Оптимизация лабораторных технологий определения уровня дисгемоглобинов в крови Фаткуллин Ким Вилевич

Содержание к диссертации

Введение

Глава 1. Обзор литературы 13

1.1 Современные представления о структуре и функциях гемоглобина в организме 13

1.2 Основные клинически значимые дисгемоглобины 22

1.3 Методы определения уровня общего гемоглобина, карбоксигемоглобина и метгемоглобина в крови 32

1.4. Аналитические характеристики методов определения карбоксигемоглобина и метгемоглобина 41

Глава 2. Материалы и методы исследования 46

Глава 3. Результаты исследования и их обсуждение 55

3.1. Оценка аналитических характеристик спектрофотометрических методов и МКА (точность, прецизионность) при определении уровня карбокси- и метгемоглобина в крови 55

3.2. Исследование интерферирующего влияния билирубина, триглицеридов и метиленового синего на определение производных гемоглобина в крови методами двухволновой фотометрии и МКА 70

3.3. Исследование влияния антикоагулянтов и вида крови на определяемый уровень карбокси- и метгемоглобина. Оценка стабильности дисгемоглобинов в зависимости от условий хранения и используемого антикоагулянта 76

3.4. Влияние типа и степени заполнения вакуумных систем на определяемый уровень карбокси- и метгемоглобина в крови 91

4. Заключение 97

Выводы и практические рекомендации 103

Список сокращений 106

Список литературы 107

• Основные клинически значимые дисгемоглобины
• Оценка аналитических характеристик спектрофотометрических методов и МКА (точность, прецизионность) при определении уровня карбокси- и метгемоглобина в крови
• Исследование влияния антикоагулянтов и вида крови на определяемый уровень карбокси- и метгемоглобина. Оценка стабильности дисгемоглобинов в зависимости от условий хранения и используемого антикоагулянта
• Влияние типа и степени заполнения вакуумных систем на определяемый уровень карбокси- и метгемоглобина в крови

Введение к работе

Актуальность темы. Патологические состояния, сопровождающиеся повышением в крови уровня нефункциональных форм гемоглобина (дисгемоглобинов), наибольшей клинической значимостью среди которых обладают карбокси- и метгемоглобин (COHb, MetHb), представляют собой значимую медицинскую проблему. Повышенная концентрация дисгемоглобинов рассматривается как наиболее точный индикатор действия на организм токсических агентов - окиси углерода и метгемоглобинобразователей. Помимо случаев хронического отравления, определение уровня карбокси- и метгемоглобина является важным диагностическим исследованием, необходимым как для постановки диагноза острого отравления, так и для мониторинга состояния пациентов в условиях токсико-реанимационных отделений. Уровень карбоксигемоглобина у городских жителей, не связанных с воздействием монооксида углерода (CO) на производстве, в соответствии с методическими рекомендациями «Методы лабораторных исследований, используемые при диспансеризации рабочих с вредными условиями труда» (утв. Минздравом РСФСР 20.02.1980), может составлять до 4-6 %; концентрация метемоглобина у работников, имеющих контакт с окислителями, не должна превышать 1-3 %. Согласно Toxicological Profile for Carbon Monoxide (2012), у здоровых людей рекомендовано использовать пороговые пределы нормы COHb в крови 3 % для некурящих и 10 % для курильщиков. Вместе с тем, соответствие измеренного уровня COHb / MetHb и тяжести отравления (по клинической картине) не всегда может быть однозначным из-за многочисленных физиологических факторов, влияющих на поглощение и элиминацию токсических агентов, что может вести к недооценке тяжести состояния пациента и ошибкам в планировании лечебных мероприятий.

В соответствии с Федеральными клиническими рекомендациями (2013), ошибка определения уровня карбоксигемоглобина в 3-4 % и выше может вести к неверной оценке степени тяжести отравления угарным газом, которая в настоящее время определяется в основном по клиническим признакам (возможно, из-за отсутствия надежной аналитической базы). Поскольку взятие крови для измерения уровня карбоксигемоглобина непосредственно в очаге воздействия CO почти всегда невозможно, а его концентрация при поступлении пациента в лечебное учреждение может существенно отличаться от исходной, то в тех случаях, когда транспортировка пациента заняла продолжительное время или на догоспитальном этапе проводилась оксигенотерапия, для расчета начального уровня COHb может использоваться номограмма C.J. Clark et al. (1981), требующая, однако, точного определения уровня COHb как можно быстрее после поступления пациента в медицинскую организацию.

Измерение концентрации дисгемоглобинов в крови имеет большое значение для судебно-медицинской экспертизы: определение карбоксигемоглобина необходимо для

установления причины смерти в соответствующих случаях, метгемоглобина - для непосредственного выявления отравления метгемоглобинобразователями и определения давности образования гематом. Считается, что содержание НbСО в крови более 10 % свидетельствует о прижизненном его образовании в результате отравления. В соответствии с методическими рекомендациями «Биохимические методы исследования в судебно-медицинской практике» (Москва 2008), при воздействии метгемоглобинобразующих веществ признаки интоксикации проявляются при концентрации MetHb более 3 %, явного отравления – более 10 %. При определении давности образования субдуральной гематомы уровень метгемоглобина в крови из венозных синусов может колебаться от 1,5 % до 47,5 %; соответственно, ошибка анализа не должна превышать 3-5 % от определяемого уровня..

До недавнего времени наиболее распространенным было определение производных гемоглобина в крови фотометрическими методами на 1-2 фиксированных длинах волн. Методы требовали точной настройки спектрофотометра, применения точно выверенных коэффициентов в расчетных формулах, строгого соблюдения pH реакционной среды, а также значительного времени анализа и тщательности его выполнения. В последние 10-20 лет все большее распространение приобретают методы многоволнового мультикомпонентного анализа (МКА), предполагающие одновременное измерение экстинкции пробы на многих длинах волн (от 5 до 128) с последующим решением переопределенной n-мерной системы уравнений. Эти методы реализованы в блоках ко-оксиметрии анализаторов неотложных состояний, гораздо реже - в виде самостоятельных приборов. Они имеют значительные преимущества перед спектрофотометрией: меньшее время анализа, меньшая трудоемкость, возможность одновременного измерения концентрации нескольких аналитов (Hb, O₂Hb, COHb, MetHb и др.). Вместе с тем, оснащение реальных клинико-диагностических и судебно-медицинских лабораторий приборами, реализующими принцип МКА, может быть проблематично вследствие финансовых затруднений. Аналитические характеристики методов МКА несколько отличаются от классических фотометрических (прецизионность, чувствительность, интерферирующее влияние ряда веществ), что требует их детального сопоставления и определения наиболее важных аналитических и преаналитических факторов, влияющих на результаты исследований.

Степень разработанности темы исследования. В работах М.С. Кушаковского (1968), WHO Environmental Health Criteria 213 (1999), W.G. Zijlstra (2000) и V.A. Boumba (2005) присутствуют сведения об аналитических характеристиках различных методов определения уровня карбокси- и метгемоглобина в экспериментальном и клиническом материале. Однако, имеющиеся данные в основном касаются методов, реализованных в приборах «предыдущего» поколения (2-3-волновой фотометрии), и оценка исследуемых методов проводилась в основном по критериям прецизионности (CV) и корреляции результатов (r) с методом, принимаемым в

качестве опорного, в то время как для клинических специалистов более значима правильность и точность метода. Вместе с тем, измерение уровня дисгемоглобинов с точностью порядка ± 1% не имеет большого значения – скорее необходимо дифференцировать низкие уровни COHb от значительно более высоких, то есть важно быстро отличить 1 % от 10 %, а не 1 % от 2 % (Wilbur S. et al., 2012).

В работах Г.В. Дервиза (1966), O. Suzuki (2005), N.B. Hampson (2008), F. Shihana (2011), A. Ghanem et al. (2012) содержится информация о влиянии условий взятия и хранения биоматериала на стабильность дисгемоглобинов, но подавляющее большинство исследований посвящено только карбоксигемоглобину. До настоящего времени имелись лишь единичные работы по оценке влияния условий хранения, используемых вакуумных систем и антикоагулянтов, действию ряда факторов (липемия, иктеричность) на определяемый уровень карбокси- и метгемоглобина в клиническом материале, а также не проводилось сравнение аналитических параметров методов. Детальное исследование отмеченных аспектов позволит решить вопросы, связанные со стандартизацией преаналитического этапа определения уровня карбокси- и метгемоглобина, а также с выбором наиболее целесообразных методик их определения (точность, продолжительность анализа, стоимость). Это важно для объективной оценки тяжести интоксикации у лиц, поступающих в медицинские организации с отравлением угарным газом и метгемоглобинобразователями, своевременного назначения адекватного лечения, а также в судебно-медицинской практике, где лаборатории редко оснащены современными газоанализаторами крови с определением дериватов гемоглобина. Указанные аспекты явились основанием для настоящего диссертационного исследования.

Цель исследования: определение влияния факторов преаналитического и аналитического этапов лабораторного исследования на достоверность измерения уровня дисгемоглобинов в крови.

Задачи исследования:

1. Определение аналитических характеристик (точность, прецизионность) одно-,
двухволновых и многоволновых мультикомпонентных фотометрических методов измерения
уровня карбокси- и метгемоглобина при их различной концентрации в крови.

1. Оценка интерферирующего влияния билирубина, триглицеридов и метиленового синего на уровень дисгемоглобинов в крови, определяемый различными методами.

2. Оценка влияния вида крови и типа вакуумных систем на определяемый уровень карбокси- и метгемоглобина в клиническом материале.

3. Оценка стабильности карбокси- и метгемоглобина в крови в зависимости от условий хранения биоматериала и используемого антикоагулянта.

Научная новизна исследования.

Впервые проведена комплексная сравнительная оценка различных методов определения производных гемоглобина в клиническом материале современные методами мультикомпонентного анализа в сравнении с классическими спектрофотометрическими методиками. Установлено, что методы мультикомпонентного анализа дают достоверные, точные и близкие между собой результаты при измерении уровней карбокси- и метгемоглобина, превышающих физиологическую норму. Охарактеризована аналитическая интерференция билирубина и триглицеридов в отношении определяемого двухволновыми фотометрическими методами уровня карбоксигемоглобина. Показано, что методы мультикомпонентного анализа в присутствии метиленового синего могут давать заниженные результаты по COHb и MetHb, вследствие чего в такой ситуации целесообразно использование метода Evelyn-Malloy и его модификации. Выявлено, что вид антикоагулянта (ЭДТА-К₃, Li-гепарин) практически не влияет на результат измерения уровня дисгемоглобинов в крови; в то же время, отмечен эффект завышения уровня СОНb (до 4,8 %) в ряде ЭДТА- и гепарин-содержащих пробирок в зависимости от степени их заполнения. Показано, что карбоксигемоглобин, вне зависимости от вида антикоагулянта, достаточно стабилен при длительном хранении крови в различных температурных условиях. Метгемоглобин достаточно стабилен при его физиологической концентрации в крови, но при исходно повышенных уровнях наблюдается существенное снижение концентрации MetHb в ходе хранения как при комнатной температуре (Т_1/2 ~ 4 ч), так и при +4 - +8 ^оС (Т_1/2 ~ 10 ч), что не полностью согласуется с данными, приведенными в ряде справочных руководств.

Теоретическая и практическая значимость исследования.

На основании полученных данных сформулированы рекомендации к ведению преаналитического этапа, выбору методов и аппаратуры для определения уровня карбокси- и метгемоглобина в крови в зависимости от конкретной клинической ситуации. Определены условия взятия, хранения и обработки биоматериала, а также его исследования, позволяющие получить наиболее корректные аналитические результаты.

Показано, что методы МКА позволяют получить достоверные и точные данные при определении уровней дисгемоглобинов, превышающих физиологическую норму.

Методики МКА пригодны для определения COHb и MetHb в иктеричном и липемичном биоматериале, но подвержены значительному интерферирующему влиянию метиленового синего. Использование ЭДТА- или гепарин-содержащих вакуумных систем для сбора крови требует осторожной трактовки результатов определения COHb (при небольших его уровнях) в связи с возможным завышением.

Стабильность COHb позволяет производить отсроченное измерение его уровня. В то же время, концентрация MetHb в биоматериале при остром отравлении метгемоглобинобразователями должна определяться как можно быстрее, а при невозможности быстрого анализа образцы должны храниться при низкой температуре.

Методология и методы исследования.

Методологической основой диссертационной работы явилось последовательное применение общенаучных (теоретико-эмпирических) и специальных методов научного познания. Работа выполнена в дизайне сравнительного экспериментального и клинического исследования с использованием клинико-лабораторных и статистических методов.

Соответствие паспорту специальности: Тема работы, использованные методы и материалы, полученные результаты и их обсуждение, выводы и практические рекомендации соответствуют паспорту специальности 14.03.10 – клиническая лабораторная диагностика (пункты 2, 7, 8).

Положения, выносимые на защиту:

1. Современные методы мультикомпонентного анализа с многоволновым измерением позволяют получить близкие между собой результаты при определении уровня карбокси- и метгемоглобина в крови, но, как и фотометрические методы, не обеспечивают достаточной воспроизводимости результатов (CV >20 %) при низких концентрациях карбокси- и метгемоглобина (< 1 %).

2. Присутствие билирубина и триглицеридов в исследуемом образце крови приводит к завышению определяемого двухволновыми фотометрическими методами уровня карбоксигемоглобина. Вид крови (капиллярная, венозная) и применяемый антикоагулянт не оказывают существенного влияния на определяемый уровень дисгемоглобинов в крови. Применение некоторых вакуумных систем приводит к завышению определяемого уровня карбоксигемоглобина, особенно при частичном (неполном) заполнении пробирок.

3. Карбоксигемоглобин обладает высокой стабильностью при хранении в различных температурных режимах. Исходно повышенный уровень метгемоглобина в крови с течением времени значительно снижается; уровни метгемоглобина в физиологических пределах при хранении биоматериала существенно не изменяются.

Степень достоверности и апробация результатов

Степень достоверности полученных результатов определяется достаточным количеством исследуемого биоматериала (222 пробы), адекватными методами исследования и корректными методами статистической обработки. Основные подборки клинического материала формировались в одинаковых условиях. Пробы пациентов исследовались на анонимной основе (преимущественно из остатков биоматериала после проведенных клинико-лабораторных

исследований); участие добровольцев в исследовании подтверждалось их письменным согласием.

Материалы диссертации были представлены на Всероссийской научно-практической конференции «Национальные дни лабораторной медицины» (Москва, 2014), Всероссийской научно-практической конференции «Достижения и перспективы развития лабораторной службы в России» (Москва, 2015), 80-й и 81-й Всероссийской научной конференции студентов и молодых ученых «Вопросы теоретической и практической медицины» (Уфа, 2015-2016).

Внедрение результатов исследования в практику.

Основные результаты исследования опубликованы в печатных работах, доложены на научных и научно-практических конференциях, внедрены в практику работы химико-токсикологической лаборатории ГБУЗ РБ ГКБ № 21 г. Уфы, используются в учебном процессе кафедры лабораторной диагностики ИДПО ФГБОУ ВО БГМУ Минздрава России.

Публикации результатов исследования. По теме диссертации опубликовано 8 научных работ, из них 5 - в рецензируемых журналах из перечня ВАК Минобрнауки России.

Личный вклад автора. Диссертантом самостоятельно проведен сбор и анализ отечественной и зарубежной литературы по теме диссертации, лично проведены измерения лабораторных показателей, статистическая обработка результатов исследований, написание текста диссертации, подготовка публикаций.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 120 страницах компьютерного текста, содержит 33 таблицы, 35 рисунков и включает введение, обзор литературы, описание материалов и методов исследования, результаты собственных исследований и их обсуждение, заключение, выводы, практические рекомендации и список использованной литературы, включающий 62 отечественных и 68 зарубежных работ.

Основные клинически значимые дисгемоглобины

КАРБОКСИГЕМОГЛОБИН образуется при связывании угарного газа (СО) с атомом Fe2+ в составе гемоглобина. Он неспособен присоединять кислород и участвовать в его транспорте, поскольку соответствующий участок связывания кислорода атомом Fe2+ оказывается занятым.

Угарный газ в организме может иметь как эндогенное, так и экзогенное происхождение.

Эндогенное образование угарного газа. По мере старения эритроцитов они удаляются из циркуляции, а гем, входящий в их состав, разрушается под действием фермента гемоксигеназы. Разрушение гема начинается с окислительного расщепления молекулы порфирина между кольцами A и B, в результате чего формируется зеленый тетрапиррол – биливердин и CO, образующийся при окислении углерода в -метиновом мостике, находящимся между разрываемыми пирроль-ными кольцами при распаде Hb в клетках ретикуло-эндотелиальной системы (рисунок 1.8) [49, 99].

В ходе катаболизма гема эритроцитов (включая разрушение части эритроцитов во время эритропоэза в костном мозге) образуется около 80 % эндогенного угарного газа. Остальная его часть ( 20 %) формируется в результате расщепления миоглобина, цитохромов, металлосодержащих ферментов (каталаза, перокси-даза, триптофанпирролаза, гуанилатциклаза, NO-синтаза и др.), перекисного окисления липидов, а также действия ксенобиотиков и некоторых бактерий [27, 49, 99]. Эндогенная продукция СО возрастает при гемолизе, талассемии [20], а также при состояниях, сопровождающихся развитием гипоксии и явлениями ацидоза, приводящих к ускорению процесса катаболизма геминовых структур. Физиологический уровень эндогенного СОHb в крови составляет, по данным разных авторов, до 4 % [49].

Основными экзогенными источниками угарного газа являются выхлопные газы машин, печи и камины, краски и растворители, содержащие метиленхлорид (его пары быстро абсорбируются легкими, попадают в кровоток и при окислении в печени могут образовать СО) [20, 49, 99], а также курение табака. У жителей городов с сильно загрязненным воздушным бассейном показатель COHb в крови может достигать 8,8 %; у жителей Москвы — до 12 % [45].

Считается, что экзогенный СО поступает в организм только ингаляционно. После прекращения воздействия (вдыхания) до 70 % угарного газа выделяется в течение первого часа, до 96 % — за 4-8 часов. Выведение монооксида углерода осуществляется в основном через дыхательные пути [20, 45], незначительная часть выходит через кожу и ЖКТ, а также с мочой в виде комплексного соединения с железом [20].

Токсическое действие монооксида углерода на организм основано на развитии гипоксического состояния, обусловленного суммарным эффектом гипоксиче-ской гипоксии (в результате понижения парциального давления кислорода во вдыхаемом воздухе); гемической гипоксии (в результате образования COHb); циркуляторной гипоксии (вследствие гемодинамических нарушений); тканевой гипоксии (инактивация ферментов тканевого дыхания) [20].

Скорость образования COНb прямо пропорциональна концентрации СО во вдыхаемом воздухе. Сродство гемоглобина к СО в 200-300 раз больше, чем к О2 [20, 29, 45], хотя присоединение CO к гемоглобину происходит в 10 раз медленнее [20] При связывании угарного газа с одним из четырех атомов железа гемоглобина, увеличивается сродство к кислороду остальных трех участков его связывания гемоглобином, в результате чего кислород труднее отдается тканям [20, 38, 99]. Это явление известно как эффект Халдана: оно проявляется не только в смещении кривой диссоциации кислорода влево, но и в изменении формы КДО с S-образной на гиперболическую (рисунок 1.9) [99].

Рисунок 1.9 - Сдвиг кривой диссоциации оксигемоглобина под влиянием CO и других факторов [20]. Скорость диссоциации COHb зависит исключительно от парциального давления кислорода во вдыхаемом воздухе (эффект «вытеснения») [20]. Период полураспада (T1/2) COHb при нормальном дыхании составляет около 5,3 часа, при вдыхании 100 % кислорода под давлением 1 атм. он сокращается до 1,3 часа, при 3 атм. — до 0,4 часа, а при дополнительном введении диоксида углерода - до 12 минут за счет дополнительной стимуляции дыхательного центра [99].

Нарушения, обусловленные взаимодействием монооксида углерода с железосодержащими веществами в тканях (цитохромоксидазой, цитохромом Р-450, цитохромом C, каталазой, пероксидазой, миоглобином и др.) и образованием медленно диссоциирующих соединений (T1/2 = 48-72 часов), приводят к тканевой гипоксии [20]. В результате воздействия угарного газа на миоглобин происходит образование COMb, причем сродство Mb к угарному газу в 40 раз выше, чем к кислороду, а сердечного Mb — втрое выше по сравнению со скелетным [99]. Поэтому «отсроченные» симптомы отравления угарным газом могут быть обусловлены его постепенным высвобождением из COMb и последующим образованием COHb [38, 99].

Монооксид углерода также вступает в связь с внегемовым железом [45], при этом некоторые фракции плазменного железа обладают большим сродством к CO, чем железо гема [57]. Так, при хроническом отравлении угарным газом, до 25-30 % CO может быть связано с негемоглобиновым железом плазмы.

Особенно чувствительны к гипоксии при воздействии угарного газа ткани с интенсивным энергообменом - нервная и миокардиальная, а также эмбриональные ткани. Образование COMb отрицательно влияет на функциональное состояние миокарда и скелетной мускулатуры [20]; так, для острых отравлений угарным газом были характерны сверхвысокие концентрации КФК-МB в крови пациентов [8].

В последние годы немалая роль в механизме токсического действия угарного газа отводится связанному с гипоксией развитию оксидативного стресса с образованием свободнорадикальных форм кислорода [20], при этом интенсивность свободно-радикального окисления коррелирует с тяжестью острого отравления угарным газом [59]. В условиях гипоксии ускоряется распад гликогена, нарушается утилизация глюкозы с увеличением уровня лактата, страдают другие виды метаболизма (что связано с энергодефицитом) [20]. Наиболее тяжело переносят отравление угарным газом лица с анемиями, гематологическими расстройствами и с хроническими сердечно-легочными заболеваниями, особенно в пожилом возрасте, а также курящие [38, 99].

Угарный газ легко диффундирует через плаценту и может связываться с фе-тальным гемоглобином плода, который обладает большим сродством к CO, чем гемоглобин взрослого [38]. Уровень образующегося COHb может быть на 10-15 % выше, чем у матери [99]. Эта разница обусловлена более медленной скоростью диссоциации COHb у плода - в 5 раз медленнее, чем в организме матери [114]. Острое отравление, относительно благополучно протекающее у матери, может привести к внутриутробной гибели плода вследствие аноксической энцефалопатии, в том числе «отсроченной». В начальные сроки беременности гипоксия плода может вести к выкидышу или порокам развития; в поздние сроки возможны преждевременные роды или рождение живого ребенка с выраженной энцефалопатией. Эти изменения зафиксированы при уровне COHb у плода свыше 15 % [20].

Клинические проявления острого отравления угарным газом у человека варьируют от головокружения, головной боли, тошноты и рвоты при отравлении легкой степени до судорог, потери сознания, комы и смерти в тяжелых случаях, и зависят от времени воздействия, содержания угарного газа во вдыхаемом воздухе (а также скорости нарастания концентрации) и интенсивностью физической активности [20, 57, 86]. При тяжёлой физической работе лёгочная вентиляция резко увеличивается (до 30 л/мин по сравнению с 6-9 л/мин в покое), соответственно, возрастает и поглощение (рисунок 1.10) [45]. Легким считается отравление, при котором содержание COHb в крови не превышает 20 %; среднетяжелым — до 50 %; тяжелым — до 60-70 %. При содержании COHb больше 70 % наступает быстрая смерть [20].

Клиника хронического отравления CO развивается при длительном действии малых (меньше 0,1 мг/л) концентраций СО, не снижающих содержания О2 в крови [20]. При этом со стороны сердечно-сосудистой системы наблюдаются более тяжелые нарушения, чем при остром отравлении, причем они могут выявляться спустя 1-1,5 года после прекращения контакта с СО. Гипоксия, ассоциированная с хронической интоксикацией CO, может сопровождаться развитием психоневрологических расстройств и нарушениями функций других систем организма. Уровень COHb при хроническом отравлении монооксидом углерода может достигать 3-13 % [20]. При этом повышенный уровень карбоксигемоглобина может иметь место как при отсутствии клинической картины интоксикации CO, так и при явно выраженной патологии. С другой стороны, выраженная клиническая картина хронической интоксикации CO может сопровождаться нормальным либо повышенным содержанием карбоксигемоглобина [49]. Таким образом, для постановки диагноза хронического отравления угарным газом определение лишь только уровня COHb в крови не является достаточным.

Оценка аналитических характеристик спектрофотометрических методов и МКА (точность, прецизионность) при определении уровня карбокси- и метгемоглобина в крови

Образцы крови с уровнями гемоглобина и его производных соответственно таблицам 2.1 и 2.2 из раздела «Материалы и методы» многократно измерялись различными методами: МКА на анализаторе ABL 825 FLEX и ПолиГем, фотометрическим методом Кушаковского в модификации Zijlstra et al. [32, 130], методом Evelyn-Malloy [81], а также модифицированным методом Evelyn-Malloy по М.С. Кушаковскому [32]. В качестве аттестованного контрольного материала использовался Multi 4 CO-Oximeter Control фирмы Instrumentation Laboratory, США (низкий, нормальный и высокий уровни).

При сравнительном анализе за опорные значения принимались данные МКА на ABL 825, так как входящие в анализаторы этого производителя (RADIOMETER) ко-оксиметрические блоки являются признанными мировой научной общественностью приборами для измерения уровня дисгемоглобинов в крови и часто применяются в описанных в литературе научно-исследовательских работах [66, 67, 97]. С другой стороны в руководстве по эксплуатации анализаторов ABL содержатся сведения об использовании метода Evelyn-Malloy в качестве первичного референтного по отношению к методу МКА для данного типа анализаторов [63], и данный метод широко применяется в научных исследованиях [91, 92, 93, 104].

При сравнительной оценке методов определения дисгемоглобинов различия считались «клинически значимыми», если они могли оказать существенное влияние на оценку тяжести состояния пациента.

Результаты оценки точности измерений уровня карбоксигемоглобина с использованием аттестованного контрольного материала приведены в таблице 3.1.1.

Точность методов определялась по соответствию результатов измерения контрольного материала допустимым пределам аттестованных значений COHb по разным уровням. Из представленных в таблице 3.1.1 данных следует, что результаты измерения уровня COHb в контрольном материале методом МКА укладывались в допустимые интервалы по всем уровням, за исключением данных фотометрического метода при измерении контрольного материала уровня 1 и 2. Двух-волновой фотометрический метод показал существенное завышение уровня ана-лита в контрольном материале с низкой концентрацией COHb (уровень 2) - среднее значение измерений превысило верхний аттестованный предел на 3,2 %, а при измерении контрольного материала с высокой концентрацией COHb (уровень 1) среднее значение измерений было ниже нижней границы допустимого интервала на 4,2 %.

Данные измерений уровня COHb в пробах крови (как клинических, так и моделированных – с разными уровнями аналитов) различными методами / приборами приведены в таблице 3.1.2.

Как видно из таблицы, результаты измерений разными методами и на разных приборах имели отличия, которые, в основном, не оказывают существенного влияния на оценку (для методов МКА). Подробная характеристика различий и возможных причин их появления требовала сравнительной оценки аналитических характеристик методов, в том числе относительного аналитического смещения (по сравнению с опорными значениями) и прецизионности (вариации результатов), данные по которым приводятся ниже.

Полученные в ряде случаев отрицательные значения уровня COHb и MetHb (таблицы 3.1.1, 3.1.4) связаны с особенностями расчетов по спектральной матрице поглощения света (методическая ошибка). Указанный эффект наблюдался при измерениях на всех приборах, в том числе использующих принцип МКА, причем один из них (ABL 825 FLEX) использовался в настоящем исследовании в качестве опорного (контрольного).

В таблице 3.1.3 приведены средние значения аналитического смещения результатов измерения COHb разными методами по отношению к значениям, полученным методами, принятыми за опорные (МКА на ABL 825 и на ПолиГем).

Не учитывались «нулевые» уровни дисгемоглобинов ( 5 %), концентрация которых не может быть уверенно измерена в связи с особенностями используемой в большинстве анализаторов спектрально-фотометрической методики (небольшой абсолютный разброс данных, но значимый относительный разброс). Такие уровни COHb наблюдаются у здоровых некурящих лиц, не подвергающихся воздействию угарного газа, и клинического значения не имеют.

Как следует из приведенных данных, смещение результатов двухволновой фотометрии (СФ 534/562) относительно ABL 825 сильно зависит от концентрации карбоксигемоглобина и достигает наибольших значений при низких его уровнях (COHb = 5-15 %). При этом абсолютные значения смещения составляют от -8,3 до +13,1 %, но расчетное относительное смещение оказывается большим (вплоть до 76,8 %). Поэтому двухволновую фотометрию нежелательно использовать для определения COHb при его низких уровнях. При более высокой концентрации COHb (15-45 %) как абсолютное, так и относительное смещение результатов оказывается намного меньшим, а при уровне COHb выше 45 % оно меняет знак (завышение сменяется занижением).

Результаты МКА на анализаторе ПолиГем отличаются от опорных в значительно меньшей степени, показывая относительное завышение от 1,1 % (верхний диапазон концентраций COHb) до 9,1 % (нижний диапазон), что, вероятно, связано с различием расчетных матриц в приборах и клинически малозначимо. С учетом результатов измерения аттестованного контрольного материала, можно констатировать, что обнаруженное несоответствие между результатами двухволново-го фотометрического метода и МКА обусловлено недостаточной корректностью именно фотометрического метода, тогда как методы МКА можно считать достаточно точными и корректными при исследовании уровня карбоксигемоглобина в оцениваемых диапазонах.

На рисунке 3.1.1 приведены результаты измерений карбоксигемоглобина методом МКА, реализованном в анализаторе ПолиГем, а также фотометрическим методом (СФ 534/562) в сравнении с показаниями МКА на анализаторе ABL 825.

На рисунке 3.1.2 показана разность результатов измерений карбоксигемо-глобина на анализаторе ПолиГем и двухволновым фотометрическим методом (СФ 534/562) с результатами, полученными опорным методом МКА (ABL 825).

Как свидетельствуют данные таблицы 3.1.2 и рисунков 3.1.1, 3.1.2, «клинически значимых» (влияющих на оценку состояния пациента) различий между уровнями COHb в материале с различными концентрациями общего Hb, COHb, MetHb и в различных их сочетаниях, измеренными исследуемыми методами МКА, не выявлено (d 3,3 %). В то же время, двухволновый фотометрический метод показал определенное завышение результатов по сравнению с методами МКА: при исследовании материала с концентрацией COHb 20 % абсолютная разница по сравнению с МКА на ABL 825 достигала 13,1 %, в материале с уровнем COHb 20-40 % – 6,4 %, а в области высоких значений аналита (COHb 50 %) отмечено противоположное явление - занижение достигало 8,3 %. Это может быть обусловлено как неабсолютным соответствием расчетных формул, связывающих коэффициенты молярной экстинкции присутствующих в гемолизате соединений (дезоксигемоглобин и карбоксигемоглобин) при различных длинах волн, так и относительной погрешностью калибровки используемого аналитического оборудования (спектрофотометра), а также значительной долей мануальных процедур в ходе проведения анализа.

Аналитическая вариация результатов определения COHb (таблица 3.1.4) была ожидаемо ниже на анализаторе ABL 825, считающемся «референтным» и оснащенном проточной измерительной системой.

Коэффициент вариации на приборе ПолиГем, использующем тот же принцип МКА, но не имеющем проточной системы (кюветы устанавливаются вручную), зависел от уровня COHb, но не превышал 4,92 % даже при низком уровне COHb, когда абсолютный разброс составляет доли процента и не имеет никакого клинического значения. Вариация в фотометрическом методе оказалась более высокой (особенно в «средних» диапазонах концентрации COHb), что можно связать с ручным дозированием, необходимостью центрифугирования и постоянного изменения длины волны на спектрофотометре. Тем не менее, CV не превышал 4,83 %, что можно считать вполне приемлемым в клинической практике.

Данные измерения метгемоглобина в аттестованном контрольном материале и образцах крови с разными уровнями аналитов приведены в таблицах 3.1.5 – 3.1.8 и на рисунках 3.1.3 – 3.1.6.

Точность методов определялась по соответствию результатов измерения контрольного материала допустимым пределам аттестованных значений MetHb по разным уровням. Как следует из данных в таблице 3.1.5, результаты измерения уровня MetHb всеми исследуемыми методами укладывались в референтные пределы. В то же время, низкий уровень метгемоглобина в контрольном материале не позволяет судить о точности исследуемых методов при уровне MetHb, превышающем физиологическую норму. С этой целью было возможно применение аттестованного материала с более высоким уровнем MetHb (10-20-30-40 %), но такой материал малодоступен, а при кустарном изготовлении - недостаточно точен и стабилен в связи с возможным наличием метгемоглобинредуцирующих компонентов. Поэтому в работе за опорные принимались данные измерения метгемо-глобина как методом Evelyn-Malloy, так и методом МКА на ABL 825, поскольку мануальные процедуры в последнем случае сведены к минимуму и, тем самым, обеспечивается минимальный разброс показаний.

Исследование влияния антикоагулянтов и вида крови на определяемый уровень карбокси- и метгемоглобина. Оценка стабильности дисгемоглобинов в зависимости от условий хранения и используемого антикоагулянта

При проведении лабораторного исследования большая часть ошибок приходится на преаналитический этап. Одними из наиболее значимых факторов этого этапа являются стабильность аналита и допустимые к применению типы антикоагулянта. Если по стабильности карбоксигемоглобина в литературе имеется достаточно много сведений, по большей части относящихся к судебно-медицинской экспертизе и, как правило, свидетельствующих о весьма высокой стабильности COHb [98, 115, 128], то для метгемоглобина подобных исследований значительно меньше и, при этом, данные весьма противоречивы [2, 77, 78, 106]. В ГОСТ Р 53079.4-2008 по правилам ведения преаналитического этапа лабораторных исследований данные по влиянию антикоагулянтов, типа биоматериала, а также по стабильности показателей карбокси- и метгемоглобина в крови отсутствуют. В связи с вышеуказанным, мы посчитали необходимым провести сравнительные измерения уровня дисгемоглобинов в образцах крови с различными уровнями аналитов в разных типах биоматериала (капиллярная и венозная кровь) с использованием различных антикоагулянтов (ЭДТА-К3, ЭДТА-К2, литий-гепарин) в вакуумных пробирках от производителей, чья продукция получила достаточно широкое распространение в отечественных лабораториях, а также оценить влияние условий хранения биоматериала на стабильность уровня карбокси- и метгемоглобина.

Влияние антикоагулянтов и вида крови (венозная / капиллярная) на определяемый уровень дисгемоглобинов в крови. Исследовались свежеполученные образцы венозной и капиллярной крови 15 здоровых добровольцев (как курящих, так и некурящих). Измерения на приборе ПолиГем проводились как ex tempore в первичном материале без антикоагулянта, так и в гепаринизированных и ЭДТА-содержащих образцах. Для предотвращения возможного влияния вакуума на уровень COHb вследствие «эвакуации» CO из пробы, венозная кровь забиралась одноразовым шприцом с последующим быстрым переносом (после снятия иглы) в вакуумную пробирку с открытой крышкой и последующим тщательным перемешиванием. Капиллярная кровь бралась в пластиковые микропробирки с соответствующими добавками. Данные измерений приведены в таблице 3.3.1.

Как следует из полученных результатов, измеренная концентрация COHb в пробах венозной и капиллярной крови, а также в пробах без антикоагулянта, в ге-паринизированных и в ЭДТА-содержащих образцах практически не различалась (r 0,99). Измеренная концентрация MetHb различалась мало; коэффициент корреляции варьировал от 0,88 до 0,97 (сильная прямая связь). Таким образом, тип антикоагулянта или его отсутствие, а также вид исследуемой крови практически не влияют на результаты измерений COHb и MetHb при уровнях, соответствующих нормальным (у здоровых людей).

Исследование стабильности дисгемоглобинов в моделированных по уровню COHb образцах венозной крови. От 7 здоровых добровольцев было получено по 20 мл крови, которая была перенесена в пробирки, содержащие ЭДТА-К3 или литий-гепарин (для стабилизации материала одного добровольца использовался лишь один вид антикоагулянта). Полученные пробы с антикоагулянтами в дальнейшем насыщались угарным газом в различной степени (в соответствии с методикой, описанной в разделе «Материалы и методы»). Каждый из подготовленных образцов после тщательного перемешивания аликвотировался по 13 пробиркам типа Эппендорф, которые подвергались анализу через 20 мин, 1, 3, 12, 24, 48 и 72 часа после приготовления. Кроме того, выделялись серии образцов, хранившихся в разных температурных условиях (при комнатной температуре и при +2-8 С). Данные, полученные при анализе проб, приведены в таблице 3.3.2 и рисунках 3.3.1-5.7.

Согласно данным, приведенным в таблице 3.3.2 и рисунках 3.3.1- 3.3.9, максимальная разница между измеренными уровнями карбоксигемоглобина в образцах крови с различным временем хранения составила 0,6 %, а для метгемоглобина - 0,13 %, что клинически незначимо. Таким образом, карбоксигемоглобин, даже при его высоком уровне в образце, является достаточно стабильным при хранении биоматериала как при комнатной температуре, так и в холодильнике; в обоих случаях литий-гепарин был предпочтительным антикоагулянтом. Аналогичное заключение можно сделать и по метгемоглобину (при его физиологическом уровне в крови): наилучшую стабильность при хранении при 2-8 С показали образцы с литий-гепарином, при комнатной температуре – образцы с ЭДТА.

Исследование стабильности дисгемоглобинов и влияния антикоагулянтов на результаты исследований в образцах крови здоровых добровольцев (курящих и некурящих). Свежеполученные 54-56 мл крови от каждого из 7 добровольцев были разделены по 14 пробиркам (объем 4 мл) с ЭДТА-К3 и литий-гепарином. До исследования образцы помещались в холодильник при +2-8 С. Измерения проводились через 30 мин, 1, 4, 12, 24, 48 и 72 ч от момента взятия материала. Результаты измерений отражены в таблице 3.3.3 и рисунках 3.3.8 - 3.3.14.

Как следует из данных таблицы 3.3.3 и рисунков 3.3.10 - 3.3.16, «клинически значимых» различий между измеренной концентрацией дисгемоглобинов в пробах с «физиологическим» уровнем MetHb, хранившихся различное время при +2-8 С, выявлено не было. Вместе с тем, в материале, стабилизированном ЭДТА-К3, определялся более высокий уровень карбоксигемоглобина по сравнению с ге-паринизированной кровью, причем в образцах № 6 и № 7, хранившихся 48 и 72 ч, измеренная концентрация COHb была еще выше. Явным отличием этих двух проб от остальных образцов было меньшее заполнение вакуумной пробирки (25-40 % от требуемого объема вследствие нехватки биоматериала). Таким образом, можно сделать предположение, что на результаты измерений уровня COHb, кроме типа антикоагулянта, влияет степень заполнения вакуумной пробирки. Для более детального изучения этого эффекта были проведены специальные исследования, результаты которых приведены ниже (глава 3.4).

Исследование стабильности дисгемоглобинов в моделированных образцах венозной крови с повышенным уровнем MetHb. У здорового курящего добровольца было взято 16 мл крови в 4 вакуумных пробирки объемом 4 мл (по две пробирки с ЭДТА-К3 и с литий-гепарином). В каждом из полученных образцов был измерен базовый уровень дисгемоглобинов, причем взятие биоматериала осуществлялось без нарушения герметичности системы - путем отбора инсулиновым шприцом 30-40 мкл крови. Затем во все четыре пробы вносилось по 10 мкл 4 % нитрита натрия с последующим тщательным перемешиванием. Спустя 60 мин экспозиции производилось измерение уровня дисгемоглобинов, после чего одна пара пробирок помещалась в холодильник при температуре 2-8 C, а вторая пара хранилась при комнатной температуре (18-25 оС). Последующие измерения производились через 3, 5, 7, 9, 11, 13, 19, 21, 24 час после взятия крови. Полученные данные приведены в таблице 3.3.4 и на рисунке 3.3.17.

Как видно из данных, приведенных в таблице 3.3.4, исходный уровень кар-боксигемоглобина в пробирках с ЭДТА несколько превышал показатели в литий-гепариновых системах (что подтверждает ранее приведенные данные), но оставался весьма стабильным на протяжении всего срока хранения, независимо от температурных условий и антикоагулянта.

В то же время, полученные результаты свидетельствуют о низкой стабильности метгемоглобина. Его уровень в исходных образцах крови был «физиологическим» (практически нулевым), после внесения нитрита натрия и 60-минутной инкубации достигал 18,7 - 19,0 %, и далее в ходе хранения прогрессивно снижался в результате работы метгемоглобинредуктазных систем крови, причем скорость изменения концентрации сильно зависела от температуры: уровень MetHb при 2-8 С снижался значительно медленнее по сравнению с комнатной температурой. Оценочное время полураспада метгемоглобина в крови (Т1/2) при 18-25 оС составило около 4 час, при 2-8 C – около 10 час.

Тип антикоагулянта (литий-гепарин или ЭДТА) не оказывает влияния на стабильность карбоксигемоглобина, но скорость восстановления MetHb в образцах крови с литий-гепарином несколько ниже, чем в материале, стабилизированном ЭДТА-К3.

Клинический пример 2. Больной И., 55 лет, поступил в приемное отделение ЦРБ пос. Давлеканово с жалобами на внезапно развившуюся слабость и головную боль. Из анамнеза: заболел после употребления в пищу приобретенной на рынке «квашеной капусты», подозревает отравление. Аналогичные симптомы наблюдались у его знакомого П., 46 лет, который ел ту же капусту. При осмотре отмечена бледность, одышка, цианоз слизистых. Заподозрено отравление метгемо-глобинобразователями (возможно, нитратами/нитритами, использованными для засолки капусты вместо поваренной соли). При взятии крови на анализ было отмечено, что она имеет темный цвет с шоколадным оттенком. Из-за отсутствия в больнице оборудования, позволяющего провести измерение уровня метгемогло-бина, взятая у пациента проба венозной крови в вакуумной пробирке с ЭДТА была отправлена для исследования в экспресс-лабораторию ГБУЗ РБ ГКБ № 21 г. Уфы. Проба транспортировалась при температуре окружающего воздуха +18-22 оС в течение 2,5 час. При поступлении материала в экспресс-лабораторию шоколадного оттенка не отмечено. Исследование уровня метгемоглобина проводилось спектро-фотометрическим методом Evelyn-Malloy на приборе Unico 2605; результат измерения – 7,4 %, что подтверждает факт отравления метгемоглобинобразователями легкой степени. С учетом приведенных в литературе данных об отсутствии клинических изменений состояния пациентов при уровне метгемоглобина до 10 %, а также выраженности цианоза у пациента И. на момент поступления в больницу, можно предположить, что за время транспортировки произошло восстановление части метгемоглобина, что сделало невозможным определение степени тяжести отравления по уровню этого аналита. Следовало определить уровень метгемогло-бина в более ранние сроки, либо транспортировать кровь в охлажденном виде.

Влияние типа и степени заполнения вакуумных систем на определяемый уровень карбокси- и метгемоглобина в крови

В предыдущем разделе работы отмечалось завышение определяемого уровня карбоксигемоглобина в биоматериале, взятом в ЭДТА-содержащие вакуумные пробирки (по сравнению с литий-гепариновыми), причем эффект был более выраженным при недостаточном заполнении пробирки. Вопреки имеющимся правилам взятия крови (ГОСТ Р 53079.4-2008), в реальной практической работе как клинико-диагностических, так и судебно-медицинских лабораторий встречаются ситуации, когда, несмотря на все усилия персонала, не удается набрать требуемое количество крови для полного заполнения вакуумной пробирки, а анализ очень важен и должен быть обязательно выполнен. Согласно литературным сведениям [74, 121], проявление отмеченного выше эффекта может быть связано с выделением CO из материала крышек пробирок, и отмечается лишь в вакуумных пробирках с ЭДТА. Нами не было обнаружено работ, в которых изучалось влияние степени заполнения пробирки на определяемый уровень карбоксигемоглобина в крови. С связи с тем, что в настоящее время в медицинских лабораториях применяются вакуумные пробирки разных производителей, технологические процессы производства которых могут несколько отличаться, представлялось важным оценить влияние объема пробирки и степени ее заполнения на определяемый уровень карбокси- и метгемоглобина в различных вакуумных системах.

На первом этапе у здоровых курящих добровольцев было взято по 10 мл крови, которая впоследствии переносилась в 5-6 одинаковых пробирок, причем степень заполнения их кровью была разной (на стенки предварительно наносились специальные метки). Пробы выдерживались при комнатной температуре в течение 30 мин, затем уровень COHb в них измерялся методом МКА на анализаторе ПолиГем.

Как свидетельствуют данные в таблицах 3.4.1 - 3.4.4, наблюдалась четкая зависимость между степенью заполнения пробирок с ЭДТА-К3 и измеренным уровнем карбоксигемоглобина, выраженная в различной степени в продукции разных производителей (сильная обратная корреляция; r от -0,71 до -0,93). На наш взгляд, возможны две основных причины этого эффекта: интерферирующее влияние самого антикоагулянта, либо присутствие некоторого количества монооксида углерода, который может выделяться материалом крышки пробирки, пластиком, смазкой / сурфактантом и др. Интересно, что в пробирках Hongyu с ЭДТА-К2 (табл. 3.4.5) этот эффект проявлялся в гораздо меньшей степени. В то же время, уровень MetHb изменялся очень мало (абсолютные изменения - в пределах 0,1-0,2 %) и практически не зависел от степени заполнения пробирки.

С целью выявления преобладающей причины завышения уровня COHb было проведено его измерение в крови, взятой у курящего добровольца (10 мл) и распределенной в разной степени в 4 пробирки Univac с ЭДТА-К3. При этом за 1 ч до исследования с первых трех пробирок были сняты крышки для девакууми-зации и удаления потенциально присутствующего CO (таблица 3.4.6).

Исходя из полученных результатов, можно сделать предположение об отсутствии интерферирующего влияния самого антикоагулянта ЭДТА-К3 на определяемый уровень COHb в крови. Следовательно, причиной завышения уровня карбоксигемоглобина является угарный газ, содержащийся в вакуумных пробирках. Поскольку отмеченный эффект был в разной степени выражен в пробирках с различной степенью заполнения, представляло интерес исследование уровня COHb в пробирках одного производителя, но имеющих разный объем. Были проведены измерения уровня дисгемоглобинов в крови курящего добровольца, взятой в ЭДТА-К3 вакуумные пробирки Univac одинакового размера, но рассчитанные на разный объем крови (2 и 4 мл) (таблица 3.4.7).

Отмечается явное различие определяемых уровней карбоксигемоглобина, достигающее 1,4 % в одном и том же образце крови, взятом в вакуумные пробирки разного объема. Размеры пробирок, материал крышек и пластика были одинаковыми, и различались они лишь степенью вакуума и количеством антикоагулянта. Следовательно, в пустой вакуумной пробирке накапливается определенное количество CO, который впоследствии растворяется во взятой крови, увеличивая определяемые показатели карбоксигемоглобина. Объем CO поддается расчету, если знать концентрацию гемоглобина в крови и его газосвязывающую способность (раздел 3 обзора литературы). Можно предположить, что при сниженном уровне гемоглобина в крови (анемии) указанный эффект будет еще более выражен. Для его минимизации нужно использовать вакуумные пробирки, рассчитанные на полное заполнение кровью.

Уровень метгемоглобина в наших экспериментах практически не зависел от объема пробирок и степени их заполнения кровью (по крайней мере, для физиологических значений MetHb).

Влияние степени заполнения пробирок, содержащих литий-гепарин, на определяемый уровень COHb. Результаты измерения уровня COHb и MetHb в пробирках разных производителей с различной степенью заполнения отражены в таблицах 3.4.8 и 3.4.9.

В литий-гепариновых пробирках Hongyu Medical отмеченного эффекта не наблюдалось. Можно предположить, что выделение CO зависит не столько от антикоагулянта, сколько от материала пробирки, крышки и используемого сурфак-танта. Возможно, эффект проявляется по-разному в разных партиях пробирок (с учетом данных таблиц 3.4.3, 3.4.5, 3.4.9), в связи с чем рекомендуется предварительная оценка степени завышения COHb для каждой конкретной партии пробирок с ЭДТА-К3 и литий-гепарином, особенно при выполнении научных исследований, требующих точных результатов.

На уровень метгемоглобина (в пределах физиологических значений) степень заполнения кровью литий-гепариновых пробирок практически не оказывала влияния (d = 0,1-0,2 %).