Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 14
1.1. Роль метаболизма фолатов и полиморфизма генов обмена гомоцистеина в патогенезе невынашивания беременности .14
1.1.1. Метаболический путь фолата 17
1.1.2. Полиморфизм отдельных генов и метаболизм фолиевой кислоты 19
1.1.2.1. Полиморфные варианты гена метилентетрагидрофолатредуктазы (MTHFR) 19
1.1.2.2. Полиморфизм генов метионин-синтазы (MTR) и метионин-синтазы редуктазы (MTRR) 21
1.1.3. Обзор работ по изучению распространенности полиморфизма генов фолатного цикла на материале абортусов .22
1.2. Роль сосудисто-эндотелиального фактора роста и полиморфизма его гена в патогенезе невынашивания беременности 25
1.2.1. Современные представления об этиологии и патогенезе невынашивания беременности 25
1.2.2. Семейство белков сосудисто-эндотелиального фактора роста (VEGF)...26
1.2.3. Рецепторы белков семейства VEGF 28
1.2.4. Роль VEGF-A и его рецепторов в эмбриогенезе 29
Глава 2. Материалы и методы исследований 33
2.1. Объем и структура материалов, дизайн исследования .33
2.2. Методы исследования
2.2.1. Молекулярно-генетические методы исследования.. 36
2.2.2. Цитогенетические методы исследования .39
2.2.3. Методы патоморфологического исследования 42
2.2.4. Методы статистического анализа .45
Глава 3. Лабораторные факторы риска неразвивающейся беременности 49
2 3.1. Молекулярно-генетические маркеры системы метаболизма фолата (MTHFR 677С Т, MTHFR 1298A C, MTRR 66A G, MTR 2756A G) 49
3.1.1. Молекулярно-генетическое исследование частоты встречаемости аллелей и генотипов полиморфных вариантов 677С Т и 1298 A C гена MTHFR в исследуемых группах 49
3.1.2. Молекулярно-генетическое исследование частоты встречаемости аллелей и генотипов полиморфных вариантов MTRR 66 A G, MTR 2756 A G 61
3.1.3. Молекулярно-генетическое исследование сочетанного наследования полиморфных вариантов генов метаболизма фолата (MTHFR 677С Т, MTHFR 1298 A C, MTRR 66 A G, MTR 2756A G)
3.2. Молекулярно-генетическое исследование частоты встречаемости аллелей и генотипов полиморфных вариантов 936 C T, -634 G C гена сосудисто-эндотелиального фактора роста (VEGF-А) .81
3.3. Результаты морфологического исследования абортного материала случаев неразвивающейся беременности 95
3.3.1. Морфофункциональная характеристика маточно-плацентарной области 96
3.3.2. Морфофункциональная характеристика ворсин хориона 97
3.4. Цитогенетическое исследование продуктов зачатия случаев неразвивающейся беременности 103
Глава 4. Анализ результатов исследований .. .109
4.1. Анализ цитогенетического исследования продуктов зачатия случаев неразвивающейся беременности 109
4.2. Анализ патоморфологического исследования продуктов зачатия случаев неразвивающейся беременности 115
4.3. Анализ молекулярно-генетического исследования маркеров системы метаболизма фолата (MTHFR 677С Т, MTHFR 1298 A C, MTRR 66 A G, MTR 2756 A G) 118
4.3.1. Анализ частоты встречаемости аллелей и генотипов полиморфных вариантов 677С Т и 1298 А С гена MTHFR в исследуемых группах 118
4.3.2. Анализ частоты встречаемости аллелей и генотипов полиморфных вариантов генов MTRR 66 A G, MTR 2756 A G в исследуемых группах 121
4.3.3. Анализ сочетанного наследования полиморфных вариантов генов метаболизма фолата (MTHFR 677С Т, MTHFR 1298А С,
MTRR 66A G, MTR 2756A G) 124
4.4. Анализ частоты встречаемости аллелей и генотипов полиморфных вариантов 936 С Т, -634 G C гена сосудисто-эндотелиального фактора роста (VEGF-А) 127
Глава 5. Алгоритм прогнозирования риска неразвивающейся беременности 129
Заключение 138
Выводы 142
Практические рекомендации 144
Список литературы
- Полиморфизм отдельных генов и метаболизм фолиевой кислоты
- Цитогенетические методы исследования
- Молекулярно-генетическое исследование сочетанного наследования полиморфных вариантов генов метаболизма фолата (MTHFR 677С Т, MTHFR 1298 A C, MTRR 66 A G, MTR 2756A G)
- Анализ патоморфологического исследования продуктов зачатия случаев неразвивающейся беременности
Полиморфизм отдельных генов и метаболизм фолиевой кислоты
Причины невынашивания беременности многочисленны и нередко комплексны. Особую роль в этиологии прерывания беременности в раннем сроке играет хромосомный дисбаланс. Так, в 6-7 недель беременности 60-75% абортусов имеют аномальный кариотип [7].
Основным типом аномального кариотипа плода 1 триместра являются анеуплоидии. В настоящее время предполагается существование генетических факторов риска возникновения геномных мутаций. Уже известно более 15 генов, мутации которых предрасполагают к нерасхождению хромосом в митозе и мейозе. Продукты этих генов входят в состав митотического веретена, контролируют синтез нуклеиновых кислот, ферментов системы репарации ДНК, белков рекомбинации мейотических хромосом, а также системы детоксикации ксенобиотиков. В большинстве этих процессов принимают участие фолаты, поэтому особый интерес представляет изучение роли полиморфизма генов обмена фолиевой кислоты в качестве фактора геномных мутаций плода.
Предполагаются следующие патогенетические механизмы влияния фолатов на пролиферацию и дифференцировку быстро делящихся клеток эмбриона:
1. Фолаты необходимы для синтеза и метилирования ДНК, РНК, белков и фосфолипидов, нейротрансмиттеров; участвуют в репарации двунитевых разрывов ДНК, в противном случае запускаются механизмы апоптоза клетки;
2. Фолаты необходимы для регуляции экспрессии генов посредством метилирования ДНК;
3. Продукты обмена фолиевой кислоты через метилирование ДНК обеспечивают стабильность прицентромерного гетерохроматина хромосом, последнее необходимо для нормального расхождения хромосом к полюсам деления клетки.
Дефицит фолиевой кислоты и витаминов группы В, связанный с особенностями диеты, физиологическими особенностями организма, наличием сопутствующих заболеваний, приемом лекарственных препаратов и с дефектами в генах фолатного обмена приводят к избыточному накоплению гомоцистеина в организме. Гомоцистеин обладает опосредованным и выраженным прямым эмбриотоксическим действием за счет следующих патогенетических механизмов:
1. Гомоцистеин вызывает повреждение эндотелиальной выстилки сосудов и запускает процессы коагуляции. В результате этого образуются тромбы, и происходит нарушение микроциркуляции в тканях, в том числе в стенке матки и плаценте, что приводит к ряду акушерских осложнений как на ранних этапах развития беременности (дефекты имплантации эмбриона, невынашивание беременности), так и на поздних сроках (хроническая фетоплацентарная недостаточность, задержка роста плода, гибель плода).
2. Гипергомоцистеинемия является фактором риска развития аутоиммунных процессов и антифосфолипидного синдрома, также нарушающих нормальное развитие беременности.
3. Гомоцистеин свободно проходит через плаценту и может оказывать прямое эмбриотоксическое действие, вызывая такие тяжелые и летальные неврологические формы патологии, как незаращение костномозгового канала (spina bifida) и анэнцефалия, а также незаращение верхней губы и неба, пороки сердца и мочевыделительной системы. Во время беременности между первым и вторым триместрами беременности происходит физиологическое снижение концентрации гомоцистеина (менее 50%), и такое состояние поддерживается до конца беременности. Происходит физиологическая адаптация матери для поддержания адекватной циркуляции крови в плаценте за счет оптимизации системы гемостаза. После родов в течение 2-4 дней концентрация гомоцистеина восстанавливается. Гипергомоцистеинемия занимает ведущее место в структуре тромбофилии у пациенток с синдромом потери плода, эклампсией, развитием преждевременной отслойки нормально
15 расположенной плаценты и тромбоэмболических осложнений во время беременности. Избыточное количество гомоцистеина в крови комплексно влияет на основные звенья тромбообразования: коагуляционный каскад, сосудисто-тромбоцитарное звено, окислительно-восстановительные реакции, эндотелий и гладкомышечные клетки сосудов.
Гипергомоцистеинемия повышает уровень тканевого фактора (TF) в крови, который запускает внешний путь коагуляционного каскада. Повышенный уровень гомоцистеина тормозит активацию основного естественного антикоагулянта – протеина С. Повышение гомоцистеина уменьшает в крови концентрацию активного плазмина, необходимого для фибринолиза. Гипергомоцистеинемия усиливает связывание высокоатерогенного липопротеина – (ЛПНП) с фибрином, что ингибирует фибринолиз. Повышенный уровень гомоцистеина увеличивает на 30-40% синтез тромбоксана А2, фактора адгезии и агрегации тромбоцитов. Гомоцистеин быстро окисляется в крови и в избыточном количестве повышает уровень свободных форм кислорода, активируя перекисное окисление липидов (фактора атерогенного повреждения эндотелия сосудов и активации тромбоцитов). Гомоцистеин связывает NO, основной фактор вазодилатации, тем самым в избыточных количествах стимулируя адгезию лимфоцитов к эндотелию, нарушая пролиферацию эндотелиоцитов. Гипергомоцистеинемия определяет риск нарушений развития хориона и децидуальной ткани и, как следствие, нарушения процессов имплантации и плацентации (таблица 1) [38].
Полиморфные варианты генов Эффект полиморфных вариантов генов Фолатного цикла MTHFR 677С Т MTHFR 1298 A C MTRR 66 A G MTR 2756 A G Микротромбозы в спиральных артериях.Нарушение пролиферации эндотелия сосудов плаценты, активация апоптоза клеток. Нарушение имплантацииНевынашивание беременности
Значимая роль фолатов в раннем внутриутробном развитии определила интерес к их изучению полиморфизма генов фолатного цикла на материале абортусов I триместра беременности в качестве одного из факторов прекращения развития эмбриона.
Фолат и фолиевая кислота (синтетический витамин, отсутствующий в естественных продуктах) являются двумя формами семейства веществ, связанных с птероилглутаминовой кислотой (ПтеГлу). Эта кислота является сложной молекулой, состоящей из птероидной кислоты и одного (моноглутамат) или нескольких, до 9 остатков глютаминовой кислоты (полиглутаматы). Пища, особенно свежая зелень, печень, дрожжи и некоторые фрукты в основном содержат восстановленные полиглутаматы. В тонком кишечнике всасывается фолат-моноглутамат, после восстановления и метилирования в кровь фолаты поступают в виде 5-метилтетрагидрофолата. Кроме пищи, постоянное поступление 5-метилтетрагидрофолата обеспечивается кишечно-печеночным циклом: птерил-моноглутамат всасывается из кишечника и поступает в печень, где он восстанавливается и метилируется до 5-метилтетрагидрофолата. Образовавшийся 5-метилтетрагидрофолат выделяется с желчью в кишечник, где он затем всасывается и разносится с кровью по всему организму.
Метилентетрагидрофолатредуктаза (MTHFR) – ключевой фермент обмена фолата. Фермент катализирует превращение 5,10-метилентетрагидрофолата в 5-метилентетрагидрофолат – доминирующую форму, циркулирующего в крови фолата. Метаболит 5-метилентетрагидрофолат принимает участие в одноуглеродном переносе, который является частью синтеза нуклеотидов, реметилирования гомоцистеина до метионина, синтеза S-аденозил метионина, метилирования ДНК, белков, нейротрансмиттеров, фосфолипидов (рис.1).
Цитогенетические методы исследования
Получение биологического материала плодов. Эмбриональные ткани получали из полости матки вакуум-аспирацией или кюретажем. Непосредственно в операционной производили отбор биологического материала (продуктов зачатия), который представлял собой плодный пузырь или его часть с фрагментами хориона. Забор биоматериала проводили одновременно с забором материала для цитогенетического исследования ворсин хориона. Полученные фрагменты тканей переносили в чашку Петри (диаметром 100 мм) с питательной средой RPMI-1634 или раствором Хенкса, нагретых до +30-+37С0. Отмытый от крови фрагмент ткани хориона (5-10 мг) переносили в пробирку эппендорф объемом 1,5 мл. II. Выделение ДНК комплектом реагентов «Сорб-С» из биоптата хориона. 1. В пробирку – эппендорф объемом 1,5 мл, содержащую биоптат, добавляли 0,4 мл буфера, подогретого до +60С0, 17 мкл лизирующего раствора, пробы перемешивали, термостатировали при t=+60С0 1ч, перемешивая каждые 10 мин. Затем пробы центрифугировали в режиме 12 000 оборотов/мин, 5 мин. 2. Готовили отрицательный контрольный образец: в пробирку – эппендорф помещали 0,1 мл стерильной воды, добавляли 0,4 мл буфера для лизирующего раствора, подогретого до +60С0, 17мкл лизирующего раствора, пробы перемешивали, термостатировали при t+60С0 1ч, перемешивая каждые 10 мин. Затем пробы центрифугировали в режиме 12 000 оборотов/мин, 5 мин. 3. Надосадочную жидкость 0,2-0,35 мл переносили в новые пробирки эппендорф, центрифугировали в режиме 5 000 оборотов/мин, 5 мин. Добавляли 0,25 мл сорбента, перемешивали и инкубировали 10-15 мин. при комнатной температуре, перемешивая через каждые 2 минуты. Центрифугировали в режиме 5 000 оборотов/мин, 1 мин. 4. Удаляли надосадочную жидкость и добавляли к осадку 0,3 мл раствора для отмывки №1, перемешивали. Центрифугировали при 5 000 оборотов/мин 1 мин. 5. Удаляли надосадочную жидкость и добавляли к осадку 0,5 мл раствора для отмывки №2, перемешивали. Центрифугировали в режиме 10 000 оборотов/мин, 1 мин. Повторяли этот этап еще один раз. 6. Инкубировали пробирки с осадком с открытыми крышками 5 мин при t=+65С0. Добавляли 0,05 мл ТЕ-буфера для элюции ДНК, перемешивали и инкубировали пробирки 5 мин. при t=+65С0, перемешивая каждую минуту. Центрифугировали в режиме 12 000 оборотов/мин, 1 мин.
Материалом для цитогенетического исследования послужил материал абортированных эмбрионов\плодов женщин основной (116 образцов) и контрольной (116 образцов) групп для определения кариотипа. Образцы биологического материала получали в ходе вакуум-аспирации или инструментального удаления продуктов зачатия беременности. На биологическом материале продуктов зачатия было выполнено стандартное цитогенетическое исследование, позволяющее выявлять числовые и структурные аномалии хромосом.
Методика приготовления цитогенетических препаратов Фрагменты плодного мешка тщательно отмывали от крови и децидуальной ткани в среде RPMI-1634 комнатной температуры. Отобранные отдельные ворсины хориона обрабатывали по стандартному протоколу ускоренного «прямого» метода приготовления препаратов хромосом из ворсин хориона. Приготовленные препараты окрашивали стандартным дифференциальным методом G-окраски с применением 0,25% раствора трипсина и раствора красителя Гимза [2]. Кариотипирование проводили на микроскопе Leica DM 4000B c программным обеспечением Leica CW 4000 Karyo.
Протокол приготовления препаратов хромосом из ворсин хориона I. Получение биологического материала.
Непосредственно в операционной производили отбор биологического материала (продуктов зачатия), который представлял собой плодный пузырь или его часть с фрагментами хориона. Полученные фрагменты тканей переносили в чашку Петри диаметром 100 мм с питательной средой RPMI-1634 или раствором Хенкса, предварительно нагретых до +30-+37С0. Среда содержала гепарин (25 000 ед. на 500 мл раствора). Отбор ворсин хориона проводили под контролем бинокулярной лупы МБС-2 в проходящем свете затемненного поля. Отобранные ворсины и их фрагменты переносили в свежую порцию среды (среда RPMI-1634 или раствор Хенкса, t = +30-+37С0) в чашку Петри диаметром 100 мм и визуально оценивали количество полученных ворсин хориона.
Приготовление препаратов для цитогенетического исследования хромосомного набора клеток хориона ускоренным «прямым» методом
Отмытые от крови ворсины хориона незамедлительно переносили в два пенициллиновых флакона объемом 15 мл, содержащие 5 мл свежеприготовленного 0,9% трехзамещенного цитрата натрия и 30 мкл колхицина с концентрацией раствора 0,2 мг/мл. Таким образом, проводилась гипотоническая обработка биоптата при комнатной температуре в течение 45 минут. Из биологического материала каждого пациента готовили два флакона, в каждый из которых отбирали по 5-7 ворсин от хориальной ткани.
Из флаконов удаляли 2,5 мл гипотонического раствора пипеткой. Во флаконы порциями добавляли 2,5 мл свежеприготовленного раствора фиксатора (метанол: ледяная уксусная кислота, 3:1) охлажденного до t=-10C0. Первую порцию раствора фиксатора добавляли по каплям, встряхивая флакон, затем струйно. Флаконы с биоптатом инкубировали 1ч. при t=+4-+8C0.
Молекулярно-генетическое исследование сочетанного наследования полиморфных вариантов генов метаболизма фолата (MTHFR 677С Т, MTHFR 1298 A C, MTRR 66 A G, MTR 2756A G)
На следующем этапе работы для оценки влияния полиморфных вариантов MTRR 66 A G и MTR 2756 A G на риск привычного невынашивания, из женщин основной и контрольной групп были сформированы две подгруппы “С” и “D”. Подгруппу “С” составили 39 женщин с привычным невынашиванием, то есть с двумя и более спонтанными потерями беременности в сроке до 12 недель гестации в анамнезе. Подгруппу “D” составили 185 женщин без привычного невынашиванием из основной группы и все женщины контрольной группы. Среди женщин подгруппы “D” в анамнезе было зарегистрировано не более одного случая спонтанной потери плода в сроке до 12 недель гестации.
Последовательно было проведено сравнение частот генотипов и аллелей полиморфных вариантов генов MTRR 66 A G и MTR 2756 A G среди женщин с привычным невынашивание беременности (подгруппа С), относительно женщин с единичным эпизодом спонтанного выкидыша до 12 недель гестации (подгрупп D) и относительно женщин контрольной группы без случаев потерь беременности до 12 недель гестации.
Результаты исследований распределения частот генотипов и аллелей полиморфных вариантов генов MTRR 66 A G и MTR 2756 A G среди женщин подгрупп “С” и “D” представлены в таблице 27.
При анализе распределения частот генотипов и аллелей генов фолатного цикла MTRR 66 A G и MTR 2756 A G среди женщин с привычным невынашиванием беременности (подгруппа С) обнаружено достоверное отличие в распределении генотипов по полиморфизму MTRR 66 A G. В подгруппе женщин с привычным невынашиванием беременности достоверно чаще встречается генотип MTRR 66 AА по мультиплекативной модели наследования (OR=2,84, CL95%:1,33-6,07, p=0,025), так и по доминантной модели наследования (генотип АА встречался чаще совокупности генотипов AG+GG, OR=2,84, CL95%:1,3-6,21, p=0,008), в сравнении с женщинами с одним случаем потери беременности в анамнезе.
При анализе распределения частот генотипов и аллелей полиморфных вариантов генов фолатного цикла MTRR 66 A G и MTR 2756 A G среди женщин с привычным невынашиванием беременности (подгруппа А) в сравнении с женщинами без случаев спонтанной потери плода (контрольная группа), получены аналогичные результаты (таблица 28).
По результатам исследовании в подгруппе женщин с привычным невынашиванием достоверно чаще встречается генотип MTRR 66 AА с учетом доминантной модели наследования (генотип АА встречался чаще совокупности генотипов AG+GG, OR=2,44, CL95%:1,06-5,64, p=0,035) в сравнении с репродуктивно успешными женщинами контрольной группы, таблица 28. Таким образом, была выявлена ассоциация генотипа MTRR 66 AА с двумя и более случаями невынашивания беременности в анамнезе.
74 На следующем этапе работы для анализа влияния полиморфных вариантов MTRR 66 A G и MTR 2756 A G на риск формирования хромосомной аномалии у плода была сформирована подгруппа “Е”, которую составили женщины с аномальным кариотипом плода. Кариотип плодов был определен стандартным цитогенетическим методом в результате исследования абортного материала при неразвивающейся беременности.
Результаты анализа распределение частот аллелей и генотипов полиморфных вариантов генов MTRR 66 A G и MTR 2756 A G у женщин с аномальным кариотипом плода при неразвивающейся беременности и женщин контрольной группы с нормальным кариотипом плода представлены в таблице 29.
Частоты аллелей и генотипов полиморфизмов MTRR 66 A G и MTR 2756 A G у женщин с неразвивающейся беременностью с нормальным и аномальным кариотипом плода. Ген (полиморфизм) генотип/ аллель Женщины саномальнымкариотипомплода,абс.(%) Женщины снормальнымкариотипомплода,абс.(%) р OR(CL95%) MTRR66A G AA 13(22,8) 11(20,4) 0,8 AG 28(49,1) 25(46,3) GG 16(28,1) 18(33,3) A 54(47,4) 47(43,5) 0,6 G 60(52,6) 61(56,5) AA 13(22,8) 11(20,4) 0,8 AG+GG 44(77,2) 43(79,6) GG 16(28) 18(33,3) 0,5 AG+AA 41(72) 36(66,7) MTR2756A G AA 28(60,9) 47(74,6) 0,13 AG 14(30,4) 15(23,8) GG 4(8,7) 1(1,6) A 70(76,1) 109(86,5) 0,047 0,5(1,0-0,25) G 22(23,9) 17(13,5) 2,02(1,0-4,04) AA 28(60,9) 47(74,6) 0,13 AG+GG 18(39,1) 16(25,4) GG 4(8,7) 1(1,6) 0,08 АА+AG 42(91,3) 62(98,4) 75 Результаты исследования выявили достоверное различие по частоте встречаемости аллеля 2756G полиморфизма MTR 2756 A G. В подгруппе женщины с неразвивающейся беременностью и хромосомной аномалией у плода (подгруппа Е) достоверно чаще встречался аллель MTR 2756G (OR=2,02, CL95%:1,0-4,04, p=0,047), таблица 29. Таким образом, была выявлена ассоциация аллеля MTR 2756G женщины с хромосомным дисбалансом у плода при неразвивающейся беременности.
Важным представляется рассмотрение совместного наследования полиморфных вариантов MTRR 66 A G и MTR 2756 A G, так как гены MTRR и MTRR определяют синтез двух функционально тесно связанных ферментов. Фермент MTR (метионин-синтаза) непосредственно метилирует гомоцистеин, а для восстановления его функции необходим второй фермент MTRR (менионин-синтаза-редуктаза).
Результаты анализа частоты встречаемости сочетаний генотипов полиморфизмов MTRR 66 A G и MTR 2756 A G среди женщин с неразвивающейся беременностью и женщин контрольной группы представлены в таблице 30.
Не обнаружено значимых отличий частоты встречаемости сочетаний генотипов полиморфизмов MTRR 66 A G и MTR 2756 A G среди женщин с неразвивающейся беременностью и женщин контрольной группы.
Результаты анализа частота встречаемости сочетаний генотипов полиморфизмов MTRR 66 A G и MTR 2756 A G среди плодов неразвивающейся беременности и плодов контрольной группы представлены в таблице 31.
Анализ патоморфологического исследования продуктов зачатия случаев неразвивающейся беременности
В проведенном исследовании полиплоидия была представлена только в варианте триплоидии с частотой 16%, которая согласуется с данными литературы по другим популяциям [22,31,32,40,87]. Известно, что триплоидия является либо результатом нарушения созревания половых клеток (отсутствие редукции диплоидного набора), либо оплодотворения одной яйцеклетки двумя сперматозоидами (диандрия) [2,40]. Примерно 70% триплоидий имеют отцовское происхождение и являются диандрическими [40,119]. Стандартный цитогенетический анализ не позволяет установить происхождение триплоидии, поэтому проведенные исследования позволяют лишь констатировать факт наличия триплоидных кариотипов у плодов при неразвивающейся беременности.
Обращает на себя внимание случай триплоидии в виде химерного варианта с эуплоидным клоном (chi69,ХХУ/46,ХУ). Формирование химеры может указывать на наличие незарегистрированного дегенерировавшего близнеца.
В работе были обследованы 6 случаев анэмбрионии. Аномальный кариотип зарегистрирован у двух эмбрионов и представлен трисомией хромосомы 1. По данным единичных публикаций трисомии хромосомы 1 регистрировалась у дробящихся зародышей до стадии 10 бластомеров, и предполагается, что данный вид хромосомной аномалии не совместим с постимплантационным развитием [2]. Это объясняет тот факт, что данный вид хромосомного дисбаланса был зарегистрирован нами в случаях анэмбрионии при неразвивающейся беременности. По результатам других авторов частота хромосомной аномалии при анэмбрионии составляет около 60%, то есть более чем в 2 раза больше, чем в нашем исследовании [87]. Возможно, это обусловлено малым числом случаев анэмбрионии в нашем исследовании. С другой стороны, аномальные кариотипы представлены трисомией хромосомы 1, которая встречается крайне редко в исследованиях кариограмм спонтанных аботрусов. Возможно, элиминация плодов с подобной аномалией происходит на максимально ранних этапах формирования бластоцисты, и такие случаи беременности не удается зарегистрировать и получить биоматериал самопроизвольного выкидыша для исследования.
Результаты проведенного исследования однозначно свидетельствуют о том, что разнообразие хромосомных аномалий, наблюдаемых у плодов при неразвивающейся беременности, отличается от такового при развивающейся беременности и живорождении. Это обусловлено тем, что большинство хромосомных аномалий летальны, и лишь немногие варианты числовых и структурных аномалий совместимы с постнатальным развитием плода и ведут к хромосомным болезням. У новорожденных частота хромосомных мутаций составляет около 0,5-0,9%. Наиболее распространенными хромосомными аномалиями у новорожденных последовательно по снижению частоты встречаемости являются трисомии хромосом 21, 18, 13, аномалии в системе половых хромосом, наиболее редко, триплоидия [2]. Напротив, наиболее распространенными аномалиями кариотипа при неразвивающейся беременности нами отмечены триплоидия (16%) и трисомия хромосомы 16 (10%).
Особенностью полученных результатов является высокая частота мозаичных форм хромосомных нарушений, которые составили 19 % (12 случаев) от числа аномальных кариотипов. Известно, что частота межтканевого мозаицизма между тканями собственно эмбриона и цитотрофобласта у спонтанных абортусов достигает 15-20% [22,40]. Это на порядок выше частоты мозаицизма ограниченного плацентой (1-2%) по данным пренатальной диагностики на материале ворсин хориона при физиологически развивающейся беременности.
Обнаружение мозаичных анеуплоидных кариотипов свидетельствует о митотических ошибках на постзиготическом этапе развития эмбриона. Таким образом, причиной хромосомных аномалии у плода является не только наличие анеуплоидных гамет у родителей, но и соматические мутации в тканях самого плода на этапах имплантации, морфогенеза и развития плода с изначально нормальным кариотипом.
По данным исследований в других популяциях, проведенных с использованием стандартного цитогенетического анализа, частота мозаицизма по всем хромосомам колеблется от 0 до 20% [31,119]. Наиболее достоверные результаты о наличии мозаичного варианта кариотипа можно получить методами молекулярной цитогенетики, например, FISH (fluorenscence in situ hybridization) методом, который позволяет многократно увеличить количество анализируемых метафаз. Исследователи из г. Томска FISH-методом обнаружили более высокую частоту мозаичных форм кариотипа спонтанных абортусов (66%) [18,40,87]. В работе Ворсановой С.Г. с применением метода FISH мозаицизм обнаружен у 50,3% эмбрионов с аномальным кариотипом [8]. Поэтому, выявленный в проведенном исследовании мозаицизм в 19% случаев хромосомной аномалии у плода можно рассматривать характерным признаком для этиологии неразвивающейся беременности.
В настоящее время одной из причин хромосомного мозаицизма на ранних этапах онтогенеза человека рассматриваются нарушения контроля клеточного цикла, которые могут быть обусловлены мутациями в генах его регуляции, а также эпимутациями в этих генах. Исследования некоторых авторов указывают на взаимосвязь цитогенетических нарушений с аномалиями эпигенетического репрограммирования генов клеточного цикла, что является одной из причин нарушения сегрегации хромосом при делении клеток и возникновения мозаицизма [40,104]. Такому механизму формирования мозаицизма способствует тот факт, что на ранних этапах онтогенеза происходят интенсивные эпигенетические изменения генома, а именно: стирание метилирования и установление его de novo (Deanetal., 2005).
Постзиготические (митотические) ошибки деления, обуславливающие мозаичный кариотип плода при неразвивающейся беременности, могут свидетельствовать и о действии факторов внешней и внутренней среды организма матери на течение эмбриогенеза.
Основным типом аномального кариотипа плода первого триместра являются анеуплоидии. В настоящее время предполагается существование генетических факторов риска возникновения геномных мутаций. Уже известно более 15 генов, мутации которых предрасполагают к нерасхождению хромосом в митозе и мейозе. Продукты этих генов входят в состав митотического веретена деления, контролируют синтез нуклеиновых кислот, ферментов системы репарации ДНК и РНК, белков рекомбинации мейотических хромосом, а также системы детоксикации ксенобиотиков. В большинстве этих процессов принимают участие фолаты, поэтому особый интерес вызывает изучение роли полиморфизма генов обмена фолиевой кислоты в качестве фактора геномных мутаций плода.
Следует отметить, что частота хромосомных аномалий у эмбрионов при неразвивающейся беременности, по данным ряда авторов, выше, чем при самопроизвольных абортах [25,32,40]. Следовательно, можно предположить, что гибель эмбриона при несостоявшемся аборте чаще вызвана генетическими факторами, чем при самопроизвольной потере плода. Это ставит новые вопросы о механизмах внутриутробной задержки погибшего эмбриона при несостоявшемся аборте и причинах гибели плода с нормальной хромосомной конституцией.
Таким образом, в проведенном исследовании определена частота и структура анеуплоидии, структурных перестроек и полиплоидии в цитотрофобласте хориона при неразвивающейся беременности среди женщин Свердловской области. В целом, частота хромосомных аномалий среди плодов при неразвивающейся беременности I триместра, погибших в сроке 4-11,5 недель (8 недель+3 дня) гестации, составила 46%. Значительная часть аномальных кариотипов абортусов была представлена мозаичными вариантами (19%). Обнаружение мозаичных анеуплоидных кариотипов свидетельствует о митотических ошибках на постзиготическом этапе развития эмбриона. Это может быть обусловлено неблагоприятным действием на митоз факторов внешней и внутренней среды организма матери.