Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 14
1.1. Фагоцитарное звено свободнорадикального гомеостаза крови 14
1.2. Свободнорадикальные реакции с участием гемоглобина 28
1.3. Липидные гидропероксиды и методы их определения 34
1.4. Сывороточный альбумин человека как участник свободнорадикальных реакций 41
1.5. Свободнорадикальный гомеостаз и его нарушения 53
1.5.1. Роль свободных радикалов в жизнедеятельности клетки 53
1.5.2. Оксидативный стресс 57
1.5.3. Карбонильный стресс 58
1.5.4. Нитрозативный/нитрозирующий стресс 61
1.5.5. Редуктивный стресс 63
1.6. Диагностика нарушений свободнорадикального гомеостаза 65
Глава 2. Пациенты, материалы и методы исследования 68
2.1. Пациенты 68
2.2. Материалы и реактивы 72
2.3. Оборудование 74
2.4. Программное обеспечение 75
2.5. Методики 75
Глава 3. Нейтрофилы крови как источник свободных радикалов 78
3.1. Разработка метода анализа радикал-продуцирующей активности нейтрофилов крови 78
3.1.1. Эффект двухстадийной стимуляции на радикал-продуцирующую активность нейтрофилов крови 78
3.1.2. Использование различных хемилюминесцентных зондов в параллельных измерениях 3.1.3. Деконволюция хемилюминограммы на квадратично-экспоненциальные функции 90
3.2. Механизм развития быстрой и медленной фМЛФ-индуцированной вспышки 91
3.3. Изучение фенотипа нейтрофилов при стимуляции ФМА 93
3.4. Изучение действия других стимулов 99
3.5. Применение метода оценки радикал-продуцирующей функции фагоцитов крови для целей клинического лабораторного анализа 102
3.5.1. Пратически здоровые доноры 102
3.5.2. Ожоговая болезнь 103
3.5.3. Сахарный диабет II типа 109
3.5.4. АНЦА-ассоциированные системные васкулиты 110
3.5.5. Системная красная волчанка 112
3.5.6. Беременные и пациентки с угрозой прерывания беременности 113
3.5.7. Миелодиспластический синдром 116
Глава 4. Определение липидных гидропероксидов 119
4.1. Определение липидных гидропероксидов методом ИК-спектроскопии 119
4.2. Определение липидных гидропероксидов методом активированной хемилюминесценции 125
4.2.1. Модельная аналитическая система на основе соевого лецитина 125
4.2.2. Хемилюминесцентное определение липидных гидропероксидов в системе субстрат Fe(II)-кумарин С-525 127
4.2.3. Определение липидных гидропероксидов в системе микропероксидаза – изолюминол 129
4.2.4. Определение липидных гидропероксидов в фолликулярной жидкости и мембранах клеток 132
Глава 5. Гемоглобин как липидный прооксидант 133
5.1. Взаимодействие гемоглобина с липидами и фосфолипидами 133
5.2. Прооксидантная активность гемоглобина по отношению к липидам 135
Глава 6. Альбумин как мишень свободных радикалов 140
6.1. Альбумин как мишень действия ультрафиолетового излучения 140
6.1.1. Изменение антиоксидантных и флуоресцентных свойств тирозина, триптофана и альбумина под действием УФ-облучения 141
6.1.2. Карбонилирование под действием ультрафиолетового излучения 145
6.1.3. Изменение связывающих свойств альбумина под действием ультрафиолета 146
6.1.4. Ишемически модифицированный альбумин: роль окислительной модификации 148
6.1.5. Изменение дзета-потенциала альбумина под действием ультрафиолета 149
6.1.6. Влияние ультрафиолетового излучения на флуоресценцию глобулинов 150
6.2. Альбумин как мишень действия индукторов оксидативного стресса 151
6.2.1. Окислительная модификация альбумина под действием ультразвука 151
6.2.2. Окислительная модификация альбумина под действием химических агентов 151
6.2.3. Окислительная модификация альбумина активированными нейтрофилами 152
6.3. Клиническое значение ДОА при некоторых патологиях 153
Глава 7. Оценка антиоксидантного профиля плазмы крови 157
7.1. Разработка методики 158
7.2. Антиоксидантный профиль плазмы при некоторых заболеваниях 164
7.2.1. Антиоксидантная емкость «сильной» фракции 164
7.2.1. Антиоксидантная емкость «средней» фракции 167
7.2.3. Прооксидантная емкость плазмы 168
7.3. Антиоксидантный профиль фолликулярной жидкости 169
7.4. Определение активности супероксиддисмутазы в плазме крови 172
Глава 8. Методология лабораторной оценки свободнорадикального гомеостаза крови 175
8.1. Круг решаемых клинических и аналитических задач 175
8.2. Разработанность аналитических процедур 177
8.3. Аналитическая надежность, информативность, экспрессность, стоимость 178
8.4. Референтные интервалы 180
8.5. Комплексность подхода и его клиническая информативность 181
Заключение 186
Выводы 192
Практические рекомендации 194
Список работ, опубликованных по теме диссертации 196
Публикации в журналах из списка ВАК 196
Тезисы докладов 199
Список литературы 203
- Липидные гидропероксиды и методы их определения
- Изучение фенотипа нейтрофилов при стимуляции ФМА
- Клиническое значение ДОА при некоторых патологиях
- Комплексность подхода и его клиническая информативность
Введение к работе
Актуальность темы
Традиционно свободные радикалы и их реакционноспособные метаболиты рассматривались как повреждающие агенты, образующиеся при патологии и ее усугубляющие, что дало Г. Зису основание ввести понятие «оксидативного стресса» — патологического состояния, связанного с избыточной продукцией свободных радикалов и их биохимически активных метаболитов, превышающего возможности защиты антиоксидантной системы и ведущее к деструктивным последствиям для клетки и организма. В рамках концепции негативного влияния свободнорадикальных процессов на жизнедеятельность организма были изучены различные патологические состояния и накоплено много данных, свидетельствующих о том, что оксидативный стресс действительно имеет место при многих болезнях и связан с такими патологическими состояниями как гипоксия, опухолевый рост, дегенеративные процессы, старение. Фактически не оказалось ни одного заболевания, в котором в той или иной мере не проявлялся бы оксидативный стресс, в одних случаях являясь причиной или первичным звеном патогенеза, в других — следствием.
Прогресс в области молекулярной медицины в настоящее время приводит к
пересмотру роли свободных радикалов и их метаболитов. Становится очевидно, что
свободные радикалы и продукты их превращения необходимы для физиологической
жизнедеятельности клетки. Они являются регуляторами ряда метаболических и сигнальных
путей, обеспечивают пролиферацию клеток, их выживаемость, метаболизм,
провоспалительный ответ и ответ на повреждение ДНК. Также становится очевидным, что
не имеет значение только состояние стресса, — декомпенсированного дисбаланса — но и
сдвиг свободнорадикального баланса без повреждения, но ведущий к модуляции
сигнальных и эпигенетических процессов. Например, с участием свободных радикалов
происходит модулирование каскада протеинкиназы С, взаимодействие с
транскрипционным фактором Nrf2, активация каскада NF-B, уменьшение деградации фактора HIF1, влияние на редокс-потенциал клетки через систему пероксид водорода-глутатион-глутатионпероксидаза.
Таким образом, изучение свободнорадикальных процессов на разных уровнях организации — клетка, ткань, орган, организм — приобретает новое значение для понимания процессов, лежащих в основе нормальной жизнедеятельности и патологии и дает возможность контролировать эти процессы.
В настоящее время основным подходом рутинной оценки выраженности оксидативного стресса является определение биомаркеров методом ELISA, а «золотым стандартом» научных исследований является чрезвычайно дорогостоящий и требующий высокой квалификации оператора метод масс-спектрометрии и хромато-масс-спектрометрии. Не умаляя значимости маркерного подхода, следует отметить его очевидные недостатки: а) неизвестен точный механизм образования ряда маркеров, неясно, какие события и когда привели к их образованию, в том числе не всегда известно влияние других видов метаболического стресса, б) многие маркеры нестабильны и превращаются в метаболиты в течение отбора пробы и хранения, в) неизвестен «выход» продукта реакции и, следовательно, ставится под вопрос связь с глубиной оксидативного стресса, г) антитела к маркерам в ряде случаев неспецифичны или обладают разным аффинитетом, д) во многих случаях не ясна связь с клинической ситуацией (клиническая релевантность). Уровню доказательности А удовлетворяют менее десятка маркеров, в числе которых малоновый диальдегид, 8-оксо-2-дезоксигуанозин (маркер повреждения ДНК), 8-изопростаны (маркеры окисления липидов), карбонилы белков. За рубежом и в России фирмы выпускают наборы реагентов для определения двух-трех десятков маркеров оксидативного стресса, а также антиоксидантной емкости или активности антиоксидантных ферментов.
Более целесообразным является подход, основанный на прямой оценке активности
основных прооксидантов, а также состоянии основных мишеней воздействия свободных
радикалов — белков и липидов. Фактически, всю обширную совокупность реакций с
участием свободных радикалов можно назвать свободнорадикальным гомеостазом и
поставить целью описание свободнорадикального профиля пациента. В качестве
аналитических должны быть использованы методы с перспективой внедрения в
клиническую лабораторную практику. Одним из таких методов является
хемилюминесцентная фотометрия, обладающая рядом важных преимуществ:
аналитической чувствительностью, аналитической информативностью, селективностью за счет выбора активаторов, простотой аппаратурной реализации и экспрессностью. Этот метод в непрямом варианте позволяет оценить антиоксидантную емкость пробы.
В плане клинической лабораторной диагностики, за рубежом имеются отдельные немногочисленные компании, предоставляющие услуги по количественному определению ограниченного набора показателей (супероксиддисмутаза, глутатион и связанные с ним ферменты) с указанием референтных интервалов. В России нет ни утвержденных методов, ни кандидатов на эти методы, тем более не разработано рекомендаций врачу по интерпретации результатов. Это связано с отсутствием систематических исследований,
нацеленных на разработку подходов и методов оценки состояния свободнорадикального гомеостаза для целей клинической лабораторной диагностики.
Степень научной разработанности темы
Изучение свободнорадикальных реакций в живых системах началось более
пятидесяти лет назад. Достижения свободнорадикальной биологии и медицины можно
суммировать следующим образом: 1) изучены ферментные и неферментные механизмы
продукции свободных радикалов в клетках: НАДФН-оксидазы, ксантиноксидаза,
митохондриальные и микросомальные дыхательные цепи, циклооксигеназы,
липоксигеназы, пероксидазы и другие ферменты., перекисное окисление липидов, катализируемое металлами переменной валентности, редокс-реакции гемоглобина; 2) есть данные о степени выраженности и роли оксидативного стресса при многих патологиях; 3) найдено около двух сотен маркеров оксидативного стресса, несколько десятков из которых имеют ту или иную клиническую релевантность и могут быть использованы для оценки глубины протекания оксидативного стресса, 4) разработан ряд хемилюминесцентных методик для изучения свободнорадикальных реакций и определения антиоксидантов, 5) имеются промышленно выпускаемые наборы реагентов и даже отдельные клинические диагностические лаборатории, проводящие диагностику оксидативного стресса по немногим позициям — общие антиоксиданты, супероксиддисмутаза, каталаза, глутатион, общие АФК по способности окислять железо(II).
Тем не менее, в области фундаментальной и практической медицины остается много нерешенных задач, в частности в области клинической лабораторной диагностики свободнорадикального гомеостаза: 1) не выработана концепция оценки состояния свободнорадикального гомеостаза у здоровых и больных, на основании которой можно было бы сформулировать рекомендации для врача-лаборанта и врача-клинициста; 2) не предложено методик оценки уровня оксидативного стресса в разных звеньях гомеостаза, на основании которых можно было бы предложить диагностические и прогностические параметры; 3) имеющееся на сегодняшний день разнообразие методик используется разрозненно отдельными научными группами, в итоге получаемые результаты несопоставимы между собой и не имеют ценности для практики клинической лабораторной диагностики.
Все вышеизложенное обусловило формулировку цели и постановку задач.
Цель исследования: Разработка комплекса методов и методологии клинической лабораторной оценки состояния свободнорадикального гомеостаза крови на основе выявленных механизмов протекания свободнорадикальных реакций в организме человека.
Задачи исследования:
-
Исследовать механизм ответа нейтрофилов крови на двухстадийную стимуляцию, разработать метод анализа радикал-продуцирующей активности нейтрофилов, оценить его клиническую релевантность.
-
Предложить способ оценки прооксидантной активности гемоглобина и его производных.
-
Разработать методики определения прооксидантной активности липидных гидропероксидов.
-
Изучить механизмы окислительного повреждения сывороточного альбумина человека, предложить способ количественной оценки окислительного повреждения, оценить клиническую релевантность этого параметра.
-
Разработать подход к оценке антиоксидантного профиля биологических жидкостей, выявить механизмы формирования аналитических сигналов, оценить клиническую релевантность предложенного подхода.
-
Выработать методологические принципы применения разработанного комплекса методов и интерпретации показателей.
Методология и методы исследования
Большинство методик были разработаны с использованием метода
хемилюминесцентной фотометрии в присутствии активаторов. Также были использованы
спектрофлуориметрия, спектрофотометрия, ИК-спектроскопия, проточная
цитофлуориметрия.
В исследование вошли 469 практически здоровых доноров и пациентов: практически здоровые доноры (n = 150), пациенты с ожоговой травмой (n = 34), с сахарным диабетом II типа (n = 50), с системной красной волчанкой (n = 46), с системными АНЦА-ассоциированными васкулитами (n = 40), практически здоровые беременные женщины (n = 61), пациентки с привычным невынашиванием беременности (n = 28), женским бесплодием (n = 32), миелодиспластическим синдромом (n = 28). Все пациенты проходили клиническое и лабораторное обследование и лечение под контролем соответствующих специалистов в лечебных учреждениях г. Москвы.
В качестве объектов исследования использовали цельную кровь, плазму крови, фолликулярную жидкость. Исследование включало анализ этих объектов при помощи предложенных методов в сопоставлении с клиническими и лабораторными данными.
Математическое моделирование кинетических кривых проводили с использованием специально разработанного программного модуля на платформе LabView (автор А.Ю. Рябов). Полученные данные обрабатывали статистическими методами при помощи пакета «STATISTICA v.10» (StatSoft).
Научная новизна
Разработан новый способ оценки радикал-продуцирующей активности
нейтрофильных гранулоцитов крови, заключающийся в последовательной стимуляции их двумя стимулами с различным механизмом действия и регистрации отклика этих клеток во времени при помощи метода активированной хемилюминесценции с последующей деконволюцией кинетической кривой. Двухстадийная стимуляция форбол-12-миристат-13-ацетатом и N-формилметионил-лейцил-фенилаланином дала возможность получить единообразную форму кривых за счет нивелирования влияния возможной предактивации фагоцитов в организме.
На основании этого метода удалось предложить новые параметры: удельную радикал-продуцирующую активность фагоцита при двухстадийной стимуляции, коэффициент затухания продукции активных форм кислорода, коэффициент активации при двухстадийной стимуляции.
Впервые при помощи разработанного метода двухстадийной стимуляции нейтрофилов показано наличие в крови как минимум двух популяций нейтрофилов крови, характеризующихся различной кинетикой продукции свободных радикалов в ответ на рецепторный стимул и различным соотношением доли внеклеточной и внутриклеточной продукции свободных радикалов, а именно: популяция «быстрых» нейтрофилов, характеризующаяся продукцией свободных радикалов в течение первых минут в основном во внеклеточную среду и популяция «медленных» нейтрофилов, характеризующаяся отсроченной продукцией свободных радикалов преимущественно внутриклеточно.
Впервые для оценки радикал-продуцирующей активности нейтрофилов крови для целей клинической лабораторной диагностики предложены параметры, основанные на соотношении активности «быстрой» и «медленной» популяций, определенной по кинетической кривой отклика нейтрофилов на двухстадийную стимуляцию.
Впервые показано, что окислительное повреждение альбумина физическими факторами (ультрафиолетовое излучение, ультразвук), химическими факторами (гипохлорит, пероксильные радикалы, пероксид водорода, трет-бутилгидропероксид, гидроксильные радикалы), биологическими (активированные нейтрофилы), приводит к
дозозависимому снижению триптофановой флуоресценции, может быть использовано в качестве универсального лабораторного параметра для оценки глубины нарушений свободнорадикального гомеостаза в белковом звене. Показана корреляция предложенного параметра — относительного снижения триптофановой флуоресценции — с нарушением лиганд-связывающих свойств альбумина и изменением дзета-потенциала.
Впервые для целей лабораторного анализа предложен способ оценки антиоксидантного профиля биологических жидкостей, основанный на методе активированной хемилюминесценции и позволяющий оценивать активность сильных антиоксидантов и белков, а также прооксидантную активность альбумина. Оценена клиническая релевантность предложенных параметров для некоторых патологий: АНЦА-ассоциированные васкулиты, системная красная волчанка, привычное невынашивание беременности, практически здоровые беременные женщины.
Впервые для целей клинического лабораторного анализа предложен комплекс
методик, основанный преимущественно на кинетической активированной
хемилюминесценции с использованием единого оборудования, позволяющий оценить состояние свободнорадикального гомеостаза организма человека по анализу крови (системный свободнорадикальный гомеостаз), других жидкостей, таких как фолликулярная жидкость (локальный свободнорадикальный гомеостаз).
Положения, выносимые на защиту:
1. Способ оценки радикал-продуцирующей функции фагоцитов крови, заключающийся в
последовательной стимуляции их двумя стимулами с различным механизмом действия
и регистрации отклика этих клеток во времени при помощи метода активированной
хемилюминесценции с последующей деконволюцией кинетической кривой, дает
возможность получить единообразную форму кривых отклика за счет нивелирования
влияния возможной предактивации фагоцитов в организме; клиническую
релевантность имеют следующие параметры, характеризующие радикал-
продуцирующую функцию фагоцитов крови: удельная радикал-продуцирующая
активность «быстрого» фагоцита, коэффициент двойной стимуляции, коэффициент
затухания, соотношение активностей «быстрой» и «медленной» популяции фагоцитов,
рассчитанное в результате деконволюции кинетической кривой.
2. В крови человека существует как минимум две популяции фагоцитов, отличающиеся
кинетикой продукции свободных радикалов в ответ на двойную последовательную
стимуляцию форбол-12-миристат-13-ацетатом и N-формилметионил-лейцил-
8
фенилаланином: популяция «быстрых» фагоцитов характеризуется преимущественно внеклеточным характером продукции свободных радикалов, популяция «медленных» фагоцитов характеризуется как внеклеточной, так и внутриклеточной продукцией свободных радикалов.
3. В результате оксидативного стресса, вызванного различными факторами, происходит
модификация альбумина, сопровождающаяся изменением его конформации и, как
следствие, дозозависимым ослаблением триптофановой флуоресценции, что
количественно характеризует глубину протекания оксидативного стресса в белковом
звене в любых биологических жидкостях, содержащих альбумин, и может быть
использовано для целей клинической лабораторной диагностики.
4. Способ оценки антиоксидантного профиля биологических жидкостей, основанный на
методе активированной кинетической хемилюминесценции, позволяет одновременно
определять активность сильных антиоксидантов и антиоксидантов средней силы, в
основном, белков, а также прооксидантную активность, источником которой в плазме
крови является окисленный альбумин; следующие показатели антиоксидантного
профиля — площадь «провала», тангенс угла наклона восходящей части кривой и
подъем стационарного уровня — могут быть использованы в целях клинической
лабораторной диагностики.
5. Хемилюминесцентная система, состоящая из гемоглобина, окисленной линолевой
кислоты и кумарина С-334 может быть использована для аналитического определения
прооксидантной активности липидных гидропероксидов, а также гемоглобина или
продуктов его превращения в целях клинической лабораторной диагностики.
Теоретическая и практическая значимость
Результаты, представленные в диссертационной работе, позволят расширить знания о роли свободнорадикальных процессов как важного патогенетического фактора.
Для фагоцитов крови показано существование двух популяций, отличающихся радикал-продуцирующей функцией. Разработан подход к оценке радикал-продуцирующей функции нейтрофилов, позволяющий получить новые релевантные параметры для целей клинической лабораторной диагностики.
Для сывороточного альбумина человека найден параметр, универсальным образом реагирующий на его окислительную модификацию. Разработан подход оценки глубины протекания системного или локального оксидативного стресса, основанный на определении степени окислительной модификации альбумина.
Для оценки соответствующего звена системного и локального гомеостаза разработан подход анализа антиоксидантного профиля в биологических жидкостях (плазме крови, фолликулярной жидкости).
Разработаны методики определения липидных гидропероксидов в жидкостях и клеточных мембранах.
Разработана методика определения прооксидантной активности гемоглобина и его производных в биологических жидкостях.
В совокупности разработанные методы могут быть объединены в рамках единого подхода оценки состояния системного и локального свободнорадикального гомеостаза в норме и патологии и могут быть использованы в лабораторной клинической диагностике.
Внедрение результатов исследования
Результаты работы используются в процессе преподавания на кафедре медицинской биофизики факультета фундаментальной медицины Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова. Отдельные результаты диссертационного исследования внедрены в практику научной работы Медицинского научно-образовательного центра Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова.
Личный вклад соискателя
Идея диссертационной работы и ее реализация принадлежат автору, а именно:
углублённый анализ отечественной и зарубежной научной литературы, планирование
научной работы, разработка методов и подходов, доказательство взаимосвязей, анализ и
интерпретация клинических, лабораторных и инструментальных данных, их
систематизация, статистическая обработка и описание полученных результатов, написание и оформление основных публикаций по выполненной работе.
Модуль для деконволюции кинетической кривой отклика нейтрофилов разработан к.ф.-м.н. А.Ю. Рябовым. Данные цитофлуориметрических измерений получены совместно с И.В. Образцовым. Клинический материал был получен при участии д.м.н. А.С. Аметова, д.м.н. М.А. Годкова, д.м.н. Р.И. Шалиной, к.м.н. Г.А. Дудиной, к.м.н. Т.Н. Красновой, к.м.н. В.В. Кулабухова, к.м.н. Л.Н. Щербаковой, аспирантов М.Ш. Покаленьевой, М.А. Прудниковой, А.К. Рабадановой, Е.В. Смирновой, А.Е. Шеримовой.
Публикации и апробация исследования
По материалам диссертации опубликовано 26 рецензируемых статей в журналах из перечня ВАК, 26 тезисов докладов на международных и российских конференциях. Результаты работы были представлены в виде устных сообщений на конференциях: Шестая национальная научно-практическая конференция с международным участием «Активные формы кислорода, оксид азота, антиоксиданты и здоровье человека», Смоленск 14–18 сентября 2009, Россия, Симпозиум «Проблемы медицинской биофизики», Москва, 2012, VIII симпозиум «Биологические основы терапии онкологических и гематологических заболеваний», Москва, 2013, Второй съезд аналитиков России, Москва, 23–27 сентября 2013, XX Всероссийской научно-практическая конференция «Достижения и перспективы развития лабораторной службы России» Москва, КРОКУС-Экспо, 24–26 марта 2015, Материалы XXI Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Качество лабораторных исследований условие безопасности пациентов» Москва, Крокус-Экспо, 22–24 марта 2016, The 16th International Nutrition & Diagnostics Conference, Prague, Czech Republic, October 3–6, 2016, II-ая Международная конференция «Свободные радикалы в химии и жизни», Минск, Белоруссия, 19–20 октября 2017, III Национальный конгресс по регенеративной медицине, Москва, 15–18 ноября 2017. Всероссийская конференция с международным участием: «Перинатальная медицина — от истоков к современности», Екатеринбург 13-14 октября 2017, VII Международный форум кардиологов и терапевтов, Москва 21 – 23 марта 2018 г, IV Конгресс гематологов России, Москва 12 – 14 апреля 2018, «Кислород и свободные радикалы», Гродно, 15– 16 мая 2018 г. XI Международная научно-практическая конференция «Современная лабораторная медицина: эффективность, доступность, качество». Москва 24 – 25 мая 2018 г.
Структура и объем диссертации
Липидные гидропероксиды и методы их определения
Давно известно, что непредельные липиды являются мишенью свободных радикалов. Описан и доказан механизм их окисления (перекисное окисление липидов), заключающийся в последовательности цепных реакций. В результате происходит накопление липидных гидропероксидов, являющихся промежуточными стабильными продуктами. Липидные гидропероксиды, таким образом, могут служить маркерами оксидативного стресса, с другой стороны, они активно реагируют с металлами переменной валентности, такими как Fe(II), приводя к новым свободнорадикальным реакциям и разветвлению цепи. В таком аспекте количественное определение липидных гидропероксидов в липопротеинах и клеточных мембранах непосредственно приобретает особую важность. Это не только показатель глубины происходящих нарушений свободнорадикального гомеостаза в липидном звене, но и предиктор дальнейшего развития оксидативного стресса, которое может произойти, например, при реакции окисленных липидов с гемоглобином.
Перекисное окисление (липидная пероксидация) — один из основных механизмов реализации оксидативного стресса в липидном звене. Это дегенеративный процесс, нарушающий структуру и функции атакуемой системы, часто вызывая цитопатологические последствия. Особенно уязвимы для оксидативного стресса клеточные мембраны и другие системы, богатые ненасыщенными липидами (фосфолипиды, гликолипиды, холестерин). Липидная пероксидация является общим ключевым фактором, опосредующим повреждение мембранных структур органов и тканей при многих заболеваниях. Роль в патогенезе показана при многих заболеваниях печени, артритах, атеросклерозе, гипоксических, злокачественных опухолях, травмах, ожогах, катаракте. [76].
Гидропероксиды липидов (LOOH) — первичный продукт пероксидации липидов. Они участвуют в дальнейших биохимических процессах, в итоге разлагаясь до сложной смеси, включающей эпоксиды, кетоны, углеводороды, насыщенные и ненасыщенные альдегиды. Определяемая концентрация LOOH характеризует разницу между образованием и разложением гидропероксидов в организме; постоянное обновление LOOH поддерживает действующие концентрации биомаркера [77].
Роль гидропероксидов липидов в организме не ограничивается способностью к повреждению упорядоченных структур. Сегодня развиваются теории, указывающие на сигнальную роль LOOH в организме. В зависимости от степени поражения липидов, липидная пероксидация приводит к различным последствиям для клетки:
1. отсутствие эффекта (при соблюдении окислительно-восстановительного баланса),
2. активация защитной системы организма: ферментативный синтез дополнительных антиоксидантов (при относительно низком уровне пероксидации),
3. смерть в результате апоптоза (при среднем уровне пероксидации),
4. некроз клетки (при высоком уровне пероксидации) [78].
Механизм образования гидропероксидов фосфолипидов хорошо описан [79] (рис. 1.11): избыток АФК запускает процесс липидного перокисления путём отрыва H+ от полиненасыщенного липида. Образовавшиеся липидные углеродные радикалы (L) проходят через молекулярную перегруппировку, переходя в сопряженные диены. В этой конформации они реагируют с молекулярным кислородом, образуя реакционноспособный липидный пероксил-радикал (LOO). Последний отрывает ион H+ от другого липида, превращаясь в нерадикальный интермедиат — липидный гидропероксид (LOOH) [77]. В отсутствии металлов-катализаторов, нагрева, ультрафиолетового облучения, гидропероксиды липидов относительно устойчивы in vitro [80].
Роль LOOH как биомаркеров окислительного стресса подтверждается рядом исследований. Высокие концентрации гидропероксидов липидов часто обнаруживают у пациентов с такими заболеваниями как атеросклероз, рак или нейродегенеративные болезни [81]. Одно из крупнейших клинических исследований [82], оценивавшее ценность гидропероксидов липидов как биомаркера сердечно-сосудистых заболеваний — PREVENT. В целом, работ по роли окисленных липидов при атеросклерозе и ишемической болезни сердца очень много [82] [83,84,85] [86]. Роль окисленных липидов также показана в патогенезе остеопороза [87], болезни Альцгеймера [88], первичной легочной гипертензии [89], возрастной макулярной дегенерации [90], воспалении [91], могут вызывать повреждения ДНК [92]. Отдельную область представляют собой исследования окисления липидов при фотодинамической терапии [93].
В последнее время активно обсуждается роль окисленных липидов как сигнальных молекул [94]. Окисленные липиды, будучи электрофильными молекулами, могут взаимодействовать с белками, модифицируя тиоловые группы и инициируя каскад сигнальных событий [95]. Второй механизм связан с продуктами распада, такими как лизофосфатидилхолин, который вызывает вторичную продукцию пероксида водорода [96]. Окисленные липиды меняют активность глутатионпероксидазы и приводят к гиперэкспрессии сигнальной молекулы p66Shc. Обзор, посвященный электрофильной модификации окисленными липидами тиолов с упором на пути Keap1-Nrf2, HSR и UPR можно прочитать здесь [97].
Большинство методик для биологических объектов (крови, тканей) адаптировались, исходя из приложений для масел и жиров. Существующие методы можно разделить на четыре группы в зависимости от измеряемого параметра: потребление кислорода, расходование субстрата, количественное определение липидных гидропероксидов, формирование вторичных продуктов окисления, получаемых при разложении гидропероксидов [77]. Основными маркерами липидной пероксидации являются конъюгированные диены, альдегиды, изопростаны.
Все методики, посвященные анализу гидропероксидов, можно разделить на две основные категории: методы для определения общего количества гидропероксидов и методы, основанные на хроматографическом разделении. Последние дают информацию о структуре и количестве гидропероксидов конкретных липидов. Оба подхода дают важную информацию о протекающих процессах окисления и не являются взаимозаменяемыми. Методы, определяющие общее содержание гидропероксидов всех липидов в образце обычно простые, быстрые, подходят для анализа большого количества образцов. Основным недостатком большинства из них является отсутствие специфичности. Методики положительно реагируют не только на присутствие гидропероксидов липидов в образце, но и на небольшие количества посторонних веществ. Методы описаны в табл. 1.1 [82].
Изучение фенотипа нейтрофилов при стимуляции ФМА
Проточная цитометрия используется для определения различных популяций и субпопуляций лимфоцитов и является одним из наиболее высокочувствительных и объективных методов. Анализируя состав поверхностных дифференцировочных маркеров, можно определить, к какой популяции или субпопуляции относятся исследуемые клетки; функцию клеток и их взаимодействие с другими клетками; стадию их дифференцировки и активации. Была изучена экспрессия ряда маркеров в ответ на ФМА. Данные этого раздела главы получены совместно с И.В. Образцовым.
Рецептор FcgRIII (CD16) предназначен для взаимодействия с IgG3 или IgG1. Стимуляция ФМА приводила к увеличению уровня экспрессии CD16 нейтрофилами в течение первых 5 минут с последующей тенденцией к снижению показателя (рис. 3.13). Рисунок 3.13 (а) динамика плотности экспрессии маркера СD16 в процессе инкубации нейтрофилов с ФМА, (б) динамика темпа роста экспрессии маркера в процессе инкубации нейтрофилов с ФМА, (в) описательная статистика.
L-селектин (CD62L) — гликопротеин на клеточной поверхности лейкоцитов, относящийся к классу молекул клеточной адгезии. Показано достоверное постепенное снижение уровня экспрессии CD62L на поверхности нейтрофилов под воздействием стимуляции ФМА; при этом темп снижения экспрессии маркера оставался неизменным в течение всей инкубации (рис. 3.14).
CD64 — мембранный белок, гликопротеин, Fc рецептор к мономерным иммуноглобулинам изотипа IgG с высокой аффинностью. Наличие CD64 на поверхности нейтрофилов является признаком инфекции и сепсиса. Выявлено незначительное увеличение уровня экспрессии CD64 под действием праймирования ФМА, однако эта тенденция статистически не достоверна. В модельном эксперименте не удалось вызвать повышение экспрессии CD64 до уровня, характерного для пациентов с сепсисом и/или клинически значимыми бактериальными осложнениями (рис. 3.15).
Mac-1 или CR3 (интегрин M2) — мембранный белок, гетеродимерный интегрин подсемейства 2-интегринов. Связывание рецептора вызывает последующий фагоцитоз и деградацию чужеродной клетки. При стимуляции ФМА наблюдается достоверное увеличение плотности экспрессии, причём наиболее интенсивный рост определяется в первые 5 минут инкубации (рис. 3.16).
Рисунок 3.16 (а) динамика плотности экспрессии маркера CD11b в процессе инкубации нейтрофилов с ФМА, (б) динамика темпа роста экспрессии маркера в процессе инкубации нейтрофилов с ФМА, (в) описательная статистика. CD15 (3-фукозил-N-ацетиллактозамин) — углеродная молекула адгезии. Экспрессия этой молекулы в ответ на стимуляцию ФМА приведена на рис. 3.17. Наблюдается достоверное увеличение плотности экспрессии CD15, темп роста достоверно не меняется.
Стимуляция нейтрофилов ФМА приводит к разделению общего пула клеток на две субпопуляции, позитивных и по CD11b, и по CD15, при этом характеризующиеся более (bright) или менее (high) высоким уровнем экспрессии этих маркеров. Содержание популяции, ярко экспрессирующей CD11b/CD15, достоверно увеличивается в течение первых пяти минут инкубации и достигает максимума к десятой минуте. Анализ плотности экспрессии CD11b и CD15 на обсуждаемых субпопуляциях нейтрофилов выявил различные тенденции изменения экспрессии этих маркеров: одна субпопуляция отличается более интенсивным достоверным приростом CD11b, а также увеличением экспрессии CD15 в ответ на ФМА, в то время как вторая характеризуется снижением экспрессии CD15, а также менее интенсивным приростом CD11b по сравнению с первой.
CD33 — белок, трансмембранный рецептор, расположенный на поверхности миелоидных клеток. CD33 является молекулой адгезии, связывается с сиаловой кислотой, поэтому относится к семейству белков SIGLEC группы лектинов. Экспрессия маркера CD33 в ответ на ФМА приведена на рис. 3.19. Выявлена тенденция к незначительному нарастанию экспрессии CD33 при стимуляции ФМА.
Динамика экспрессии изученных кластеров дифференцировки при стимуляции нейтрофилов ФМА сведена в табл. 3.4.
Параллельно с цитофлуориметрическими экспериментами была измерена динамика продукции свободных радикалов методом ХЛ с люминолом (рис. 3.20).
Таким образом, ФМА активирует свободно-радикальные процессы в течение 5 минут; экспрессия интегринов (С11b, С15, С33) активируется в течение 5 минут Экспрессия селектинов уменьшается в течение двух минут. Экспрессия рецепторов к иммуноглобулинам увеличивается в течение двух минут, затем падает.
Цитофлуориметрические эксперименты преследовали двоякую цель. Во-первых, они показали, что нейтрофилы остаются жизнеспособными после воздействия ФМА в экспериментальных дозах. Во-вторых, они были призваны пролить свет на вопрос существования одной или нескольких популяций. Поскольку именно после воздействия ФМА на хемилюминограмме появлялся бимодальный ответ на фМЛФ, следовало выяснить, что происходит с нейтрофилами после воздействия ФМА с точки зрения фенотипа. Можно ли предположить наличие двух популяций, отличающихся способностью к фагоцитозу фМЛФ, или нейтрофилы однородны. Литературные данные, появившиеся за последние несколько лет, свидетельствуют о существовании двух популяций — нейтрофилы «нормальной плотности» и нейтрофилы «низкой плотности» (по отношению к центрифугированию в градиенте плотности).
Судя по данным по коэкспрессии CD11b и CD15, можно выделить две популяции, причем одна субпопуляция отличается более интенсивным достоверным приростом CD11b, а также увеличением экспрессии CD15 в ответ на ФМА, в то время как вторая характеризуется снижением экспрессии CD15, а также менее интенсивным приростом CD11b по сравнению с первой. Таким образом, проведенные эксперименты подтверждают гипотезу о наличии как минимум двух популяций и закладывают основу дальнейшего изучения фенотипа нейтрофилов, ответственного за разную продукцию активных форм кислорода в ответ на стимул.
Клиническое значение ДОА при некоторых патологиях
Безглобулиновую плазму для анализа получали следующим образом: в микроцентрифужную пробирку вносили определенный объем плазмы и равное количество насыщенного раствора сульфата аммония, смесь перемешивали и осадок отделяли центрифугированием в течение 5 минут при 1500 об/мин. Использование сульфата аммония в качестве высаливателя на результаты спектрофлуориметрии мешающего влияния не оказывало.Измеряли флуоресценцию в максимуме при 353 нм (ex = 260 нм) и рассчитывали снижение триптофановой флуоресценции относительно такого же содержания интактного альбумина (доля окисленного альбумина, ДОА): ДОА = (I0-I)/I0, где I0 – расчетная (теоретическая) флуоресценция, определенная по градуировочному графику для известной общей концентрации альбумина, I — измеренная в плазме.
Общую концентрацию альбумина получали из данных биохимического анализа.
Параметр ДОА определяли для: а) группы практически здоровых доноров, возраст от 18 до 45 лет, n = 36, б) пациентов с сахарным диабетом II типа, в) пациентов с АНЦА-ассоциированными системными васкулитами, г) пациентов с системной красной волчанкой, д) практически здоровых беременных (табл. 6.4).
Референтный интервал по оценкам для группы практически здоровых доноров составил от 0.05 до 0.44. Если сопоставить это значение с показателем ЭКА/ОКА и дзета-потенциала, то можно видеть, что для практически здоровых доноров альбумин находится в состоянии окисленности, соответствующим ненарушенной лиганд-связывающей функции и неизмененного дзета-потенциала. Повышение ДОА больше 0.5 сопровождается нарушением транспортной функции. Для модели УФ-облучения справедлива аналогичная закономерность для дзета-потенциала. Таким образом, можно считать значение ДОА = 0.5 условной границей системного оксидативного стресса в белковом звене.
Для группы АНЦА-ассоциированных системных васкулитов найдено значимое различие между ДОА с контрольной группой практически здоровых доноров. Также выявлено значимое различие доли ДОА в группе пациентов с генерализированным течением болезни (среднее ДОА 0.47, Sr = 0.22) по сравнению с группой с локальным течением болезни (среднее ДОА 0.56, Sr = 0.20), p = 0.04.
Отдельного обсуждения заслуживают данные, полученные у пациентов с системной красной волчанкой. При определении показателя ДОА в подавляющем большинстве получали отрицательные значения, что свидетельствовало о присутствии мешающих компонентов, обладающих триптофановой флуоресценцией. Предположительно, такими компонентами могли оказаться циркулирующие иммунные комплексы (ЦИК). Было проведено осаждение и отделение ЦИК из безглобулиновой плазмы с использованием ПЭГ-6000. Было подтверждено мешающее влияние ЦИК, присутствующих в крови больных СКВ.
Отсутствие значимости между ДОА больных СКВ (после отделения ЦИК) и группой доноров дает возможность говорить об отсутствии оксидативного стресса при СКВ, что согласуется с повышенной антиоксидантной емкостью плазмы.
Для анализа безглобулиновой плазмы, содержащей ЦИК, был предложен новый экспрессный и простой параметр — количество остатков триптофана, содержащееся в ЦИК и альбумине. Этот параметр рассчитывается как Trp (САЧ+ЦИК) = I trp реал/I0 trp теор, где I trp реал — интенсивность флуоресценции безглобулиновой плазмы при 353 нм (ex=260 нм), I0 trp теор — интенсивность флуоресценции триптофана, соответствующая концентрации альбумина, определенной биохимическим методом.
Было показано, что показатель Trp (САЧ+ЦИК) значимо выше в группе с поражением внутренних органов (n = 32, среднее Trp 2.21, Sr = 0.53), по сравнению с группой без поражения внутренних органов (n = 16, среднее Trp 1.83, Sr = 0.60), p для критерия Стьюдента 0.032.
Для пациентов с компенсированным сахарным диабетом II типа различие с группой доноров является незначимым, что свидетельствует об отсутствии системного оксидативного стресса, проявляющегося в белковом звене.
При сравнении показателей ДОА для здоровых беременных не было выявлено статистически значимых различий, однако в группе беременных отмечался больший разброс в значениях ДОА, в пяти случаях значения оказались выше 0.7, что может свидетельствовать о наличии выраженного системного оксидативного стресса.
При сравнительной характеристике ДОА в группе женщин после самопроизвольного выкидыша (n = 5) оказалась достоверно ниже по отношению к показателям группы практически здоровых беременных (p = 0.02), в некоторых случаях принимая отрицательные значения, что свидетельствовало о наличии мешающего влияния компонентов, возможно, ЦИК, цитокинов или специфических антител. При попытке осаждения ЦИК с помощью полиэтиленгликоля из безглобулиновой плазмы ни в одном случае не было обнаружено ЦИК. Гипотеза о наличии цитокинов или специфических анитител нуждается в дальнейшей проверке.
В заключение приведены спектры флуоресценции образцов фолликулярной жидкости, антиоксидантная активность которых будет обсуждена в следующей главе (рис. 6.19):
Для двух групп — фолликулы со зрелой яйцеклеткой (n = 25) и пустые фолликулы (n = 7) — были оценены показатели ДОА фолликулярной жидкости, полученной при процедуре экстракорпорального оплодотворения. Содержание альбумина было определено спектрофотометрически по реакции с бромкрезоловым зеленым (стандартные наборы «АГАТ»). В случае зрелой яйцеклетки ДОА фолликулярной жидкости было равно 0.19 ± 0.05, в случае пустых фолликулов 0.58 ± 0.12, что говорит о развитии локального оксидативного стресса в фолликуле в этом состоянии.
Комплексность подхода и его клиническая информативность
В комплекс методов оценки свободнорадикального гомеостаза на данном этапе преполагается включить пять методов:
1. Оценка радикал-продуцирующей активности нейтрофилов
2. Оценка прооксидантной активности липидных гидропероксидов
3. Оценка антиоксидантного профиля плазмы крови
4. Определение доли окисленного альбумина
5. Определение активности супероксиддисмутазы
Объединение в комплекс обусловлено: а) общими исследуемыми компонентами участниками свободнорадикальных реакций, б) общим биохимическим методом люминометрией, в) единой физиологической схемой взаимного влияния (рис. 8.3).
Эта схему в перспективе целесообразно дополнить такими показателями как прооксидантная активность плазмы крови, антиоксидантный профиль жирорастворимых антиоксидантов, показатели звена глутатиона.
Клиническая информативность — способность лабораторного теста характеризовать состояние внутренней среды организма и выявлять патологические отклонения. Основной задачей при оценке клинической информативности лабораторных исследований — установление с их помощью точности разграничения исследуемых сопоставляемых состояний организма или групп пациентов.
К параметрам клинической информативности относят клиническую чувствительность, клиническую специфичность и основанные на них диагностическую эффективность и предсказательную ценность.
Классификация результатов как истинных и ложных зависит от положения отсечных точек. В исследовании в качестве отсечных точек были приняты верхние границы референтных интервалов. Далее будет обсуждена клиническая информативность отдельных показателей для некоторых их изученных патологий. Это показатели активности нейтрофилов и патологические процессы, связанные с их активацией в результате острого воспалительного, аутоиммунного процесса и заболевании кроветворной системы.
Показатели чувствительности и специфичности рассчитывали следующим образом:
Пусть а — число больных, у которых показатель превышает отсечную точку, b — число здоровых, у которых показатель превышает отсечную точку, с — число больных с показателем ниже отсечной точки, и d — число здоровых с показателем ниже отсечной точки. Тогда:
Чувствительность = а/(а+с)
Специфичность = d/(b+d)
Прогностичность положительного результата = а/(а+b)
Прогностичность отрицательного результата = d/(c+b)
При ожоговой болезни, как было показано, на хемилюминограмме нейтрофильного ответа появляется медленная вспышка, что отражается в увеличении коэффициента затухания Kd. Эта вспышка проявляется с первых суток и является характеристикой эффективного внутриклеточного киллинга нейтрофилами. Отсутствие ее при тяжелой болезни (индекс Франка 70) свидетельствует о плохом прогнозе. Всего было обследовано 34 пациента с ожоговой болезнью, из них 16 с ИФ 70. У с = 4 на первых сутках заболевания Kd соответствовал нормальным значениям, у a = 12 был выше нормы. У практически здоровых доноров b = 4, d = 86. Таким образом,
Чувствительность = а/(а+с) = 75%
Специфичность = d/(b+d) = 86%
Прогностичность положительного результата = а/(а+b) = 60%
Прогностичность отрицательного результата = d/(c+d) = 95%
Если отсечную точку выбрать по 100% границе для практически здоровых доноров (Kd = 0.78), то b = 0, d = 90
Прогностичность положительного результата = а/(а+b) = 100%
Прогностичность отрицательного результата = d/(c+d) = 96%
Кривая ошибок коэффициента затухания приведена на рис. 8.4.
При миелодиспластическом синдроме диагностическую ценность имеют коэффициент активации и сотношение люминол- и люцигенин-активированной интенсивности ответа. Клиническая информативность этих показателей приведена в табл. 8.6.
При АНЦА-ассоциированных системных васкулитах клиническое значение имеет соотношение интенсивностей медленного и быстрого ответа, рассчитанное после деконволюции хемилюминограммы. Результаты приведены в табл. 8.7.
Рассчитанные показатели клинической информативности следует рассматривать как ориентировочные. В последующем целесообразно их уточнить за счет расширения размера групп.