Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1 Обзор литературы 21
1.1 Липофильные окислительно-антиоксидантные биомаркеры атеросклероза .21
1.2 Окисленно модифицированные протеиновые биомаркеры атеросклероза .25
1.3 Атеротромботические нарушения (тромбоцитарного и коагуляционного звеньев гемостаза) при атеросклерозе .30
1.4 Биомаркеры дисфункции эндотелия при атеросклерозе .36
1.5 Биомаркеры острого коронарного синдрома .43
1.6 Биомаркеры оссификации и кальцификации атеросклеротических очагов 46
1.7 Метаболические биомаркеры атеросклероза 48
1.8 Липидно-липопротеиновые биомаркеры атеросклероза .51
1.9 Воспалительные цитокины и хемоаттрактанты в крови при атеросклерозе 55
1.10 Деструктивные биомаркеры атерослероза 64
ГЛАВА 2 Материал и методы исследования 72
2.1 Общая клиническая характеристика обследованных и распределение их по группам 72
2.2 Лабораторные методы исследования 77
2.3 Статистическая обработка материала 83
ГЛАВА 3 Результаты собственных исследований и их обсуждение 84
3.1 Липофильные окислительно-антиоксидантные биомаркеры в крови при КА без ОКС 84
3.2 Воспалительные и окислительные биомаркеры в крови при остром коронарном синдроме 86
3.3 Окислительные, тромбогенные и эндотелиально-дисфункциональные биомаркеры при ИМ 91
3.4 Протеиновые маркеры ОКС 97
3.5 Протеиновые биомаркеры стенозирующего атерокальциноза .101
3.6 Липидно-липопротеиновые и нелипидные биомаркеры коронарного атеросклероза 104
3.7 Воспалительные и деструктивные биомаркеры при КА .111
3.8 Воспалительные и деструктивные биомаркеры КА, ассоциированные с нестабильностью атеросклеротических бляшек в коронарных артериях 117
3.9 Окислительно-антиоксидантные, липидные и эндотелиально дисфункциональные биомаркеры КА, ассоциированные с нестабильностью атеросклеротических бляшек в коронарных артериях 123
3.10. Комплекс ключевых биомаркеров для лабораторной диагностики риска развития осложнений КА 126
3.11.Комплекс ключевых биомаркеров для лабораторной диагностики коронарного атеросклероза 130
3.12. Разработка оценки риска развития коронарного атеросклероза логико математическим методом 136
Заключение 148
Выводы 152
Практические рекомендации 155
Список литературы
- Атеротромботические нарушения (тромбоцитарного и коагуляционного звеньев гемостаза) при атеросклерозе
- Лабораторные методы исследования
- Окислительные, тромбогенные и эндотелиально-дисфункциональные биомаркеры при ИМ
- Окислительно-антиоксидантные, липидные и эндотелиально дисфункциональные биомаркеры КА, ассоциированные с нестабильностью атеросклеротических бляшек в коронарных артериях
Введение к работе
Актуальность изучения факторов и биологических маркеров ключевых
патофизиологических механизмов атеросклероза в Западно-Сибирском регионе
обусловлена крайне высокой распространенностью факторов риска ИБС и
метаболических нарушений, особыми климато-географическими условиями,
особенностями питания. Поэтому востребовано получение новых данных в области изучения риска осложнений заболевания и повышения эффективности его ранней диагностики. Решение проблемы в целом является перспективным для разработки научной платформы современных методов влияния на этот патологический процесс, действующих непосредственно на молекулярно-клеточные механизмы атерогенеза.
Степень разработанности темы
В отношении ДЛП показано, что не только гиперхолестеринемия (ГХС), преимущественно за счет повышенного уровня холестерина липопротеинов низкой плотности (ЛНП-ХС), но и гипертриглицеридемия (ГТГ) и сниженный уровень холестерина липопротеинов высокой плотности (ЛВП-ХС) играют важную роль в развитии ИБС и независимо ассоциируются с КА [Steinberg D., 2005; Tabet F.et al., 2009; Диагностика и коррекция нарушений липидного обмена с целью профилактики и лечения атеросклероза. ВНОК, 2012; Fruchart J.-C., 2003; Рагино Ю.И. и соавт., 2009; Nitenberg A., 2006].
Повышенный уровень продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ) в ЛНП, их сниженная устойчивость к окислению и низкое содержание в ЛНП липофильных антиоксидантов часто выявляются у лиц с ИБС и КА [Steinberg D., 2009; Stocker R. et al., 2005; Fruchart J.-C., 2003; Зенков Н.К. и соавт., 2001; Рагино Ю.И. и соавт., 2007].
Показано, что окисленный фибриноген потенцирует активацию факторов свертывания крови, агрегацию тромбоцитов и эритроцитов, повышенную секрецию цитокинов макрофагами, что приводит к тромбогенным нарушениям гемостаза [Асейчев А.В. и соавт., 2002; Ройтман Е.В. и соавт., 2004].
По мнению некоторых исследователей, высокое содержание в периферическом кровотоке остеонектин-положительных клеток может отражать наличие продуктивного этапа воспалительного процесса в сосудистой стенке [Gadeau A.P. et al., 2001; Gossl M. et al., 2008; Trion A. Et al., 2004].
Особое место в ряду воспалительных биомаркеров занимает С-реактивный белок
(СРБ), который после разработки высокочувствительных (чувствительность от 0,1 мг/л)
специфичных иммуноферментных тест-систем его определения получил название
"высокочувствительный СРП" (вчСРП) [Bucova M. et al., 2008; Koenig W. Et al., 2006;
Pearson T.A. et al., 2003]. Кроме вчСРП, по результатам многих исследований,
ассоциированными с атеросклерозом воспалительными маркерами являются
интерлейкины ИЛ-6 [Sukhija R. Et al., 2007], ИЛ-8 [Boekholdt S.M. et al., 2004], ИЛ-1-бета, а также фактор некроза опухоли-альфа (ФНО-альфа) [Рагино Ю.И. и соавт., 2007; Bucova M. et al., 2008; Pearson T.A. et al., 2003] и деструктивные металлопротеиназы (ММП-3 и ММП-9) [Adachi T. et al., 2007; Armstrong E.J. et al., 2006; Bucova M. et al., 2008; White A.J. et al., 2007].
В целом, в последние годы и комплексные и узконаправленные исследования вышеописанных процессов в мире ведутся широко, но, несмотря на это, многие вопросы этиологии и патогенеза атеросклероза остаются открытыми. Весьма не однозначны данные о ключевых факторах, влияющих на процесс развития КА и его осложнений, особенно, острого коронарного синдрома и инфаркта миокарда. Уточнению и дополнению механизмов развития атеросклероза могут способствовать комплексные исследования широкого спектра атерогенных и патогенетически значимых биомаркеров в крови при коронарном атеросклерозе и его осложнениях.
Цель исследования
Изучить потенциально проатерогенные и патогенетически значимые биохимические показатели и выявить из них наиболее важные и информативные биомаркеры коронарного атеросклероза и его осложнений для уточнения механизмов развития заболевания и разработки новых подходов к его лабораторно-биохимической диагностике.
Задачи исследования:
-
Изучить динамику изменений биохимических показателей, отражающих участие окисленных липопротеинов низкой плотности и провоспалительных цитокинов в развитии инфаркта миокарда и нестабильной стенокардии. Сформировать панель значимых окислительных липидных и провоспалительных биомаркеров острого коронарного синдрома (ОКС).
-
Изучить комплекс окислено модифицированных протеиновых биомаркеров в крови и их взаимосвязи с атеротромботическими нарушениями (тромбоцитарного и коагуляционного звеньев гемостаза) и биомаркерами дисфункции эндотелия при стенозирующем атеросклерозе коронарных артерий и его осложнении остром инфаркте миокарда (ИМ).
-
Изучить комплекс протеиновых биомаркеров в крови, включая сердечный белок, связывающий жирные кислоты (кардиоБСЖК), выявить особенности их изменений при ОКС (острый ИМ и нестабильная стенокардия).
-
Поиск и определение содержания в крови ключевых протеиновых биомаркеров оссификации и кальцификации атеросклеротических очагов с использованием протеомных технологий при стенозирующем атеросклерозе и кальцинозе коронарных артерий, выявление их ассоциации с другими биомаркерами атеросклероза.
-
Изучить комплекс окислительных, воспалительных, деструктивных биомаркеров и хемоаттрактантов в крови, выявить особенностей их изменений при стенозирующем атеросклерозе коронарных артерий разной степени выраженности и при развитии его осложнения -ОКС. Сформировать панель значимых воспалительных и деструктивных биомаркеров, свидетельствующих о дестабилизации атеросклеротических бляшек.
-
Определить ключевые потенциально проатерогенные и патогенетически значимые окислительные, липидные, воспалительные, деструктивные, гемостазиологические и протеомные биомаркеры в крови при коронарном атеросклерозе для уточнения и дополнения механизмов развития атеросклероза и его осложнений.
-
На основе сформированных панелей значимых окислительных, липидных, воспалительных, деструктивных, протеомных и метаболических биомаркеров разработать новые способы неинвазивной лабораторно-биохимической диагностики атеросклероза и риска его осложнения – острого инфаркта миокарда.
Научная новизна
1. Установлена прямая корреляция между наличием атеросклеротического процесса в коронарных артериях и окислительной модификацией липопротеинов низкой плотности (повышенный уровень окисленных липопротеинов низкой плотности со сниженной резистенстностью к окислению и значительное окисление их липидных и апопротеиновых компонентов). Исследование данных маркеров может служить средством контроля за потенциально атерогенными окислительными изменениями липопротеиновых частиц, инициирующих атерогенез у пациентов, имеющих факторы риска развития сердечнососудистых заболеваний.
2. Показано, что у мужчин с коронарографически верифицированным атеросклерозом
существенно повышены липидные и нелипидные факторы риска развития коронарного
атеросклероза: уровни общего холестерина, холестерина липопротеинов низкой
плотности, С-реактивного протеина, гомоцистеина, интерлейкина 6, интерлейкина 8,
металлопротеиназы 9. Полученные данные являются основой для определения комплекса
биомаркеров, ассоциированных с повышенным риском развития коронарного
атеросклероза и острого коронарного синдрома.
3. Выявлена зависимость изменений уровней провоспалительных и деструктивных
биомаркеров от разной степени выраженности и распространенности коронарного
атеросклероза. С увеличением числа атеросклеротических поражений артерий от одной ко
всем трем снижается концентрация интерлейкина 1 бета, фактора некроза опухоли альфа,
интерлейкина 8, а уровни С-реактивного протеина и металлопротеиназы 3 возрастает. При
преимущественно небольшой степени стеноза (25-50%) коронарных артерий
концентрации С-реактивного протеина, провоспалительных цитокинов и
металлопротеиназ выше, чем при выраженном стенозе. Указанные биохимические
показатели являются маркерами риска развития осложнений заболевания.
4. Показано, что у мужчин со стенозирующем коронарным атеросклерозом и кальцинозом
коронарных артерий повышена концентрация в крови остеонектина и выявлены значимые
ассоциации этого биомаркера с фактором некроза опухоли альфа, интерлейкином 6,
интерлейкином 8, липопротеинами низкой плотности и с наличием стенозирующего
коронарного атеросклероза. Это указывает на участие остеонектина в механизмах
кальцификации атеросклеротического очага.
5. На основании полученных данных выделен комплекс наиболее информативных
биомаркеров, свидетельствующих о наличии нестабильности атеросклеротических
процессов, что может быть использовано для разработки мер по оптимизации диагностики
прогрессии коронарного атеросклероза.
6. Установлено, что при остром инфаркте миокарда наряду с повышенными
окислительными изменениями липидов и протеинов крови, наблюдается значительная
окислительная модификация фибриногена, что потенцирует протромбогенные изменения
сосудисто-тромбоцитарного звена гемостаза (ускоренная лейкоцитарно-тромбоцитарная
агрегация, повышенный уровень продуктов деградации фибрина, сниженная активность
фибринолиза, повышение активности фактора Виллебранда и снижение метаболитов
оксида азота). Повышенный уровень фибриногена может быть одним из новых маркеров
окислительного стресса, имеющего место при коронарном атеросклерозе и инфаркте
миокарда.
7. Впервые обнаружено, что из провоспалительных биомаркеров инфаркта миокарда
наиболее повышенными в крови (особенно в 1 сутки) являются концентрации
интерлейкина 6, интерлейкина 8 и С-реактивного белка. Результаты исследования
окислительных биомаркеров при остром коронарном синдроме свидетельствуют о более
выраженной окислительной модификации липопротеинов низкой плотности и о
нарушении равновесия «прооксидантов-антиоксидантов» в липопротеинах низкой
плотности при инфаркте миокарда.
8. Впервые разработана лабораторно-диагностическая линейка, включающая определение
исходного уровня продуктов перекисного окисления липидов в липопротеинах низкой
плотности, резистентность липопротеинов низкой плотности к окислению, концентрации
базального инсулина, С-реактивного белка, апопротеина В, триглицеридов, холестерина
липопротеинов низкой плотности и апопротеина А1, для раннего выявления факторов
риска развития коронарного атеросклероза.
9. Впервые предложен комплекс биомаркеров, включающий определение интерлейкина 6,
интерлейкина 8, С-реактивного белка, исходного уровня продуктов перекисного
окисления липидов в липопротеинах низкой плотности, резистентности липопротеинов
низкой плотности к окислению для раннего выявления факторов риска развития инфаркта
миокарда.
Теоретическая и практическая значимость работы
Результаты исследования выявили особенности изменений липофильных окислительно-антиоксидантных биомаркеров в крови и определили ключевые из них при стенозирующем атеросклерозе коронарных артерий разной степени выраженности. Выявлены особенности изменений окислительных липидных биомаркеров в крови и определены ключевые из них при ОКС (нестабильная стенокардия напряжения, острый инфаркт миокарда). Изучен комплекс окисленно модифицированных протеиновых биомаркеров в крови и их взаимосвязь с атеротромботическими нарушениями (тромбоцитарного и коагуляционного звеньев гемостаза) и биомаркерами дисфункции эндотелия при стенозирующем атеросклерозе коронарных артерий и его осложнении остром ИМ. Выявлены особенности изменений комплекса протеиновых биомаркеров в крови, включая белок, связывающий жирные кислоты кардиального типа (кардиоБСЖК), при ОКС. С использованием протеомных технологий изучены ключевые протеиновые биомаркеры оссификации и кальцификации атеросклеротических очагов при стенозирующем атеросклерозе и кальцинозе коронарных артерий и охарактеризованы их ассоциации с другими биомаркерами атеросклероза. Выявлены особенности изменений липидно-липопротеиновых биомаркеров в крови при стенозирующем атеросклерозе коронарных артерий. Обнаружены особенности изменений комплекса воспалительных, деструктивных биомаркеров и хемоаттрактантов в крови при стенозирующем атеросклерозе коронарных артерий разной степени выраженности и при развитии ОКС. В целом, полученные результаты указывают на ключевую роль воспалительно-деструктивного и окислительного процессов в развитии КА и его осложнений.
Выявленные значимые потенциально атерогенные и патогенетически значимые окислительные, липидные, воспалительные, деструктивные, гемостазиологические и протеомные биомаркеры в крови при коронарном атеросклерозе позволили уточнить и раскрыть ключевые факторы и механизмы развития коронарного атеросклероза и его осложнений.
В практическом аспекте на основе сформированных панелей значимых
окислительных, липидных, воспалительных, деструктивных, протеомных и
метаболических биомаркеров разработаны новые комплексы маркеров для неинвазивной лабораторно-биохимической диагностики коронарного атеросклероза (повышенный исходный уровень продуктов перекисного окисления липидов в липопротеинах низкой плотности, сниженная резистентность липопротеинов низкой плотности к окислению, повышенные концентрации в крови базального инсулина, С-реактивного белка, апопротеина В, триглицеридов и сниженные концентрации холестерина липопротеинов высокой плотности и апопротеина А1) и его осложнения – инфаркта миокарда (интерлейкина 6, интерлейкина 8, С-реактивного белка, исходного уровня продуктов перекисного окисления липидов в липопротеинах низкой плотности, резистентности
липопротеинов низкой плотности к окислению). Полученные результаты являются
основой для разработки и совершенствования лабораторно-биохимической
диагностической линейки коронарного атеросклероза и его осложнения - инфаркта миокарда и определяют важное направление дальнейших исследований в области патофизиологии атеросклероза.
Положения выносимые на защиту:
-
Наряду с общими изменениями провоспалительных, окислительных и гемостазиологических показателей при остром коронарном синдроме, имеется комплекс лабораторных биомаркеров, ассоциированных с наличием инфаркта миокарда (в 1 сутки заболевания) и отражающих некроз кардиомиоцитов (белок, связывающий жирные кислоты кардиального типа), повышение провоспалительных (С-реактивный протеин, интерлейкин 6, интерлейкин 8), протромбогенных (окисленный фибриноген, потенцирующий сосудисто-тромбоцитарные нарушения) и окислительных факторов (исходный уровень продуктов перекисного окисления липидов в липопротеинах низкой плотности), который может использоваться для лабораторной диагностики и оценки риска развития инфаркта миокарда.
-
Повышенные уровни С-реактивного белка, интерлейкина 6, интерлейкина 8, окисленных протеинов и сниженные метаболитов оксида азота и молекул адгезии сосудистого эндотелия ассоциируются с наличием нестабильности в атеросклеротических бляшках коронарных артерий.
-
Для лабораторной диагностики коронарного атеросклероза определен комплекс значимых биомаркеров, включающий повышенный исходный уровень продуктов перекисного окисления липидов в липопротеинах низкой плотности, сниженную резистентность липопротеинов низкой плотности к окислению, повышенные концентрации в крови базального инсулина, С-реактивного белка, апопротеина В, триглицеридов и сниженные концентрации холестерина липопротеинов высокой плотности и апопротеина А1, который дает возможность судить о факторах риска развития сердечно-сосудистых заболеваний атеросклеротического генеза.
Степень достоверности и апробации результатов
Материалы, представленные в диссертации, основаны на обследовании 775 пациентов (коронарный атеросклероз, острый инфаркт миокарда, популяционная выборка мужчин без ИБС), представленная выборка репрезентативна для оценки всех изучаемых вариантов патологии. Оборудование, на котором выполнялись исследования, проходило регулярную поверку в соответствии с «ГОСТ Р 8.563-96 Государственная система обеспечения единства измерений». Методики выполнения измерений с вынесением соответствующего заключения метрологической службы, что подтверждается наличием сертификатов. Использованы современные методические подходы для выполнения биохимических исследований – клинико-биохимических (Сертификаты Федерального контроля качества) и фундаментальных, а также проведена статистическая обработка результатов.
Результаты проведенных исследований были доложены и обсуждены на III научных чтениях, посвященных памяти Е.Н. Мешалкина (Новосибирск, 2002); на VI European Congress of clinical gerontology (Москва, 2002); на Сибирской конференции «Проблемы кардиологии пожилого и старческого возраста (Барнаул, 2002); на X Российском национальном конгрессе “Человек и лекарство” (Москва, 2003); на II съезде
геронтологов и гериатров России (Москва, 2003); на Всероссийской конференции
"Актуальные проблемы профилактики неинфекционных заболеваний" (Москва, 2003); на
Всероссийской конференции «Проблемы и перспективы клинической фармакологии»
(Барнаул, 2004); на III Всероссийском диабетологическом Конгрессе (Москва, 2004); на
Российском национальном Конгрессе кардиологов (Томск, 2004; Москва, 2005; Москва,
2009; Москва, 2010; Москва, 2011; Санкт-Петербург, 2013; Казань, 2014; Москва, 2015);
на Международном симпозиуме «Молекулярные механизмы регуляции функции клетки»
(Тюмень, 2005); на Всероссийской конференции «Вопросы патогенеза типовых
патологических процессов» (Новосибирск, 2009; Новосибирск, 2011); на Четвертой
Всероссийской конференции «Фундаментальные аспекты компенсаторно-
приспособительных процессов» (Новосибирск, 2009); на Российской конференции «Современные подходы к диагностике и лечению сердечно-сосудистых заболеваний» (Санкт-Петербург, 2010); на VI Съезде российского общества медицинских генетиков (Ростов-на-дону, 2010); на Международном конгрессе «Кардиология на перекрестке наук» (Тюмень, 2010; Тюмень, 2012; Тюмень, 2013); на международной конференции «Современная кардиология: эра инноваций» (Томск, 2010); на II и IV съездах терапевтов Сибири и Дальнего Востока (Новосибирск, 2010; Новосибирск, 2014); на Всероссийской конференции «Алмазовские чтения» (Санкт-Петербург, 2011); на Национальном конгрессе терапевтов (Москва, 2011); на VIII Всероссийском Конгрессе «Артериальная гипертония. От А.Л. Мясникова до наших дней» (Москва, 2012); на 1-м международном образовательном форуме «Российские дни сердца» (Москва, 2013); на III Евразийском Конгрессе кардиологов (Москва, 2014); на VIII Всероссийской конференции «Молекулярная диагностика» (Москва, 2014); на II Международном образовательном форуме «Российские дни сердца», Санкт-Петербург, 2014; на III Международном конгрессе «Артериальная гипертензия — от Короткова до наших дней», Санкт-Петербург, 2015; на 7th international symposium on atherosclerosis, Amsterdam, 2015; на III Международном образовательном форуме «Российские дни сердца», Москва, 2015.
Атеротромботические нарушения (тромбоцитарного и коагуляционного звеньев гемостаза) при атеросклерозе
В инициации и развитии атеросклеротического очага одна из ключевых ролей принадлежит образованию в крови и в сосудистой стенке богатых ХС окисленно модифицированных липопротеинов низкой плотности (окЛНП) вследствие индуцированной гиперпродукции активных кислородных метаболитов (АКМ) [Воробьва Е.Н. и соавт., 2005; Ланкин В.З. и соавт., 2000; Никитин Ю.П. и соавт., 2002; Aviram M., 1998; Colavitti R. et al., 2005; Gianturco S.H. et al., 1994; Parthasarathy S. et al., 1996]. В отличие от нативных ЛНП, окЛНП содержат большое количество гидроперекисей полиненасыщенных жирных кислот (ПНЖК), окисленный аполипопротеин В-100 (апоВ), а также продукты их окислительного распада/деградации (малоновый диальдегид, диеновые коньюгаты, гексаналь, гидроксиноненаль, лизолецитин, карбонильный радикал), способные инициировать самоподдерживающиеся циклы окислительной трансформации биополимеров сосудистой стенки [Воевода М.И. и соавт., 2003; Рагино Ю.И., 2004; Рагино Ю.И. и соавт., 2007; Finkel T., 1998; Parthasarathy S. et al., 1996; Steinberg D., 2002]. Согласно современным представлениям об атерогенезе [Баркаган З.С. и соавт., 2006; Гуревич В.С., 2006; Никитин Ю.П., 2006; Оганов Р.Г. и соавт., 2004; Libby P., 2001; Puddu G.M. et al., 2005], уже минимально окЛНП могут повышать экспрессию в эндотелиоцитах хемоаттрактантов MCP-1 [Parthasarathy S. et al., 1996], макрофаг колониестимулирующего фактора (MCSF), адгезивных молекул X-LAM (лейкоцитарная адгезивная молекула), E-селектина, VCAM-1 и ICAM-1, а в макрофагах - экспрессию скэвинджер-рецепторов типа SR-A, SR-BI и CD36 [Castrillo A. et al., 2004; Nakata A. et al., 1999; Puddu G.M. et al., 2005]. Связывание и захват макрофагами через скэвинджер-рецепторы окЛНП приводит к накоплению в них эстерифицированного ХС и трансформации МФ в пенистые клетки [Ross R., 1999]. Исследованиями последних лет было установлено, что задержка атерогенных липидов в интиме сосудов зависит от количественного и качественного состава гликозаминогликанов (ГАГ) сосудистой стенки [Boren J. et al., 2000]. Было показано, что васкулярные протеогликаны связывают белки, входящие в состав липопротеинов низкой плотности [Leta G.C. et al., 2002; Raines E., 2000]. Наряду с этим, ГАГ и коллаген входят в содержимое атеросклеротической бляшки, которое обладает высоким тромбогенным потенциалом. ГАГ влияют на воспалительный процесс при атеросклерозе [Camejo J., et al., 1993; Fasio S. et al., 1997].
Степень окислительной модификации ЛНП зависит, с одной стороны, от количества в них ПНЖК (основного субстрата окисления) и продуктов окисления, а с другой стороны, от их антиоксидантного потенциала. ЛНП защищены от окисления несколькими эндогенными (альфа-токоферол, гамма-токоферол, бета-каротин, ретинол, ликопен, убихинон) и экзогенными антиоксидантами (витамин С, мочевая кислота, альбумин, некоторые водорастворимые полифенолы) [Климов А.Н. и соавт., 1995; Меньщикова Е.Б. и соавт., 1994; Сафронов И.Д. и соавт., 2006; Титов В.Н. и соавт., 2005; Rzanowska M. et al., 2005; Vardi M. et al., 2013].
Альфа-токоферол — один из самых сильных липофильных антиоксидантов, связывающий гидроксильные радикалы. В организме -токоферол транспортируется в плазму клеток в составе липопротеинов и является важнейшей защитой мембраны клеток от свободных радикалов, предотвращая цепную реакцию перекисного окисления липидов. Он защищает полиненасыщенные жирные кислоты (ПНЖК) в фосфолипидах клеточных мембран и липопротеины в плазме крови, вступая в реакцию с перекисными радикалами [Окуневич И.В. и соавт., 2004]. Экспериментально дефицит витамина Е трудно воспроизвести у людей из-за сложной системы сдержек и противовесов в системе антиоксидантного каскада. Хотя симптомы легкой и умеренной недостаточности -токоферол едва различимы, многие клинические эффекты дефицита хорошо документированы. Как правило во время истощения витамина Е повышается концентрация маркеров перекисного окисления липидов, тем не менее, эти маркеры не всегда специфичны для дефицита -токоферола, так как изменения других антиоксидантов также могут влиять на уровень этих маркеров. Так как пациенты с гипертриглицеридемией имеют повышенный уровень липопротеинов, концентрация -токоферола у них также имеет тенденцию к повышению, что приводит к завышению уровня витамина Е в общем статусе организма. Насыщение эндотелиальных клеток витамином Е подавляет презентацию молекул межклеточной адгезии (ICAM-1) и васкулярной молекулы адгезии клеток (VCAM-1), что снижает адгезию компонентов клеток крови к эндотелию [Szczeklik, A., 1981; Tran, K. et al., 1990]. Однако антирадикальный потенциал -токоферола реализуется только в присутствии других антиоксидантов [Ланкин В.3. и соавт., 2000; Leger С., 2000]. При взаимодействии свободных радикалов с -токоферолом последний окисляется с образованием токофероксил- радикала. Это приводит к быстрому истощению концентрации витамина Е, снижению антиоксидантной активности и нарастанию прооксидантного действия [Ланкин В.3. и соавт., 2001; KeaneyJ. F. et al., 1999]. Однако наличие в среде других антиоксидантов — аскорбиновой кислоты, бета-каротина, биофлавоноидов восстанавливает токофероксил радикал до -токоферола с возвратом к оптимальной концентрации [Бурлакова Е.Б. и соавт., 1998; Ланкин В.3. и соавт., 2001; Окуневич И.В. и соавт., 2004]. Антиоксидантное действие витамина Е заключается во встраивании в структуру липопротеинов низкой плотности и клеточных мембран, тем самым эффективно предотвращая пероксидацию липидов и окисление липопротеинов. Кроме того, отмечено, что регулярный прием витамина Е оказывает стабилизирующее действие на липидные компоненты клеточных мембран, в результате чего тормозится образование провоспалительных простагландинов. [Ланкин В.3. и соавт., 2000; DiplockA. T., 2000].
К другим липофильным антиоксидантам относятся витамин А и его провитамины (бета-каротин и другие каротиноиды). В организме человека витамин А обнаруживают в трех формах в зависимости от степени окисления углеродного атома. Он поступает в организм в виде каротиноидов растительной пищи либо в виде свободного ретинола и его эфиров. Попадая в кишечник, свободный ретинол всасывается в слизистой оболочке. В крови транспорт ретинола осуществляется ретинолсвязывающим белком. Далее транспортирующий белок взаимодействует с цитоплазматической мембраной клеток, после чего внутрь клетки проникает свободный ретинол, а белок переносчик возвращается во внеклеточное пространство. Внутри клетки все три формы витамина А связываются с белками. Ретиноевая кислота в комплексе со специфическим цитозольным белком стимулирует процессы клеточного роста и пролиферации. Антиоксидантная функция витамина А выражается в защите любых биологических мембран от повреждения активными формами кислорода. Наиболее известный каротиноид — бета-каротин, обладает иммуностимулирующим действием за счет антипролиферативной и проапоптотической активности in vitro в отношении лимфоцитов и торможения функциональной активности тромбоцитов [Захарова И.Н. и соавт., 2010].
Лабораторные методы исследования
У всех пациентов кровь для биохимического исследования брали утром натощак из локтевой вены не ранее, чем через 12 часов после последнего приема пищи. Содержание общего холестерина (ХС), триглицеридов (ТГ), ХС липопротеинов высокой плотности (ХС-ЛВП) и глюкозы в сыворотке крови определяли ферментативными методами с использованием стандартных реактивов «Biocon Fluitest» на биохимическом анализаторе «Фотометр 5010+». Пересчет глюкозы сыворотки крови в глюкозу плазмы крови осуществлялся по известной формуле (Руководство по диабету Европейского общества кардиологов и Европейской ассоциации изучения диабета, 2007): глюкоза плазмы (ммоль/л) = -0,137+1,047 х глюкоза сыворотки (ммоль/л). Показатель ХС-ЛНП рассчитывался по формуле Фридвалда. Уровни апоА1 и апоВ измеряли иммунотурбидиметрическим методом с использованием реактивов DiaSys (Германия).
Методами иммуноферментного анализа с использованием стандартных тест-систем ELISAs определяли в сыворотке крови уровни с-пептида (тест системы DSL), вчСРП (тест-системы Biomerica), ФНО-альфа, ИЛ-1-бета, ИЛ-6, ИЛ-8 (тест-системы BCM Diagnostics), ИЛ-18, ИЛ-2 (тест-системы – Cytimmune), растворимого лиганда рецептора CD40 (тест-системы Bender MedSystems), хемоаттрактантов (моноцитарного хемоаттрактантного протеина - MCP-1) (тест-системы Bender MedSystems), эндотелиально-моноцитарно аттрактантного протеина (EMAP-II), эндотелиальных молекул адгезии: sVCAM-1 и sICAM-1 (тест-системы Biosource), деструктивных металлопротеиназ: ММП-3, ММП-7 и ММП-9 и тканевого ингибитора металлопротеиназ -ТИМП-1 (тест-системы BCM Diagnostics), концентрации антител к окЛНП (тест-системы Biomedica), гомоцистеина (тест-системы Axis-Shield), базального иммунореактивного инсулина (тест-системы Axis-Shield) на ИФА анализаторе Multiscan EX (Финляндия).
Уровни ЛП(а) определяли методом двойной радиальной иммунодиффузии в агарозном геле с использованием моноспецифических поликлональных гетероиммунных антисывороток к человеческому ЛП(а). Изоформы апопротеина (а), определяющие фенотипы – апо(а) с низким молекулярным весом и апо(а) с высоким молекулярным весом [Kronenberg F. et al., 1999], исследовали методом иммуноблота в электрофорезной камере GE Healthcare (Австрия). Окислительную резистентность ЛНП in vitro оценивали оригинальным способом, разработанным в ФГБУ «НИИ терапии и профилактической медицины» СО РАМН (Рагино Ю.И., Душкин М.И., 1998). Суммарную фракцию ЛНП и ЛОНП (преимущественно ЛНП) получали из 0,5 мл сыворотки крови методом осаждения, в присутствии гепарина (200 ЕД/мл сыворотки) и хлорида марганца (50 мМ/мл сыворотки). В полученных липопротеинах определяли содержание белка по методу Лоури. Окислительную модификацию ЛНП проводили в среде Дульбекко без кальция и магния, содержащей 50 мкмоль СuSO4 в присутствии 0,2 мг/мл белка ЛНП. Пробы инкубировали при 37С на водяной бане. Через определенные промежутки времени (0 ч, 3 мин, 6 мин, 15 мин и 30 мин) оценивали уровень ТБК-реактивных продуктов в 0,2 мл инкубационной среды, содержащей ЛНП. Определение ТБК-реактивных продуктов (МДА) проводили флуориметрическим методом на спектрофлуориметре «Hitachi F-300» (Schuh J., Fairclough G.F., 1978). Степень окислительного стресса определяли в сыворотке крови при помощи теста FORT на анализаторе FORM Plus (Callegari, Италия). Тест FORT является колориметрическим тестом, основанным на способности переходных металлов, таких как железо, катализировать расщепление гидропероксидов (ROOH), с образованием свободных радикалов. Эти радикалы затем захватываются аминопроизводным, CrNH2. Амин взаимодействует со свободными радикалами, с образованием окрашенного стабильного продукта, определяемого фотомитрически при длине волны 505 нм. Интенсивность окрашивания прямо пропорциональна количеству радикалов и концентрации гидропероксидов, и, соответственно, окислительному статусу образца.
Определение концентрации а-токоферола, ретинола и -каротина в ЛНП проводили по собственному способу (Рагино Ю.И., Душкин М.И., Каштанова Е.В., 2001). К 0,5 мл сыворотки крови добавляли 20 мкл гепарина (из фармакопейного раствора, содержащего 5000 ЕД/мл), перемешивали, добавляли 37 мкл 1 М раствора MnCl2, перемешивали, оставляли на 30 минут при 0 С, центрифугировали при 0 С 30 минут, осадок промывали 0,5 мл 0,9% раствора NaCl, центрифугировали, осажденные ЛНП растворяли в 0,5 мл 1 М раствора NaCl. В полученных ЛНП измеряли белок по методу Лоури. Далее, в ЛНП определяли концентрации а-токоферола и ретинола флуориметрическим методом Taylor S.L. и соавторов (1976). К 0,25 мл сыворотки добавляли 0,5 мл C2H5OH, встряхивали, добавляли 0,25 мл аскорбиновой кислоты и 0,5 мл KOH для омыления образцов. На 40 минут пробы помещали на водяную баню при температуре 70 С, после чего пробы остужали, и экстрагировали 2 мл гексана, тщательно встряхивая каждую пробу. Верхний гексановый слой переносили в другие пробирки и анализировали на спектрофлуориметрах «Hitachi F-300» и «Versafluor». Результаты выражали для а-токоферола - в мг/мг белка ЛНП, для ретинола и -каротина - в мкг/мг белка ЛНП.
Активность параоксоназы (PON1) определяли фотометрическим методом в трис-HCl буфере, содержащем параоксон (Sigma) [Рагино Ю.И. и соавт., 2005], окислительную модификацию белков определяли фотометрическим методом после проведения реакции с 2,4-ДНФГ [Рагино Ю.И. и соавт., 2005]. Определение окислительной модификации апопротеинов в ЛНП (ок-апо-ЛНП) проводили оригинальным способом, разработанным в ФГБУ «НИИ терапии и профилактической медицины» СО РАМН (Рагино Ю.И. и соавт., 2005). ЛНП получали из сыворотки крови осаждением в присутствии гепарина (200 ЕД/мл сыворотки) и хлорида марганца (50 мМ/мл сыворотки) при 0С, промывали 0,9% раствором хлорида натрия, растворяли в 1 мл 1 М раствора хлорида натрия, измеряли в них концентрации белка (апопротеинов) по методу Лоури. Затем к 100 мкл ЛНП добавляли 900 мкл 20% раствора трихлоруксусной кислоты для денатурации апопротеинов. Такое соотношение растворов ЛНП и ТХУ (1:9) с конечным объемом пробы в 1 мл нами было определено в ходе экспериментов как оптимальное и сопоставимое в отношении 1:1 с добавляемым затем 1 мл 0,1 М раствора 2,4-динитрофенилгидразина (2,4-ДНФГ) в 2 М растворе HCl. Далее пробу инкубировали при комнатной температуре в течение 1 ч, центрифугировали при 3000 g 20 минут, осадок промывали 2 раза 1 мл раствора этанол:этилацетат (1:1) для экстракции избытка 2,4-ДНФГ, не прореагировавшего с карбонильными группами окисленных апопротеинов, осадок высушивали и, далее, растворяли в 2,5 мл 8 М раствора мочевины с добавлением 15 мкл 2 М раствора HCl. В контрольную пробу добавляли вместо 2,4-ДНФГ 1 мл 2 М раствора HCl. Степень окислительной модификации апопротеинов определяли измерением оптической плотности образовавшихся динитрофенилгидразонов спектрофотометрическим методом при длине волны 363 нм. Результаты выражали в Ед оптической плотности/мг апопротеинов в ЛНП.
Окислительные, тромбогенные и эндотелиально-дисфункциональные биомаркеры при ИМ
Обсуждая полученные результаты важно отметить, что ИЛ-1 и ФНО-альфа секретируются активированными воспалительными клетками несколько раньше, чем ИЛ-6, относящийся к цитокинам, завершающим развитие воспалительной реакции. ИЛ-6 - провоспалительный и гепатоцитактивирующий фактор, поэтому он, вероятно, более чем ИЛ-1 и ФНО-альфа стимулирует синтез белков острой фазы воспаления – прежде всего вчСРП [Libby P., 2010; Wang X., Connolly T.M., 2010; Luc G. et al., 2003].
Известно, что к суперсемейству ФНО-альфа относится и лиганд рецептора CD40 (CD40L), экспрессирующийся на активированных Т-ЛФ, МФ, эндотелиальных и других клетках и потенцирующий провоспалительные и протромботические изменения за счет воспалительного активирования эндотелиальных клеток и увеличения экспрессии тканевого фактора в моноцит/МФ [Biasillo G., 2010; Aukrust P. et al., 2011]. В отличие от ФНО-альфа, концентрация CD40L в крови у мужчин с определенными во фрагментах интима/медии коронарной артерии нестабильными бляшками, оказалась, как и в случае вчСРП и ИЛ-6, выше в 1,3 раза в сравнении с пациентами первой подгруппы.
Аналогичные, но значительно более выраженные различия между группами выявлены для концентрации в крови ИЛ-8. Так, у мужчин второй подгруппы этот показатель был в 3,4 раза выше, чем у мужчин без нестабильных бляшек. Полученные данные подчеркивают, вероятно, весьма значимое место этого цитокина, стимулирущего продукцию моноцит/МФ [Libby P., 2010; Armstrong E.J., Morrow D.A., Sabatine M.S., 2006], среди биомаркеров дестабилизации атеросклеротических очагов не только в сосудистой стенке, но и в крови.
Концентрация в крови эндотелиоцитарных молекул адгезии sVCAM оказалась наибольшей у мужчин первой подгруппы, то есть без нестабильных бляшек, выше в 1,2 раза, чем у пациентов с нестабильными бляшками (рисунок 6). Обсуждая полученные данные важно отметить, что адгезивные молекулы играют значимую роль на ранних стадиях формирования атеросклеротической бляшки, связанных с хемотаксисом, адгезией и миграцией моноцитов в субэндотелиальное пространство, а не на стадии дестабилизации бляшки. После выполнения своих функций sVCAM подвергаются ферментативному расщеплению и за счет хорошей растворимости попадают в кровь [Braunersreuther V., 2007; Wang X., Connolly T.M., 2010].
Различий между подгруппами мужчин в концентрациях в крови деструктивных ММП-3 и ММП-9 нами не было обнаружено. Полученные результаты не были ожидаемыми, особенно в отношении ММП-9. Однако были выявлены различия в концентрации в крови ТИМП-1.
Уровень ТИМП-1 оказался у мужчин первой подгруппы, то есть без нестабильных бляшек, выше в 1,1, чем у пациентов с нестабильными бляшками второй подгруппы. Эти данные подтверждают известную связь между ТИМП-1 и ИЛ-8, повышенный уровень которого может ингибировать активность ТИМП-1 [Armstrong E.J., Morrow D.A., Sabatine M.S., 2006; Newby A.C., 2005].
На втором этапе статистической обработки результатов проводился корреляционный анализ между показателями воспалительно-деструктивных биомаркеров в крови с показателем нестабильности атеросклеротических бляшек с учетом непараметрического распределения признаков. С показателем нестабильности атеросклеротических бляшек в коронарных артериях коррелировали уровни в крови только вчСРБ, ИЛ-6 (слабые связи) и ИЛ-8 (средняя сила связи).
Резюмируя полученные данные важно отметить, что у мужчин с преобладанием нестабильных атеросклеротических бляшек в коронарных артериях уровни в крови вчСРБ, ИЛ-8, ИЛ-6 и CD40L выше, а sVCAM и ТИМП-1 ниже в сравнении с мужчинами, у которых в коронарных артериях преобладают стабильные бляшки. Четыре из указанных биомаркеров в крови (вчСРБ, ИЛ-6, ИЛ-8 и sVCAM) коррелируют (p 0,01) с показателями нестабильностьи атеросклеротических бляшек в коронарных артериях. Эти же 4 биомаркера показали и прямые корреляционные связи между их концентрацией в сосудистой стенке (в атеросклеротических бляшках коронарных артерий) и в крови (p 0,01).
В целом, наши результаты изучения воспалительно-деструктивных биомаркеров коронарного атеросклероза без острого коронарного синдрома, то есть вне осложнения, указывают на отсутствие выраженной связи между значениями этих показателей в коронарных артериях и в крови. Это свидетельствует о том, что повышенная активность воспалительно деструктивного процесса, характерная для нестабильных, но еще не осложненных атеросклеротических бляшек, скорей всего носит преимущественно локальный характер и, вероятно, слабо отражается на концентрации воспалительно-деструктивных биомаркеров в крови.
Окислительно-антиоксидантные, липидные и эндотелиально дисфункциональные биомаркеры КА, ассоциированные с нестабильностью атеросклеротических бляшек в коронарных артериях
Распределение пациентов по показателю апоВ дает нам основание для определения порогового значения на границе 100 мг/дл несмотря на то, что средний уровень апоВ в группе пациентов без ИБС составил 112,9 мг/дл.
Ориентиром для оценки критического в отношении высокого риска развития ИБС уровня ТГ в крови был уровень 175 мг/дл, так как именно после этого значения резко снижается частота встречаемости пациентов без ИБС.
Нами так же были обозначены условные границы для показателей, характеризующих окислительные процессы в ЛНП. Пороговое значение, позволяющее оценить фактор риска развития ИБС для исходного уровня продуктов ПОЛ в ЛНП, составило 3 нМ МДА/мг ЛНП, а для показателя, характеризующего резистентность ЛНП к окислению 30нМ МДА/мг ЛНП.
Рассмотрим основные шаги алгоритма расчета значений оценки риска развития ИБС для полученной лабораторно-диагностической панели, содержащей 8 параметров, использующихся в разработанной логико-математической модели.
Для перечня параметров, на основании значений которых врачом выполняется процедура логического вывода, при их формализации необходимо учитывать следующую важную особенность: значения анализируемых параметров, на основании которых выполняется оценка, измерены в разных шкалах и имеют различную логику трактовки и различную степень вклада в общую картину. Поэтому для получения оценок для каждого параметра необходимо выполнять процедуры выбора способов оценки степени важности параметров и их нормирования, которые определяются в соответствии с предварительными экспертными рассуждениями, формализуемыми в виде алгоритма логического вывода. На основании этого алгоритма строится логико-математическая модель (ЛММ), представляющая комбинацию неполных деревьев решений и экспертных оценок. При этом в модели учитывается вес каждого параметра, граница «норма-патология», выявленная для каждого параметра, и способ его нормирования в рамках логики рассуждений специалиста.
С целью формализации знаний экспертов был использован метод Дельфи. Метод Дельфи имеет несомненные преимущества по сравнению с методами, основанными на обычной статистической обработке результатов индивидуальных опросов. Существует несколько модификаций метода Дельфи. При получении весов нами были рассмотрены несколько вариантов, среди которых наилучшие результаты дал метод непосредственной оценки. Он позволил охватить всю совокупность результатов исследований по полученной лабораторно-диагностической панели. Необходимо отметить, что процедура формирования модели и алгоритмов для расчета выполнялись с участием одного эксперта. Процедура формирования коллегиального (коллективного) экспертного способа формирования алгоритмического и модельного обеспечения в данной работе не рассматривалась.
На первом шаге для каждого параметра xt устанавливаются интервальные значения «норма-патология» nxt. На втором шаге для каждого xt в зависимости от шкалы измерения и логики анализа значений задается способ нормирования. На третьем шаге методом Дельфи получаются средневзвешенные оценки i степени вклада каждого параметра в общую интегральную оценку степени риска развития ИБС. После чего формируется обобщенная модель, позволяющая рассчитывать единообразную общую оценку с учетом степени вклада нормированных значений каждого xt к их интервальным значениям «норма-патология» „Х: = «,/( ,) at - весовой коэффициент, учитывающий степень вклада параметра, полученный методом Делфи; 141 f (xt) - логико-математическая функция пересчета исходного значения каждого из восьми параметров х, учитывающая логику анализа исходного параметра и способ его пересчета относительно заданного экспертом интервального значения «норма-патология» nxt для каждого х, для / = 1,8. Для полученной обобщенной модели выполняется ее тестирование на реальных данных и оценка, предполагающая расчет характеристик диагностической точности, специфичности и чувствительности [Оганов Р.Г., 2010]: Чувствительность (Se, sensitivity) - это способность диагностического метода давать правильный результат, который определяется как доля истинно положительных результатов среди всех проведенных тестов. Специфичность (Sp, specificity) - это способность диагностического метода не давать при отсутствии заболевания ложноположительных результатов, который определяется как доля истинно отрицательных результатов среди здоровых лиц в группе исследуемых. Диагностическая точность (Ac, accuracy) - это доля правильных результатов теста (т.е. сумма истинно положительных и истинно отрицательных результатов) среди всех обследованных пациентов.
Результат проведенных экспериментов (рисунок 9) с моделью на всем объеме данных о пациентов с установленным диагнозом ИБС - да (1) и ИБС -нет (0), которые рассматривались в работе, позволяет определить диапазон порогового значения модели, которое в зависимости от решаемой задачи (скрининг, прогноз и т.п.) может быть изменено. Для задачи скрининга и оценки риска развития ИБС было определено пороговое значение 0,6 , которое является оптимальным для соотношения тройки параметров Ac-Sp-Se.