Введение к работе
Актуальность проблемы
Пандемия ВИЧ/СПИДа продолжает оставаться одной из основных проблем здравоохранения во всем мире, несмотря на все усилия по предотвращению и контролю ВИЧ-инфекции. В настоящее время более 33 млн. людей живут с ВИЧ-инфекцией. По данным UNAIDS за 2009 год зарегистрировано 2,5 млн. смертей и около 2,7 млн. новых случаев ВИЧ-инфекции, большинство из них среди женщин [Rohan L.C. et al, 2010]. В России в период до 2001 г. среди выявленных случаев преобладали мужчины (75-88%). Но уже к 2006 г. доля ВИЧ-позитивных женщин составила 44% и продолжает расти. Увеличивается и число детей, инфицированных ВИЧ-позитивными матерями. Такое тендерное распределение ставит обязательным вопрос о разработке эффективных способов предотвращения передачи ВИЧ женщинам и блокирования половой передачи ВИЧ.
Поиск новых перспективных соединений, предотвращающих передачу ВИЧ-инфекции, является одной из актуальных задач здравоохранения, поскольку существуют трудности в разработке вакцин, отсутствуют средства специфической профилактики и появляются варианты ВИЧ-1, обладающие лекарственной устойчивостью [Hughes L.M. et al, 2007]. Частью комплексного подхода в системе профилактических мер против распространения ВИЧ/СПИДа является разработка и применение микробицидов.
Микробициды - это препараты, гелевые или мазевые композиции, содержащие активные вещества, способные предотвращать половую передачу ВИЧ и других инфекций, передающихся половым путем (гонорея, хламидиозы, генитальный герпес). Такие продукты предназначены, прежде всего, для женщин, которые могут пользоваться данным средством профилактики независимо от полового партнера.
Многие микробициды успешно прошли доклинические испытания, но их безопасность для человека и эффективность остаются нерешенной проблемой. Важность клинических испытаний была проиллюстрирована исследованиями ноноксинола-9, который вызывал физические повреждения слизистой оболочки, что повышало риск ВИЧ-инфицирования. Такой опыт способствовал разработке критериев, которые должны быть использованы в качестве стандартов при проведении клинических испытаний [Moscicki А.В., 2008].
Согласно последним публикациям около 70 новых соединений находятся на стадии подготовки к исследованиям как спермициды и/или микробициды местного действия и 7 препаратов в настоящее время проходят клинические испытания. Они включают в себя поверхностно-активные вещества (ПАВ), анионные полимеры, ингибиторы проникновения ВИЧ в клетку, ингибиторы обратной транскриптазы. Предполагается, что применение препарата даже с эффективностью 60% за 3 года предотврати?.
2,5 млн. случаев ВИЧ-инфекции, если он будет использован 20% женщин в 50% небезопасных половых актах [Hughes L.M. et al, 2007].
Для создания компонентов вакцин и микробицидов, направленных против актуальных вариантов ВИЧ, циркулирующих на определенной территории, а также для того, чтобы понять эпидемиологию и происхождение ВИЧ-1, необходим постоянный мониторинг распространения ВИЧ-эпидемии. ВИЧ-инфекция на территории России и бывшего СССР в основном вызвана двумя субтипами А и В, а также рекомбинантным субтипом А/В. Генетический анализ определил субтип А как доминирующий в большинстве регионов. В то же время в Калининграде и в Череповце выявлен рекомбинантный вариант А/В (CRF03). Кроме того, исследования, проведенные различными группами авторов, выявили появление других субтипов ВИЧ, которые способны вызвать новые вспышки эпидемии [Гилязова А.В. и др., 2010]. Таким образом, обнаружение новых вариантов вируса и прогноз развития эпидемии являются важными аспектами в разработке профилактических средств против ВИЧ-1.
Целью данной работы был поиск соединений, подавляющих репликацию ВИЧ-1 в различных вирус-клеточных системах, а также определение молекулярно-генетической структуры вариантов ВИЧ-1, циркулирующих в Московской области.
Для достижения цели были поставлены следующие задачи:
-
Изучение молекулярно-генетической структуры вариантов ВИЧ-1, циркулирующих в Московской области.
-
Изоляция актуальных штаммов ВИЧ-1 от инфицированных лиц с ранней инфекцией.
-
Исследование цитотоксических свойств потенциальных микробицидов, относящихся к различным классам химических веществ (растительные полифенолы, гуминовые вещества, кремниевые наночастицы и аддукты нанокластеров углерода).
-
Оценка антивирусной активности соединений различной природы in vitro с использованием референс-штамма и первичного изолята ВИЧ-1.
-
Поиск комбинаций препаратов, проявляющих синергизм при ингибировании ВИЧ-инфекции in vitro.
Научная новизна работы
Получены новые данные по молекулярно-генетической структуре вариантов ВИЧ-1, циркулирующих в Московской области. Результаты свидетельствуют об увеличении эволюционной дистанции между циркулирующими вариантами ВИЧ.
Получены клинические изоляты ВИЧ-1, представляющие собой актуальные штаммы, которые вызывают инфекцию на территории Московской области.
Впервые исследованы индивидуальные соединения класса полифенолов, выделенные из растений семейства Euphorbiaceae, на цитотоксичность и эффективность в отношении ВИЧ-инфекции in vitro.
Впервые проведен анализ гуминовых веществ как соединений, перспективных для разработки микробицидов.
Впервые изучены цитотоксические, антивирусные и вирулицидные свойства кремниевых наночастиц и аддуктов нанокластеров углерода на модели ВИЧ-инфекции in vitro. Впервые показана возможность комбинированного использования этих препаратов в комплексе с другими анти-ВИЧ-соединениями.
Найдены эффективные соединения с высокими индексами селективности, которые могут стать основой для разработки специфических анти-ВИЧ-микробицидов.
Научно-практическая значимость работы
Разработка эффективных микробицидных препаратов позволит снизить распространение ВИЧ/СПИД половым путем. В данной работе изучена анти-ВИЧ-активность соединений, принадлежащих к различным классам химических веществ: растительные полифенолы, гуминовые вещества, кремниевые наночастицы, аддукты нанокластеров углерода.
Цитотоксичность препаратов, их антивирусное и вирулицидное действие были проверены с использованием стандартных методик, что позволяет сравнивать результаты с последующими исследованиями, а также с литературными данными. В результате такого сравнения возможен отбор наиболее эффективных соединений в отношении ВИЧ-инфекции in vitro.
Полученные клинические изоляты представляют собой актуальные штаммы ВИЧ, циркулирующие в Московской области в настоящее время. Данные первичные штаммы могут быть использованы для оценки эффективности потенциальных кандидатных микробицидов и компонентов анти-ВИЧ-вакцин.
В результате исследований выявлены наиболее активные соединения, перспективные для создания нового типа микробицидных препаратов, которые позволят быстро и эффективно предотвратить передачу ВИЧ-инфекции половым путем. Обнаружение комбинаций препаратов, подавляющих ВИЧ-инфекцию in vitro, делает возможным использование активных соединений в более низких концентрациях, что уменьшит цитотоксичность.
Выявление малой токсичности для клеток препаратов наночастиц кристаллического и пористого кремния, а также аддуктов нанокластеров углерода открывает возможность изучения этих образцов в качестве систем доставки анти-ВИЧ-микробицидов.
- Данные по молекулярной эпидемиологии ВИЧ-инфекции в Московской области, описанные в настоящей работе, могут быть использованы для разработки региональных вакцин. На основании полученных результатов
можно судить о путях и источниках распространения эпидемии и проводить профилактическую работу значительно эффективнее.
Апробация работы
Материалы диссертационной работы были доложены и обсуждены на следующих Всероссийских и Международных конгрессах, конференциях и симпозиумах: Microbicides 2008 (February 23-27, 2008, New Delhi, India); Теоретические и практические аспекты современной эпидемиологии (28 января 2009 г., Москва); 5' European Conference on Clinical and Social Research on AIDS and Drugs (April 28-30, 2009, Vilnius, Lithuania); X Международном Конгрессе «Современные проблемы иммунологии, аллергологии и иммунофармакологии» (20-23 мая, 2009 г., Казань); Актуальные вопросы инфекционной патологии (23-24 сентября 2009 г., Ростов-на-Дону); Keystone Symposia Meeting «Overcoming the Crisis of ТВ and AIDS» (October 20-25, 2009, Arasha, Tanzania); III Международной конференции по вопросам ВИЧ/СПИДа в Восточной Европе и Центральной Азии и Американо-Российском научном семинаре по профилактике ВИЧ (28-30 октября 2009, Москва); Ш-й Ежегодной научной конференции молодых ученых НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН (20 апреля 2010 г., Москва); Microbicides 2010 (May 22-25, 2010, Pittsburgh, USA); NIH Workshop on Building U.S. Russia Collaborative Research Teams in HIV Prevention Science (May 27, 2010, St. Petersburg, Russia); Международной конференции «Актуальные проблемы развития биоорганической химии» (20-21 сентября, 2010 г., Ташкент).
Объем и структура диссертации
Диссертация изложена на 143 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов собственных исследований, обсуждения полученных данных и выводов. Библиографический указатель включает 130 источников, в том числе 10 отечественных и 120 зарубежных. Диссертация содержит 40 таблиц и 32 рисунка.