Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 15
1.1. 1.1 Биологические особенности хламидий .15
1.2. 1.1.1 Жизненный цикл хламидий 15
1.3. 1.1.2 Структура клеточной оболочки хламидий 17
1.4. 1.1.3 Система секреции III типа хламидий .19
1.5. 1.2 Эпидемиология хламидийной инфекции 23
1.3 Стратегии контроля распространения хламидийной инфекции: лечение или профилактика? .26
1.4 Преимущества вакцинации, как стратегии контроля над распространением хламидийной инфекции 27
1.5 Особенности патогенеза хламидийной инфекции..
1.5.1 Клеточная парадигма .31
1.5.2 Иммунологическая парадигма 34
1.6. 1.6 Характеристика иммунного ответа при хламидийной инфекции... 37
1.6.1 Врожденная резистентность 38
1.6.2 Адаптивный иммунный ответ .41
1.7. 1.7 Исследования по разработке вакцин против хламидиоза 42
1.7.1 Аттенуированные хламидийные вакцины .42
1.7.2 Субъединичные вакцины .43
1.7.3 Генетические вакцины 46
1.7.4 Адъюванты, используемые в разработке вакцин против хламидиоза 48
1.7. 1.8 Состояния и перспективы разработки вакцины против урогенитального хламидиоза, вызванного C. trachomatis 51
Глава 2. Собственные исследования 54
2.1 Материалы 54
2.1.1 Бактериальные штаммы .54
2.1.2 Клеточные линии.. 54
2.1.3 Антигены 54
2.1.4 Плазмидные векторы 54
2.1.5 Адъюванты 55
2.1.6 Другие реактивы 55
2.1.7 Лабораторные животные 56
2.1.8 Лабораторное оборудование .56
2.2 Методы исследования 57
2.2.1 Методы работы с животными 57
2.2.2 Методы мониторинга инфекционного процесса .63
2.2.3 Методы иммуномониторинга вакцинных конструкций .63
2.2.4 Статистическая обработка результатов исследований 69
2.3 Результаты исследований .70
2.3.1 Изучение иммуногенных и протективных свойств рекомбинантного аденовирусного вектора, экспрессирующего белок OmcB C. trachomatis 70
2.3.1.1 Получение рекомбинантного аденовируса, несущего ген оmcB C. trachomatis 70
2.3.1.2 Изучение иммуногенных и протективных свойств Ad-mOmcB-Fc на
модели урогенитальной хламидийной инфекции, вызванной C. muridarum 73
2.3.2 Характеристика иммуногенных свойств структурного белка третьей
транспортной системы хламидий TC 0037 80
2.3.2.1 Определение специфических антител к рекомбинантному белку TC 0037 C. muridarum (rC 0037) и его эпитопу - пептиду TC 0037 (pC 0037) методом ИФА 81
2.3.2.2 Анализ специфической лимфопролиферации в ответ на антиген TC 0037 C. muridarum 82
2.3.2.3 Анализ реакции торможения миграции макрофагов (РТММ),
полученных от мышей, иммунизированных белком TC 0037 C. muridarum 84
2.3.2.4 Адаптивный перенос Т-клеток от мышей, иммунизированных антигеном TC 0037 C. muridarum 86
2.3.3 Сравнительный анализ иммуногенных и протективных свойств генетических конструкций на основе аденовирусного вектора, экспрессирующих белки хламидий OmcB и TC 0037 (Ad-mOmcB-Fc/Ad-MBLC 0037) 89
2.3.3.1 Получение рекомбинантного аденовируса, несущего ген tc 0037 (Ad MBLC 037) C. muridarum 89
2.3.3.2 Изучение иммуногенных и протективных свойств препаратов Ad mOmcB-Fc, Ad-MBLC 0037 на модели урогенитальной хламидийной инфекции, вызванной C. muridarum .90
2.3.4 Оптимизация схемы иммунизации генетической конструкцией на основе аденовирусного вектора, экспрессирующего белок TC 0037 C. muridarum 98
2.3.4.1 Изучение гуморального иммунного ответа на иммунизации Ad-MBL TC 0037 с бустированием рекомбинантным белком TC 0037 в сочетании с монофосфорил липидом А (rTC 0037-MPLA) 99
2.3.4.2 Оценка клеточного иммунного ответа к антигену TC 0037 у лабораторных животных, интраназально иммунизированных Ad-MBLC 0037 с бустированием rTC 0037-MPLA 101
2.3.4.3 Изучение протективных свойств иммунизации генетической конструкцией на основе аденовирусного вектора, экспрессирующего белок TC 0037 C. muridarum с бустированием rTC 0037-MPLA 104
Глава 3. Обсуждение результатов 113
Выводы .124
Список литературы
- Стратегии контроля распространения хламидийной инфекции: лечение или профилактика?
- Методы мониторинга инфекционного процесса
- Изучение иммуногенных и протективных свойств препаратов Ad mOmcB-Fc, Ad-MBLC 0037 на модели урогенитальной хламидийной инфекции, вызванной C. muridarum
- Оценка клеточного иммунного ответа к антигену TC 0037 у лабораторных животных, интраназально иммунизированных Ad-MBLC 0037 с бустированием rTC 0037-MPLA
Стратегии контроля распространения хламидийной инфекции: лечение или профилактика?
Хламидийная инфекция - наиболее часто регистрируемое бактериальное инфекционное заболевание, передаваемое половым путем. По данным ВОЗ ежегодно диагностируется более 100 миллионов случаев инфицирования C. trachomatis (WHO, 2012). Заболеваемость продолжает расти даже в развитых странах, и составляет более 500 случаев заболевания на 100 тысяч населения в год. Наиболее часто заболевание выявляется в возрасте от 15 до 24 лет (ESSTI, 2007; VandeLaar, 2007; Chesson, 2004).
У 75% женщин и 40% мужчин отмечено бессимптомное течение заболевания, а у подростков в 30-40% случаев имеет место скрытая хламидийная инфекция, которая протекает в течение 2-5 лет (Detels, 2011). Бессимптомное течение характерно не только для урогенитальной локализации, но также для инфекций других органов. Эпидемиологическая значимость бессимптомных хламидиозов была доказана еще в работах основоположника хламидиологии в России, А.А. Шаткина, так как эти формы не диагностируются и не лечатся, но способствуют распространению инфекции и приводят к осложнениям (Шаткин, 1990).
Хламидии способны вызывать серьезные заболевания с тяжелыми осложнениями и последствиями. У женщин восходящее течение инфекции приводит к развитию воспалительных заболеваний органов малого таза (ВЗОМТ). В результате хронического воспаления фаллопиевых труб может развиваться бесплодие. По различным оценкам, его частота составляет 10-40% не леченых случаев хламидиоза у женщин (Haggerty, 2010). Кроме того, на фоне специфического воспаления (сальпингита) возрастает риск внематочной беременности, хронического тазового болевого синдрома, тазового перитонита, выкидышей и преждевременных родов (Schachter, 2008; Peipert, 2003; Haggerty, 2010). У беременных инфицированных женщин, высока вероятность рождения недоношенного ребенка и его инфицирования с развитием конъюнктивита и пневмонии (Schachter, 2008).
Для мужчин риск осложнений гораздо меньше, но возрастает при повторном заражении хламидиозом. У мужчин хламидиоз нередко приводит к простатиту, эпидидимиту, к развитию бесплодия на фоне рубцевания семявыносящих протоков, а также к артриту (Stamm, 2008).
В настоящее время существуют два подхода для контроля за хламидийной инфекцией: массовый скрининг и последующее лечение антибиотиками и внедрение эффективной вакцины.
Стратегия массовых обследований с последующим лечением показала свою эффективность в группах высокого риска для своевременного выявления у них активно протекающей инфекции и последующего лечения, включая половых партнеров. Более того, при таком подходе удалось получить достоверное снижение уровня развития осложнений, таких как ВЗОМТ, эктопическая беременность, бесплодие (Westrom, 1992; Haggerty, 2010).
Тем не менее, в странах, где уже более 30 лет проводятся государственные программы скрининга, заболеваемость хламидиозом продолжает расти. Этот факт можно объяснить следующими обстоятельствами. Во-первых, используемое однократное лечение азитромицином не всегда эффективно для элиминации возбудителя (Drummond, 2011; Dukers-Muijrers, 2012). Так, у 10-15 % женщин, получавших такое лечение, впоследствии была выявлена хламидийная инфекция, свидетельствующая о развитии хронической формы (Workowski, 1993; Gtz, 2013).
Во-вторых, предполагается, что раннее подавление инфекции антибиотиками мешает формированию протективного иммунного ответа, предотвращающего повторное заражение (Brunham, 1996; Bailey, 1999; Brunham, 2005). В-третьих, высока частота повторного заражения (Brunham, 2005). Кроме того, при моделировании эпидемиологического надзора, показано, что эффективность скрининга может быть достигнута при охвате не менее 45% в группах риска, однако в реальности эта цифра существенно ниже (Dukers-Muijrers, 2012).
Тем самым, современные стратегии скрининга и лечения не достаточно эффективны по контролю над распространением хламидиоза. Поэтому создание вакцины признано ВОЗ наиболее перспективным направлением (Brunham, 2005; Gray, 2009). На основе математической модели показано, что вакцинирование подростков до начала половой жизни позволит принципиально снизить заболеваемость через 20 лет (Gray, 2009). Несмотря на то, что в этом направлении, за последние годы, достигнут значительный прогресс, в настоящее время еще не разработана эффективная и безопасная вакцина против урогенитального хламидиоза.
В первую очередь, такая ситуация объясняется особенностями иммунного ответа при хламидийной инфекции. При неосложненной форме урогенитального хламидиоза запускается целый комплекс иммунных реакций. В защите от хламидийной инфекции и реинфекции одинаково важную роль играют как, специфические CD4+ Т-клеточный ответ, продуцирующий ИФ, так и гуморальный иммунный ответ, включая секреторные и системные антитела (Hvid, 2007; Agrawal, 2009).
В клинических исследованиях и исследованиях на животных было показано, что иммунный ответ на восходящую хламидийную инфекцию сопровождается развитием тяжелой патологии (Vergara, 2005). Продукция воспалительных цитокинов, таких как ИЛ-1, ИЛ-8, ФНО и ГМ-КСФ, побочно приводит к повреждению тканей репродуктивных органов (Loomis, 2002; Vergara, 2005; Mascellino, 2011).
В настоящее время принято считать, что основной задачей при разработке противохламидийной вакцины является индукция иммунного ответа, не только способствующего разрешению воспалительных процессов в репродуктивных органах, но и не вызывающего развития патологии. Другой объективной проблемой при создании протихламидийной вакцины является ежемесячное циклическое ремоделирование тканей и флуктуации гормонов в женских репродуктивных органах, что препятствуют сохранению Т-клеток в генитальном тракте (Billig, 2010).
Разработка вакцин основана на выборе антигенов, обладающих наибольшей протективностью, созданием эффективных систем доставки и обоснованном использовании адъювантов. На сегодняшний день наиболее часто используемыми протективными антигенами для разработки эффективной противохламидийной вакцины являются хламидийные белки наружной мембраны, такие как, основной белок наружной мембраны MOMP, полиморфные белки POMPs, цистеин богатые белки CrpA, OmcB, мембранный белок CT043 (Pal, 2005; Li, 2007; Sun, 2009; Wang, 2009). Было показано, что наилучший протективный ответ у животных развивался при использовании рекомбинантного белка MOMP, имеющего нативную конформационную структуру (Sun, 2009; Schautteet, 2012). Однако было установлено, что использование белка МОМР в качестве единственного протективного антигена не позволяет получить эффективную защиту. Поэтому наиболее перспективным в настоящее время является разработка поливалентных субъединичных и генетических вакцин на основе комбинации двух и более белков C. trachomatis в сочетании с адъювантами (Schautteet, 2011).
Другими целевыми белками - кандидатами являются секретируемые белки. Широко используется в качестве создания вакцинных препаратов белок CPAF – протеаза/фактор с протеасомо-подобной активностью. Интраназальная иммунизация рекомбинантным белком CPAF в сочетании с ИЛ-12 индуцировала выраженную продукцию ИФ и приводила к значительному снижению накопления возбудителя в генитальном тракте мышей, а также ограничивала развитие осложнений в верхних отделах репродуктивной системы (Murthy, 2009; Zhong, 2001). Наиболее перспективными представляются препараты на основе аденовирусного вектора, экспрессирующего белок CPAF. Иммунизация Ad-CPAF с бустированием рекомбинантным CPAF в сочетании с адъювантами CpG/HH2 показала значительный антительный ответ, но менее выраженный клеточный иммунный ответ (Brown, 2012).
Накопленный опыт показывает, что стратегия создания противохламидийных вакцин должна быть направлена на подавление тех механизмов, которые реализуют хламидии на разных этапах взаимодействия с клеткой хозяина. Так, на этапе адгезии элементарных телец хламидий защита будет определяться наличием нейтрализующих антител. А на последующих, внутриклеточных этапах развития, включая персистенцию, доминирующим должен быть Т-клеточный иммунный ответ.
Таким образом, несмотря на интенсивные исследования в области разработки противохламидийной вакцины, по-прежнему остается актуальным поиск наиболее значимых антигенов хламидий, индуцирующих протективный иммунитет, а также выбор систем доставки и адъювантов, которые не только позволят оптимизировать иммунный ответ, но и будут направленно вызывать специфический ответ в местах локализации инфекции. Можно отметить, что работы по разработке вакцин против урогенитального хламидиоза в нашей стране не проводятся.
Методы мониторинга инфекционного процесса
Перспективной альтернативой использованию классических адъювантов является инкапсулирование (заключение в капсулу) иммуногена в биодеструктируемый полимер, утвержденный Администрацией США по пищевым продуктам и лекарственным веществам (FDA). Данная конструкция способна высвобождать свое содержимое в течение долгого времени. Одним из утвержденных биоразлагаемых полимеров является D, L-лактид-ко-гликолид (poly D, L-lactide-co-glycolide) – (PLGA). Наночастицы PLGA способны усиливать иммунный ответ и улучшать доставку антигена внутрь клетки. Этот полимер биосовместим, способен к биологическому разложению, компактен и позволяет замедлить высвобождение, заключенных в нем компонентов (Fairley, 2013).
Другим перспективным адъювантом является бактериальный монофосфориллипид А (MPLA). MPLA широко используется в настоящее время для индукции толерантности к эндотоксемии у лабораторных животных и человека; в иммунотерапии и иммунопрофилактике; в качестве вспомогательного вещества для ряда вакцин; препятствует развитию спазма сосудов головного мозга, вызванного субарахноидальным кровоизлиянием, является кардиопротектором (Lei, 1999; Xi, 2006).
Монофосфориллипид А (MPLA) является производным эндотоксина, который используется в качестве адъюванта вакцины у человека (Thoelen, 1998; Esparza-Gonzalez, 2014). MPLA производится путем гидролиза нативного дифосфорил липида А, компонента LPS, который распознается толл-подобным рецептором 4 типа, в результате чего происходит удаление всех, кроме одной фосфатной группы и различной степени деацилирование (Qureshi, 1982). Эти структурные изменения позволяют уменьшить системную токсичность на более 99% по сравнению с нативным липидом А, в результате чего получается иммуномодулирующее средство с более высоким потенциалом для клинического применения (Takayam, 1984; Astiz, 1995). Ослабленная токсичность MPLA связана со снижением индукции провоспалительных цитокинов, таких как фактор некроза опухоли альфа (ФНО), интерлейкин-1 (ИЛ-1), и гамма-интерферона (ИФ) в течение начального воздействия (Salkowski, 1997). MPLA сохраняет значительную активность и иммуномодулирующее предварительное лечение с MPLA увеличивает выживаемость после смертельной воздействия ЛПС на моделях животных (Johnson, 1987; Astiz, 1994). Тем не менее, влияние MPLA на врожденной ответ на клинически значимых моделях бактериальной инфекции не было определено. Кроме того, клеточные и молекулярные механизмы влияния, лежащие в основе благоприятного эффекта лечения MPLA, на врожденный антимикробный иммунитет не были охарактеризованы. Таким образом, дальнейшее понимание иммуномодулирующих свойств MPLA требует его изучения в качестве иммуномодулирующего средства.
Из сказанного выше, основываясь на современных литературных данных, идеальная вакцина против урогенитальной инфекции, вызванной C. trachomatis, должна индуцировать как системный иммунный ответ, так и местный мукозальный ответ (Mahdi, 2001; Vergara, 2005). На данный момент это представляет собой сложную задачу по нескольким причинам. Во-первых, недостаточно знаний в области иммунологии хламидийной инфекции, в особенности иммунных реакций, происходящих в женских репродуктивных органах в ответ на хламидию, в связи с влиянием таких факторов как половые гормоны и менструальный цикл (Kozlowski, 2002; Guseva, 2003). Во-вторых, отсутствие подходящих адъювантов, которые будут обладать достаточным иммуномодулирующим действием, и нацелены на индукцию мукозального ответа. В-третьих, недостаточно знаний в отношении протективности кандидатных антигенов хламидий, индуцирующих иммунный ответ. Кроме этого, тот факт, что иммунный ответ, прямо или косвенно участвуют в патогенезе заболевания, вызванного хламидией, еще более усложняет разработку вакцины. Поэтому успешность проектирования будущей хламидийной вакцины будет зависеть от лучшего понимания этих факторов и возможности ими управлять, чтобы добиться оптимальной эффективной защиты от инфекции.
В медицине и ветеринарии, разработка вакцины против хламидийной инфекции основывается на ее изучении при использовании различных моделей животных. Экспериментальные данные на животных моделях расширяются, в результате чего последние результаты доклинических исследований подтвердили решающую роль Tх1 иммунного ответа. Вспомогательная роль антител так же имеет значение, так как гуморальный иммунный ответ может содействовать иммунному ответу по Tх1 типу, что будет эффективнее защищать от хламидийной инфекции.
Вакцина, способная индуцировать иммунный ответ по Tх1 типу и комплементарный - системный и мукозальный иммунный ответ (IgG2a и IgA) (Tagliabue, 1984), в настоящее время является наиболее желаемой целью в разработке эффективной вакцины против урогенитального хламидиоза, вызванного C. trachomatis.
Работы, связанные с использованием рекомбинантных антигенов и пептидов, были не всегда удачными, поэтому проводящиеся в настоящее время исследования в этой области ставят своей целью улучшить уже имеющиеся кандидатные антигены за счет выбора вспомогательных компонентов, таких как системы доставки и адъюванты, а также подбора схем иммунизации, и, таким образом, добиться создания эффективной протективной вакцины. В связи с тем, что в настоящее время известен полный геном хламидий (Rockey, 2000), исследования по разработке антихламидийной вакцины будут продолжать фокусироваться на поиске дополнительных антигенов, индуцирующих Т-клеточный иммунный ответ (Brunham, 2005), а также модулирующих провоспалительные цитокины в женском урогенитальном тракте. Дальнейшие изучения в этой области помогут понять механизмы, которые подавляют иммунный ответ в женском репродуктивном тракте, включая влияние половых гормонов и менструального цикла.
В идеале, эффективная антихламидийная вакцина должна будет предотвращать заражение и распространение инфекции, а также предполагать гетеротипическую перекрестную защиту против различных серотипов и подтипов возбудителя урогенитального хламидиоза.
Изучение иммуногенных и протективных свойств препаратов Ad mOmcB-Fc, Ad-MBLC 0037 на модели урогенитальной хламидийной инфекции, вызванной C. muridarum
Для постановки реакции были получены суспензии спленоцитов мышей экспериментальных и контрольных групп в полной культуральной среде RPMI-1640, содержащей 5% эмбриональной сыворотки (FBS – Hyclone, США), 4 мМ – глютамина, антибиотики (Penstrep – Invitrogen, США). Т – клетки выделяли, используя Т клеточные колонки (Cederlane, США), согласно протоколу фирмы-изготовителя. Для выделения Т-клеток предварительно промывали Т клеточную колонку PBS, добавляли активирующий колонки реагент и инкубировали при комнатной температуре в течение 20 минут. К суспензии спленоцитов добавляли реагент, активирующий клетки. Далее суспензию спленоцитов инкубировали в течение 20 минут при +4С. После окончания инкубаций колонки, ее еще раз промывали PBS, наносили на колонку спленоциты и собирали Т-клеточную суспензию. Процедуру выделения Т-клеток повторяли дважды. Концентрацию Т-клеток определяли методом проточной цитометрии с использованием антител к Т-клеточным маркерам CD3 и TCR (Biolegend, США). Конечная концентрация Т-клеток составляла 97%.
Параллельно из интактных селезенок готовили антиген-презентирующие (фидерные клетки). Для этого готовили суспензию спленоцитов интактных мышей. Эритроциты лизировали с помощью буфера для лизиса эритроцитов (Cederlane, США), согласно протоколу изготовителя. Для лизиса спленоциты центрифугировали на центрифуге «Hettich Rotanta 460R» («Andreas Hettich GmbH&Co», Германия) в течение 8 минут при 1700 об/мин. Затем сливали супернатант, добавляли лизирующий буфер, предварительно доведенный до комнатной температуры, и инкубировали в течение 5 минут. После этого к спленоцитам добавляли культуральную среду, предварительно доведенную до комнатной температуры, и дважды центрифугировали. Суспензию антиген-презентирующих клеток разводили в полной культуральной среде в концентрации 2х106 клеток/мл.
Для индукции продукции ИФ ex vivo Т-клетки, предварительно иммунизированных и контрольных мышей, в количестве 1х106 клеток на лунку 24-х луночного плейта инкубировали с антиген-презентирующими клетками (1х106 клеток/лунку) в присутствие рекомбинантного антигена TC_0037 (10 мкг/мл) в CO2 инкубаторе.
Через 24 часа инкубации, Т-клетки повторно выделяли на Т клеточных колонках и переносили в 96-луночные планшеты для ELISPOT (Millipore, США) c предварительно нанесенными антителами к ИФ (E-bioscience, США) в количестве 0,5х106 на лунку Т-клетки инкубировали 24 часа в СО2-инкубаторе. Далее определение ИФ-продуцирующих Т-клеток проводили согласно протоколу производителя (Ready-Set-Go! ELISPOT Set, E-bioscience, США). Для определения количества Т-клеток, продуцирующих ИФ, клетки отмывали, блокировали неспецифическое связывание и инкубировали с антителами к ИФ, мечеными биотином в течение 2 часов. Далее отмывали не связавшийся стрептавидин, подсушивали плейт и подсчитывали количество клеток, продуцирующих ИФ на ELISPOT ридере (Autoimmun Diagnostika GmbH, Германия).
Определение иммуногенных хламидийных эпитопов является особенно важной и сложной задачей при разработке антихламидийной вакцины. Для такого скрининга используются комплексные биоинформационные и экспериментальные подходы, основанные на протеомных методах и геномных технологиях (Ivanov, 2005; Walkeraylor, 2005). Одним из перспективных хламидийных антигенов является белок наружной мембраны OmcB. По литературным данным OmcB обладает высоко иммунногенными свойствами (Fadel, 2007; Fadel, 2008). Он привлекатен для наших исследований тем, что вызывает выраженный антительный ответ и играет важную роль в патогенезе, поскольку рассматривается как один из основных адгезинов на начальном этапе взаимодействия патогена с эукариотической клеткой. Было показано, что белок OmcB в сочетании с другими белками хламидий вызывает протективный ответ (Eko, 2004; Hou, 2013).
В работе, проведенной на базе лаборатории молекулярной биотехнологии ФГБУ «ФНИЦЭМ им. Н. Ф. Гамалеи» Минздрава России, был получен рекомбинантный аденовирус человека 5 серотипа, несущий выбранный нами хламидийный антиген OmcB. Схема получения данной конструкции коротко приведена на рисунке
Получение рекомбинантного аденовируса (Ad-mOmcB-Fc), несущего гибридный белок, состоящий из антигена OmcB C. trachomatis и Fc-фрагмента иммуноглобулина IgG2a, с модифицированными кодонами для улучшения экспрессии в клетках млекопитающих осуществлялось в несколько стадий. Из нуклеотидной последовательности гена OmcB C. trachomatis NCBI-GeneID: 884223 была удалена бактериальная сигнальная последовательность, состоящая из 28 аминокислот, кодоны, кодирующие ген OmcB были модифицированы для лучшей экспрессии в клетках Mus musculus. Сконструированный химерный ген, кодирующий протективный антиген слитый с Fc-фрагментом антитела, был синтезирован компанией ЗАО «Евроген» и доставлен нам в составе плазмиды pALA-mOmcB-Fc. Далее было проведено клонирование гена mOmcB-Fc в плазмиду pShuttle-CMV (pSh-CMV-mOmcB-Fc). Полученной плазмидой трансформировали клетки E. coli штамм DH5 ClRb-методом Hanahan. Трансформированные клетки отбирали на агаризованной среде LB (литическая среда) с антибиотиком канамицином (50 мкг/мл). Полученный вектор pSh-CMV-mOmcB-Fc линеаризованный рестриктазой PmeI смешивали с геномной ДНК рекомбинантного аденовируса Ad-EASY и котрансформировали в клетки E. coli (штамм BJ5183). Далее из полученных рекомбинантных клонов выделяли плазмидную ДНК и анализировали ее по молекулярному весу и ПЦР-анализом. Плазмиды, обладающие молекулярным весом более 20 тысяч пар оснований, что было выявлено по электрофоретической подвижности ДНК в агарозном геле, перетрансформировали в другой штамм E. coli (DH5alpha), в котором в отличие от штамма BJ5183 возможно препаративное накопление рекомбинантных плазмид.
Изучение инфекционности вышеописанной плазмиды для пермиссивных клеток проводили на клеточной линии HEK 293 (клетки эмбриональной почки человека). Готовый препарат был получен в количестве 109 БОЕ/мл.
Экспрессию гена momcB в составе рекомбинантного аденовируса Ad-mOmcB анализировали на уровне экспрессии матричной РНК (мРНК) (Рисунок 9). Для этого использовали пермессивные клетки линии HEK 293, которые трансдуцировали рекомбинантным аденовирусом, несущим модифицированный ген omcB (momcB) в дозе 100 вирусных частиц на клетку. Выбор пермиссивной клеточной линии обусловлен возможностью репликации рекомбинантного аденовируса, что приводит к синтезу большего количества мРНК. После 24 ч. инкубирования из клеток была выделена РНК, которую использовали в качестве матрицы в реакции обратной транскрипции.
Оценка клеточного иммунного ответа к антигену TC 0037 у лабораторных животных, интраназально иммунизированных Ad-MBLC 0037 с бустированием rTC 0037-MPLA
По данным ВОЗ число инфицированных хламидиями людей на всем земном шаре по самым скромным подсчётам достигает около одного миллиарда и сохраняет стабильную тенденцию к увеличению даже в развитых странах (ВОЗ, 2012). Особую озабоченность вызывают хронические хламидиозы, приводящие к развитию таких тяжелых заболеваний, как астма, атеросклероз, артрит, женское и мужское бесплодие, патология беременности (Bashmakov, 2010; Sandoz, 2010). Проблемы контроля за распространением хламидийной инфекции обусловлены, с одной стороны, отсутствием своевременной антибактериальной терапии при бессимптомном течении инфекции, а, с другой стороны, неээфективностью антибиотиков при лечении хронических форм. Вследствие этого вакцинация рассматривается научным сообществом как наиболее эффективный способ борьбы с хламидийной инфекцией и ее осложнениями (Schautteet, 2011).
Несмотря на интенсивные исследования в области разработки противохламидийной вакцины, по-прежнему остается актуальным поиск наиболее значимых антигенов хламидий, индуцирующих протективный иммунитет, а также выбор систем доставки и адъювантов, которые не только позволят оптимизировать иммунный ответ, но и будут направленно вызывать специфический ответ в местах локализации инфекции.
В настоящий момент в мире еще не существует вакцинного препарата против урогенитального хламидиоза. К тому же можно отметить, что работы по созданию вакцин против урогенитального хламидиоза в нашей стране не проводятся. В связи с этим наши исследования являются весьма важными и актуальными. Использование нами генетической иммунизации аденовирусными векторами, экспрессирующими иммуногенные белки хламидий в настоящее время является наиболее перспективным направлением в разработке вакцины против урогенитального хламидиоза. Так, другими исследователями было показано, что иммунизация трансфицированными ДК с рекомбинантным аденовирусом, несущим ген momp C. trachomatis (серовар Е) индуцирует специфическую защиту от урогенитальной хламидийной инфекции (Lu, 2010). Результаты показали, что когда ДК трансфицировали с Ad-MOMP in vitro, ДК стимулировали экспрессию CD80 и MHC-II молекул, увеличивали секрецию ИЛ-12, а также стимулировали пролиферацию Т-клеток. Кроме этого, при адаптивном переносе Т-клеток нативным мышам, была показана индукция цитокинов Тх1 типа и антител класса IgA. Иммунизация Ad-MOMP-ДК способствовала снижению бактериальной нагрузки в нижних отделах урогенитального тракта и уменьшению патологических изменений.
В другом исследовании (Brown, 2012) было показано, что интраназальная иммунизация Ad-CPAF с бустированием рекомбинантным CPAF в сочетании с адъювантами CpG/HH2 приводила к значительному гуморальному иммунному ответу, но менее выраженному клеточному ответу со смешанным Тх1/Тх17 профилем.
Учитывая весьма успешный опыт предыдущих исследований по созданию генетических конструкций на основе рекомбинантного аденовирусного вектора, нашей основной задачей было выбрать наиболее перспективные кандидатные хламидийные белки. Использование целых хламидийных клеток представляется безперспективным из-за возможности индукции иммунопатологических реакций (Cheng, 2009). Кроме того, прогресс в области молекулярной иммунологии и биотехнологии за последние два десятилетия привел к постепенному переходу от классических вакцин, состоящих из инактивированных или живых аттенуированных патогенов, к пептидным или субъединичным вакцинам (Eko, 2004). Поэтому, разработка вакцины на основе хламидийных протективных антигенов является главным направлением в конструировании противохламидийной вакцины.
На сегодняшний день наиболее часто используемыми протективными антигенами для разработки эффективной противохламидийной вакцины являются хламидийные белки наружной мембраны, которые считаются высокоиммуногенными белками (Fadel, 2007; Fadel, 2008).
Так, белок OmcB не только вызывает выраженный антительный ответ, но и играет важную роль в патогенезе, поскольку рассматривается как один из основных адгезинов на начальном этапе взаимодействия патогена с эукариотической клеткой. Установлено, что рецепторами для OmcB являются глюкозаминогликаны, преимущественно гепаран-сульфат, молекулы которого связаны с некоторыми протеинами клеточной поверхности (Moelleken, 2008).
Было показано, что белок OmcB в сочетании с другими белками хламидий вызывает протективный ответ. Так, например, в исследованиях Eko с соавторами была разработана субъединичная вакцина, где в качестве системы доставки использовали «пустую» клеточную оболочку холерного вибриона Vibrio cholerae «ghost» (rVCG). Иммунизация данной вакцинной конструкцией способствовала значительному подалению хламидийной инфекции в нижних отделах урогенитального тракта, а также индукции как клеточного иммунного ответа по Тх1 типу, так и гуморального. Однако в дальнейшем, для усиления эффективности данной конструкции, будущие исследования будут сосредоточены на выборе дополнительных хламидийных белков, которые могут соэкспрессироваться в rVCG, так как это средство доставки обладает показателями высокой емкости и может обеспечить экспрессию нескольких целевых белков (Eko, 2004).
Другими перспективными целевыми генами C. trachomatis, изучаемыми в качестве их иммуногенных и протективных свойств, являются структурные белки клеточной стенки хламидий, и секретируемые белки, в том числе с помощью системы секреции III типа и встраиваемые в мембрану хламидийной фагосомы (Betts, 2008).
В нашем исследовании по разработке вакцины против урогенитального хламидиоза в качестве антигенов использовали белок наружной мембраны хламидий OmcB и структурный белок ССТТ TC_0037 C. muridarum. В связи с малоизученностью белка TC_0037, нами были проведены эксперименты, как in vitro, так и in vivo, позволющие охарактеризовать иммунногенные и протективные свойства данного белка. Методом ИФА была показана индукция специфических антител к белку TC_0037 C.muridarum. Клеточный иммунный ответ продемонстрирован в реакции лимфопролиферации и реакции торможения миграции макрофагов. Было показано, что клетки лимфатических узлов и спленоциты мышей, иммунизированных рекомбинантным белком TC_0037 C.muridarum пролиферировали на белок TC_0037 (p 0,05), а в РТММ - T клетки лимфатических узлов и селезенки подавляли миграцию макрофагов, в ответ на rC_0037.
Для оценки протективных свойств белка TC_0037 C.muridarum были проведены исследования по адаптивному переносу Т-клеток от мышей иммунизированных рекомбинантным белком rC_0037. В результате культурального исследования вагинальных смывов из нижних отделов урогенитального тракта нами было показано снижение уровня хламидийной инфекции в группе с переносом Т-клеток, полученных от мышей иммунизированных белком rC_0037, по сравнению с контролем, зараженными мышами C. muridarum. В результате микроскопического анализа были обнаружены специфические Т-клетки, меченные CFSE в лимфатических узлах подвздошной кишки и вагины реципиентов.