Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 10
1.1. Иммунитет 10
1.1.1. Рецепторы врожденного иммунитета 11
1.1.2. Клетки врожденного иммунитета 13
1.1.3. Растворимые факторы врожденного иммунитета 17
1.2. Миелопептиды 19
1.2.1. История изучения миелопептидов 19
1.2.2. Структура миелопептидов 21
1.2.3. Связывание миелопептидов с клетками 24
1.2.4. Пути образования миелопептидов 25
1.2.5. Эффекты миелопептидов 26
1.2.6. Лекарственные препараты на основе миелопептидов 32
1.3. Стресс и его влияние на иммунную систему 36
1.3.1. Взаимосвязь нервной, эндокринной и иммунной систем 36
1.3.2. Структура и функции рецепторов катехоламинов 40
1.3.3. Влияние катехоламинов на иммунную систему 41
1.3.4. Структура и функции рецепторов к глюкокортикоидам 42
1.3.5. Влияние глюкокортикоидов на иммунную систему 43
1.4. Проникающее ранение глаза 44
ГЛАВА 2. Материалы и методы 48
2.1. Объекты исследования 48
2.2. Основные экспериментальные подходы in vitro 49
2.2.1. Получение лейкоцитарной взвеси периферической крови человека 49
2.2.2. Получение фракций гранулоцитов и моноцитов периферической крови человека 49
2.2.3. Миелопептиды 50
2.2.4. Оценка фагоцитарной активности нейтрофилов периферической крови человека 50
2.2.5. Оценка продукции активных форм кислорода 52
2.2.6. Культивирование гранулоцитов и моноцитов 52
2.2.7. Культивирование цельной крови з
2.2.8. Определение концентрации цитокинов 53
2.3. Основные экспериментальные подходы in vivo 55
2.3.1. Общая схема исследования 55
2.3.2. Нанесение проникающего ранения глаза 55
2.3.3. Получение перитонеальных клеток 57
2.3.4. Культивирование перитонеальных клеток 57
2.3.5. Оценка продукции активных форм кислорода 57
2.3.6. Определение содержания провоспалительных цитокинов 58
2.4. Статистическая обработка данных 58
ГЛАВА 3. Результаты исследований 59
3.1. Влияние МП на фагоцитарную активность нейтрофилов периферической крови человека 59
3.2. Влияние МП на продукцию активных форм кислорода лейкоцитами периферической крови человека 62
3.2.1. Влияние МП на продукцию АФК лейкоцитами периферической крови человека без предварительной инкубации с миелопептидами 62
3.2.2. Влияние МП на продукцию АФК лейкоцитами периферической крови человека в условиях предварительной инкубации клеток с миелопептидами
3.2.3. Влияние МП на продукцию АФК гранулоцитами и моноцитами периферической крови человека без предварительной инкубации с миелопептидами 64
3.2.4. Влияние МП на продукцию АФК гранулоцитами и моноцитами периферической крови человека с предварительной инкубацией с миелопептидами
3.3. Влияние миелопептидов на синтез провоспалительных цитокинов IL-1 и
TNF- клетками периферической крови человека 71
3.3.1. Влияние МП на синтез IL-1 и TNF- культурами цельной крови 71
3.3.2. Влияние МП на синтез IL-1 и TNF- нейтрофилами и моноцитами периферической крови 72
3.4. Влияние МП на продукцию АФК перитонеальными клетками мышей 77
3.5. Влияние МП на продукцию провоспалительных цитокинов IL-1 и TNF- перитонеальными клетками мышей 80
Заключение 87
Выводы 93
Практические рекомендации 94
Список сокращений 95
Библиографический список 97
- Лекарственные препараты на основе миелопептидов
- Оценка фагоцитарной активности нейтрофилов периферической крови человека
- Влияние МП на продукцию активных форм кислорода лейкоцитами периферической крови человека
- Влияние МП на синтез IL-1 и TNF- нейтрофилами и моноцитами периферической крови
Введение к работе
Актуальность темы исследования и степень ее разработанности. Биорегуляторные
пептиды являются важными факторами регуляции врожденного иммунитета (Петров Р.В.,
Михайлова А. А., Фонина Л. А. Эндогенные иммунорегуляторные пептиды
(миелопептиды): структура, функция, механизм действия. Биоорганическая химия. 1999.
Т.25, № 11. С. 811-815; Петров Р.В., Михайлова А.А., Фонина Л. А. Костномозговые
иммунорегуляторы миелопептиды. Рос. хим. ж. (Ж. Рос. хим. об-ва им. Д.И. Менделеева),
2005. Т. XLIX, №1. С.55 - 63. 49; Петров Р.В., Михайлова А.А., Фонина Л.А. и др.
Миелопептиды. М.: Наука, 2001. 181 с., ил.; Ярилин, А.А. Иммунология: учебник. М.:
ГЭОТАРМедиа, 2010. 752 с.: ил.). Помимо цитокинов, представляющих собой
полипептидные макромолекулы, в процессах регуляции реакций врожденного иммунитета
участвуют низкомолекулярные пептиды трех классов: нейропептиды, пептиды тимуса и
пептиды костного мозга. Важным достижением отечественной иммунологии являются
выделенные из супернатанта клеток костного мозга миелопептиды, которые представляют
собой группу биорегуляторных пептидов, обладающих широким спектром
иммуномодулирующей активности. Группой отечественных ученых под руководством акад. Р.В. Петрова и А.А. Михайловой выделено и охарактеризовано шесть отдельных миелопептидов (МП-1, МП-2, МП-3, МП-4, МП-5, МП-6), обладающих широким спектром биологической активности (Черешнева М.В., Шилов Ю.И., Черешнев В.А. и др. Иммунокоррекция в комплексном лечении больных с воспалительными заболеваниями роговой и сосудистой оболочек глаза. Екатеринбург: УрО РАН, 2005. 253 с., ил.; Фонина Л.А., Гурьянов С.А., Ефремов М.А. и др. Миелопептиды: выделение и структура. Биоорганическая химия. 1998. Т.24, № 6. С. 403-407; Фонина Л.А., Кудрявцева Е.В., Беспалова Ж.Д. и др. Синтез и свойства миелопептидов с дифференцировочной активностью. Биоорганическая химия. 2010. Т.36, №4. С.493-497; Mikhailova A., Fonina L., Kirilina E. et al. Immunoregulatory properties, of hexapeptide isolated from porcine bone marrow cell culture. Regulatory Peptides. 1994. Vol. 53. P. 203-209; Гурьянов С.А., Фонина Л.А., Михайлова А.А. Выделение и определение структуры биологически активных пептидов костномозгового происхождения. Биоорганическая химия. 1993. Т.19, №8. С.786-790; Михайлова А.А. Миелопептиды и их роль в функционировании иммунной системы. Иммунология. 2001. №5. С.16-18; Петров Р.В., Михайлова А.А., Фонина Л. А. Костномозговые иммунорегуляторы миелопептиды. Рос. хим. ж. (Ж. Рос. хим. об-ва им. Д.И. Менделеева). 2005. Т. XLIX, №1. С.55 - 63. 49).
Врождённый иммунитет является наиболее древним звеном иммунной системы, включающим в себя спектр факторов, отвечающих за быстрое распознавание, уничтожение
и элиминацию патогенного биоматериала (Ward A., Rosental B. Evolutionary responses of the innate immunity to adaptive immunity. Infection, genetics and evolution. 2014. Vol.21. P.492 – 496; Ярилин А.А. Иммунология: учебник. М.: ГЭОТАРМедиа, 2010. 752 с.: ил.). Он включает в себя ряд секреторных (лизоцим, интерфероны, система комплемента, медиаторы воспаления) и клеточных (гранулоциты, моноциты-макрофаги, дендритные, NK-клетки) компонентов, которые взаимодействуют с определёнными классами антигенов, характерными для целого ряда патогенных организмов. Помимо этого, клетки врождённого иммунитета играют важную роль в индукции и регуляции функций адаптивного иммунитета (Sellati T.J., Sahay B. Cells of innate immunity: mechanisms of activation. Pathobiology of human disease: a dynamic encyclopedia of disease mechanisms. 2014. P.258– 274; Ярилин А.А. Иммунология: учебни. М.: ГЭОТАРМедиа, 2010. 752 с.: ил.).
Важнейшей проблемой современной иммунологии является разработка методов направленной иммунокоррекции при воспалительных процессах различного генеза и иммунодефицитах. Одной из главных причин развития последних являются стресс и травма, при котором нарушения функций иммунной системы являются одним из ведущих факторов патогенеза. В процессе развития стресс-реакции функции клеток врождённого иммунитета выражено угнетаются (McEwen B.S., Biron C.A., Brunson K.W. et al. The role of adrenocorticoids as modulators of immune function in health and disease: neural, endocrine and immune interactions. Brain Res. Brain Res. Rev. 1997. Vol.23 (1-2). P.79-133). Примером стрессорного воздействия может служить проникающее ранение глаза (ПРГ). В ранее проведенных исследованиях было показано, что в условиях ПРГ наблюдается развитие вторичной недостаточности клеточного звена иммунной системы, повышение поглотительной активности фагоцитирующих клеток на фоне выраженной депрессии их микробицидного потенциала (Черешнева М.В., Шилов Ю.И., Баданина О.Н. и др. Динамика показателей кислородзависимых механизмов бактерицидности циркулирующего пула фагоцитирующих клеток в тесте с нитросиним тетразолием при экспериментальном проникающем ранении глаза. Иммунология. 2000. №1. С. 26-30; Черешнева М.В., Шилов Ю.И., Черешнев В.А. и др. Иммунокоррекция в комплексном лечении больных с воспалительными заболеваниями роговой и сосудистой оболочек глаза. Екатеринбург: УрО РАН, 2005. 253 с., ил.; Черешнева М.В., Шилов Ю.И., Гаврилова Т.В. и др. Иммунокоррекция стрессорных и травматических нарушений функций иммунной системы при проникающем ранении глаза. Вестник Уральской медицинской академической науки. 2004. №4. С. 82-87; Черешнева М.В., Шилов Ю.И., Гаврилова Т.В. и др. Иммунокоррекция травматических и стрессорных нарушений функций иммунной системы при проникающем ранении глаза. Вестник офтальмологии. 2006. №2. С. 42–46). Таким образом, исследования
иммуномодулирующих эффектов отдельных миелопептидов представляются
перспективными, что обусловлено высокой иммуномодулирующей и стресс-ограничивающей активностью миелопептидов, а также их перспективностью в качестве потенциальных лекарственных средств (Михайлова А.А., Белевская Р.Г., Гурьянов С.А. и др. Препарат биваласп (миелопептид-5) – иммуномодулятор с противоопухолевой активностью. Российский биотерапевтический журнал теоретический и научно-практический журнал. 2007. Т.6, №1. С.59; Михайлова А.А. Регуляторные пептиды костного мозга — иммуномодуляторы нового поколения. Аллергол. и иммунол. 2001. Т.2, №1. С. 46; Шилов Ю.И., Орлова Е.Г. Адренергические механизмы регуляции фагоцитарной активности нейтрофилов, моноцитов и эозинофилов периферической крови крыс при остром стрессе. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2000. Т.375, №5. С. 563-566;. Шилов Ю.И, Чуприна В.В., Гаврилова Т.В. и др. Влияние миелопида на пролиферативный ответ лимфоцитов в культурах с митогеном лаконоса у пострадавших с проникающим ранением глаза. Вестник Уральской медицинской академической науки. 2009. №2 (24). С.188–189).
Цель исследования – изучение влияния миелопептидов -3, -5 и -6 на функциональную активность клеток врожденного иммунитета in vitro и in vivo.
Задачи исследования:
-
Исследовать влияние миелопептидов -3, -5 и -6 на фагоцитарную активность нейтрофилов периферической крови человека на фоне гормонов стресса адреналина и гидрокортизона in vitro.
-
Оценить влияние миелопептидов -3, -5 и -6 на спонтанную и стимулированную зимозаном продукцию активных форм кислорода клетками лейкоцитарной взвеси, а также гранулоцитами и моноцитами периферической крови in vitro.
3. Исследовать влияние миелопептидов -3, -5 и -6 на спонтанную и
стимулированную выработку провоспалительных цитокинов интерлейкина 1-бета и
фактора некроза опухоли - альфа культурами клеток цельной крови, а также фракциями
гранулоцитов и моноцитов, выделенных из периферической крови здоровых доноров in
vitro.
4. Оценить влияние миелопептида-3 на спонтанную и стимулированную зимозаном
продукцию активных форм кислорода и синтез провоспалительных цитокинов
интерлейкина 1-бета и фактора некроза опухоли – альфа перитонеальными клетками
мышей при иммобилизационном стрессе, а также стрессе, вызванном проникающим
ранением глаза in vivo.
Методология и методы исследования
Объектом исследований в системе in vitro служила периферическая кровь здоровых доноров-добровольцев в возрасте 18 - 20 лет. Все исследования проводились в соответствии с этическими нормами, с согласия доноров-добровольцев после ознакомления их с условиями и задачами эксперимента. Исследования осуществлялись на культурах цельной крови, а также отдельных фракциях клеток.
Оценку фагоцитарной активности проводили методом Каплина (Каплин, В.Н. Нетрадиционная иммунология инфекций. Пермь: Изд-во Перм. гос. мед. акад.,1996. 163 с.) в модификации Ю.И. Шилова (Шилов Ю.И., Владыкина В.П., Атнагузина А.Т. Некоторые методические подходы к оценке показателей общего и дифференцированного фагоцитоза лейкоцитов периферической крови. Характеристика различий у здоровых людей. Перм. мед. журн. 1998. Т.15, №2. С. 3-9). В качестве объектов фагоцитоза использовали формалинизированные эритроциты барана (ФЭБ).
Оценка кислородзависимой микробицидной активности лейкоцитов осуществлялась с использованием реакции люминолзависимой хемилюминесценции (ЛЗХЛ). Эксперимент проводили в двух вариантах: с предварительной инкубацией клеток с миелопептидами в течение 30 минут до внесения зимозана и одномоментно с внесением индуктора. Регистрация результатов проводилась в течение часа с интервалом в 5 минут с помощью мультимодального планшетного ридера «Infinite» M200, Tecan (Австрия).
Продукцию провоспалительных цитокинов в культурах цельной крови, а также в культурах гранулоцитов и моноцитов. В качестве индуктора синтеза цитокинов использовали опсонизированный зимозан в концентрациях 150 и 1500 мкг/мл. Определение концентрации IL-1 и TNF- человека в полученных супернатантах культур клеток проводилось методом твердофазного иммуноферментного анализа с использованием наборов «Вектор-Бест» (Новосибирск) в соответствии с методикой, предложенной производителем.
Объектом исследований в системе in vivo служили белые мыши-самца породы Swiss. Все эксперименты были проведены в соответствии с рекомендациями и этическими нормами, указанными в «Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых в экспериментальных и других научных целях» (Страсбург, 1985). Животных выводили из эксперимента путем декапитации под эфирным наркозом. Всего в экспериментах было использовано 144 животных.
Проникающее ранение глаза экспериментальным животным наносили по известной и многократно апробированной методике: ранение правого глаза мыши наносили в области лимба (пограничная область между склерой и роговицей) с помощью микролезвия в
условиях местной анестезии (Черешнева М.В., Шилов Ю.И., Гаврилова Т.В. и др. Иммунокоррекция стрессорных и травматических нарушений функций иммунной системы при проникающем ранении глаза. Вестник Уральской медицинской академической науки. 2004. №4. С. 82-87).
Оценку кислородзависимой микробицидной активности перитонеальных клеток
осуществляли с использованием реакции ЛЗХЛ. Определение содержания
провоспалительных цитокинов IL-1 и TNF- в полученных супернатантах культур перитонеальных клеток мышей проводили методом твердофазного иммуноферментного анализа с использованием наборов «R&D Systems», (США). Определение производили в соответствии со стандартной методикой, предложенной производителем.
Степень достоверности, апробация результатов, личное участие автора.
Достоверность проведенных исследований обеспечена достаточным объемом
фактического материала, арсеналом использованных методов исследования,
статистическая обработка полученных результатов адекватны поставленной цели и решаемым задачам. Статистическая обработка данных проведена с использованием программ Statistica 6.0 и Microsoft Exсel 2010. В экспериментах in vitro cтатистический анализ всех данных проводили с использованием парного t-критерия Стьюдента. Различия считались значимыми при p<0,05. В экспериментах in vivo статистический анализ проводили с помощью факторного анализа и непарного t-критерия Стьюдента. Результаты представлены в виде средней арифметической и ее стандартной ошибки (M±m). Обработка данных проведена с использованием современных пакетов прикладных программ, что подтверждает достоверность полученных результатов.
Основные положения работы были доложены и обсуждались на VIII Молодежной научной конференции Института физиологии Коми НЦ УрО РАН (Сыктывкар, 2009г.), II Всероссийском с международным участием конгрессе студентов и аспирантов-биологов «Симбиоз-Россия 2009» (Пермь, 2009 г), III Всероссийском с международным участием конгрессе студентов и аспирантов-биологов «Симбиоз-Россия 2010» (Нижний Новгород, 2010 г.), VII международной конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность» (Москва, 2010 г.); Российском Научном форуме на Урале с международным участием «Актуальные вопросы фундаментальной медицины», 23-25 октября (Екатеринбург, 2014 г).
Личный вклад соискателя состоит в непосредственном участии на всех этапах диссертационного исследования. Планирование научной работы, постановка проблемы, экспериментальная работа и подготовка статей осуществлялись совместно с научными руководителями. Анализ отечественной и зарубежной литературы, статистическая обработка данных, описание и систематизация полученных результатов, написание и
оформление рукописи диссертации выполнялось лично автором под контролем научных руководителей.
Положения, выносимые на защиту:
-
Миелопептиды -3, -5 и -6 модулируют поглотительную способность нейтрофилов периферической крови in vitro.
-
Миелопептиды -3, -5 и -6 in vitro угнетают продукцию активных форм кислорода и секрецию провоспалительных цитокинов активированными лейкоцитами периферической крови.
-
Миелопептид-3 in vivo оказывает модулирующее действие на функции стимулированных зимозаном перитонеальных клеток, отменяя стресс-индуцированное угнетение продукции провоспалительных цитокинов и активных форм кислорода.
Научная новизна. В работе впервые исследовано влияние миелопептидов на фагоцитарную активность нейтрофилов на фоне гидрокортизона и адреналина, впервые показана способность данных пептидов отменять индуцированное гормонами стресса угнетение поглотительной способности нейтрофилов, при этом проявляя собственное угнетающее действие. В работе показано, что миелопептиды МП-3, МП-5 и МП-6 угнетают продукцию активных форм кислорода и секрецию провоспалительных цитокинов активированными лейкоцитами периферической крови, все эффекты проявляются в условиях смешанной клеточной фракции при их одномоментном внесении в культуры с индуктором. Показано, что исследованные миелопептиды обладают сходными эффектами на функциональную активность лейкоцитов. МП-5 и МП-6 оказались более эффективными, нежели МП-3, в отношении очищенных нейтрофилов. В работе впервые установлено, что in vivo МП-3 оказывает модулирующее действие на функции стимулированных зимозаном перитонеальных макрофагов, отменяя стресс-индуцированное угнетение продукции провоспалительных цитокинов и активных форм кислорода.
Теоретическая и практическая значимость работы. Результаты работы расширяют существующие представления об иммуномодулирующем действии миелопептидов. Полученные данные об особенностях иммунорегуляторных эффектов МП-3, МП-5 и МП-6 позволяют утверждать, что эти низкомолекулярные пептидные молекулы эндогенной природы являются перспективной основой для создания иммуномодулирующих пептидных препаратов нового поколения.
В практическом плане работа имеет существенное значение для разработки и внедрения лекарственных препаратов на основе миелопептидов, открывает перспективы для использования их иммуномодулирующих свойств в терапии иммунодефицитных состояний различной этиологии.
Внедрение результатов исследования в практику. Результаты работы внедрены в учебный процесс на кафедре микробиологии и иммунологии Пермского государственного университета (614600, г. Пермь, ул. Букирева, 15).
Конкурсная поддержка. Диссертационная работа выполнена в лаборатории биохимии и развития микроорганизмов в соответствии с планом НИР ИЭГМ УрО РАН и является частью исследований по теме «Исследование механизмов регуляции иммунитета, создание механизмов его контроля» (номер госрегистрации темы НИР 01.9.009927) в рамках Программы фундаментальных исследований Президиума РАН «Фундаментальные науки – медицине», и поддержана грантом РФФИ-Урал-а № 10-04-96021.
Публикации. Соискатель имеет 14 опубликованных работ, из них по теме диссертации опубликовано 14 научных работ общим объемом 1,1 печатного листа, в том числе 7 статей в научных журналах и изданиях, которые включены в перечень российских рецензируемых журналов и изданий для опубликования основных научных результатов диссертаций; 4 работы опубликованы в материалах всероссийских и международных конференций и симпозиумов, 3 работы в журналах, не входящих в перечень рецензируемых журналов и изданий.
Объём и структура диссертации. Работа изложена на 119 страницах, содержит 21 рисунок и 6 таблиц. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, глав собственных исследований, обсуждения результатов, выводов, списка цитируемой литературы, включающего 209 наименований, в том числе 81 отечественных и 124 зарубежных и 3 Интернет-ресурса.
Лекарственные препараты на основе миелопептидов
Иммунитет возникает в ходе эволюции как защитная система от патогенов еще у первых многоклеточных [197]. Иммунная система представляет собой комплекс, включающий в себя специализированные клетки и различные растворимые факторы, компоненты этой системы служат для быстрого и эффективного распознавания и уничтожения потенциально опасных агентов различной природы и происхождения. Важнейшей функцией иммунной системы является способность к распознаванию своего и чужого, поэтому часть клеток иммунной системы циркулируют по организму, но значительное количество находится в барьерных органах, таких как кожа и слизистые, легкие, пищеварительный тракт, репродуктивные органы.
Существует две основных стратегии борьбы с чужеродными агентами: во первых, это распознавание высококонсервативных молекул бактериального, вирусного, грибкового происхождения, которые называются патоген ассоциированными молекулярными паттернами (ПАМП), с помощью патоген-распознающих рецепторов (ПРР) [168]. Врожденный иммунитет является наиболее эволюционно древним, он присутствует у практически всех многоклеточных [197]. Кроме того, врожденный иммунитет является более быстрым и неспецифичным, не требующим времени на подготовку к реакции, способный действовать немедленно [104]. Во-вторых, это система случайной генерации последующей клональной селекции антигенспецифичных рецепторов. Это характерно для адаптивного иммунитета, который имеется лишь у челюстноротых позвоночных [197]. Основными клетками адаптивного иммунитета являются Т- и В- лимфоциты, несущие на своей поверхности Т- и В- клеточные рецепторы соответственно. Механизмы действия адаптивного иммунитета более сложны, требуют дополнительного времени, но более специфичны, а также обладают памятью, поэтому при повторной встрече с чужеродным агентом действует быстрее и эффективнее [104]. Можно с уверенностью утверждать, что в ходе эволюции врожденный и адаптивный иммунитет оказывали влияние друг на друга [197].
Как уже было сказано ранее, клетки врожденного иммунитета распознают не отдельные чужеродные молекулы, а группы высококонсервативных молекул (липополисахариды, липопротеиды, пептидогликаны, флагеллин, нуклеиновые кислоты), характерных для патогенов – PAMP. Некоторые из ПРР могут распознавать так же компоненты погибших или повреждённых клеток. Для этого на их поверхности имеются ПРР, которые включают в себя трансмембранные белки, обследующие внеклеточное пространство, такие как Toll-подобные рецепторы (TLR), расположенные на поверхности клетки и мембранах эндоплазматического ретикулума, и лектиновые рецепторы С-типа (CLR). При контакте рецептора с патогеном образуется мультибелковый комплекс, который запускает каскад реакций, что приводит в конечном счете к активации транскрипционных факторов и высвобождению эффекторных молекул, таких, например, как цитокины и хемокины [168, 177]. Все клетки несут на себе ПРР, но набор различных типов ПРР зависит от типа клетки.
Наиболее хорошо изученной группой ПРР являются Toll-подобные рецепторы. Сейчас известно 11 различных типов TLR у человека. TLR человека и их лиганды представлены в таблице 1. Связывание рецепторов с соответствующими лигандами приводит к мультимеризации рецепторов и запуску внутриклеточных сигнальных путей, которые завершаются выделением определенных транскрипционных факторов, например, NF-B и AP-1. Эти и другие транскрипционные факторы координируют синтез про- и противовоспалительных цитокинов и хемокинов, подготавливая иммунную систему к борьбе с инфекцией [159, 177]. Кроме PAMP, TLR способны связывать и DAMP (damage-associated molecular patterns), которые являются компонентами ядерного, цитоплазматического, митохондриального происхождения и выделяются при некрозе клеток в межклеточное пространство (например, белки теплового шока (hsp), АТФ, сульфат гепарина, ДНК, мочевая кислота и др.) [177].
Функцию распознавания чужеродных агентов выполняют не только TLR, они находятся во взаимодействии с различными адаптерными белками, например, MyD88, MAL/TIRAP, TRIF, TRAM, которые участвую в частности в проведении сигнала и запуске каскадов внутриклеточных реакций [177].
Кроме TLR существуют и другие ПРР, например, ЛПС-связывающий протеин, CD14, характерный в основном для макрофагов и нейтрофилов, связывает разнообразные PAMP бактериальной поверхности: ЛПС, пептидогликаны, липотейхоевые кислоты, липоарабиноманнаны, липопротеины и др.) [177].q
Оценка фагоцитарной активности нейтрофилов периферической крови человека
Выделение гранулоцитов производили путём центрифугирования верхнего слоя плазмы с лейкоцитами, полученными из гепаринизированой крови доноров, на градиенте плотности фиколл-верографин =1,077. Полученный после центрифугирования супернатант с мононуклеарными клетками собирали в отдельную пробирку, дважды отмывали от фиколла в среде RPMI 1640 и инкубировали в течение 1 часа при 37С стеклянной чашке Петри. Затем, надосадочную жидкость сливали, а моноциты собирали с чашки при помощи скребка. Осадок, полученный после разделения фракций на градиенте плотности фиколл-верографин, содержащий гранулоциты, собирали и дважды отмывали от фиколла в среде RPMI 1640. Чистота популяций гранулоцитов и моноцитов, выделенных таким способом, составила 95-98%.
МП добавлялись в культуры клеток в следующих концентрациях: МП-3 – 10-8 г/мл, МП-5 и МП-6 – 10-7 г/мл [18]. Использованные в работе миелопептиды любезно предоставлены профессором Е.А. Кирилиной, Институт биоорганической химии им. Шемякина и Овчинникова, г. Москва.
При исследовании влияния МП на фагоцитарную активность в часть культур также добавлялись адреналин, или гидрокортизона в концентрации 10-6М.
Для оценки фагоцитарной активности был выбран метод Каплина [35] в модификации Ю.И. Шилова [79]. В качестве объектов фагоцитоза использовали формалинизированные эритроциты барана. Рабочую суспензию ФЭБ после многократной отмывки, а также рабочие растворы гормонов и пептидов готовили на среде 199. В пробирки «Эппендорф» вносили по 100 мкл гепаринизированной крови, 25 мкл гормона (адреналина, либо гидрокортизона), а также миелопептид (МП-3, МП-5, МП-6). Далее пробы инкубировались в течение 1 часа при температуре 37С. После этого, к пробам добавлялось по 50 мкл ФЭБ в концентрации 200106 клеток/мл, и производилась инкубация в течение 20 минут при температуре 37 C. Затем содержимое каждой пробы ресуспендировали и переносили по 15 мкл на предметное стекло, готовили мазок, который после фиксации метанолом окрашивали по Романовскому и микроскопически оценивали процент фагоцитоза и фагоцитарное число. Общая схема эксперимента представлена на рисунке 1. 75555
Оценку кислородзависимой микробицидной активности лейкоцитов осуществляли с использованием реакции люминолзависимой хемилюминесценции (ЛЗХЛ) (рисунок 2). Реакцию проводили в 96-луночных плоскодонных планшетах (Greiner, Германия), каждая лунка содержала 105 клеток в 100 мкл раствора Хенкса. В качестве индуктора ЛЗХЛ использовали опсонизированный зимозан в концентрации 150 мкг/мл. В качестве маркера выраженности реакции ЛХЗЛ использовался люминол (10-5М), свечение которого не избирательно по отношению к различным кислородсодержащим радикалам [161]. Общий объем исследуемого раствора в каждой лунке составил 200 мкл. Эксперимент проводили в двух вариантах: с предварительной инкубацией клеток с миелопептидами за 30 минут при 37С до внесения зимозана и одномоментно с внесением индуктора. Регистрация результатов проводилась в течение часа с интервалом в 5 минут с помощью мультимодального планшетного ридера «Infinite» M200, Tecan (Австрия).
Гранулоциты и моноциты культивировали (рисунок 3) в полной питательной среде (ППС), приготовленной на основе RPMI-1640 с добавлением 10 mM HEPES («Sigma»), 2 mM L-глутамина («Sigma»), 100 мкг/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина и 10% ЭТС («Биолот», г. Санкт-Петербург) в стерильных условиях и вносили в концентрации 106 клеток/мл в 24-луночные планшеты в ППС. В лунки вносили МП-3, МП-5, или МП-6 в указанных ранее концентрациях. В качестве индуктора синтеза цитокинов использовали опсонизированный зимозан в концентрациях 150 и 1500 мкг/мл.
Культивирование проводилось при 37С во влажной атмосфере в течение 24 часов. После этого супернатанты культур центрифугировали в течение 10 мин, надосадочную жидкость снимали и замораживали в пробирках «Эппендорф» при -20 С.
Продукцию провоспалительных цитокинов в культурах цельной крови исследовали по ранее описанной методике [140, 169]. Для этого 10 мкл цельной гепаринизированной крови культивировали в 96-луночных планшетах в ППС. В лунки вносили МП-3, МП-5, или МП-6 в указанных ранее концентрациях. В качестве индуктора синтеза цитокинов использовали опсонизированный зимозан в концентрациях 150 и 1500 мкг/мл. Культивирование проводилось при 37С во влажной атмосфере в течение 24 часов. После этого пробы переносили в пробирки и центрифугировали в течение 10 мин, надосадочную жидкость снимали и замораживали в пробирках «Эппендорф» при -20 С (рисунок 3).
Определение концентрации IL-1 и TNF- человека в полученных супернатантах культур клеток проводили методом твердофазного иммуноферментного анализа с использованием наборов «Вектор-Бест» (Новосибирск) в соответствии с методикой, предложенной производителем. 62 Рисунок 3 - Схема постановки эксперимента по оценке влияния МП-3, МП-5 и МП-6 на продукцию провоспалительных цитокинов цельной кровью, а также фракциями гранулоцитов и моноцитов периферической крови человека
В качестве стрессорного воздействия использовался 2-х часовой им-мобилизационный стресс, а также проникающее ранение глаза в условиях местной анестезии. Поскольку согласно данным литературы среди всех миелопептидов именно МП-3 оказывает направленное действие на клетки врожденного иммунитета, в качестве потенциального модулятора в экспериментах in vivo мы выбрали именно этот пептид. МП-3 вводили внутрибрюшинно за 30 минут до начала стресса в дозе 40 мкг/кг [17]. Животные были разделены на 4 группы: 1-я -контрольная; 2- я – стресс или ранение глаза; 3-я – стресс или ранение глаза на фоне введения МП-3; 4-я – введение одного МП-3. После окончания стресса, либо через 2 часа после нанесения травмы глаза, животных выводили из эксперимента методом декапитации под эфирным наркозом (рисунок 4).
Проникающее ранение глаза экспериментальным животным наносили по известной и многократно апробированной методике [74]. Ранение правого глаза мыши наносили в области лимба (пограничная область между склерой и роговицей) с помощью микролезвия в условиях местной анестезии. При этом происходило ранение роговицы, склеры и сосудистого тракта. После травмы во всех случаях наблюдалось истечение внутриглазной жидкости и стекловидного тела. Иногда имело место повреждение хрусталика, истечение крови в переднюю камеру и стекловидное тело.
Влияние МП на продукцию активных форм кислорода лейкоцитами периферической крови человека
Таким образом, миелопептиды МП-3, МП-5 и МП-6 угнетают продукцию провоспалительных цитокинов активированными лейкоцитами периферической крови. В условиях предварительной обработки клеток влияние миелопептидов на продукцию цитокинов отсутствовало, что свидетельствует о достижении максимального эффекта препаратов при одномоментном внесении в культуры с зимозаном. Можно предположить, что влияние миелопептидов на продукцию провоспалительных цитокинов, также, как и на продукцию активных форм кислорода, зависит от степени стимуляции клеток. Обращает на себя внимание тот факт, что миелопептиды оказывают влияние на лейкоциты цельной крови, но не влияют на эту функцию отдельных фракций лейкоцитов, поэтому можно предположить, что для проявления эффекта миелопептидов необходимо взаимодействие разных клеточных популяций лейкоцитов. Несмотря на многочисленные данные литературы о специфичности воздействия разных фракций миелопептидов, наши исследования показывают, что изученные миелопептиды оказывают сходный эффект [1, 5, 6, 9, 10, 11, 12].
Известно, что стресс и травматическое воздействие угнетают функциональную активность клеток врожденного иммунитета. Миелопептиды же зарекомендовали себя в качестве модуляторных молекул, способных приводить к норме нарушенные функции клеток иммунной системы, не оказывая при этом побочных эффектов. Поскольку согласно многочисленным данным литературы клетки макрофаги являются мишенью для МП-3, нами было решено оценить влияние введения этого миелопептида на функциональную активность перитонеальных клеток – синтез провоспалительных цитокинов и активных форм кислорода в условиях их угнетения травматическим воздействием или стрессом.
Установлено, что 2-х часовой иммобилизационный стресс достоверно угнетал спонтанную (рисунок 17А) продукцию активных форм кислорода клетками перитонеального смыва мышей с 30 по 60 мин наблюдений. В стимулированных зимозаном культурах (рисунок 17Б) аналогичный эффект стресса был выявлен с 20 по 60 мин наблюдений. У мышей, которым за 30 минут до иммобилизации был введен внутрибрюшинно МП-3 в дозе 40 мкг/кг (0,8 мкг/мышь), подавляющий эффект стресса отсутствует как в спонтанном, так и в стимулированном варианте реакции ЛЗХЛ. Причем в случае стимулированной реакции в виде тенденции присутствует стимулирующий эффект МП-3 на продукцию АФК у стрессированных мышей.
Влияние МП-3 на спонтанную (А) и зимозан-индуцированную (150 мкг/мл) (Б) ЛЗХЛ перитонеальных клеток в условиях иммобилизационного стресса (красный цвет - p 0,05 по сравнению с контролем, синий цвет - p 0,05 по сравнению со стрессом по непарному t-критерию Стьюдента) Индивидуального эффекта внутрибрюшинного введения МП-3 на спонтанную и стимулированную ЛЗХЛ не было обнаружено, хотя с 0 про 20 мин измерения в виде тенденции наблюдается стимуляция МП-3 продукции АФК перитонеальными клетками.
Как видно из рисунков 18А и 18Б достоверного угнетающего эффекта травмы глаза на продукцию активных форм кислорода ни в спонтанных, ни в стимулированных пробах выявить не удалось. Можно отметить лишь тенденцию к угнетению продукции АФК на фоне проникающего ранения.
Влияние МП-3 на спонтанную (А) и зимозан-индуцированную (150 мкг/мл) (Б) ЛЗХЛ перитонеальных клеток в условиях ПРГ (красный цвет - p 0,05 по сравнению с контролем, синий цвет - p 0,05 по сравнению со стрессом по непарному t-критерию Стьюдента) Предварительное внутрибрюшинное введение МП-3 восстанавливало слегка угнетенную травмой продукцию АФК. В случае стимулированной реакции ЛЗХЛ можно даже отметить тенденцию в стимуляции реакций кислородзависимой микробицидности у травмированных мышей при предварительном введении им МП-3. Введение одного МП-3 на продукцию АФК не влияло.
При анализе влияния стресса и МП-3 на продукцию провоспалительных цитокинов установлено, что стресс угнетал продукцию IL-ip перитонеальными клетками в зимозан-активированных культурах (рисунок 19А). У животных, которым на фоне стресса вводили МП-3, снижения продукции IL-ip не наблюдалось и показатели в этой группе не отличались от контроля. Введение МП-3 нестрессированным животным, напротив, приводило к стимуляции продукции IL-ip. В нестимулированных культурах динамика продукции IL-ip не изменялась. Продукция TNF- в зимозан-стимулированных культурах (рисунок 19Б) менялась схожим образом: иммобилизационный стресс снижал продукцию цитокина, а введение на фоне стресса МП-3 приводило к выравниванию уровня продукции TNF- до уровня контрольной группы. Введение МП-3 нестрессированным животным приводило к усилению продукции TNF-. В нестимулированных культурах стресс, как и изолированное введение МП-3, угнетал продукцию TNF- по сравнению с контролем. При этом совместное влияние стресса и МП-3 значимого влияния на продукцию TNF- не оказало. При проведении факторного анализа было установлено, что в индуцированных зимозаном культурах стресс (F=66,7; р=0,0001) и МП-3 (F=9,16; р=0,016) оказывают статистически значимое влияние на продукцию IL-lp, не взаимодействуя между собой (F=0,06; р=0,807). Аналогичное воздействие было обнаружено на стимулированную продукцию TNF-: стресс (F=24,18; р=0,001), МП-3 (F=45,84; р=0,0001), взаимодействие факторов (F=0,15; p=0,710). В нестимулированных культурах на продукцию IL-ip влияния факторов не выявлено. При анализе влияния на продукцию TNF- было установлено статистически значимое взаимодействие факторов стресса и МП-3 (F=253,l;p=0,0001).
Влияние МП на синтез IL-1 и TNF- нейтрофилами и моноцитами периферической крови
Как было показано в работах многих авторов, миелопептиды обладают, в первую очередь, корригирующим эффектом, их действие проявляется на фоне депрессии какой-либо функции иммунной системы в результате облучения, травмы, стресса и т.д. [1, 2, 3, 4, 7, 24, 43, 44, 48].
Известно, что адреналин и гидрокортизон являются мощными супрессорами различных звеньев иммунной системы, в том числе они проявляют угнетающее воздействие на фагоцитарную активность клеток [76, 150, 179]. В литературе представлены данные о стимулирующем влиянии Миелопида на фагоцитарную активность лейкоцитов in vitro и in vivo [73]. МП-3 стимулирует фагоцитарную активность перитонеальных макрофагов мыши в условиях бактериального заражения [49]. Кроме того, известен факт корригирующего действия МП-3, направленного в первую очередь на моноцитарно-макрофагальное звено иммунитета [49]. Однако есть данные и о том, что он может оказывать эффект и на другие клетки (ДК, гранулоциты) [19, 69]. Результаты, полученные в ходе нашего исследования влияния миелопептидов на фагоцитарную функцию нейтрофилов периферической крови на фоне гормонов стресса, не противоречат данным литературы. Биологическая активность МП-5 и МП-6 изучена недостаточно, исследуется в настоящее время [48], уже показан их противоопухолевый эффект [45, 47, 68], но влияние на функциональную активность клеток врожденного иммунитета практически не изучена.
На основании данных полученных в ходе анализа литературы можно предложить следующую гипотезу: введение в культуры гормонов стресса будут угнетать функциональную активность клеток врожденного иммунитета, а миелопептиды, в свою очередь будут отменять супрессивный эффект гормонов стресса. Результаты проведенных нами исследований подтверждают способность МП-3, МП-5 и МП-6 воздействовать на нейтрофилы, угнетая их фагоцитарную активность и нивелировать эффекты гормонов стресса. Результат экспериментов in vivo не столь однозначны. Стресс и травма оказали различное действие на функциональную активность перитонеальных макрофагов. В целом, можно заключить, что иммобилизационный стресс оказал более выраженный и однонаправленный эффект, который отменялся введением МП-3, что лишь подтверждает гипотезу, изложенную ранее. Влияние проникающего ранения глаза оказалось разнонаправленным и вероятно зависело от степени стимуляции клеток.
Известно, что хирургическое вмешательство оказывает сложный и многогранный эффект на иммунную систему, который может быть, как угнетающим, так и стимулирующим. Так, хирургическое вмешательство угнетает фагоцитарную активность и продукцию активных форм кислорода лейкоцитами, снижает число нейтрофилов и моноцитов [66]. Важным компонентом любого хирургического вмешательства является предоперационный эмоциональный стресс, который нельзя исключить и для экспериментальных животных, подвергнутых проникающему ранению глаза. Эмоциональный стресс приводит к увеличению выработки гипофизом АКТГ, который, в свою очередь, влияет на надпочечники, стимулируя выработку в них кортизола и адреналина. Эти гормоны способны связываться со специфическими рецепторами на мембране, усиливая синтез вторичного мессенджера - цАМФ, что приводит к угнетению функциональной активности клеток. Немаловажен и тот факт, что известно 2 типа адренорецепторов на поверхности лейкоцитов, связывание гормона с которыми приводит к противоположным эффектам [145].
Отсутствие статистически значимых эффектов травматического воздействия можно объяснить несколькими фактами: во-первых супрессорный эффект достигает своего пика на 2 день после хирургического вмешательства или травмы, во-вторых, степень выраженности угнетающего эффекта зависит напрямую от масштаба вмешательства, который в нашем случае был незначительным, в-третьих супрессия тем сильней, чем ближе клетки иммунной системы находятся к месту оперативного вмешательства, в-четвертых угнетение функциональной активности клеток иммунной системы зависит от наличия кровотечения, которое в нашем эксперименте не наблюдалось [66].
Ранние исследования показали, что Миелопид обладает корригирующим эффектом в отношение кислородзависимой бактерицидности: отменяет депрессию этой функции клеток крови при экспериментальным проникающим ранением глаза, что подтверждается данными НСТ-теста [74]. Данных по влиянию отдельных миелопептидов на кислородзависимую бактерицидность клеток в литературе найдено не было. Обнаруженное нами влияние миелопептидов на секреторную активность лейкоцитов позволяет предположить, что их эффекты носят модулирующий характер и зависят от степени стимуляции клеток, а также от времени воздействия миелопептидов: исследуемые миелопептиды оказывают угнетающий эффект на кислородзависимую бактерицидность лейкоцитов и нейтрофилов только в стимулированном варианте ЛЗХЛ, но не влияют на спонтанную ЛЗХЛ, что не противоречит данным литературы.
Данные литературы о влиянии миелопептидов на продукцию IL-1 и TNF- противоречивы, возможно эффекты миелопептидов зависят от выбранного объекта исследования. Так, например, одним коллективом авторов было показано, что МП-3 не влияет на продукцию цитокинов IL-1 и TNF- перитонеальными мышиными макрофагами [7], однако другой коллектив авторов представил данные, свидетельствующие о том, что МП-3, МП-5 и МП-6 снижают продукцию IL-1 и TNF- в ЛПС-индуцированных культурах моноцитов, нейтрофилов и мононуклеаров периферической крови человека [22]. В нашей работе был использован другой стимулятор - опсонизированный зимозан (компонент клеточной стенки Saccharomyces cerevisiae) в двух концентрациях (150 и 1500 мкг/мл), что позволило выявить особенность влияния миелопептидов на продукцию цитокинов в зависимости от степени активации. Полученные нами данные не противоречат данным представленным ранее [22].