Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. Современные представления об антигенной структуре вируса гепатита с, иммунном ответе и иммунологической диагностике при вирусном гепатите С (обзор данных литературы) 12
1.1. Особенности антигенной структуры вируса гепатита С 12
1.2. Особенности формирования иммунного ответа при вирусном гепатите С 15
1.3. Иммунологическая диагностика вирусного гепатита С 16
ГЛАВА II. Клиническая характеристика больных, методы исследования 33
2.1. Объём исследований и клинико-эпидемиологическая характеристика обследованных пациентов 33
2.2. Методы исследования 39
2.3. Методика, использованная в эксперименте 44
2.4. Методы статистического анализа 46
ГЛАВА III. Динамика титров антител к белкам вируса гепатита с у лиц с острым гепатитом С 48
3.1. Серологические маркёры острого гепатита С в период разгара болезни 49
3.2. Серологические маркёры острого гепатита С в период ремиссии заболевания 51
3.3. Динамика титров серологических маркёров острого гепатита С 53
ГЛАВА IV. Выявление титров антител к белкам вируса гепатита с у лиц с хроническим гепатитом с различной степени активности 56
4.1. Серологические маркёры хронического гепатита С (минимальная активность процесса) 57
4.2. Серологические маркёры хронического гепатита С (слабовыраженная активность процесса) 59
4.3. Серологические маркёры хронического гепатита С (умеренная активность процесса) 61
4.4. Сравнительная характеристика титров серологических маркёров хронического гепатита С в зависимости от степени активности заболевания 63
4.5. Сравнительная характеристика титров серологических маркёров у пациентов с минимальной активностью хронического гепатита С и лиц с острым гепатитом С в период ремиссии заболевания 67
ГЛАВА V. Характеристика титров антител к белкам вируса гепатита с у пациентов с отдельными клиническими формами хронического гепатита С 70
5.1. Количественная оценка серологических маркёров у лиц с хроническим микст-гепатитом «C+В» (умеренная активность процесса) 71
5.2. Сравнительная характеристика титров серологических маркёров хронического гепатита С и хроническим микст-гепатитом «C+В» (умеренная степень активности заболевания) 73
5.3. Количественная оценка серологических маркёров у лиц с вирусоносительством 75
5.4. Сравнительная характеристика титров серологических маркёров хронического гепатита С (минимальная степень активности заболевания) и вирусоносительства 77
5.5. Серологические маркёры хронического гепатита С с исходом в цирроз печени 80
5.6. Сравнительная характеристика серологических маркёров при хроническом гепатите С умеренной степени активности и циррозе печени в исходе хронического гепатита С. 82
ГЛАВА VI. Сопоставление титров антител к белкам вируса гепатита с и вирусной нагрузки у пациентов с различными клиническими формами вирусного гепатита с 85
6.1. Характеристика вирусной нагрузки у лиц с острым гепатитом C в периоды разгара и ремиссии заболевания 86
6.2. Сравнительная характеристика вирусной нагрузки и титров специфических антител класса G у лиц с острым гепатитом C в периоды разгара и ремиссии заболевания 88
6.3. Вирусная нагрузка у лиц с хроническим гепатитом C (различная активность процесса) 93
6.4. Сравнительная характеристика вирусной нагрузки и титров специфических антител класса G у лиц с хроническим гепатитом C (различная активность процесса) 95
Заключение 99
Выводы 118
Практические рекомендации 119
Список литературы
- Особенности формирования иммунного ответа при вирусном гепатите С
- Методика, использованная в эксперименте
- Серологические маркёры острого гепатита С в период ремиссии заболевания
- Сравнительная характеристика титров серологических маркёров хронического гепатита С в зависимости от степени активности заболевания
Введение к работе
Актуальность проблемы
Вирусный гепатит С – повсеместно распространённая вирусная инфекция с парентеральным путем передачи, характеризующаяся склонностью к хрони-зации и частыми неблагоприятными исходами, такими, как цирроз печени и ге-патоцеллюлярная карцинома (Alter, 2012; El-Serag, 2012). Констатация этой инфекции базируется на выявлении в сыворотке крови маркёров возбудителя (Михайлов, 2011). При этом, одним из основных направлений иммунодиагностики гепатита С является определение специфических антител. Тем не менее, многие аспекты лабораторной диагностики вирусного гепатита С остаются недостаточно изученными. Так, используемый для серодиагностики метод имму-ноферментного анализа (ИФА) является качественным, количественная серодиагностика вирусного гепатита С, по существу, не разработана (Лучшев и др., 2012, Круглов и др., 2013). Количественные варианты созданы лишь для непосредственного выявления РНК вируса и определения антител к нему методом иммуноблоттинга (Масалова и др., 2010). Однако эти методы являются технически сложными и достаточно дорогостоящими, что ограничивает их широкое практическое использование (Чуланов, 2003). Поиск доступных и относительно экономичных методик определения титров специфических антител в сыворотке крови больных является актуальным. Их использование, наряду с другими методиками, позволит не только более эффективно и объективно осуществлять диагностику вирусного гепатита С, прогнозировать его исходы, но и контролировать адекватность проводимой терапии. Следовательно, разработка методов количественной серодиагностики гепатита С представляется актуальной для практического здравоохранения.
Цель исследования
Изучить особенности иммунного ответа у больных различными клиническими формами вирусного гепатита С на основе исследования титров специфических иммуноглобулинов класса G к основным белкам вируса.
Задачи исследования
-
Разработать доступный в методическом отношении и эффективный вариант метода иммуноферментного анализа для определения титра специфических иммуноглобулинов класса G к вирусу гепатита С.
-
С помощью разработанной модификации метода иммуноферментного анализа исследовать количество и динамику основных серологических маркеров при различных клинических формах вирусного гепатита С.
-
Оценить прогностическую и диагностическую значимость выявляемых титров специфических иммуноглобулинов к структурным и неструктурным белкам вируса гепатита С при различных клинических вариантах заболевания.
-
Сопоставить репликативную активность вируса в сыворотке крови больных с динамикой титров специфических антител к ряду белков вируса гепатита С при различных формах заболевания.
Научная новизна
Разработан модифицированный вариант методики ИФА для определения уровня специфических иммуноглобулинов класса G у больных различными клиническими формами гепатита С. С помощью разработанного количественного варианта метода иммуноферментного анализа впервые изучена динамика иммунного ответа у больных острым гепатитом С. Показано нарастание титра антител к основным белкам вируса в ходе заболевания. Впервые с помощью ИФА дана характеристика особенностей гуморального иммунного ответа при различных клинических формах хронического гепатита С. Выяснено, что изученные формы заболевания характеризуются своеобразной картиной титров специфических иммуноглобулинов G к основным белкам вируса. Показана высокая диагностическая значимость предложенного варианта ИФА. При этом между уровнем титров специфических антител к вирусу гепатита С в сыворотке крови больных и вирусной нагрузкой, определяемой методом ПЦР, выявлена прямая корреляция. Установлено, что разработанный вариант ИФА может быть с успехом использован не только для диагностики различных клинических форм вирусного гепатита С, но и прогнозирования их исходов.
Теоретическая и практическая значимость
Материалы диссертационной работы расширяют представление об имму-нопатогенезе гепатита С, об особенностях гуморального иммунного ответа при различных клинических формах заболевания, вносят вклад в решение проблемы совершенствования лабораторной диагностики гепатита С.
В практическом плане определение титров антител к белкам вируса на разных стадиях инфекционного процесса позволит повысить эффективность диагностики гепатита С. Выявление закономерностей антителогенеза у пациентов с различными клиническими формами гепатита С, в комплексе с другими методами исследования, даст возможность проводить адекватную оценку клинического течения и степени тяжести гепатита С.
На основании результатов исследования титров антител к белкам вируса гепатита С разработаны дополнительные диагностические критерии. Выявленные закономерности гуморального иммунного ответа позволят детализировать и уточнить критерии иммунологической диагностики различных клинических форм и возможных исходов заболевания.
Положения, выносимые на защиту
-
Динамика иммунного ответа при остром гепатите С характеризуется нарастанием титра специфических иммуноглобулинов класса G к основным белкам вируса в процессе заболевания.
-
В зависимости от активности хронического гепатита С складываются различные по своей выраженности формы специфического гуморального иммунного ответа.
-
Различные клинические варианты хронического гепатита С (носительство вируса, цирроз печени в исходе хронического гепатита С) отличаются характерной картиной титров специфических антител.
-
Между репликацией вируса и титрами специфических антител класса G у пациентов как с острым, так и с хроническим гепатитом С выявлена прямая сильная корреляционная зависимость.
Внедрение результатов исследований в практику
Результаты исследования применяются в практике бактериологической лаборатории и профильного отделения КОГБУЗ «Кировская инфекционная клиническая больница» (КИКБ) при уточнении диагноза у пациентов с вирусным гепатитом С. По разработанной методике подана заявка на патент. Основные положения диссертации включены в лекционный курс для клинических ординаторов, аспирантов и врачей-инфекционистов на кафедре инфекционных болезней ГБОУ ВПО «Кировская государственная медицинская академия» Минздрава России. Результаты диссертации используются в учебном процессе на кафедре микробиологии и вирусологии с курсом клинической лабораторной диагностики, а также инфекционных болезней ГБОУ ВПО «Пермский государственный медицинский университет имени академика Е.А. Вагнера» Минздрава России.
Апробация работы и публикации
Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на юбилейной всероссийской конференции с международным участием, по-свящённой 175-летию со дня рождения С.П. Боткина (Санкт-Петербург, 2007), на 10 и 11 итоговых научно-практических конференциях молодых учёных с международным участием (Киров, 2007 и 2010) и 2 Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Социально-значимые и особо опасные инфекционные заболевания» (Сочи, 2015). По материалам диссертации опубликовано 9 научных работ, из них 3 – в журналах, рекомендованных ВАК РФ для публикаций материалов диссертационных исследований.
Объем и структура работы
Особенности формирования иммунного ответа при вирусном гепатите С
При инфицировании вирусом самый ранний обнаруживаемый в крови маркёр – вирусная РНК [8, 41]. От момента инфицирования до первого выявления РНК вируса проходит от 1-2 до 4-6 недель; а, возможно, и более. Вслед за этим повышается уровень трансаминаз: аланинаминотрансферазы (АЛТ) и аспартатаминотрансферазы (АСТ) [52, 59]. Далее у части больных (до 30-50%) развёртываются клинические симптомы заболевания [72]. Через 1-2 недели после обнаружения РНК вируса может определяться core-Ag [43. 112]. Обычно на 6-8 неделе после инфицирования детектируются специфические иммуноглобулины M. Они определяются не у всех больных (по данным различных авторов, у 53-64%), часто в низких титрах (1:5-1:20) и могут иметь нетипичный интервал обнаружения [98]. Зачастую они выявляются длительно, вместе со специфическими иммуноглобулинами G [2]. Связи между титрами специфических антител класса М и течением заболевания не выявлено [69].
При острой инфекции через 5-10 дней после появления специфических IgМ определяются специфические IgG [3]. Первыми обнаруживаются IgG к белкам core и NS3, причём они могут быть выявлены как изолированно, так и одновременно [16]. Постепенно спектр антител расширяется: на 4-й неделе заболевания у 15% больных обнаруживаются IgG к антигенам core, NS3, NS4, NS5 [19]. К 6-му месяцу острого гепатита С, завершающегося развитием персистентной инфекции, полный спектр специфических IgG определяется у 89-94% больных [47, 85, 21]. При переходе вируса в неактивное состояние эти антитела элиминируются (сначала анти-NS5, затем анти-NS4, далее анти-NS3 и последние – анти-core) [95, 101].
У пациентов с хроническим гепатитом С частота выявления специфических IgМ выше, чем у лиц с острой инфекцией (79±4,6%) [25]. Специфические анти-core-IgG определяются при хроническом гепатите С практически у всех больных, что свидетельствует о высокой иммуногенности этого белка [66, 82, 102]. Между обнаружением анти-core-IgG и наличием РНК вируса выявлена позитивная корреляционная зависимость [34, 67, 126]. Анализ выявления анти-NS3-IgG и анти-NS4-IgG показывает, что они обнаруживаются у 95-97% больных хроническим гепатитом С [70, 131]. Частота выявления анти-NS5-IgG составляет 80-83% [78, 96, 112].
Иммунологическая диагностика вирусного гепатита С С момента идентификации вируса гепатита С прошло немногим более 20 лет. Сравнительно недавнее открытие вируса, недостаточные знания о тонкостях его биологии, а также широчайшее распространение во всём мире определяет пристальный интерес специалистов различных областей медицины к данной проблеме. Нельзя не признать определенных достижений в диагностике и лечении этого заболевания. Однако остаётся ещё много нерешённых вопросов. Продолжают обсуждаться и диагностические методы, позволяющие надежно распознавать данное заболевание, и подходы к его лечению [52, 114]. В частности, весьма остро стоит проблема надежной «количественной серодиагностики гепатита С» [63, 116].
При постановке диагноза «гепатит С» необходимо учитывать следующие важные факторы: данные эпидемиологического анамнеза, показатели активности аминотрансферраз, результаты клинического осмотра пациента; наличие или отсутствие маркеров инфицирования вирусом гепатита С и другими гепатотропными вирусами. Только комплексный учет всех факторов позволяет надежно диагностировать это заболевание [16, 53].
Наиболее важным этапом является иммунодиагностика гепатита С. Решению этой проблемы посвящён значительный сегмент научных работ по изучению вируса. Основа разработки методов лабораторной диагностики гепатита С – знание динамики маркеров инфицирования, а также современные иммунохимические и молекулярно-биологические методы детекции антигенов, антител и нуклеиновых кислот вируса [48, 113, 129]. В настоящее время известен ряд методик иммунодиагностики гепатита С. Определение специфических антител После открытия вируса гепатита С перед исследователями встала задача разработки методов выявления этого вируса для диагностики острой и хронической инфекции. Было установлено, что антигены вируса гепатита С циркулируют в крови в чрезвычайно низких концентрациях [90, 104, 127]. Очевидно, что методический уровень конца 80-х годов 20-го века, применявшийся для детекции вирусных антигенов, был явно недостаточен.
В 1989 году исследователи фирмы «Chiron Corporation» под руководством Q.-L. Choo осуществили клонирование РНК вируса и получили иммунореактивные олигопептиды, взаимодействующие с антителами, циркулирующими в крови больных хроническим гепатитом « ни А, ни В» [48]. Эти олигопептиды стали основой диагностических препаратов для выявления антител к вирусу гепатита С, что определило быстрый прогресс в разработке и промышленном выпуске диагностических тест-систем. Основным методом, применяемым для детекции специфических антител, стал твердофазный ИФА, как метод, наиболее отвечающий требованиям практического здравоохранения, обладающий высокой чувствительностью, специфичностью и доступностью в методическом отношении [56, 85, 100].
Учитывая, что вирус персистирует в крови больных гепатитом С одновременно со специфическими антителами, внимание разработчиков диагностических препаратов концентрировалось на создании тест-систем для детекции специфических антител (анти-HCV), обеспечивающих как наиболее полное выявление носителей вируса, так и максимально ранние сроки диагностики острой инфекции [65]. Многообразие антигенов и антигенных детерминант, кодируемых структурной и неструктурной зоной РНК вируса, определило направление в конструировании диагностических препаратов выбором и аранжировкой олигопептидов, применяемых для их создания. За время, прошедшее со времени открытия вируса гепатита С, созданы диагностические системы следующих поколений (таблица 1):
Методика, использованная в эксперименте
Для проведения иммуноферментных исследований были использованы сертифицированные коммерческие тест-системы производства НПО «Диагностические системы» (г. Нижний Новгород, Россия), а именно: ДС-ИФА-анти-HCV комплект №2, ДС-ИФА-анти-HCV-спектр-GМ комплект №2, ДС-ИФА-анти-HCVс-М, ДС-ИФА-анти-HCV-авидность, ДС-ИФА-HBsAg комплект №1, ИФА-HBsAg-подтверждающий тест, ДС-ИФА-анти-HBс комплект №1, ИФА-анти-HBс-М-скрин, ДС-ИФА-анти-HBsAg, ДС-ИФА-HBеAg, ДС-ИФА-АНТИ-HBе, ИФА-АНТИ-HDV, ДС-ИФА-АНТИ-HAV-М-РЕКОМБ. Все перечисленные тест-системы имеют международные сертификаты соответствия и регистрационные удостоверения на территории Российской Федерации. «Корректность работы» диагностических препаратов верифицируется с помощью внутрилабораторного контроля качества (отраслевые стандартизированные образцы, контрольные панели сывороток, панели мутантных штаммов) и в рамках Федеральной системы внешней оценки качества.
Для объективизации анализа полученных результатов обратные значения титров антител прологарифмированы по основанию 2 (например, log2x для 8 – это 3 и т.п.) с последующим вычислением среднего значения log2x анти-HCV IgG для всех изученных групп больных.
Для непосредственного выполнения иммуноферментных исследований были применены следующие устройства: анализатор иммуноферментный автоматический «DYNEX System модификации DSXM» производства компании «Magellan Biosciences» (США), автоматический микрофотометр-ридер «Microline-220» производства компании «Organon Technica» (Франция) и автоматический микрофотометр-ридер «Expert Plus» производства компании «ASYS» (США). В качестве вспомогательного оборудования использовались: автоматические промывочные устройства (вошеры) «Stat Fax-2000» и «Stat Fax-2600» производства одноимённой компании (США), автоматический вошер «Atlantis» производства компании «ASYS» (США); термошейкер-инкубатор «Shaker ST-3 Sky Line», производства компании «ELMI» (США), центрифуга лабораторная «Multi-centrifuge CM-6M Sky Line», производства компании «ELMI» (США). Также были использованы дозаторы лабораторные автоматические одно- и многоканальные «Biochit», производства США и «Lenpipet-Digital» (Россия).
В качестве молекулярно-генетического метода исследования проводили количественный вариант ПЦР с флуоресцентной детекцией HCV-РНК в режиме реального времени. Эти исследования были выполнены в лаборатории клинической иммунологии ОГУЗ «Кировский областной СПИД-центр» (главный врач к.м.н. Н.Л. Широнина, заведующая лабораторией врач-бактериолог высшей категории Г.М. Зянчурина), а также – на базе отдела ПЦР-исследований бактериологической лаборатории КОГБУЗ КИКБ (отдел был открыт в ноябре 2011 года).
Для проведения ПЦР использовали коммерческую тест-систему производства ООО «Вектор-Бест» (г. Новосибирск, РФ) «Реал-Бест-РНК-HCV-количественный». Для подготовки проб и выделения НК применяли набор реагентов «Реал-Бест-экстракция-100» того же производителя. Эти тест-системы имеют международные сертификаты соответствия и регистрационные удостоверения на территории РФ. «Корректность работы» диагностических наборов верифицируется с помощью внутрилабораторного контроля качества (калибровочные панели, контрольные панели сывороток) и в рамках Федеральной системы внешней оценки качества [5].
Непосредственно в проведении ПЦР использовались детектирующие амплификаторы «iCycler iQ5» и «C1000+CFX96» производства компании «Bio-Rad», США. Для пробоподготовки применяли вспомогательное оборудование: термошейкеры-инкубаторы «Termo Shaker TS-100» с блоком SC20N, производства компании «BioSan» (Латвия) и «Гном», производства компании «ДНК-Технологии» (Россия), центрифуга лабораторная «Multi-centrifuge CM-6M SkyLine», производства компании «ELMI» (США), мини-центрифуги высокоскоростные (до 13500 об/мин.) «MiniSpin», производства компании «Eppendorf» (Германия), «Microspin 12», производства компании «BioSan» (Латвия) и «Micro-120», производства компании «Hettich Zentrifugen» (Германия); микроцентрифуга-вортекс «Microspin FV-2400», производства компании «BioSan», Латвия. При выполнении этих исследований применялись дозаторы лабораторные автоматические одно- и многоканальные «Biochit», производства США и «Lenpipet-Digital» (Россия) и штативы сорбционные магнитные «Promega» производства США.
Дополнительно для ряда групп пациентов с HCV-инфекцией проводили некоторые виды инструментальных исследований, например, ультразвуковые исследования (УЗИ). Были выполнены УЗИ печени для подтверждения патологических изменений печёночной ткани и УЗИ селезенки для обнаружения спленомегалии. Для проведения УЗИ была использована станция ультразвуковой диагностики «Aloka SSD-500» производства Японии. Этот вид исследований осуществлялся на базе отделения функциональной диагностики КИКБ (зав. отделением врач функциональной диагностики первой категории О.В. Герасименко). С целью установления характера и стадии цирроза изучали данные биопсии печени, выполненной в отделении реанимации и интенсивной терапии КИКБ (зав. отделением врач анестезиолог-реаниматолог высшей категории П.Г. Ашихмин). Для обнаружения признаков портальной гипертензии (варикозное расширение вен пищевода и кровотечения из них) на базе отделения №5 КИКБ (зав. отделением врач-инфекционист высшей категории, врач-эндоскопист М.В. Попонин) проводили ФГДС с помощью фиброгастродуоденоскопа «OLYMPUS GIF Type E3» (США). Перечисленные инструментальные диагностические манипуляции использовались для установления класса HCV-ЦП по Чайлд-Пью-Турко.
Серологические маркёры острого гепатита С в период ремиссии заболевания
При усилении активности ХВГС увеличиваются и значения титров всех исследуемых групп анти-HCV-IgG. Особенно выражено увеличение для анти-NS4-IgG и анти-NS5-IgG. Так, средние арифметические обратных значений титра анти-NS4-IgG, в зависимости от степени активности (от минимальной до умеренной) инфекционного процесса, увеличиваются в 1,93 раза. Для анти-NS5-IgG этот показатель стал выше в 1,64 раза.
При этом значение титра анти-NS4-IgG в большей мере нарастало при сравнении слабовыраженной и умеренной степени активности (в 1,52 раза), чем при минимальной и слабовыраженной (в 1,27 раза). А значение титра анти-NS5-IgG, напротив, больше увеличивался при сопоставлении минимальной и слабовыраженной степени активности процесса (в 1,51 раза), чем слабовыраженной и умеренной (в 1,1 раза).
Несколько меньшим было суммарное увеличение титра анти-сore-IgG (в 1,57 раза); причём их уровень в большей мере возрастал при слабовыраженной степени активности ХВГС (в 1,34 раза). При умеренной активности титр анти-сore-IgG был выше в 1,19 раза.
Титр анти-NS3-IgG при повышении степени активности инфекционного процесса увеличился в наименьшей степени – суммарное нарастание его уровня составило 1,13 раза. Расхождение по степени активности было незначительными. При повышении степени активности до слабовыраженной значения титра анти-NS3-IgG выросли в 1,07 раза, а при до умеренной степени активности процесса они увеличились в 1,06 раза.
Цифровые средние значения log2x выявленных обратных титров антител к основным белкам HCV у пациентов с ХВГС различной степени активности инфекционного процесса представлены в таблице 15. Таблица 15 – Сравнительная характеристика средних значений log2x обратных титров специфических IgG к основным белкам HCV при ХВГС различной степени активности инфекционного процесса
Приведённые в таблице данные свидетельствуют о том, что изменения средних арифметических титров всех групп изучаемых антител при различной степени активности ХВГС, являются статистически значимыми. Наиболее высокой достоверностью (pс 0,001) характеризуются различия показателей титров анти-NS4-IgG, анти-NS5-IgG и анти-сore-IgG. Следовательно, при различной степени активности хронической HCV-инфекции формируется характерный иммунный ответ к изученным белкам вируса различной степени выраженности. Исходя из полученных данных, можно полагать, что усиление выраженности иммунного ответа при ХВГС по всему изученному спектру антител, в особенности анти-NS4-IgG, анти-NS5-IgG и анти-сore-IgG, в 1,5-2,0 раза свидетельствует об активизации инфекционного процесса. Кроме того, преимущественное увеличение значений титров анти-сore-IgG и анти-NS5-IgG в 1,3-1,5 раза указывает на слабовыраженную степень активности ХВГС. Тогда как увеличение значений титров анти-NS4-IgG в 1,4-1,6 раза говорит об усилении степени активности заболевания до умеренной степени.
Критерием минимальной степени активности ХВГС являются титры: анти-сore-IgG – 1:64, анти-NS3-IgG – 1:128, анти-NS4-IgG – 1:16 и анти-NS5-IgG – 1:32. Признаком слабовыраженной степени активности ХВГС служат следующие значения титров: анти-сore-IgG и анти-NS3-IgG – 1:256, анти-NS4-IgG – 1:32 и анти-NS5-IgG – 1:128. Показателем умеренной степени активности ХВГС будут титры: для анти-сore-IgG – 1:1024, анти-NS3-IgG, анти-NS4-IgG и анти-NS5-IgG – 1:256. Обнаруженные закономерности статистически значимы, воспроизводимы и могут быть выявлены с помощью рутинного иммуноферментного исследования спектра анти-HCV-IgG.
Таким образом, результаты ИФА могут быть использованы в качестве дополнительного диагностического критерия для определения степени активности инфекционного процесса у пациентов с диагнозом «ХВГС».
Сравнительная характеристика титров серологических маркёров у пациентов с минимальной степенью активности хронического гепатита С и лиц с острым гепатитом С в период ремиссии заболевания Проведён сравнительный анализ значений титров специфических анти-HCV-IgG к основным белкам вируса гепатита С (сore, NS3, NS4, NS5) в группах больных ХВГС с минимальной степенью активности инфекционного процесса (n=30) и пациентов с острой HCV-инфекцией в период ремиссии, то есть через 6 месяцев после манифестации заболевания (n=30). Подобное сопоставление представляется актуальным по нескольким причинам.
Во-первых, разграничение этих клинических форм вирусного гепатита С на практике нередко бывает затруднено вследствие того, что инфекционный процесс в таких случаях характеризуется стёртым или малосимптомным течением [61, 127]. Кроме того, важен и прогностический аспект, поскольку он связан с возможностью определения с помощью предлагаемой методики исхода острой HCV-инфекции (ремиссия или хронизация). Хотя полная реконвалесценция в случае ВГС по-прежнему считается дискутабельной, раннее определение возможного исхода инфекционного процесса при ОВГС может играть существенную роль в коррекции протокола ведения и лечения таких больных [2, 47, 101].
Соотношение титров изучаемых вариантов вирусоспецифических антител класса IgG к основным белкам вируса гепатита С (сore, NS3, NS4, NS5) у пациентов с ОВГС в стадии ремиссии и ХВГС с минимальной активностью инфекционного процесса представлено на рисунке
Сравнительная характеристика титров серологических маркёров хронического гепатита С в зависимости от степени активности заболевания
На приведённой диаграмме видно, что в динамике инфекционного процесса у пациентов с ОВГС (от периода разгара к ремиссии заболевания) на фоне снижения концентрации НСV-РНК наблюдается нарастание титра анти-сore-IgG. Оба этих процесса протекают достаточно согласованно. Коэффициент корреляции «rs» для этого взаимодействия был равен - 0,79 при p 0,01. Подобное значение коэффициента «rs» свидетельствует о том, что между уменьшением концентрации НСV-РНК и нарастанием титра анти-сore-IgG в динамике инфекционного процесса у пациентов с ОВГС существует достаточно сильная отрицательная корреляционная связь.
Таким образом, установлена выраженная взаимосвязь между периодом инфекционного процесса, изменениями концентрации НСV-РНК и титра анти-сore-IgG у пациентов с ОВГС. Эти данные подтверждают целесообразность изучения методом ИФА динамики титра специфических антител класса IgG к сore-антигену вируса НСV для определения периода острой НСV-инфекции.
Далее были изучены изменения в сыворотке крови больных ОВГС концентрации НСV-РНК и титров вирусоспецифических антител класса IgG к основным неструктурным белкам НСV (NS3, NS4, NS5), в динамике острой НСV-инфекции (от периода разгара к ремиссии заболевания). Титр анти-NS3 в период разгара составил 8,17±0,14, в ремиссии – 10,16±0,15. На этих стадиях ОВГС титры анти-NS4 составили 6,33±0,12 и 8,27±0,13, а титры анти-NS5 – 5,67±0,16 и 7,87±0,18 соответственно.
На приведённой диаграмме виден согласованный характер изменения концентрация НСV-РНК и титров антител к неструктурным белкам HCV. В динамике инфекционного процесса у пациентов с ОВГС (от периода разгара к ремиссии заболевания) концентрация НСV-РНК снижается; при этом значения титров всех исследуемых вариантов анти-HCV-IgG увеличиваются.
Так, сильной, как и в случае с ХВГС, была связь между изменением количества РНК вируса гепатита С и колебаниями титра анти-NS3-IgG в сыворотке крови больных с острой НСV-инфекцией в зависимости от стадии течения заболевания. Значение коэффициента «rs» для взаимодействия этих величин составило - 0,80 при p 0,01. Такое значение подтверждает, что между уменьшением концентрации РНК вируса гепатита С и нарастанием титра анти-NS3 в динамике инфекционного процесса у пациентов с острой НСV-инфекцией существует сильная отрицательная корреляционная связь.
При оценке взаимосвязи между изменением концентрации НСV-РНК и колебаниями титра анти-NS4-IgG в сыворотке крови пациентов с ОВГС в динамике инфекционного процесса было определено значение коэффициента «rs», равное - 0,87 при p 0,01, что указывает на наличие сильной отрицательной корреляционной связи между изученными параметрами.
Подтверждается также и существование сильной отрицательной корреляционной зависимости между количеством РНК вируса гепатита С и титром анти-NS5-IgG в динамике ОВГС (от периода разгара к ремиссии заболевания). Для взаимосвязи этих параметров было определено значение коэффициента «rs», равное - 0,96 при p 0,01.
Представленные данные свидетельствуют о наличии выраженной взаимозависимости между величиной концентрации НСV-РНК и уровнем титров анти-HCV-IgG к неструктурным белкам вируса (NS3, NS4, NS5) у больных ОГС в динамике инфекционного процесса. Выявленные факты говорят о диагностической значимости изучения методом ИФА титров специфических антител к неструктурным белкам вируса НСV для определения периода течения ОВГС.
Таким образом, прослеживается отчётливая, статистически значимая корреляция между изменениями титров всех исследуемых вариантов вирусоспецифических антител к белкам НСV (анти-сore-IgG, анти-NS3-IgG, анти-NS4-IgG, анти-NS5-IgG) и уровнем концентрации НСV-РНК в зависимости от стадии течения инфекционного процесса (от периода разгара до периода ремиссии заболевания) у лиц с ОВГС.
В заключение необходимо ещё раз подчеркнуть, что вышеизложенные данные подтверждают важность и информативность определения титров перечисленных выше групп анти-HCV-IgG методом твёрдофазного ИФА для уточняющей диагностики ОВГС. 6.3. Вирусная нагрузка у лиц с хроническим гепатитом C (различная активность процесса) В настоящем разделе изложены результаты определения количества НСV-РНК у больных хроническим вирусным гепатитом С в зависимости от степени активности инфекционного процесса. Всего были обследованы три подгруппы пациентов с ХВГС по 30 человек каждая, с минимальной, слабовыраженной и умеренной активностью заболевания, соответственно. Количество НСV-РНК было проанализировано методом ПЦР (вариант Real Time) параллельно с определением титров анти-HCV у этих же пациентов. Результаты изучения концентрации НСV-РНК представлены в таблице 27.