Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1 Роль изменений иммунного статуса в патогенезе и современные направления его коррекции при термической травме (обзор литературы) 13
1.1 Иммунный статус организма при термической травме.. 13
1.1.1 Роль изменений локального и системного врожденного иммунитета в патогенезе термической травмы 14
1.1.2 Роль изменений адаптивного иммунитета в патогенезе термической травмы 17
1.1.3 Дизрегуляция иммунного ответа при термической травме 19
1.2 Эритропоэтин: общая характеристика, методы получения, механизм действия, плейотропные эффекты 21
1.2.1 Анализ ассортимента лекарственных форм с эритропоэтином 27
1.3 Фармацевтические аспекты терапии термической травмы 28
1.4 Методы стандартизации лекарственных форм с эритропоэтином 32
ГЛАВА 2 Материалы и методы исследования 36
2.1 Экспериментальная часть исследований 36
2.1.1 Эксперименты в условиях in vivo 36
2.2 Методы исследования 38
2.2.1 Иммунологические методы исследования 38
2.2.2 Биохимические методы 42
2.2.3 Морфологические методы исследования 46
2.2.4 Фармацевтические методы 47
2.2.5 Статистические методы 53
ГЛАВА 3 Результаты собственных исследований и их обсуждение 54
3.1 Изменение иммунного статуса при экспериментальной термической травме 54
3.1.1 Динамика показателей врожденного и адаптивного иммунитета при экспериментальной термической травме 54
3.1.2 Механизм изменений иммунного статуса при экспериментальной термической травме 62
3.1.3 Морфология очага повреждения и репаративные процессы при экспериментальной термической травме 78
3.1.4 Концентрация эритропоэтина в сыворотке при экспериментальной термической травме 83
3.2 Влияние системного введения эритропоэтина на иммунный статус при экспериментальной термической травме 86
3.2.1 Концентрация эритропоэтина в крови в условиях его системного применения при экспреиментальной термической травме 86
3.2.2 Влияние системного введения эритропоэтина на показатели врожденного и адаптивного иммунитета при экспериментальной термической травме 88
3.2.3 Механизм влияния эритропоэтина при системном введении на иммунный статус при экспериментальной термической травме 99
3.2.4 Влияние системного применения эритропоэтина на морфологию очага повреждения и репаративные процессы при экспериментальной термической травме 114
3.3 Экспериментально-теоретическое обоснование состава и стандартизация трансдермальной лекарственной пленки сэритропоэтином 121
3.3.1 Фармакотехнологическое исследование составов пленок 121
3.3.2 Выбор дозы эритропоэтина для местного применения в составе трансдермальной пленки 123
3.3.3 Биофармацевтические исследования составов пленок с эритропоэтином 124
3.3.4 Фармацевтические исследования трансдермальной пленки с эритропоэтином 131
3.3.5 Определение стабильности и микробиологической чистоты трансдермальной пленки с эритропоэтином 137
3.4 Влияние локального применения трансдермальной пленки с эритропоэтином на иммунный статус при экспериментальной термической травме 138
3.4.1 Влияние локального применения эритропоэтина в составе трансдермальной пленки на показатели врожденного и адаптивного иммунитета при экспериментальной термической травме 138
3.4.2 Механизм изменений иммунного статуса в условиях местного применения эритропоэтина в составе трансдермальной пленки при экспериментальной термической травме 147
3.4.3 Морфология очага повреждения при экспериментальной термической травме в условиях применения трансдермальной пленки с эритропоэтином 160
Заключение 169
Выводы 186
Практические рекомендации 188
Список используемых сокращений 188
Список литературы
- Эритропоэтин: общая характеристика, методы получения, механизм действия, плейотропные эффекты
- Динамика показателей врожденного и адаптивного иммунитета при экспериментальной термической травме
- Экспериментально-теоретическое обоснование состава и стандартизация трансдермальной лекарственной пленки сэритропоэтином
- Механизм изменений иммунного статуса в условиях местного применения эритропоэтина в составе трансдермальной пленки при экспериментальной термической травме
Эритропоэтин: общая характеристика, методы получения, механизм действия, плейотропные эффекты
Важную роль в развитии ТТ играет воспаление, в ходе которого осуществляется активация иммунных клеток и выделение медиаторов, запускающих каскад местных и системных реакций организма на повреждение [101, 119, 126, 175].
Основными клетками врожденного иммунитета являются фагоциты, представленные моноцитами (тканевыми макрофагами), дендритными клетками (ДК) и нейтрофилами. На системном уровне в ранние сроки ТТ в зависимости от степени, глубины и площади повреждения концентрация полиморфноядерных нейтрофилов и моноцитов в периферической крови может как увеличиваться, так и снижаться. Так, при ожогах, сопровождающихся бактериальными осложнениями, наблюдается снижение содержания нейтрофилов и моноцитов в крови [74]. Это может быть связано с перераспределением клеток, участвующих в иммунных реакциях, повышением их концентрации в очаге повреждения. По некоторым данным, при ТТ в срок с 3-14 сутки в крови фиксируется увеличение количества нейтрофилов, что, по словам авторов, может быть связано, во-первых, с гемоконцентрацией, во-вторых, с избыточной стимуляцией миелоидного ростка костного мозга [42].
Как известно, в первые 24 часа в ране доминируют нейтрофилы, присутствие которых в разные фазы заживления, по данным некоторых авторов, может способствовать или тормозить процессы пролиферации. Нейтрофилы представляют первую линию защиты от микробных и немикробных агентов в ранние сроки ТТ. Однако дальнейшее избыточное присутствие нейтрофилов неблагоприятно влияет на закрытие раны за счет их способности к образованию супероксиданиона и других активных форм кислорода (АФК), участвующих в процессах перекисного окисления липидов (ПОЛ). По данным Popescu et al., прогрессивное увеличение количества полиморфноядерных нейтрофилов и макрофагов в ране при ТТ наблюдается на 3-9 стуки, по мере образования грануляционной ткани их количество снижается [172]. Активация нейтрофилов и их миграция в очаг воспаления происходит под влиянием гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (G-CSF), C5a фрагмента комплемента, CXCR2 рецепторов, FMLP хемотаксического фактора, ИЛ-8 и других биологически активных веществ [101].
Практически одновременно с нейтрофилами под воздействием сигналов хемокинов SDF-1/CXCR4 в очаг воспаления мигрируют моноциты/макрофаги, которые выполняют функции фагоцитов, а также являются источниками цитокинов и факторов роста. Выделяют несколько фенотипов макрофагов, из которых М1 (CAM) и М2 (AAM) фенотипы способствуют высвобождению провоспалительных и противовоспалительных медиаторов соответственно [119, 144, 172]. Экспрессируемая активированными макрофагами, эндотелиоцитами и фибробластами ЦОГ-2 приводит к образованию простагландинов, которые способствуют вазодилатации и образованию воспалительного экссудата, а также к угнетению функций антигенпрезентующих клеток [82, 119]. По данным N.Rani et al, в ранние сроки ТТ (3 сутки) вместо «традиционных» макрофагов с фенотипом CD11b+F4/80+ происходит инфильтрация очага повреждения супрессорными клетками с фенотипом CD11b+Gr1+ (MDSCs), которые способствуют развитию воспаления за счет высвобождения провоспалительных цитокинов (ИЛ-1, ИЛ-6) и ФНО- [177].
Циркулирующие в крови моноциты, помимо трансформации в макрофаги в тканях под влиянием различных транскрипционных факторов, таких как PU.1, MafB, KLF4, c-Maf, могут дифференцироваться в очаге воспаления в ДК [119]. ДК обеспечивают интегративную связь между врожденным и адаптивным иммунитетом за счет экспрессии на своей поверхности HLA рецепторов и TLR-4 рецепторов, которые обеспечивают их взаимодействие с другими иммунокомпетентными клетками [81]. Помимо этого, ДК способны продуцировать некоторые цитокины (ИЛ-12), которые способствуют активации естественных киллеров (NK). NK, в свою очередь, могут экспрессировать провоспалительные цитокины, включая ИФН- и ФНО-, а также играть роль антигенпрезентующих клеток. При ТТ снижается количество и нарушаются функции ДК и NK, что увеличивает вероятность присоединения вторичной инфекции [109, 126].
Помимо фагоцитарных клеток в патогенезе ТТ продемонстрирована роль Т-клеток. В норме Т-клетки содержатся в небольшом количестве в периферических лимфоидных тканях, в кожном эпителии, интерстиции. После термического повреждения Т-клетки активируются, увеличивая экспрессию рецепторов TLR2, TLR4, CD69 на своей поверхности. Активированные Т-клетки продуцируют факторы роста и хемокины, а также способствуют активации Th2-, Th17-зависимого иммунного ответа в месте повреждения. [176, 178, 179, 190].
В процессе заживления раны при ТТ большинство соединительнотканных клеток кожи в процессе дифференцировки трансформируются в миофибробласты. Миофибробласты представляют гетерогенную популяцию, включающую профиброгенные, провоспалительные, проангиогенные и сократительные клетки. Они образуются в процессе активации и трансдифференцировки с участием моноцитов, мезенхимальных стволовых клеток и фиброцитов [113]. В недавнем исследовании Li G. et al. в эксперименте in vitro показали роль интегринсвязанной киназы в заживлении раны через активацию трансформирующего фактора роста 1 (TGF1), который индуцирует экспрессию сократительного белка связанного мышечного актина – (-SMA) и дифференцировку фибробластов в миофибробласты [137].
Динамика показателей врожденного и адаптивного иммунитета при экспериментальной термической травме
Количество лейкоцитов в периферической крови определяли общепринятым меланжерным методом в камере Горяева. Лейкоцитарную формулу подсчитывали в мазках крови, фиксированных метиловым спиртом и окрашенных азур II-эозином по Романовскому-Гимзе. Подсчитывали 200 лейкоцитов с дифференциацией эозинофилов, палочкоядерных и сегментоядерных нейтрофилов, лимфоцитов, моноцитов. Их количество выражали в абсолютных (109/л) величинах. Определение функциональной активности нейтрофилов по показателям НСТ-теста и фагоцитоза. Для выделения чистой фракции нейтрофилов 2 мл крови смешивали с 3 мл стерильного физиологического раствора (0,9 % раствор натрия хлористого), смесь наслаивали на градиент плотности стерильных растворов фиколла («Pharmacia», Швеция) и верографина («Spofa», Чехия), плотность верхнего слоя 1,075-1,077 г/см3, нижнего – 1,093-1,095 г/см3 и центрифугировали 40 мин при 1500 оборотах в минуту.
После центрифугирования аккуратно снимали верхний слой плазмы, забирали слой лимфоцитов, лимфоциты трехкратно отмывали в среде 199 центрифугированием при 1000 об/мин в течение 10 мин.
Кольцо нейтрофилов собирали, переносили в стерильные центрифужные пробирки, отмывали стерильным раствором Хенкса путём центрифугирования при 1500 оборотах в минуту дважды по 7 минут.
Исследование поглотительной способности нейтрофилов периферической крови проводили на модели поглощения частиц латекса. Для оценки фагоцитоза 200 мкл нейтрофилов смешивали с 20 мкл взвеси частиц монодисперсного (диаметр 1,7 мкм) полистерольного латекса. После 60 минут инкубации при температуре 370С из суспензии готовили препараты, которые высушивали, фиксировали метанолом и окрашивали азур II – эозином по Романовскому-Гимзе. С помощью иммерсионной микроскопии учитывали активность фагоцитоза – % клеток, захвативших хотя бы одну частицу латекса, интенсивность фагоцитоза – число поглощенных микросфер латекса в 100 подсчитанных клетках и фагоцитарное число – число поглощенных микросфер латекса на один фагоцит. НСТ-тест проводили, учитывая интенсивность восстановления нейтрофилами нитросинего тетразолия (НСТ) в его нерастворимую форму -диформазан по методу А.Н. Маянского и М.Е. Виксмана (1979). Проводили спонтанный и индуцированный НСТ-тест [10, 31].
В пробирки с 0,2 мл взвеси нейтрофилов добавляли 0,1 мл 0,2% раствора стандартно разведенного нитросинего тетразолия в 0,1 М фосфатном буфере (рН 7,4). Для оценки индуцированного НСТ-теста в каждую лунку добавляли 20 мкл суспензии частиц монодисперсного (диаметр 1,7 мкм) полистерольного латекса (индуцированная серия) или 20 мкл 0,9% натрия хлорида (спонтанная серия). После 30-минутной инкубации при температуре 370С к реакционной смеси добавляли 3 мл 0,1 % соляной кислоты для остановки реакции. Пробирки центрифугировали при 1000 об./мин в течение 5 мин. Надосадочную жидкость сливали, из осадка готовили мазки. После сушки препараты фиксировали метанолом и 5 минут окрашивали 0,1% водным раствором сафранина. С помощью микроскопии при увеличении 90х10х1,5 определяли % клеток, восстанавливающих НСТ, и интенсивность реакции по активности восстановления НСТ, для чего НСТ-позитивные клетки делили на 3 группы: 1 – клетки с гранулами диформазана в цитоплазме общей площадью менее 1/3 площади ядра; 2 – клетки с гранулами диформазана в цитоплазме более 1/3 площади ядра; 3 – клетки с гранулами диформазана, превышающими размеры ядра.
Для получения коэффициента интенсивности реакции количество клеток первой группы, выраженное в процентах, умножали на 1, второй группы – на 2, третьей – на 3, результаты суммировали и делили на 100.
Определение популяционного и субпопуляционного спектра лимфоцитов крови проводили с помощью проточного цитофлуориметра «Navios» («BeckmanCoulter», США) с использованием специфических крысиных моноклональных антител производителя «eBioscience» (США) с фенотипом CD 3+ и CD 45RA+, которые являются маркерами преимущественно Т- и В- лимфоцитов соответственно. Апоптоз лимфоцитов оценивали при окрашивании клеток конъюгированным с флюорохромом аннексином V (Annexin-5-FITC) и 7-аминоактиномицином D (7-AAD) из набора «Annexin 5 - FITC/7-AAD kit» («Beckman Coulter», США) на проточном цитофлуориметре «Navios» («Beckman Coulter», США). Лимфоциты из периферической крови выделяли, как указано выше. Перед окрашиванием клетки ресуспензировали в 1 мл охлажденном на льду фосфатно-солевом буфере, затем центрифугировали в течение 7 мин при 1500 об/мин, после чего сливали надосадочную жидкость. К суспензии клеток добавляли охлажденный на льду 1% раствор фиксирующего буфера (1X Binding Buffer) из расчета 5x105 – 5x106 клеток/мкл. Затем к 100 мкл клеточной суспензии добавляли 5 мкл Аnnexin V-FITC и 5 мкл ДНК – тропного красителя 7-AAD, клетки вортексировали и инкубировали в темноте в течение 15 мин при 4 С. После инкубации к клеткам добавляли 400 мкл 1% фиксирующего буфера (1X Binding Buffer), после 30 мин инкубации в термостате при 37С проводили анализ клеток на проточном цитофлюорометре.
Дифференцировали интактные клетки (Annexin-5-FITC–/7-AAD–), клетки с ранними признаками апоптоза (Annexin-5-FITC+/7-AAD–), клетки с поздними признаками апоптоза и частично некротические клетки (Annexin-5-FITC+/7-AAD+). Результат выражали в %.
Определение уровня иммуноглобулинов в сыворотке проводили с помощью иммуноферментного анализа. Концентрацию Ig M, Ig G определяли на автоматическом иммуноферментном анализаторе «Personal LAB» (Италия) с применением специфических тест-систем для крыс фирмы «ALPCO» (США). Результат выражали в нг белка на 1 мл биологической жидкости (нг/мл).
Экспериментально-теоретическое обоснование состава и стандартизация трансдермальной лекарственной пленки сэритропоэтином
Итак, в условиях системного введения ЭПО при ТТ на 3 сутки в крови наблюдаются неоднозначные изменения функциональной активности нейтрофилов в крови: поглотительная способность снижается на 5, 8 и 14 сутки наблюдений, НСТ-редуцирующая способность нейтрофилов увеличивается на 3 и 5 сутки, снижается – на 8 и 14 сутки, функциональный резерв нейтрофилов крови, оцениваемый по НСТ-тесту, снижается на 3 и 5 сутки и увеличивается на 8 сутки наблюдений. Такие изменения могут благоприятно влиять на течение раневого процесса, способствуя регенерации. В частности, активация продукции активных форм кислорода, ферментов нейтрофилами, поступающими в очаг в ранние сроки ТТ (3-5 стуки), может способствовать деструкции поврежденных тканей, очищению очага термического повреждения. Напротив, ограничение функциональной активности нейтрофилов в крови, увеличение количества мононуклеаров в крови с последующим возможным поступлением последних в очаг ТТ на поздних сроках (8-14 сутки) будет способствовать торможению сосудисто экссудативных реакций, стимулировать репаративные процессы. Неоднозначные изменения показателей поглотительной способности и кислородзависимого метаболизма нейтрофилов в крови могут быть обусловлены, во-первых, их содержанием в крови: увеличением количества палочкоядерных и сегментоядерных нейтрофилов в крови на 3 сутки эксперимента и снижением – на 8 сутки, во-вторых, специфическим влиянием ЭПО на функциональную активность нейтрофилов в зависимости от его концентрации в среде. По данным Осикова М.В. и соавторов, в условиях in vitro ЭПО в дозах 3,75 и 15 МЕ/мл увеличивает интенсивность продукции нейтрофилами активных форм кислорода в индуцированном НСТ-тесте [46]. Однако, по данным Rocha J. et al., внутривенное применение ЭПО в дозе 1000 МЕ/кг при ожоге легких существенно не влияет на количество нейтрофилов в ранние сроки травмы, но способствует ограничению высвобождения ими активных форм кислорода, что фиксируется в методе люминол-зависимой хемилюминесценции [185]. Это свидетельствует о неоднозначном характере влияния ЭПО на функциональную активность нейтрофилов в крови при ТТ в зависимости от локализации, масштаба, глубины поражения, а также дозы ЭПО, методических подходов оценки функции клеток. На следующем этапе исследования оценивали влияние системного введения ЭПО на популяционный спектр лимфоцитов в крови при ТТ. Установлено, что абсолютное количество CD3+ и CD45RA+ лимфоцитов в крови статистически значимо не изменяется на 3 сутки эксперимента (таблица 20). На 5, 8 и 14 сутки ТТ количество CD3+ и CD45RA+ лимфоцитов в крови увеличивается. Причем, на 8 сутки ТТ наблюдается максимальный прирост количества CD3+ и CD45RA+лимфоцитов в крови, превышающий значения в группе интактных животных. В динамике ТТ количество CD3+ лимфоцитов увеличивается на 8 и 14 сутки ТТ по сравнению с 3 и 5 сутками, а количество CD45RA+ лимфоцитов в динамике увеличивается на 8 сутки по сравнению с 3 и 5 сутками эксперимента, на 14 сутки относительно 5 суток, и снижается на 14 сутки по сравнению с 8 сутками.
Таким образом, при системном применении ЭПО при ТТ количество Ти В-лимфоцитов в крови увеличивается, что, вероятно, связано, во-первых, со снижением их гибели путем апоптоза и/или некроза, во-вторых, со стимулирующим влиянием ЭПО на лимфопоэз, в-третьих, с изменением поступления лимфоцитов в очаг ТТ. По некоторым данным, ЭПО может напрямую связываться с рецепторами на поверхности лимфоцитов, активируя антиапоптогенный протеин Bcl-2, а также оказывать влияние на фосфорилирование STAT5 в лимфоцитах, способствуя их пролиферации [139].
При оценке концентрации иммуноглобулинов в сыворотке при ТТ в условиях системного применения ЭПО установлено, что содержание IgМ в сыворотке увеличивается на 3 сутки и статистически значимо не изменяется на 5, 8 и 14 сутки наблюдений (таблица 21). Содержание IgG в сыворотке при ТТ при системном применении ЭПО увеличивается на 3, 5, 8 и 14 сутки, превышая значения в группе интактных животных на 3 и 14 сутки. Изменения концентрации IgM в сыворотке при системном применении ЭПО в динамике ТТ не наблюдается. При оценке содержания IgG в динамике ТТ наблюдается его снижение на 5 сутки относительно 3 суток экспримента.
Итак, при экспериментальной ТТ в условиях системного применения ЭПО изменения адаптивного иммунитета включают увеличение количества CD3+ лимфоцитов и CD45RA+ лимфоцитов на 5, 8 и 14 сутки наблюдения, увеличение концентрации IgМ в сыворотке на 3 сутки, IgG – на 3, 5, 8 и 14 сутки. Полагаем, что эффект ЭПО в отношении образования антител плазматическими клетками зависит, во-первых, от дозы и способа введения ЭПО, во-вторых, концентрации провоспалительных и противовоспалительных цитокинов в крови при ТТ, регуляции Th2 зависимого иммунного ответа. По данным A. Jasiulewicz и соавторов, одним из факторов, способствующих продукции иммуноглобулинов лимфоцитами крови, является концентрация ИЛ-10, который влияет на пролиферацию и дифференцировку В-клеток. ЭПО способствует увеличению экспрессии рецепторов к некоторым цитокинам, в том числе ИЛ-10, на В-лимфоцитах [117]. Кроме того, обнаруженный факт увеличения концентрации IgG в сыворотке может отражать относительное увеличение его концентрации в связи со снижением экссудации в очаге ТТ и выхода белков плазмы, в т.ч. IgG, в очаг повреждения в условиях протекторного действия ЭПО, ограничивающего зону вторичной альтерации и активирующего репаративные процессы [117].
Таким образом, в условиях системного применения ЭПО при экспериментальной ТТ в крови максимальные изменения иммунного статуса наблюдаются на 5, 8 и 14 сутки: снижается представительство нейтрофилов на 8 сутки, увеличивается количество моноцитов на 14 сутки, увеличивается количество CD3+ лимфоцитов и CD45RA+ лимфоцитов на 5, 8 и 14 сутки наблюдения. На 5, 8 и 14 сутки ТТ снижается поглотительная способность нейтрофилов, на 3 и 5 сутки – увеличивается, а на 8 и 14 сутки - снижается НСТ-редуцирующая способность нейтрофилов в крови; увеличивается концентрация IgM в сыворотке на 3 сутки и IgG в сыворотке - на 3, 5, 8 и 14 сутки наблюдения.
Механизм изменений иммунного статуса в условиях местного применения эритропоэтина в составе трансдермальной пленки при экспериментальной термической травме
При экспериментальной ТТ в условиях применения ТДП с ЭПО наблюдается увеличение общего количества лейкоцитов в крови на 3 сутки за счет эозинофилов, лимфоцитов и моноцитов (Таблица 44). Содержание палочкоядерных и сегментоядерных нейтрофилов статистически значимо не изменяется относительно группы крыс с ТТ. На 5 сутки наблюдений общее количество лейкоцитов и их популяционный профиль в крови статистически значимо не изменяется, а на 8 и 14 сутки - увеличивается за счет лимфоцитов и моноцитов. При этом, количество лимфоцитов на 14 сутки эксперимента восстанавливается, достигая значений в группе интактных животных. При оценке динамики содержания клеток крови при ТТ в условиях применения ТДП с ЭПО было установлено, что общее количество лейкоцитов снижается на 5 сутки по сравнению с 3 сутками. Количество эозинофилов снижается на 5 сутки относительно 3 суток наблюдений и увеличивается на 14 сутки по сравнению с 8 сутками. Общее количество нейтрофилов, в том числе сегментоядерных форм, увеличивается на 5 сутки по сравнению с 3 сутками, при этом, количество палочкоядерных форм снижается на 5 и 8 сутки относительно 3 суток эксперимента. Количество лимфоцитов в крови снижается на 5 сутки по сравнению с 3 сутками. Содержание моноцитов в крови снижается на 5 сутки относительно 3 суток и на 14 сутки по сравнению с 8 сутками наблюдений.
Таким образом, при экспериментальной ТТ в условиях применения ТДП с ЭПО максимальные изменения клеточного состава лейкоцитов в крови наблюдаются на 3, 8 и 14 сутки - увеличивается общее количество лейкоцитов преимущественно за счет лимфоцитов и моноцитов. При этом, наблюдается частичное восстановление количества нейтрофилов в крови и восстановление лимфоцитов в крови относительно группы интактных животных на 14 сутки ТТ.
При оценке поглотительной способности нейтрофилов при ТТ в условиях применения ТДП с ЭПО было установлено, что на 3 сутки снижается активность и статистически значимо не изменяется интенсивность фагоцитоза (Таблица 45). На 5 и 8 сутки наблюдается противоположная картина: снижается интенсивность фагоцитоза и статистически значимо не изменяется его активность. На 14 сутки эксперимента активность и интенсивность фагоцитоза снижаются. Фагоцитарное число статистически значимо не изменяется на 3, 5, 8 и 14 сутки. В динамике ТТ при местном применении ЭПО в составе ТДП отмечается снижение активности фагоцитоза на 14 сутки по сравнению с 8 сутками.
НСТ-редуцирующая способность нейтрофилов изменяется следующим образом: активность спонтанного НСТ-теста статистически значимо не отличается от группы животных с ТТ на 3, 5 и 8 сутки и снижается на 14 сутки, а интенсивность спонтанного НСТ-теста статистически значимо не изменяется на 3, 8 сутки и снижается на 5, 14 сутки (Таблица 45). В индуцированном НСТ-тесте активность и интенсивоность снижаются на 3, 8 и 14 сутки наблюдений и статистически значимо не изменяются на 5 сутки. Функциональный резерв активности и интесивности статистически значимо не изменяется во все сроки наблюдений. При оценке динамики показателей кислородзависимого метаболизма нейтрофилов в крови при ТТ в условиях применения ТДП с ЭПО было установлено, что активность спонтанного НСТ-теста увеличивается на 8 сутки по сравнению с 5 сутками, снижается на 14 сутки относительно 8 суток. Интенсивность спонтанного НСТ-теста снижается на 14 сутки по сравнению с 8 сутками эксперимента. В индуцированном НСТ-тесте активность и интенсивность увеличиваются на сутки относительно 3 суток, и снижаются на 8 сутки по сравнению с 5 сутками наблюдений. Функциональный резерв активности и интенсивности снижается на 8 сутки относительно 5 суток и увеличивается на 14 сутки по сравнению с 8 сутками.
Таким образом, при местном применении ЭПО в составе ТДП при ТТ максимальные изменения функциональной активности нейтрофилов отмечаются на 8 и 14 сутки, наблюдается частичное восстановление всех показателей относительно группы интактных животных на 14 сутки. Как уже было сказано в предыдущих главах, снижение поглотительной и НСТ-редуцирующей способности нейтрофилов в крови может ограничивать зону вторичной альтерации и способствовать репарации в очаге повреждения. Отметим, что при местном применении ЭПО в составе ТДП влияние на количество в крови нейтрофилов и их функциональную активность менее выражено по сравнению с системным применением ЭПО.
На следующем этапе оценивали показатели адаптивного иммунитета. Было установлено, что на 3 сутки применения ТДП с ЭПО при ТТ количество CD45RA+ и CD3+ лимфоцитов в крови статистически значимо не изменяется относительно группы крыс с ТТ (Таблица 46). На 5 и 8 сутки эксперимента содержание CD3+ и CD45RA+ лимфоцитов в крови увеличивается. На 14 сутки количество CD3+ лимфоцитов статистически значимо не изменяется, а CD45RA+ лимфоцитов – увеличивается относительно группы животных с ТТ. При оценке динамики количества CD3+ лимфоцитов при ТТ в условиях применения ТДП с ЭПО на 5 сутки отмечается их снижение относительно 3 суток, на 8 сутки количество CD3+ лимфоцитов в крови увеличивается по сравнению с 5 сутками ТТ. В динамике ТТ при использовании ТДП с ЭПО количество CD45RA+ лимфоцитов в крови снижается на 5 сутки по сравнению с 3 сутками и увеличивается на 14 сутки эксперимента по сравнению с 5 сутками.