список литературы 113
- Особенности взаимодействия сальмонелл с организмом хозяина
- Оценка спонтанной и индуцированной продукции про- и противовоспалительных цитокинов в супернатантах культур спленоцитов экспериментальных животных
- Обсуждение результатов
- Влияние милиацина на биопленкообразование сальмонеллами
Введение к работе
Актуальность темы исследования и степень ее разработанности
Продолжающийся рост заболеваемости сальмонеллезом во многих странах мира, многовариантность сальмонелл, значительное разнообразие клинических форм проявлений (от бактерионосительства до генерализованной формы), высокая адаптационная способность, позволяющая длительно выживать (персистировать) в организме хозяина, выдвигают эту инфекцию в ряд важнейших медицинских, экологических, ветеринарных и социальных проблем (Seallan E., Hoekstra R.M., Angulo F.J. et al. Fudborne iliness acquired in the United States major pathogens. Emer. Infect. Dis. 2011. Vol.17. Р. 7-15; Jackson B.R., Griffin P.M., Cole D. et al. Outbreak – associated Salmonells Enterica Serotypes and Food Commodities United States, 1990-2008. Ermeg. Infect. Dis. 2013. Vol. 19(8). Р. 1239-1244). В этиологической структуре сальмонеллезов у людей продолжают доминировать Salmonella серовар Enteritidis, составляющие около 80% от всех идентифицированных сальмонелл.
Наиболее заметные успехи в борьбе с патогенами, обладающими способностью к персистенции, могут быть достигнуты благодаря использованию веществ как с иммуномодулирующими свойствами, так и воздействующими непосредственно на этиологический фактор. В настоящее время к числу перспективных иммунокорректоров отнесены тритерпеноиды – вещества, обладающие широким спектром биологического действия, включая способность к стимуляции гуморального и клеточного иммунного ответа (Толстиков Г.А., Ильичева Т.Н., Покровский А.Г. и др. Иммуностимулирующая активность тритерпенов растительного происхождения и их производных. Журн. микробиол. 2001. №2. С.53-56; Patel S. Therapeutic importance of sulfated polysaccharides from seaweeds: updating the recent findings. Biotech. 2012. Vol.2(3). Р.171-185; Sharma U., Bala M., Kumar N. et al. Immunomodulatory active compounds from Tinospora cordifolia. J. Ethnopharmacol. 2012. Vol.141. Р.918–926; Молчанова В.И., Чикаловец И. В., Черников О. В. и др. Биологическая активность неомитилана – биогликана из мидии Crenomytilus grayanus. В кн.: Исследования природных соединений в Тихоокеанском институте биоор ганической химии ДВО РАН. 2013. С.111-119). К числу таких веществ относится милиацин – пентациклический тритерпеноид растительного происхождения, показавший иммуностимулирующий эффект в вакцинальном процессе, а также иммунопротекторное влияние в условиях иммунодепрессии, обусловленное в том числе его антиоксидантным действием (Кириллова, А.В. Иммунотропная активность милиацина: автореф. дис. … канд. мед. наук. Пермь, 2004. 25 с.; Панфилова, Т.В. Протективная активность милиацина при стрессиндуцированной иммуносупрессии: автореф. дис. … канд. мед. наук. Пермь, 2007. 23с.; Железнова, А.Д. Экспериментальное обоснование применения милиацина для коррекции иммуносупрессии, индуцированной метотрексатом: автореф. дис. … канд. мед. наук. Пермь, 2010. 22с.). Вместе с тем вопрос о защитном влиянии милиацина в отношении инфекционного процесса остается открытым.
Актуальность данной работы определяется тем, что до начала ее выполнения не была проведена оценка защитного эффекта милиацина при сальмонеллезной инфекции; не было установлено влияние тритерпеноида на цитокиновый профиль организма и функциональную активность макрофагов инфицированных животных; не был определен механизм защитного действия милиацина, связанный с его мембранопротекторной активностью; не было изучено влияние тритерпеноида на жизнеспособность и биологические свойства возбудителя инфекции.
Цель исследования
Экспериментальная оценка протективной активности милиацина при сальмонеллезной инфекции.
Задачи исследования
-
Дать оценку влияния милиацина на течение и исход экспериментальной сальмонеллезной инфекции по показателям летальности мышей, высеваемости сальмонелл, массы и клеточного состава лимфоидных органов.
-
Изучить влияние милиацина на продукцию про- и противовоспалительных цитокинов спленоцитами и функциональную активность перитонеальных макрофагов у экспериментальных животных.
-
Исследовать уровень эндотоксинемии и перекисного окисления липидов у мышей при экспериментальном сальмонеллезе на фоне применения милиацина.
-
Оценить бактерицидный эффект и влияние милиацина на антилизоцимную активность сальмонелл, а также на их способность к биопленкообразованию.
Методология и методы диссертационного исследования
Исследования выполнены на базе проблемной лаборатории по изучению механизмов естественного иммунитета (зав. - проф. А.И. Смолягин) и кафедры патологической физиологии Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего образования «Оренбургский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации (зав. – проф. Б.А. Фролов). В работе использовали тритерпеноид милиацин (3--метокси-18-олеанен). Для достижения цели и решения поставленных задач была воспроизведена модель сальмонеллезной инфекции на мышах-самцах (CBAxC57Bl6)F1. Милиацин вводили трехкратно внутрибрюшинно с интервалами в 3 дня между введениями с последующим внутрибрюшинным заражением животных клиническим штаммом Salmonella серовар Enteritidis через 24 часа после последнего введения тритерпеноида. Исследования были проведены на 4 группах животных, включая интактных мышей, зараженных сальмонеллами без какого-либо предварительного воздействия и зараженных на фоне предварительного введения растворителя для милиацина или милиацина.
Для характеристики течения инфекционного процесса использовали показатели гибели
животных, микробной обсемененности внутренних органов, массы и содержания клеток в
органах иммуногенеза (тимус, селезенка, костный мозг). Иммунологические исследования
включали определение продукции про- и противовоспалительных цитокинов спленоцитами,
титра антител в сыворотке крови, функциональной активности перитонеальных макрофагов;
биохимические – исследование уровня эндотоксинемии, ТБК-реагирующих продуктов и
кортикостерона в крови животных. Также было изучено влияние милиацина на
функциональную активность перитонеальных макрофагов незараженных мышей. Все эксперименты проведены с учетом требований международных и российских законодательных актов о юридических и этических принципах исследований с использованием подопытных животных.
Раздел работы по влиянию милиацина на биологические свойства микроорганизмов выполнен на базе лаборатории биомониторинга и молекулярно-генетических исследований (зав. – д.м.н., проф. РАН Н.Б.Перунова) Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института клеточного и внутриклеточного симбиоза Уральского отделения Российской академии наук и Центра коллективного пользования приборным оборудованием "Институт микро- и нанотехнологий" Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего образования Оренбургского государственного
университета (директор ЦКП д.ф-м.н., проф. С.Н. Летута). Влияние милиацина на биологические свойства сальмонелл оценивали по показателям антимикробной активности, антилизоцимной активности и биопленкообразования. Наряду со спектрофотометрическим способом определения биопленок применялся метод атомно-силовой микроскопии (АСМ). Результаты исследований были статистически обработаны методами вариационной статистики с использованием пакета прикладных программ Microsoft Excel и «STATISTICA 10.0», включая методы параметрического (t-критерий Стьюдента), непараметрического (U-критерий Манна-Уитни) анализов.
Степень достоверности, апробация результатов, личное участие автора
Достоверность результатов, обоснованность научных выводов базируется на
достаточном объеме наблюдений, использовании современных лабораторных методов
исследований. Основные положения диссертации доложены и обсуждены на объединенном
иммунологическом форуме, Нижний Новгород, 2013; Всероссийской научно-практической
конференции с международным участием «Патологическая анатомия, патофизиология и
клиника неотложных состояний», Уфа, 2014; Российском научном форуме на Урале с
международным участием «Актуальные проблемы фундаментальной медицины»,
Екатеринбург, 2014; IX и X Всероссийских конференциях с международным участием «Иммунологические чтения в Челябинске», Челябинск, 2014, 2015; V Международном симпозиуме «Взаимодействие нервной и иммунной систем в норме и патологии», Санкт-Петербург, 2015; Пермском научном форуме, Пермь, 2015; VIII Российской научной конференции с международным участием «Персистенция и симбиоз микроорганизмов», Оренбург, 2015; научно-практической школе-конференции «Аллергология и клиническая иммунология», Крым, 2015; II Всероссийской научно-практической конференции с элементами научной школы для молодых ученых и специалистов "Эндогенные бактериальные инфекции: микробиологические и иммунологические аспекты", Оренбург, 2016; XIV конференции иммунологов Урала, Челябинск, 2017.
Личный вклад соискателя состоит в непосредственном участии на всех этапах
диссертационного исследования. Основная идея, планирование научной работы, включая
формулировку цели и задач, определение методологии и общей концепции диссертационного
исследования проводились совместно с научными руководителями: профессором, д.м.н.
Б.А.Фроловым, заведующим кафедрой патологической физиологии и профессором, д.м.н.
И.Н.Чайниковой, ведущим научным сотрудником проблемной лаборатории. Иммунологические
исследования выполнялись автором при консультировании и участии сотрудников
Оренбургского государственного медицинского университета (профессора, д.м.н.
А.И.Смолягина, доцента, к.м.н. Т.В. Панфиловой, доцента, к.м.н. А.Д. Железновой). Статистическая обработка результатов, изучение литературных источников и подготовка текста диссертации проведены лично автором.
Положения, выносимые на защиту
-
Тритерпеноид растительного происхождения милиацин оказывает защитный эффект при экспериментальной сальмонеллезной инфекции, что проявляется снижением гибели животных, снижением выраженности эндотоксинемии, уменьшением микробной обсемененности внутренних органов, ограничением гипоплазии костного мозга и тимуса, а также реакции селезенки на инфекционный процесс в виде увеличения ее массы и количества спленоцитов.
-
Защитные эффекты тритерпеноида при сальмонеллезной инфекции опосредуются активацией Th-1-зависимого иммунного ответа (усиление продукции интерферона-гамма, интерлейкина-12 и снижение секреции интерлейкина-4, интерлейкина-6), стимуляцией
продукции противовоспалительного цитокина – интерлейкина-10 и ограничением секреции значимого патогенетического фактора воспаления – интерлейкина-17; антиоксидантной активностью, ограничивающей индуцированное сальмонеллами накопление в крови продуктов липопероксидации.
3. Милиацин усиливает примирующий эффект перитонеальных макрофагов в отношении
продукции интерлейкина-12 и ослабляет его в отношении продукции оксида азота, ограничивая
избыточность воспалительного компонента патологического процесса и мобилизацию
клеточного иммунитета.
4. Протективная активность милиацина сочетается с модифицирующим эффектом на
биологические свойства сальмонелл: не влияя на рост бактерий, тритерпеноид подавляет их
способность к биопленкообразованию и снижает антилизоцимную активность.
Научная новизна
Впервые установлено протективное влияние милиацина при сальмонеллезной инфекции,
выражающееся в снижении летальности, высеваемости сальмонелл из органов, выраженности
эндотоксинемии (патент РФ №2564918). Выявлено, что в основе механизмов защитного
действия милиацина при данной инфекции лежит активация Th-1-зависимого иммунного
ответа, стимуляция продукции противовоспалительного цитокина - ИЛ-10, ограничение продукции наиболее значимых патогенетических факторов воспаления ИЛ-6 и ИЛ-17, а также продукции оксида азота макрофагами. Установлено, что эффекты тритерпеноида опосредуются стимуляцией им механизмов клеточного иммунитета (усиление продукции спленоцитами и макрофагами ИФН- и ИЛ-12 у зараженных мышей на фоне введения милиацина), антиоксидантной и мембранопротекторной активностью (ограничение индуцированного сальмонеллами накопления в крови продуктов липопероксидации – ТБК-реагирующих продуктов). Впервые получены данные о влиянии тритерпеноида на биологические свойства сальмонелл: подавление биопленкообразования (положительное решение о выдаче патента на изобретение №2016116177/15(025370)), снижение уровня антилизоцимной активности.
Теоретическая и практическая значимость работы
Полученные данные расширяют представление о механизмах протективного действия
тритерпеноида милиацина при экспериментальной сальмонеллезной инфекции. Установленная
способность милиацина снижать продукцию NO макрофагами представляется важной в плане
его дальнейшего изучения в качестве природного ингибитора продукции оксида азота.
Выявленное новое свойство милиацина, характеризующее его способность ограничивать
колонизацию биотопов патогенной (сальмонеллы) флорой, может повысить эффективность
методов профилактики и лечения болезней бактериальной природы. Установленный в работе
защитный эффект милиацина при экспериментальной сальмонеллезной инфекции служит
обоснованием дальнейшей разработки тритерпеноида в качестве возможного средства
повышения эффективности воздействия на инфекционный процесс, вызванный
грамотрицательными патогенными энтеробактериями.
Внедрение результатов исследования в практику
Результаты диссертационного исследования внедрены в учебный процесс кафедры патологической физиологии и кафедры эпидемиологии и инфекционных заболеваний Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего образования "Оренбургский государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации.
Публикации по теме диссертации
Соискатель имеет 20 опубликованных работ, из них по теме диссертации опубликовано 17 научных работ общим объемом 2,5 печатных листов, в том числе 13 публикаций (статей - 12, тезисов - 1) в научных журналах и изданиях, которые включены в Перечень российских рецензируемых научных журналов и изданий для опубликования основных научных результатов диссертации. Соискателю выдан 1 патент на изобретение РФ №2564918 «Средство для снижения системной патологической эндотоксинемии», вошедший в базу данных «100 лучших изобретений России – 2015», и получено положительное решение о выдаче патента № 63-230-2233 от 30.08.2017 на изобретение №2016116177/15(025370) «Средство для селективного влияния на биопленкообразование микроорганизмами». 2 работы опубликованы в материалах всероссийских и международных конференций и симпозиумов; имеется 1 публикация в электронном научном издании, зарегистрированном в базе данных РИНЦ.
Объем и структура диссертации
Диссертация изложена на 157 страницах машинописного текста, иллюстрирована 10 таблицами и 4 рисунками, состоит из введения, обзора литературы, главы с описанием материалов и методов исследования, главы с изложением результатов собственных исследований, заключения, выводов и списка литературы, который включает 78 отечественных и 356 зарубежных источников.
Особенности взаимодействия сальмонелл с организмом хозяина
Род Salmonella объединяет более 2500 представителей, широко распространенных в природе [189]. Salmonella enterica является жгутиковой, грамотрицательной, факультативной внутриклеточной бактерией, являющейся основной причиной кишечных заболеваний человека и животных [295, 413]. Среди сальмонелл выделяют штаммы «госпитального» и «животного», эпидемического происхождения. S. entericа подразделяется на шесть подвидов, которые биохимически дифференцируются на серовары на основе состава их углеводов, жгутиков и липополисахаридных (ЛПС) структур [165, 224].
Главным компонентом клеточной стенки грамнегативных бактерий являются липополисахариды. ЛПС наружной мембраны грамотрицательных бактерий является эндотоксином. ЛПС различных бактериальных групп построены по подобному структурному принципу [17, 22] и состоят из гетерополисахаридной части, ковалентно связанной с липидным компонентом, обозначаемым как липид А. Эти две части детерминируют различные свойства ЛПС. Гетерополисахаридная часть (О-специфические боковые цепи и ядро) несет структуры, распознаваемые лектинами, специфическими антителами и бактериофагами. Другая функциональная часть ЛПС – липид А, представляющий собой наиболее консервативную структуру эндотоксина и обусловливающий общность биологических свойств ЛПС, ответственна за эндотоксиновый эффект. Наружная часть ЛПС представлена высоковариабельными углеводами, которые экспонируются на поверхности бактериальной клетки. Установлено, что ЛПС локализован мозаично на поверхности бислойного пептидогликана бактериальной клетки в комплексе с белками и полисахаридами. Высвобождение ЛПС происходит в результате самообновления клеточного пула при размножении и гибели бактериальных клеток. Полисахаридная часть ЛПС, отличающаяся значительной вариабельностью у различных видов грамнегативных бактерий, определяет гидрофильность его молекулы [83]. В состав липида А входят жирные кислоты, глюкозамин и остатки фосфорной кислоты. Жирные кислоты придают молекуле гидрофобные свойства [157]. Таким образом, особенность химической структуры ЛПС обеспечивает ему наличие как гидрофильных, так и гидрофобных свойств (амфипатичность), а также обусловливает способность к взаимодействию с растворимыми компонентами биологических жидкостей и рецепторным аппаратом клеточных мембран [6]. Степень выраженности биологических эффектов ЛПС зависит от молекулярной массы ЛПС, степени его агрегации и пространственной структуры [6, 157]. В системном кровотоке ЛПС находится в агрегированном состоянии, что обусловливает слабое взаимодействие с лейкоцитами и отсутствие выраженного клеточного ответа [76]. Липид А из различных грамотрицательных бактерий имеет идентичную организацию и обладает стереотипными биологическими свойствами, включающими пирогенность, митогенность, активацию систем гемокоагуляции и фибринолиза, системы мононуклеаров. ЛПС (эндотоксин) грамотрицательных бактерий, включая сальмонеллы, в настоящее время отнесен к индикаторам эндотоксинемии, гемоциркуляция которого в макроорганизме инициирует каскад патофизиологических и иммунопатологических реакций [7, 8, 77].
Липид А ЛПС распознается TLR4 как паттерн, в ответ на который индуцируется магистральный сигнальный путь, приводящий к синтезу провоспалительных цитокинов (ФНО-, ИЛ-1, ИЛ-6, ИЛ-8), цитокинов-организаторов лимфоцитарного иммунного ответа (ИЛ-12), цитокинов -медиаторов иммунного воспаления (ИФН-) и противовоспалительных цитокинов (ИЛ-10), c чего и начинается врожденная иммунная реакция с последующей активацией механизмов адаптивного иммунитета [63]. Цитокиновый ответ индуцируется уже через час от контакта ЛПС с рецепторами врожденного иммунитета. Сальмонеллы способны ускользать от иммунного распознавания, используя модификацию липида А для изменения реакции TLR [194, 274]. Для регуляции генов вирулентности, часть из которых модифицирует структуру липида А, сальмонеллы используют двухкомпонентный сенсор PhoP/PhoQ [137, 242, 307], который наряду с регуляцией вирулентности реагирует на состав среды, окружающей патоген в организме хозяина. В результате модифицированные варианты липида А способны в 100 раз слабее активировать TLR4, что существенно снижает силу локального воспалительного ответа [273] и нарушает элиминацию патогена.
Факторы патогенности сальмонелл, обеспечивающие инвазивные свойства и способность размножаться в клетках моноцитарно-макрофагальной системы, энтероцитах, контролируются хромосомными и плазмидными генами [98, 121, 147, 163, 180, 364]. Гены сальмонелл, отвечающие за факторы вирулентности, занимают 4% генома и располагаются в хромосоме и плазмиде в виде островов патогенности (SPI-salmonella pathogenicity island). Острова патогенности сальмонелл включают в себя кластеры генов, которые кодируют эффекторные молекулы, с помощью которых сальмонеллы взаимодействуют с клетками хозяина, обеспечивая выживание и уклонение от иммунных механизмов [160, 228, 250, 297].
На сегодняшний день описаны 23 SPI, хотя функции генов, содержащиеся в каждом из 23 островов, еще не полностью выяснены [201, 367]. SPI локализуются на бактериальной хромосоме или на плазмиде, однако, не все серовары обладают всеми известными SPI. SPI-1 - SPI-5 являются общими для всех сероваров S. Enterica c некоторыми различиями среди сероваров или штаммов [142, 199]. Наиболее описаны SPI-1 и SPI-2, имеющие особое значение в развитии инфекции in vivo [178, 403]. SPI-1 и SPI-2 кодируют две различные системы секреции III типа (T3SS), каждая из которых транслоцирует специфическую группу бактериальных эффекторных белков в цитоплазму поражаемой клетки хозяина (T3SS-1 и T3SS-2) [131, 154, 363]. Метаболическая адаптация сальмонелл к стрессорным условиям выживания в клетках хозяина реализуется также с участием продуктов SPI-1 и SPI-2 [139]. Существует парадигма, что SPI-1 обеспечивает инвазию сальмонелл в клетки энтероцитов, распространение в lamina propria и моноцитарно/макрофагальные клетки посредством интернализации SPI-1 T3SS и секреции 13 идентифицированных эффекторов (AvrA, SipA, Sip B, SipC, Sip D, SIrP, SopA, SopB/SigD, SopD, SopE, SopE2, SptP, SspH), которые индуцируют реорганизацию плазматической мембраны, актина цитоскелета с формированием макропиносомы [273, 375]. Инъецирование эффекторных молекул в цитозоль макрофага препятствует формированию фаголизосомы и защищает от киллинга активными формами кислорода и азота. Блокировка созревания фаголизосомы - главного процесса фагоцитарной реакции способствует выживанию и размножению сальмонелл даже внутри макрофага -клетки с мощным киллерным потенциалом [106]. Кроме того, такой способ выживания бактерий внутри фагосомы препятствует нормальному процессингу и презентации антигенных детерминант Т-клеткам, реализующим адаптивный иммунный ответ. Гены SPI-1-зависимой транслокации позволяют S. Typhimurium проникать в тонкий кишечник, пейеровы бляшки и заражать не фагоцитирующие эпителиальные клетки [176, 409]. Гены вирулентности, ассоциированные с SPI-II, усиливают не только репликацию сальмонелл в селезенке инфицированных мышей [368], но и играют важнейшую роль в ускользании (evasion) от иммунного ответа, инициируя секрецию эффекторных белков в специализированные вакуоли salmonella containing vacuole (SCV) [175]. Указанная стратегия обеспечивает выживание в фагоците, избегая слияние фагосомы с лизосомой и ингибируя образования реактивных форм кислорода и азота, что нейтрализует бактерицидные свойства макрофагов [123, 174, 412]. Внутриклеточному выживанию сальмонелл и последующей диссиминации способствует способность их через рецептор этаноламина (EutR) клеточной мембраны клеток хозяина активировать химический сигналинг, усиливая тем самым экспрессию и транслокацию эффекторов SP1-2 [87]. Установлена видовая специфичность функционирования отдельных островов патогенности сальмонелл: продукты генов SPI-13 обеспечивают интернализацию S. Enteritidis в мышиные макрофаги, но не в макрофаги человека [158].
Часть генов вирулентности сальмонелл расположена в плазмидах [294, 361]. Плазмидозависимые гены вирулентности у сальмонелл (Spv-plasmid encoded virulence factor) активируются при входе сальмонелл в эпителиальные клетки и регуляция их транскрипции происходит при участии альтернативных сигма факторов (субъединица РНК-полимеразы). Недостаток сигма факторов повышает чувствительность сальмонелл к окислительному стрессу в макрофагах [95].
Оценка спонтанной и индуцированной продукции про- и противовоспалительных цитокинов в супернатантах культур спленоцитов экспериментальных животных
Продукцию цитокинов изучали на 10-е сутки экспериментальной инфекции. Данные о влиянии милиацина на спонтанную и индуцированную продукцию цитокинов спленоцитами различных групп инфицированных животных представлены в таблице 3.
Как следует из таблицы, сальмонеллезная инфекция (группа II) характеризуется повышением способности спленоцитов в системе in vitro как к спонтанной (ИФН-, ИЛ-6), так и к индуцированной (ИЛ-12, ИФН-, ИЛ-17, ИЛ-6) продукции цитокинов по сравнению с аналогичной продукцией культурой спленоцитов от интактных мышей (группа I). Инфекционный процесс сопровождается также повышением митогениндуцированной продукции ИЛ-10. Содержание ИЛ-4 в культуральной среде нестимулированных спленоцитов от зараженных мышей (группа II) соответствовало значениям, определяемым для спленоцитов от неинфицированных животных (группа I). Вместе с тем, заражение характеризовалось четкой тенденцией к двукратному снижению индуцированной продукции данного цитокина.
Введение растворителя, предшествовавшее заражению (группа III), не оказало влияния на направленность и выраженность изменений (по сравнению с группой II) спонтанной и митогениндуцированной продукции ИЛ-6, ИЛ-12, ИФН- и ИЛ-17. Однако оно сопровождалось уменьшением стимулированной продукции ИЛ-10 (по отношению к группе II) и ИЛ-4 (по отношению к группам I и II).
Использование милиацина (группа IV) не отменяло стимулирующей направленности влияния самой инфекции на продукцию ИЛ-12 и ИФН-. Более того, милиацин обеспечивал наиболее значительный прирост их спонтанной продукции среди всех групп зараженных мышей. В отношении митогениндуцированной продукции данных цитокинов стимулирующего действия тритепреноида не наблюдалось. Применение милиацина обусловливало также наиболее высокие показатели спонтанной и индуцированной продукции ИЛ-10. В отношении ИЛ-17 и ИЛ-6 эффект милиацина носил противоположную направленность, а именно в сторону не усиления, а ограничения прироста его митогениндуцированной продукции до минимальных значений по отношению к другим группам зараженных животных. Спонтанная продукция ИЛ-4 спленоцитами мышей IV группы не менялась, а индуцированная – характеризовалась его низким содержанием на уровне значений контроля (III группа). Проведенный анализ показал значимое повышение соотношений спонтанной и стимулированной продукции ИФН-/ИЛ-4, ИФН-/ИЛ-17, ИЛ-12/ИЛ-4 у группы мышей, подвергшихся только заражению сальмонеллой и группы мышей, получавших перед заражением милиацин, относительно аналогичных соотношений у интактных животных (таблица 4).
Для соотношения ИФН-/ИЛ-10 выявлено достоверное повышение только индуцированной продукции у мышей группы заражения и группы с предварительным введением милиацина относительно животных интактной группы. При сравнении соотношений оппозитных цитокинов у мышей, получавших милиацин по сравнению с животными зараженной группы, отмечалось значимое увеличение ИФН-/ИЛ-4 для спонтанной продукции, а также существенное повышение соотношения ИФН-/ИЛ-17 для стимулированной продукции. Анализ цитокинового баланса на основе расчета интегрального цитокинового индекса (Иц) для мышей всех исследуемых групп показал, что Иц для мышей группы милиацин+заражение достоверно ниже аналогичного показателя у мышей группы заражения, как для спонтанной продукции, так и для стимулированной продукции цитокинов.
Приведенные результаты свидетельствуют о том, что использование тритерпеноида милиацина способствует установлению оптимального баланса цитокинов, отражающего снижение активности воспалительного процесса к 10 суткам экспериментального инфекционного процесса.
Обсуждение результатов
Материалы, представленные в данной главе исследований прежде всего свидетельствуют о том, что милиацин ослабляет тяжесть течения сальмонеллезной инфекции. Данное положение подтверждается снижением гибели животных, уменьшением микробной обсемененности их внутренних органов, ограничением гипоплазии костного мозга и тимуса, а также реакции селезенки на инфекционный процесс в виде увеличения ее массы и количества спленоцитов. Отмеченное некоторое снижение показателя микробной обсемененности у мышей III группы, получавших предварительно растворитель, могло быть обусловлено стимулирующим действием на перитонеальные макрофаги самой процедуры внутрибрюшинного введения растворителя. Не исключено, что такая процедура могла изменить функциональное состояние макрофагов по классическому пути их активации, характеризующемуся повышением бактерицидного потенциала фагоцитов [74]. Реализация этого потенциала могла способствовать и сдвигу максимальной гибели мышей на вторую неделю, однако она была недостаточной для их эффективной защиты, что отразилось на общем показателе погибших животных. Результаты работы свидетельствуют также о том, что защитное действие милиацина не связано с гуморальным иммунным ответом, что соответствует существующим представлениям об относительной роли антител в защите организма от сальмонеллезной инфекции [72, 261]. В связи с этим можно полагать, что эффекты тритерпеноида опосредуются стимуляцией им механизмов клеточного иммунитета [19], антиоксидантной [52] и мембранопротекторной [1, 26, 68] активностью. Последняя представляет особое звено в механизме протекции при сальмонеллезной инфекции с учетом внутриклеточного паразитирования возбудителя [247]. Вместе с тем не исключено, что действие милиацина носит бинарный характер и определяется также его прямым бактерицидным влиянием, установленным для других тритерпенов [328], либо ограничением персистентных свойств возбудителя [10], повышающим чувствительность последнего к факторам защиты макроорганизма.
Предпринятые нами исследования показателей вовлеченности миелоидных клеток и лимфоцитов в воспалительный процесс по оценке способности спленоцитов к продукции про- и противовоспалительных цитокинов с последующим расчетом интегрального цитокинового индекса выявили, что использование тритерпеноида милиацина способствовало установлению оптимального баланса цитокинов, отражающего снижение активности воспалительного процесса к 10 суткам экспериментального инфекционного процесса. Таким образом можно предположить, что увеличение продукции ИЛ-12 и ИФН- спленоцитами инфицированных животных прежде всего свидетельствует о том, что сальмонеллезная инфекция стимулирует Тh-1-зависимый иммунный ответ. Снижение на этом фоне ИЛ-4 – показателя активации Тh-2-клеток отражает реципрокные отношения между данными субпопуляциями Т-лимфоцитов и подтверждает существующие представления о значимости клеточных механизмов иммунной защиты при этой патологии [72, 173]. Милиацин усиливает мобилизацию этих клеточных механизмов в виде дальнейшего увеличения спонтанной продукции ИЛ-12 и ИФН-. Отсутствие значимого прироста их индуцированной продукции спленоцитами животных опытной группы (IV) по отношению к контролю (III) и отрицательной группе сравнения (II) могло отражать эффект митогенной стимуляции, «выравнивающий» продуктивный потенциал клеток для данных цитокинов. Возрастание под влиянием милиацина спонтанной и индуцированной продукции ИЛ-10 можно расценивать как проявление ауторегуляторной функции иммунной системы в виде включения супрессорного фактора (ИЛ-10), лимитирующего избыточную цитотоксичность и соответственно, выраженность иммунного воспаления, через включение апоптотического механизма гибели активированных Т-клеток [269]. Понижающий эффект милиацина в отношении ИЛ-17 мог быть обусловлен стимулирующим действием тритерпеноида на продукцию ИЛ-12, лимитирующего продукцию другого представителя данного семейства цитокинов – ИЛ-23, имеющего с ИЛ-12 общую субъединицу (р40). Очевидно, что при такой конверсии на фоне активации под действием ИЛ-12 Тh-1-хелперов – источников ИФН-, дефицит ИЛ-23 ограничил бы индукцию Th-17-хелперов – источников ИЛ-17. Снижение продукции ИЛ-17 выступает существенным механизмом защитного действия милиацина через ограничение участия данного цитокина в стимуляции синтеза провоспалительных цитокинов, а также в мобилизации гранулоцитов, поддерживающей остроту воспалительной реакции и отражающей специфику Th-17-опосредованного воспаления [138, 173].
Определение уровня эндотоксинемии как универсального фактора патогенеза различных заболеваний инфекционной и неинфекционной природы [49, 76, 77] показало, что милиацин ослабляет выраженность эндотоксинемии, снижая уровень эндотоксина в крови и системные проявления его влияния на организм. Наиболее очевидным объяснением такого эффекта милиацина является ранее установленный факт снижения под его влиянием микробной обсемененности «внутренних органов». Вместе с тем выраженность эндотоксинемии обусловлена не только поступлением эндотоксина в системную циркуляцию, но и возможностью его элиминации из крови. Последняя в наибольшей степени определяется активностью макрофагальной системы печени - клеток Купфера, характеризующихся высокой экспрессией рецепторов к ЛПС LR4. Принимая во внимание данные о способности милиацина оказывать гепатопротекторный эффект, в том числе и в отношении клеток Купфера [69], представляется вероятным, что влияние тритерпеноида реализовывалось в отношении и этого антиэндотоксинового механизма.
Есть основания полагать, что базовым фактором повышения устойчивости организма к инфекции и реализации обсуждаемых механизмов является способность милиацина оказывать мембранопротекторное действие, в т.ч. за счет ограничения липопероксидации. В наших экспериментах эта позиция подтверждена снижением накопления продуктов ПОЛ – ТБК-РП. Следствием стабилизации мембран является сохранность мембранных протеинкиназ, участвующих в формировании регуляторных сигналов, обеспечивающих не только мобилизацию функции клеток, но и поддержание их жизнеспособности. К числу таких важнейших регуляторов относится Akt/PKB (Autologous kinase tumor killing / Protein kinase B), активирующая факторы транскрипции (NF-kB) провоспалительных цитокинов, и в то же время лимитирующее воспаление путем снижения продукции оксида азота и апоптотической гибели клеток.
В целом, результаты, представленные в данной главе исследований, позволяют заключить, что милиацин ослабляет тяжесть течения сальмонеллезной инфекции, что проявляется снижением гибели животных, уменьшением микробной обсемененности их внутренних органов, ограничением гипоплазии костного мозга и тимуса, а также реакции селезенки на инфекционный процесс в виде увеличения ее массы и количества спленоцитов, снижением выраженности эндотоксинемии. Защитный эффект тритерпеноида при сальмонеллезной инфекции опосредуется стимуляцией механизмов клеточного иммунитета (усиление продукции ИФН- и ИЛ-12 у зараженных мышей на фоне введения милиацина), антиоксидантной и мембранопротекторной активностью (ограничение индуцированного сальмонеллами повышения ПОЛ и накопления в крови продуктов липопероксидации). Выявленные сдвиги цитокинового баланса (увеличение продукции ИЛ-10, ИЛ-12 и ИФН- и снижение на этом фоне ИЛ-4, ИЛ-6 и ИЛ-17) свидетельствуют о том, что в основе механизмов защитного действия милиацина при инфекции, вызванной внутриклеточными грамотрицательным патогеном, лежит активация Th-1-зависимого иммунного ответа, стимуляция продукции противовоспалительного цитокина – ИЛ-10 и ограничение секреции одного из наиболее значимых патогенетических факторов воспаления – ИЛ-17.
Влияние милиацина на биопленкообразование сальмонеллами
Результаты исследования влияния милиацина на биопленкообразование сальмонеллами представлены в таблице 3,4.
Как видно из материалов таблицы 3, милиацин в дозе 50 мкг/мл по сравнению с бульонной культурой подавлял биопленкообразование у 83,3% штаммов S. Typhimurium и у 64,3% штаммов серовара S.Enteritidis. Использование милиацина в концентрации 100 мкг/мл оказывало действие, подобное концентрации 50 мкг/мл.
В таблице 4 представлены результаты влияния милиацина на уровень БПО у исследованных культур сальмонелл. Как видно из таблицы милиацин в концентрации 50 мкг/мл вызывал трехкратное снижение БПО у S. Typhimurium, 1,5-кратное у S.Enteritidis. Использование милиацина в концентрации 100 мкг/мл оказывало подобное действие, но менее выраженное. Растворитель для милиацина вызывал снижение БПО, по сравнению с бульонной культурой, у исследуемых штаммов, но уровень ингибирования БПО был менее выраженным по сравнению с милиацином.
Для визуализации эффекта влияния милиацина на биопленкообразование сальмонеллами было проведено исследование биопленкообразования с использованием атомно-силовой микроскопии (АСМ). Учитывая полученные данные о выраженном антибиопленочном эффекте милиацина в дозе 50 мкг/мл (таблицы 2,3), и то, что данная концентрация милиацина создавалась в организме экспериментальных животных при моделировании инфекционного процесса и введении милиацина в разовой дозе 2 мг/кг массы экспериментальных животных (мышей), а также при изучении протективного влияния милиацина на иммунную систему [55], для анализа результатов влияния данного средства на биопленки бактерий с использованием АСМ исследуемые штаммы бактерии сокультивировались с милиацином в указанной концентрации.
На рисунке 1 изображена биопленка, сформированная клетками штамма Salmonella Typhimurium, погруженными во внеклеточный экзополимерный матрикс.
На трехмерном АСМ-изображении видна поверхность с резкими перепадами высот, образованными элементами внеклеточного экзополимерного матрикса.
На рисунке 2 (А и Б) видна биопленка, образованная штаммом S. Typhimurium, в виде округлых островков, погруженных во внеклеточный экзополимерный матрикс.
При сравнении рисунков 3(А) и 4(А) видно, что штамм S. Typhimurium в обоих случаях сформировал биопленку. Трехмерные изображения (рисунки 1 (Б) и 2(Б)) также подтверждают это. Как видно из рисунка 3 инкубация сальмонелл с милиацином значительно подавляла образование биопленки, что особенно заметно на трехмерном изображении (рисунок 3 - Б).
В таблице 5 представлены характеристические размеры микробных клеток S. Typhimurium, погруженных в биопленку, и высота самой биопленки.
Из данных таблицы 5 и изображений АСМ следует, что милиацин не влияет на размеры бактерий, входящих в биоплёнку, но снижает высоту биоплёнки, что подтверждается визуально на изображениях АСМ. Поэтому можно сделать вывод, что милиацин препятствует развитию бипленки посредством воздействия на внеклеточный экзополимерный биоматрикс.
Оценка морфометрических параметров биопленки с помощью АСМ также подтверждала угнетающее действие милиацина на их образование. Тритерпеноид, не влияя на размеры бактериальных клеток, существенно (р 0,05) снижал высоту биопленок в опытных образцах культур S. Typhimurium (0,938±0,04мкм) по сравнению с образцами контрольных проб (соответственно 2,939±0,03 мкм) и проб групп сравнения (соответственно 1,493±0,04 мкм).
Снижение выраженности биопленкообразования у патогенных энтеробактерий - сальмонелл под влиянием милиацина может отражать один из значимых механизмов его действия. Наиболее очевидным объяснением такого эффекта тритерпеноида является ограничение продукции экзополимерного матрикса биопленки, важнейшего структурного элемента биопленки, определяющего повышенную устойчивость биопленочных микроорганизмов к антибиотикам и факторам иммунной защиты организма человека.a