Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы .12
1.1. Рак гортани и глотки и вирус папилломы человека как его этиологический фактор .12
1.2. Распространенность ВПЧ у пациентов с плоскоклеточными карциномами головы и шеи 16
1.3. Табакокурение и прочие факторы развития плоскоклеточных карцином головы и шеи 19
1.4. Выживаемость пациентов с плоскоклеточными опухолями головы и шеи 20
1.5. Структура вирусов папиллом и функции вирусных онкогенов .22
1.6. Иммунологический контроль папилломавирусной инфекции 26
1.7. Клеточные факторы, влияющие на злокачественность ВПЧ .28
1.8. Роль генетических факторов в ВПЧ-индуцированном канцерогенезе эпителия слизистых оболочек 30
1.9. Синтропные для плоскоклеточных карцином головы и шеи и папилломавирусной инфекции гены .45
Глава 2. Материалы и методы исследования .50
Глава 3. Результаты собственных исследований 55
3.1. Клиническая характеристика пациентов 55
3.2. Оценка результатов общего анализа крови у пациентов и здоровых добровольцев. 56
3.3. Исследование наличия вируса папилломы человека в образцах опухолевой ткани пациентов и буккального соскоба здоровых добровольцев 57
3.4. Оценка распределения частот генотипов SNP-мутаций генов TP53, TNFa, IL10, EGFR у здоровых добровольцев и у пациентов с плоскоклеточными карциномами головы и шеи 58
3.5. Оценка распределения частот комбинаций генотипов SNP-мутаций у здоровых добровольцев и у пациентов с плоскоклеточными карциномами головы и шеи 67
3.6. Оценка распределения частот генотипов SNP-мутаций генов TP53, TNFa, IL10, EGFR у здоровых добровольцев и пациентов с плоскоклеточными карциномами гортани 68
3.7. Оценка распределения частот генотипов SNP-мутаций генов TP53, TNFa, IL10, EGFR у здоровых добровольцев и пациентов с плоскоклеточными карциномами глотки и ротовой полости 75
3.8. Оценка распределения частот генотипов SNP-мутаций генов CYP1A1, GSTP1, CYP2E1 у здоровых добровольцев и пациентов с плоскоклеточными карциномами головы и шеи 81
3.9. Оценка распределения частот комбинаций генотипов SNP-мутаций генов детоксикации у здоровых добровольцев и у пациентов с плоскоклеточными карциномами головы и шеи 85
3.10. Оценка распределения частот генотипов SNP-мутаций генов CYP1A1, GSTP1, CYP2E1 у здоровых добровольцев и пациентов с плоскоклеточными карциномами гортани 86
3.11. Оценка распределения частот генотипов SNP-мутаций генов CYP1A1, GSTP1, CYP2E1 у здоровых добровольцев и пациентов с плоскоклеточными карциномами ротовой полости и глотки .90
ГЛАВА 4. Обсуждение полученных результатов. 95
Заключение .110
Выводы .111
Научно-практические рекомендации .113
Список сокращений .117
Список литературы .
- Выживаемость пациентов с плоскоклеточными опухолями головы и шеи
- Роль генетических факторов в ВПЧ-индуцированном канцерогенезе эпителия слизистых оболочек
- Оценка распределения частот генотипов SNP-мутаций генов TP53, TNFa, IL10, EGFR у здоровых добровольцев и у пациентов с плоскоклеточными карциномами головы и шеи
- Оценка распределения частот генотипов SNP-мутаций генов CYP1A1, GSTP1, CYP2E1 у здоровых добровольцев и пациентов с плоскоклеточными карциномами гортани
Введение к работе
Актуальность темы исследования
По данным мировой статистики доля рака верхних дыхательных путей составляет более 7% в структуре всех злокачественных новообразований. В целом в России, по данным В. И. Чиссова [Чиссов В.И. и др., 2009], стандартизованный показатель заболеваемости раком гортани в России составил 3,13 на 100 000 населения, среди мужчин — 7,28, среди женщин — 0,36; из них 65,8% были в трудоспособном возрасте. Кроме того, онкологические заболевания головы и шеи по приросту смертности занимают одно из первых мест в мире. Во многом эта ситуация объясняется поздней диагностикой и диктует необходимость разработки новых алгоритмов ранней диагностики и определения критериев включения пациентов в группу риска [Кожанов Л.Г. и др., 2008; GaykalovaD.A. и др., 2014].
Известно, что возникновение карцином головы и шеи во многом связано с увеличением канцерогенной нагрузки на организм при курении и алкоголизме. Особую роль в реализации онкогенных рисков играют ферменты цитохрома Р450, поскольку метаболизируют канцерогены, переводя их в неактивное состояние.Однако, эти ферменты в силу индивидуальных особенностей функционирования системы детоксикации могут увеличивать канцерогенный потенциал некоторых химических веществ. Поэтому исследование генетических вариантов ферментов цитохрома Р450 актуально в аспекте развития различных видов рака [LangJ. и др., 2012; MauryaS.S. и др., 2013; WuB. и др., 2013]. Кроме того, распространенность курящих людей среди населения России колеблется около 40%, однако не у всех курильщиков развиваются онкологические заболевания головы и шеи, в то время как эти заболевания возникают и у некурящих, что позволяет думать о других факторах, влияющих на неопластическую трансформацию эпителиальной ткани верхних дыхательных путей. Таким образом, механизмы, лежащие в основе развития карцином, включающие сложные взаимодействия иммунной системы, различных супрессоров опухолевого процесса, факторов роста, детоксикационных систем [Кожанов Л.Г. и др., 2008; Elahi M.M. и др., 2009; Киселев В.И., 2011; CorraG.T. и др., 2011; FrankA.K. и др., 2011; BleotuC. и др., 2012; ChansaenrojJ. и др., 2012; DingQ. и др., 2013; BasmaH.A. и др., 2013; GeJ. и др., 2013;ShiQ. и др., 2013; BircanS. и др., 2014], требуют детального изучения.
Существуют данные о влиянии некоторых вирусов на развитие различных злокачественных новообразований. Особое внимание следует уделить вирусу папилломы человека. Если роль ВПЧ в развитии рака шейки матки доказана, то данные, свидетельствующие о роли ВПЧ в канцерогенезе эпителия слизистых оболочек головы и шеи, противоречивы [StephenJ.K. и др., 2012; TahtaliA. и др., 2013]. Распространенность ВПЧ в опухолях головы и шеи колебалась от 17% до 53%, в среднем, составляя около 25%, в то время как у здоровых людей в ротовой полости и глотке ВПЧ встречался в среднем
по миру у 7% обследованных.Различие в частоте встречаемости вируса в эпителиальной ткани у больных и здоровых людей диктует необходимость изучения возможной роли ВПЧ в возникновении карцином головы и шеи. Кроме того, вызывает научный интерес выяснение влияния ВПЧ на патогенез опухолей, а также оценка взаимосвязи между наличием папилломавирусной инфицированности и особенностями иммунорегуляции, определяемой различными генетическими вариантами генов цитокинов. Выяснение этих аспектов возникновения и развития опухолей рта, глотки и гортани позволит персонализировать диагностику и терапию плоскоклеточных карцином такой локализации.
Степень разработанности темы
Рядом отечественных и зарубежных авторов проводилось изучение вклада вируса папилломы человека в развитие плоскоклеточных карцином головы и шеи [RautavaJ., SyrjnenS., 2011; StephenJ.K. и др., 2012; TezalM. и др., 2012; LechnerM. и др., 2013; MehradM. и др., 2013; QuinteroK. и др., 2013;WeiW. И др., 2013], а также различные аспекты генетической предрасположенности к данной патологии [Иванов А.М., 2009; Цыган В.Н., 2010; BraakhuisB. и др., 2013; LangJ. и др., 2012; LiaoG. и др, 2013; ShiQ. и др., 2013; WangJ. и др., 2013; BhatG.A. и др., 2014; GrimmM. и др., 2014; GuptaS. и др., 2014], однако исследователи не пришли к однозначным выводам. Кроме того, не проводились комплексные исследования, учитывающие связь ВПЧ и различных генетических полиморфизмов генов цитокинов, супрессоров опухолевого роста, ферментов детоксикационной системы.
Цель исследования
Целью настоящей работы является изучение взаимосвязи папилломавирусной инфекции и рака гортани и глотки с учетом иммуногенетических особенностей пациентов, определяемых SNP-мутациями генов ключевых цитокинов, супрессоров опухолевого роста, ферментов детоксикационной системы и выявление прогностически значимых лабораторных маркеров для оценки степени риска и особенностей течения плоскоклеточных карцином головы и шеи.
Задачи исследования
-
Провести исследование опухолевой ткани пациентов с карциномами головы и шеи и образцов буккального соскоба здоровых добровольцев на наличие ДНК вируса папилломы человекаметодом ПЦР с учетом особенностей данных анамнеза и общеклинических исследований у больных с карциномами головы и шеи.
-
Оценить особенности гистологической картины опухолевой ткани и особенности опухолевого роста при инфекции ВПЧ.
-
Исследовать частоту встречаемости SNP мутаций промоторных участков генов ключевых цитокинов IL10 и TNFа, супрессора опухолевого роста ТР53, рецептора к эпидермальному фактору роста, ферментов детоксикационной системы CYP1A1, CYP2E1, GSTP1 у больных с карциномами головы и шеи и у здоровых добровольцев.
-
Оценить роль SNP мутаций промоторных участков генов ключевых цитокинов IL10 и TNFа, супрессора опухолевого роста ТР53, рецептора к эпидермальному фактору роста, ферментов детоксикационной системы CYP1A1, CYP2E1, GSTP1 в развитии карцином головы и шеи в присутствии ВПЧ.
-
Выявить прогностически значимые лабораторные маркеры для оценки степени риска и особенностей течения плоскоклеточных карцином головы и шеи и на их основе разработать алгоритм обследования пациентов.
Научная новизна
Впервые показаны особенности развития карцином головы и шеи у пациентов с инфекцией ВПЧ опухолевой ткани, в зависимости от генотипов генов TP53 и IL10. Определена значимость аллельного полиморфизма генов TP53 Pro72Arg, IL10 592C>A,IL10 G1082A,CYP2E1 с1/с2 как факторов риска развития карцином головы и шеиразличных локализаций.
Разработан алгоритм обследования приэтих патологиях с учетом наличия ВПЧ и различных вариантов генов ключевых цитокинов, супрессоров опухолевого роста, ферментов детоксикационной системы.
Теоретическая и практическая значимость работы
В результате проведенного исследования было дано представление о взаимосвязи вируса папилломы человека и развития рака гортани и глотки, а также выявлены особенности течения карцином головы и шеи в зависимости от полиморфизма ряда генов систем иммунорегуляции, детоксикации, апоптоза, а также от наличия инфицированности вирусом папилломы человека эпителиальной ткани верхних дыхательных путей.
Определены возможные прогностически значимые лабораторные маркеры для оценки степени риска и особенностей течения карцином головы и шеи и на их основе разработан алгоритм обследования при этих патологиях с учетом наличия ВПЧ и различных вариантов генов ключевых цитокинов, супрессоров опухолевого роста, ферментов детоксикационной системы. Показанные особенности течения заболевания в зависимости от генотипов ряда генов позволят индивидуализировать ведение пациента и прогнозировать исход болезни. Результаты исследования могут быть использованы в практической деятельности врачей клинической лабораторной диагностики и онкологов, а рекомендации к оценке риска развития опухолей головы и шеи могут использоваться в кабинетах медицинской помощи при отказе от курения в поликлиниках.
Методология и методы исследования
Для реализации поставленной цели научной работы были использованы анализ литературы и современные методы статистической обработки данных. Лабораторное исследование выполнено на высокотехнологичном оборудовании. Объектами исследования являлись пациенты с плоскоклеточными карциномами гортани, глотки, ротовой полости; здоровые добровольцы, не имеющие онкологической патологии.Предметом исследования являлись гематологические параметры, инфицированность вирусом папилломы человека и аллельный полиморфизм генов цитокинов,
супрессоров опухолевого роста, ферментов детоксикационной системы у обследуемых пациентов и здоровых добровольцев. Основные положения, выносимые на защиту
-
У пациентов с плоскоклеточными карциномами головы и шеи наблюдается высокая частота распространенности ВПЧ в эпителиальной ткани верхних дыхательных путей, что характеризует важную роль ВПЧ в неопластической трансформации эпителия верхних дыхательных путей, однако опухолевый процесс у пациентов, инфицированных ВПЧ, протекает с меньшей злокачественностью.
-
Среди пациентов с плоскоклеточными карциномами головы и шеи различной локализации частота встречаемости гетерозиготного генотипа по аллельным вариантам полиморфных локусов гена CYP2E1 (с1/с2) определяетособенности функционирования ферментов системы детоксикации.
-
Вклад иммунорегуляторной системы и системы регуляции роста тканей в развитие карцином головы и шеи характеризуется более высокой частотой гомозиготного генотипа по аллелю Arg гена TP53 (Pro72Arg), а также наличием аллеля А гена IL10 (G1082A) и аллеля А гена IL10 (592C>A). Также показано, что наличие аллеля А гена TNF (G308A) и аллеля А гена IL10 (592C>A) можно рассматривать как прогностически неблагоприятные факторы.
Личный вклад автора
Автором произведен сбор анамнеза и образцов ткани и крови 120 пациентов, наблюдающихся в ГБУЗ «Волгоградский областной онкологический диспансер №1» и ГУЗ «Поликлиника №20» г. Волгограда. Диссертант самостоятельно выполнил все лабораторные исследования на базе лаборатории геномных и протеомных исследований отдела фармакологии Волгоградского медицинского научного центра ВолгГМУ. Автором проанализировано большое количество отечественных и зарубежных источников литературы по теме исследования, обоснованы цель, задачи, научная новизна и практическая значимость исследования, сформулированы основные положения, выносимые на защиту и выводы, проведена статистическая обработка. Автором самостоятельно написан текст диссертации, автореферата, опубликованных статей.
Реализация результатов работы
Результаты работы, а именно рекомендации к оценке риска развития плоскоклеточных карцином гортани, глотки и ротовой полости,внедрены в практическую деятельность в кабинете медицинской помощи при отказе от курения в ГУЗ «Поликлиника №20» г.Волгограда (акт о внедрении от 9 июня 2015г.), а также используются в процессе обучения студентов 5-6 курсов медико-биологического факультета, интернов по специальности «Клиническая лабораторная диагностика» и врачей клинической лабораторной диагностики лечебно-профилактических учреждений цикла общего усовершенствования факультета усовершенствования врачей
ВолгГМУ на кафедре клинической лабораторной диагностики с курсом КЛД ФУВ ВолгГМУ (справка о внедрении от 10 июня 2015г.).
Степень достоверности и апробация результатов
Достоверность работы подтверждается достаточным объемом клинических и лабораторных данных, полученных в результате исследования 120 пациентов, использованием современного оборудования, методов исследования и статистической обработки полученных результатов. Статистические методы соответствуют поставленным задачам, выводы и практические рекомендации логически вытекают из полученных результатов исследования.
Результаты работы были представлены на XVI Региональной конференции молодых исследователей Волгоградской области (Волгоград, 2011), юбилейной 70-ой открытой научно-практической конференции молодых ученых и студентов с международным участием «Актуальные проблемы экспериментальной и клинической медицины» (Волгоград, 2012), XVII Всероссийской научно-практической конференции «Молодые ученые в медицине» (Казань, 2012), Всероссийской молодежной научной конференции «Современные проблемы биомедицинской инженерии» при финансовой поддержке РФФИ в рамках научного проекта № 15-38-10042 мол_г (Саратов, 2015). Также работа была отмечена грантом программы «Участник молодежного научно-инновационного конкурса» («УМНИК», 2012-2013), а также признана лучшим инновационным продуктом для предоставления частным лицам (бизнес-ангелам) по социально значимому проекту «Развитие системы организации работы в регионах России по подготовке и отбору инновационных проектов ранних стадий и привлечению частного капитала к их финансированию» (Москва, 2013).
Апробация диссертации проведена на расширенном заседании кафедр клинической лабораторной диагностики с курсом КЛД ФУВ; молекулярной биологии и генетики; иммунологии и аллергологии; микробиологии, вирусологии и иммунологии с курсом клинической микробиологии; акушерства и гинекологии; урологии, нефрологии и трансплантологии ФУВ; фундаментальной медицины и биологии ГБОУ ВПО ВолгГМУ Минздрава России (протокол № 12 от 16 апреля 2015 года).
Публикации по теме диссертации
По материалам работ опубликовано 11 печатных работ, из них 2 статьи – в изданиях, рекомендованных Высшей аттестационной комиссией Министерства образования и науки РФ для опубликования основных результатов диссертационных исследований.
Объем и структура работы
Диссертация изложена на 144 страницах машинописного текста, иллюстрирована 14 рисунками, 62 таблицами и 3 схемами. Состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов исследования, обсуждения результатов, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка литературы, включающего 55 отечественных и 160 зарубежных источников.
Выживаемость пациентов с плоскоклеточными опухолями головы и шеи
Согласно концепции развития здравоохранения России злокачественные заболевания относятся к группе наиболее социально значимых болезней, в значительной степени определяющих качество трудового потенциала общества. Злокачественные опухоли головы и шеи занимают 6-е место по распространенности во всем мире, 5-е место в России, по приросту смертности – одно из первых [9, 49]. В 2000 году число вновь заболевших раком гортани составило уже 7,8 на 100 000 населения Российской Федерации, из которых 65,8% больных были в трудоспособном возрасте [48].В 79—84% наблюдений заболевание диагностируется в III—IV стадиях, что неблагоприятноотражается на результатах лечения [31].Рост злокачественного перерождения гортани составляет в среднем 3% в год [1].
Наиболее высокая заболеваемость раком гортани отмечается в Польше, Таиланде и Огайо (штат в США). В Западной Европе к неблагоприятным странам относят Францию, Испанию и Италию. Этому заболеванию подвержены в основном мужчины в соотношении 1 к 10, за исключением Шотландии, где это соотношение составляет 1 к 2. К странам с низкой заболеваемостью (менее 2 на 100 000 населения) относятся Норвегия, Швеция, Япония. В Великобритании частота рака гортани составляет 4 на 100 000 населения.
Среди этиологических факторов, приводящих к развитию злокачественных новообразований гортани, выделяют курение табака, употребление алкоголя. Определенную роль в возникновении опухолевого процесса играют также факторы питания, радиация, голосовые перегрузки, профессиональные вредности (пыль, сажа, анилиновые краски, радиоактивные вещества), вирус папилломы человека [173]. Существенной особенностью ВПЧ является их возможность переключаться с инфекции непродуктивного типа к инфекции продуктивного типа и наоборот. В первом случае вирус реплицируется синхронно с клеткой и не приносит ей вреда. Во втором случае он быстро размножается и лизирует клетку, высвобождая массу новых вирионов, способных инфицировать другие клетки [131]. Показано, что ВПЧ могут оказывать различное действие на слизистую оболочку органов. Так, проявлением продуктивного воздействия являются папилломы, а результатом трансформирующего действия могут быть внутриэпителиальные поражения (дисплазия, инвазивный рак). Таким образом, условиями формирования необратимой неоплазии являются [27, 28]: активная экспрессия генов Е6 и Е7 ВПЧ; индукция множественных повреждений хромосомной ДНК в инфицированной клетке, которая завершает процесс перерождения. С ВПЧ– 6, 11, 13, 30–го типов связано в большинстве случаев развитие веррукозного ларингита (ювенильный папилломатоз гортани). Заболевание диагностируется чаще у детей до 5 лет, заразившихся перинатально, и характеризуется появлением папилломатозных разрастаний на голосовых связках, что и приводит к речевым затруднениям, нарушениям циркуляции воздуха в верхних отделах дыхательных путей. ВПЧ были выделены также и на слизистых оболочках полости рта.
По данным GillisonM.L. распространенность ВПЧ в ротовой полости в США среди мужчин и женщин возрастом от 14 до 69 лет составила 6,9%, причем ВПЧ-16 встречался с частотой 1,0%. Среди людей 30–34 лет распространенность ВПЧ составила 7,3%, а 60-64 лет – 11,4%. У мужчин по сравнению с женщинами ВПЧ в ротовой полости встречалось чаще (10,1% и 3,6% соответственно). Инфицирование ВПЧ возрастало с увеличением числа сексуальных партнеров и различных видов сексуальных контактов [92, 93].
В исследовании, проведенном в США, было выяснено, что распространенность ВПЧ в ротовой полости у молодых людей возраста от 18 до 30 лет составила 2,4%, и достоверно чаще ВПЧ встречалось у темнокожих. Авторы делают выводы о том, что оральные сексуальные контакты могут играть роль в передаче ВПЧ [156].
ВПЧ–6, 11 могут вызывать рак гортани и глотки, но в то же время роль других типов ВПЧ в злокачественном перерождении слизистой ротовой полости изучена недостаточно. Отмечены редкие случаи развития орофарингеальных бородавок, обусловленные «генитальными» серотипами ВПЧ–16, 18. ChansaenrojJ. и др. отмечают, что ВПЧ-16 наиболее часто распространено в шейке матки, в то время как ВПЧ 6 и 11 типов чаще встречаются на коже, в дыхательном и пищеварительном трактах. Результаты показали гомологию ВПЧ-11 разных органов, а филогенетический анализ выявил, что ВПЧ-11 различных органов принадлежат одной генетической линии [77].
В литературном обзоре KreimerA.R. и др. было показано, что распространенность ВПЧ среди пациентов с плоскоклеточными опухолями головы и шеи составила 25,9% в среднем по миру, причем достоверно чаще ВПЧ встречается у пациентов с орофарингеальными карциномами (35,6%), чем с раком ротовой полости (23,5%) и раком гортани (24,0%). Преобладающим типом ВПЧ среди ВПЧ-положительных образцов орофарингеальных карцином был ВПЧ-16 (86,7%) по сравнению с опухолями ротовой полости и опухолями гортани, где этот тип ВПЧ встречался с частотой 68,2% и 69,2% соответственно. ВПЧ-18 встречался в ВПЧ-положительных орофарингеальных, ларингеальных опухолях и опухолях ротовой полости в 2,8%, 17%, 34,1% соответственно [121].
Роль генетических факторов в ВПЧ-индуцированном канцерогенезе эпителия слизистых оболочек
Информация о генах получена из базы данных HuGENavigator (http://www.hugenavigator.net) путем формирования соответствующих поисковых запросов (англоязычные названия заболеваний).
При поиске генов программа ранжирует их в соответствии с найденным баллом (score), который рассчитывается по формуле: Score = H/Hi + GA/GAi + GWAS/GWASi + MA/MAi + GT/GTi, где H – общее число статей в PubMed, в которых изучен данный ген при данной болезни; Hi – общее число статей в базе, посвященных данной болезни; GA – число генетических ассоциативных исследований с участием данного гена при данной болезни; GAi – общее число ассоциативных исследований для данной болезни; GWAS – число полногеномных ассоциативных исследований с участием данного гена при данной болезни; GWASi – общее число полногеномных ассоциативных исследований для данной болезни; MA – число статей по мета-анализу ассоциаций с участием данного гена при данной болезни; MAi –общее число статей по мета-анализу ассоциаций для данной болезни; GT – число статей по генетическому тестированию с участием данного гена при данной болезни; GTi – общее число статей по генетическому тестированию для данной болезни.
Проведен анализ общности генов, ассоциированных с папилломавирусной инфекцией, раком гортани, раком глотки, носоглотки, ротоглотки. Информация о генах получена из базы данных HuGE Navigator (http://www.hugenavigator.net) путем формирования соответствующих поисковых запросов (англоязычные названия заболеваний).
На 2013 год в базе HuGE Navigator число изученных генов составляло: для папилломавирусной инфекции 134 гена, для рака глотки 310 генов, для рака гортани 102, для рака носоглотки 261 ген, ротоглотки – 37. Были приняты к рассмотрению только гены, участвующие в развитии двух и более патологий, для которых значение балла составило не менее 0.01.
Наибольшее значение балла для новообразований глотки составило 1,638 (GSTM1), 0,352 (HLA-A), 0,329 (GSTT1) для генов, кодирующих ферменты детоксикации и главного комплекса гистосовместимости (табл.2). Таблица 2. Наибольшее значение балла для новообразований глотки
HuGENavigator (http://www.hugenavigator.net) мы выбрали для своего исследованиягенетические полиморфизмы гена-супрессора опухолевого роста р53Pro72Arg, гена рецептора эпидермального фактора роста EGFR А2073Т, генов цитокинов IL10 (полиморфизмы G1082A и 592C A) и TNFG308A, а также генов ферментов детоксикационной системы CYP1A1 Ile462Val, GSTP1 Ile105Val, CYP2E1 с1/с2. Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Исследование проведено на базе кафедры клинической лабораторной диагностики с курсом КЛД ФУВ ГБОУ ВПО «Волгоградский государственный медицинский университет» МЗ РФ за период с 2012г. по 2014 г. В качестве обследуемых были выбраны 84 пациентаотделения опухолей головы и шеи ГБУЗ «Волгоградский областной клиническийонкологический№1» возрастом от 31 до 81 лет. Были исследованы периферическая кровь пациентов и образцы опухолевой ткани плоскоклеточных карцином гортани и глотки у 84 пациентов ВОКОД №1, среди которых женщины составляли 11,9% (10 человек), мужчины – 88,1% (74 человек). Забор крови осуществлялся в период госпитализации пациентов в отделение опухолей головы и шеи ВОКОД №1 в 2011-2012 г.г. Взятие образцов опухолевой ткани произведено по время плановых операций в ВОКОД №1.
Также на базе ГУЗ «Поликлиника №20» была сформирована контрольная группа, в которую вошли 36 здоровых добровольцев, не имеющих онкологической патологии, среди которых женщины составляли 11,1% (4 человека), а мужчины 88,9% (32 человека) (табл.7). У добровольцев забор крови и образцов буккального соскоба производился во время плановой диспансеризации в 2013г.
Особую благодарность автор выражает заведующему отделением опухолей головы и шеи ГБУЗ «ВОКОД №1» Ткачу В.В., врачам отделения Пономареву В.В., Файнштейну Д.В., Кузютину С.А., заведующей клинико-диагностической лабораторией ГБУЗ «ВОКОД №1» Голубевой О.Е., главному врачу ГУЗ «Поликлиника №20» Меняйлову В.И., заведующей клинико-диагностической лабораторией ГУЗ «Поликлиника №20» Меняйловой Г.И.
Определение основных гематологических параметров осуществлялось на автоматическом гематологическом анализаторе Advia 60 (Bayer Diagnostics, Германия).
Определение наличия ВПЧ в образцах опухолевой ткани и буккального соскоба проводилось с помощью тест-системы «ВИПАПОЛ комплекс» производства НПО «Литех» (Россия) с предварительным выделением ДНК сорбентным методом из образцов буккального соскоба здоровых добровольцев и образцов опухолевой ткани пациентов с использованием комплектов «Комплекта реагентов для экспресс-выделения ДНК из буккального соскоба» и «Набор для выделения ДНК из биопроб» производства НПО «Литех» соответственно.Определение наличия ВПЧ в образцах включало в себя несколько этапов: амплификация и последующая детекция в агарозном геле. Амплификация проводилась по следующей программе, указанной в инструкции к тест-системе «ВИПАПОЛ комплекс» производства НПО «Литех» (Россия) (табл.9). Таблица 9. Программа амплификации для тест-системы «ВИПАПОЛ комплекс»
Система «SNP-экспресс» представляет собой комплект реагентов для выявления мутаций (полиморфизмов) в геноме человека. Анализу подвергается геномная ДНК человека, выделенная из лейкоцитов цельной крови с помощью реагента «ДНК-экспресс-кровь» производства НПО «Литех». С образцом выделенной ДНК параллельно проводятся две реакции амплификации – с двумя парами аллель-специфичных праймеров. Амплификация проводилась по следующей программе (табл.11), указанной в инструкции к тест-системе«SNP-экспресс» производства НПО «Литех» (Россия).
Оценка распределения частот генотипов SNP-мутаций генов TP53, TNFa, IL10, EGFR у здоровых добровольцев и у пациентов с плоскоклеточными карциномами головы и шеи
В исследуемой группе распространенность генотипа IleIle составила 81,82%, генотипа IleVal – 18,18%, генотипа ValVal – 0,00%. Частота аллеля Ile составила 90,91%, частота аллея Val составила 9,09%. В контрольной группе распространенность генотипа IleIle составила 80,56%, генотипа IleVal – 19,44%, генотипа ValVal – 0,00%. Частота аллеля Ile составила 90,28%, частота аллея Val составила 9,72%. (табл.51).
Статистически значимых различий между группами выявлено не было. При анализе значений возраста пациентов и коэффициентов тяжести проведенное сравнение двух независимых групп с использованием U 87 критерия Манна-Уитни выявило тенденцию (U=38,5, Z=-l,72, р=0,085), что носители аллеля Val поражаются заболеванием в более позднем возрасте (средний возраст 63,13±7,62лет) по сравнению с носителями генотипа Ilelle (средний возраст 55,82±5,52 лет) в то время, как у носителей аллеля Val коэффициент тяжести (коэф.тяж.0,275±0,16 ед.) достоверно (U=36,5, Z=2,06, р=0,039) ниже по сравнению с носителями генотипа Ilelle (коэф.тяж.0,48±0,21 ед.).
При анализе других критериев (характеристика опухолевого процесса, наличие ВПЧ, показатели общего анализа крови) достоверных различий между группами выявлено не было.
В исследуемой группе распространенность генотипа IleIle составила 41,86%, генотипа IleVal –53,49%, генотипа ValVal – 4,65%. Частота аллеля Ile составила 68,6%, частота аллея Val составила 31,4%. В контрольной группе распространенность генотипа IleIle составила 58,33%, генотипа IleVal – 38,88%, генотипа ValVal – 2,79%. Частота аллеля Ile составила 77,77%, частота аллея Val составила 22,23%.
Статистически значимых различий между группами выявлено не было. Величина ORдля генотипа IleVal составила 1:1,83. При оценке влияния различных генотипов на характер опухолевого роста была обнаруженанаиболее частая встречаемость Т1 степени местной распространенности опухоли у пациентов с генотипом IleIle по сравнению с носителями аллеля Val (табл.53).
Таблица 53. Частота встречаемости Т1 степени местной распространенности опухоли среди пациентов с карциномами гортани в зависимости от генотипов SNP-мутации в позиции GSTP1 Ile105Val Т1 степень (частота, %) Т2-Т4 степени (частота, %) Пациенты с генотипом IleIle 33,33 66,67 Пациенты с генотипами IleVal и ValVal 6,67 93,33 При анализе других критериев (характеристика опухолевого процесса, наличие ВПЧ, показатели общего анализа крови, коэффициент тяжести, возраст пациентов, образ жизни) достоверных различий между группами выявлено не было. 3.10.3. Оценка распределения частот генотипов SNP-мутации в позиции CYP2E1 с1/с2у пациентов с карциномами гортани (n=33) и здоровых людей (n=36).
В исследуемой группе распространенность генотипа с1с1 составила 54,54%, генотипа с1с2 – 30,3%, генотипа с2с2 – 15,16%. Частота аллеля с1 составила 69,69%, частота аллея с2 составила 30,31%. В контрольной группе распространенность генотипа с1с1 составила 66,66%, генотипа с1с2 – 13,88%, генотипа с2с2 – 19,46%. Частота аллеля с1 составила 73,6%, частота аллея с2 составила 26,4%. (табл.54).
В исследуемой группе распространенность генотипа IleIle составила 76,32%, генотипа IleVal – 18,42%, генотипа ValVal – 5,26%. Частота аллеля Ile составила 85,53%, частота аллея Val составила 14,47%. В контрольной группе распространенность генотипа IleIle составила 80,56%, генотипа IleVal – 19,44%, генотипа ValVal – 0,00%. Частота аллеля Ile составила 90,28%, частота аллея Val составила 9,72%. (табл.56). Таблица 56. Распределение частот аллелей и генотипов полиморфного варианта гена CYP1A1Ile462Val Показатель Контрольная группа n=36 (частота, %) Исследуемая группа n=38 (частота, %) RR Аллель Ile Val 90,289,72 85,53 14,47 0,95 1,49 Генотип IleIle IleValValVal 80,56 19,44 0,00 76,32 18,42 5,26 0,95 0,95 Статистически значимых различий между группами выявлено не было. При анализе различных критериев (коэффициент тяжести заболевания, образ жизни, возраст пациентов, характеристика опухолевого процесса, наличие ВПЧ, показатели общего анализа крови) достоверных различий между группами выявлено не было.
. Оценка распределения частот генотипов SNP-мутации в позиции GSTP1 Ile105Val у пациентов с карциномами глотки и ротовой полости (n=39) и здоровых людей (n=36).
В исследуемой группе распространенность генотипа IleIle составила 64,1%, генотипа IleVal –33,33%, генотипа ValVal – 2,57%. Частота аллеля Ile составила 80,76%, частота аллея Val составила 19,24%. В контрольной группе распространенность генотипа IleIle составила 58,33%, генотипа IleVal – 38,88%, генотипа ValVal – 2,79%. Частота аллеля Ile составила 77,77%, частота аллея Val составила 22,23%. (табл.57). Таблица 57. Распределение частот аллелей и генотипов полиморфного варианта гена GSTP1 Ile105Val
В исследуемой группе распространенность генотипа с1с1 составила 54,17%, генотипа с1с2 – 25,0%, генотипа с2с2 – 20,83%. Частота аллеля с1 составила 66,67%, частота аллея с2 составила 33,33%. В контрольной группе распространенность генотипа с1с1 составила 66,66%, генотипа с1с2 – 13,88%, генотипа с2с2 – 19,46%. Частота аллеля с1 составила 73,6%, частота аллея с2 составила 26,4%. (табл.58). Таблица 58. Распределение частот аллелей и генотипов полиморфного варианта гена CYP2E1 с1/с Показатель Контрольная группа n=36 (частота, %) Исследуемая группа n=24 (частота, %) RR
Оценка распределения частот генотипов SNP-мутаций генов CYP1A1, GSTP1, CYP2E1 у здоровых добровольцев и пациентов с плоскоклеточными карциномами гортани
При оценке влияния различных генотипов на характер опухолевого роста были выявлены с помощью точного критерия Фишера статистически достоверные различия между носителями аллеля А и пациентами с карциномами головы и шеи с генотипом СС в частоте встречаемости различных степеней местной распространенности опухоли: так у носителей генотипа СС достоверно чаще встречаются опухоли с Т1 и Т2 степенями. Также у носителей генотипа СС достоверно чаще встречаются опухоли с ранними (Iи II) клиническими стадиями. Снижение экспрессии IL10 у носителей генотипа СС приводит к активации клеточного иммунитета и характеризуется меньшей злокачественностью опухолевого процесса [183].
С помощью точного критерия Фишера была выявлена более частая распространенность ВПЧ у пациентов с карциномами гортани с генотипом СС по сравнению с носителями аллеля А. Данный факт может свидетельствовать о роли ВПЧ в канцерогенезе эпителия гортани при отсутствии иммуносупрессии интерлейкином 10.
Фактор некроза опухолей альфа является провоспалительным цитокином, обладающим цитотоксическим действием, направленным на клетки опухоли либо клетки, пораженные вирусами, иммуномодулирующим действием, вызываемым активацией макрофагов, нейтрофилов, эозинофилов и эндотелиальных клеток.
При оценке распределения частот генотипов SNP-мутации в позиции TNFG308A у пациентов с плоскоклеточными карциномами головы и шеи и у пациентов с карциномами гортани и здоровых людей статистически значимых различий обнаружено не было. Однако для пациентов с карциномами ротовой полости и глотки было показано, что значениеOR для генотипа АА составило 1:3. Кроме того, при анализе значений коэффициента тяжести заболевания для пациентов с карциномами ротовой полости и глоткибыла выявлено, что у носителейаллеля Ав позиции TNFG308A по сравнению с носителями генотипа GGзаболевание протекает тяжелее. А для пациентов с карциномами гортани с помощью точного критерия Фишера была показана более редкаявстречаемость Т4 степени местной распространенности опухоли у пациентов с генотипом GG по сравнению с носителями аллеля А. Все это может быть объяснено тем фактом, что замена G на А в положении 308 гена приводит к повышению уровня экспрессии TNFa[103] и опосредованной супрессии опухолевого роста.
Кроме того, был проведен анализ комбинаций генотипов SNP-мутаций генов IL10, ТР53, EGFR, TNFa у пациентов с плоскоклеточными карциномами головы и шеи. В результате сравнения частот комбинаций было показано, что чаще у здоровых добровольцев встречаются генотипы ProArg GG, ProArgAT, ProArg СС для генов TP53 Pro72Arg и TNFG308A, EGFRA2073T, IL10 592C A соответственно. Также как факторы защиты можно рассматривать комбинация генотипов АТСС для генов EGFRA2073T и IL10 592C A. Относительный риск для всех этих комбинаций составил 0,38 – 0,5 ед.Достоверно чаще у пациентов с карциномами головы и шеи по сравнению с контрольной группой встречались комбинации генотипов ArgArg АТ, ArgArg СА, ArgArg АА для генов TP53 Pro72Arg и EGFRA2073T, IL10 592C A, IL10 G1082A соответственно. Также как факторы риска можно рассматривать комбинацию генотипов АТСА для генов EGFRA2073T и IL10 592C A и комбинацию ААСА для мутаций IL10 G1082A/IL10 592C A. Относительный риск для всех этих комбинаций составил 1,64 – 1,79 ед.(рис.11).
При оценке распределения частот генотипов SNP-мутации в позиции CYP1A1 Ile462Val у пациентов с карциномами головы и шеи в целом и здоровых людей статистически значимых различий обнаружено не было. Для пациентов с карциномами гортани было показано, что носители аллеля Val поражаются заболеванием в более позднем возрасте по сравнению с носителями генотипа IleIle в то время, как у носителей аллеля Val коэффициент тяжести достоверно ниже по сравнению с носителями генотипа IleIle. Это может быть объяснено какими-либо тяжелыми иммунологическими или иными нарушениями у пациентов с генотипом, по литературным данным обладающим протективным свойством[128, 129].
При оценке распределения частот генотипов SNP-мутации в позиции GSTP1 Ile105Val у пациентов с карциномами головы и шеи в целом и с карциномами ротовой полости и глотки и здоровых людей статистически достоверных различий обнаружено не было.Аллель Val оценивается многими исследователями как фактор риска развития рака шейки матки, колоректального рака, рака легкого, рака простаты, рака ротовой полости, рака мочевого пузыря [69, 79, 126, 174, 192]. Кроме того, наличие аллеля Val является неблагоприятным признаком для прогноза тяжести ракового заболевания [157]. Мы также приходим к этим выводам, обнаружив более частую встречаемость Т1 степени местной распространенности опухоли у пациентов с карциномами гортани с генотипом IleIle по сравнению с носителями аллеля Val.
Оценка роли полиморфизма CYP2E1 c1/c2 противоречива в трудах многих исследователей. Ряд работ показывают влияние на развитие различных видов рака аллеля с1 [61, 62], другие – аллеля с2 [172]. Мы же при оценке распределения частот генотипов SNP-мутации в позиции CYP2E1 с1/с2у пациентов с карциномами головы и шеи и здоровых людей обнаружили более широкую распространенность генотипа с1с2 в исследуемой группе по сравнению с контрольной (рис.12). Эта же картина сохранилась и для пациентов с карциномами гортани (рис.13).
Кроме того, для пациентов с карциномами головы и шеи в целом была выявлена более частая распространенность курильщиков среди пациентов с генотипом с1с2 по сравнению с носителями генотипа с2с2. Эта же картина сохранилась и для пациентов с карциномами гортани в то время, как для пациентов с карциномами ротовой полости и глотки была выявлена более частая встречаемость курильщиков среди пациентов с генотипом с1с1 по сравнению с носителями аллеля с2, что характеризует различный вклад таких факторов, как генетическая предрасположенность и курение, в развитие онкологических процессов разных локализаций.