Введение к работе
Актуальность темы
В настоящее время цитостатические препараты широко используются в клинической практике: онкологии и трансплантологии, а также при лечении аутоиммунных заболеваний. Активное применение цитостатических препаратов приводит к развитию выраженных иммунодефицитов, поэтому изучение иммунологических нарушений и возможностей их коррекции является чрезвычайно актуальной проблемой. Одним из наиболее эффективных и широко применяемых цитостатиков является циклофосфан (ЦФ), который входит в различные схемы противоопухолевой химиотерапии, активно применяется в трансплантологии и клинике аутоиммунных заболеваний [R.A. Brodsky et al, 2008; A.E. DeZern et al, 2011].
Модель индуцированного ЦФ иммунодефицита является наиболее адекватной для изучения особенностей механизма иммунологических нарушений при действии цитостатиков. Детальное понимание воздействия препарата на различные субпопуляции клеток и сроки их восстановления при различных режимах введения цитостатиков представляет как практический, так и теоретический интерес. Особое значение данная модель иммунодефицита приобретает при изучении действия иммуномодуляторов в иммуносупрессированном организме, что наблюдается в клинической практике при терапии цитостатиками.
В единичных исследованиях показана способность иммуномодуляторов различной природы восстанавливать количественный и субпопуляционный состав клеток в лимфоидных органах после действия цитостатиков [Е.А.Лебединская с соавт., 2009]. В литературе обсуждаются возможности применения препарата полиоксидоний для коррекции индуцированных иммунодефицитов, а также приводятся данные о применении вакцины БЦЖ для коррекции иммунологических нарушений [M. Babjuk et al., 2011]. Однако многообразие иммуномодулирующих агентов лишь затрудняет задачу выбора оптимальных методов иммунокоррекции. Следует отметить, что нарушения иммунного статуса, вызванные применением цитостатиков, существенно повышают риск развития инфекционных осложнений, вызываемых условно-патогенными антибиотикоустойчивыми микроорганизмами [J.Y.Song et al., 2009]. Поэтому для оптимальной иммунокоррекции вторичных иммунодефицитов, вызванных цитостатиками, предпочтительны иммуномодуляторы, обладающие способностью стимулировать противоинфекционную резистентность организма [A. Custovic et al., 2009]. К таким препаратам относится бактериальная поликомпонентная вакцина Иммуновак-ВП-4 (ВП-4), содержащая в своем составе агонисты толл-подобных рецепторов, являющаяся активатором систем врожденного и адаптивного иммунитета против основных возбудителей внутрибольничных инфекций. Экспериментальные исследования показали, что ВП-4 обладает также противоопухолевой и антиметастатической активностью [Н.К. Ахматова и соавт., 2005]. В связи с выше сказанным целесообразна разработка модели стойкой иммуносупрессии для изучения особенностей механизма иммунологических нарушений при действии цитостатиков и дальнейшей оценки иммунокорригирующего действия иммуномодуляторов.
Цель. Выявление основных параметров иммуносупрессии, индуцированной циклофосфаном, и оценка эффективности иммунокорригирующего действия ВП-4 на фоне действия цитостатика.
Задачи исследования:
-
Изучить особенности фармакокинетики циклофосфана при различных схемах введения для обоснования выбора оптимального режима стойкой индуцированной иммуносупрессии.
-
Исследовать морфологические изменения в органах гемоиммунопоэза при введении циклофосфана и возможность их коррекции с помощью ВП-4.
-
Оценить влияние ВП-4 на миелосупрессию, вызванную циклофосфаном.
-
Исследовать влияние индуцированной иммуносупрессии на продукцию цитокинов, иммунофенотип и функциональную активность мононуклеарных лейкоцитов мышей после введения циклофосфана и влияние на эти показатели ВП-4.
-
Изучить влияние ВП-4 на противоопухолевую активность циклофосфана.
Научная новизна
Получены новые данные, характеризующие параметры индуцированной ЦФ иммуносупрессии при трехкратном (с интервалом в 72 часа) введении цитостатика в дозе 100 мг/кг веса тела животных:
- морфологические изменения органов иммуногенеза: в красном костном мозге, а также в корковом и мозговом веществе тимуса и селезенки увеличивается количество эритроцитов, уменьшается количество дифференцирующихся клеток эритроидного ряда, резко снижается содержание молодых и зрелых форм лейкоцитов, нарушается строма органа и её сосудистая сеть;
- в периферической крови мышей отмечается выраженная лейкопения продолжительностью 10 суток, с наименьшим количеством лейкоцитов на 8-9 сутки ((3,7-1,7)х103 в мм3), повышение сегментоядерных лейкоцитов, некоторое снижение лимфоцитов;
- определено существенное снижение продукции ИЛ-1, увеличение уровня супрессорного цитокина ТФР-, кратковременное уменьшение ИЛ-12 и транзиторное повышение ИЛ-6 и ИНФ-;
- снижено число клеток, экспрессирующих дифференцировочные - CD3+, CD4+, CD19+, DX5+ (NK), CD4+/CD25+ маркеры при уменьшении цитотоксической активности NK-клеток.
Впервые исследовано влияние ВП-4 на фармакокинетику ЦФ. Показано, что введение иммуномодулятора через 72 после воздействия цитостатика не влияет на процессы биораспределения и токсические свойства активных метаболитов ЦФ.
Впервые выявлено, что агонист толл-подобных рецепторов ВП-4 при введении мышам с индуцированной ЦФ иммуносупрессией обладает способностью корригировать нарушения в органах иммуногенеза и иммунологические показатели:
- нормализует структуру красного костного мозга, тимуса и селезенки мышей, нормализует процессы иммуногенеза с появлением молодых клеток эритроидного, миелоидного и лимфоидного рядов, нормализует соотношение форменных элементов периферической крови;
- активирует процесс миелопоэза, что проявляется в появлении моноцитов и бластных форм клеток в периферической крови мышей;
- вызывает кратковременное снижение в сыворотке ИЛ-1, повышает содержание цитокинов Th1 (ФНО-, ИЛ-12, ИНФ-), Th2 (ИЛ-6, ИЛ-4, ИЛ-10) и снижает продукцию супрессорного цитокина ТФР- спленноцитами мышей, восстанавливает экспрессию маркеров лимфоцитов CD3+, CD4+, CD19+,CD4+/CD25+, повышает активность NK-клеток на фоне снижения числа клеток, экспрессирующих молекулы DX5+ (NK) и CD3+/DX5+ (NKT);
- усиливает противоопухолевую активность ЦФ в отношении плазмоцитомы MOPS-21 в эксперименте на мышах.
Впервые дано экспериментальное обоснование возможности использования ВП-4 для иммунокоррекции нарушений, обусловленных индуцированной цитостатиками иммуносупрессией.
Практическая значимость
Установлено, что для достижения иммунокорригирующего эффекта ВП-4 следует вводить не ранее, чем через 72 часа после последнего введения ЦФ.
Полученные данные обосновывают целесообразность дальнейшего изучения иммунокорригирующего действия ВП-4 для коррекции индуцированной иммуносупрессии, вызванной цитостатиками.
Материалы диссертационной работы включены в научно-экспериментальную работу лаборатории терапевтических вакцин НИИВС им. И.И.Мечникова РАМН. Результаты исследований используются в циклах лекций курса «Вакцинопрофилактика» и курса «Иммуноонкология» 1-ого МГМУ им. И.М. Сеченова.
Основные положения, выносимые на защиту.
1. Разработана модель индуцированной ЦФ стойкой иммуносупрессии при трехкратном введении ЦФ в дозе 100 мг/кг с интервалом 72 ч, при которой выявлены морфологические нарушения структуры и функции органов иммуногенеза и выраженные иммунологические нарушения в организме мышей.
2. Применение ВП-4 на фоне индуцированной ЦФ иммуносупрессии приводит к нормализации структуры и функции органов иммуногенеза и восстанавливает иммунологические показатели.
3. Введение ВП-4 после введения ЦФ усиливает противоопухолевое действие в отношении плазмоцитомы MOPS-21 у мышей.
Апробация работы. Материалы диссертационной работы представлены и обсуждены: на Х Всероссийском научном Форуме, 29 мая-1 июня, 2006, г. Санкт-Петербург; на VIII Конгрессе «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии», 27-29 июня 2007, г. Москва; на ХI Всероссийском научном Форуме, 28-31 мая 2007, г. Санкт-Петербург; на Международной научной конференции «Фундаментальные и прикладные исследования в медицине», 26 ноября - 4 декабря 2008, г. Пекин; на VII Международной конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность», 27-29 октября 2010, г. Москва; на Первом конгрессе Евро-Азиатского общества по инфекционным болезням 1-3 декабря 2010, г. Санкт-Петербург; на Всероссийской научной конференции молодых ученых «Проблемы биомедицинской науки третьего тысячелетия» 21–22 декабря 2010, г. Санкт-Петербург; на IX Международной германо-российской научно-практической конференции Форума им. Р.Коха и И.И.Мечникова «Инновации и сотрудничество в медицине и здравоохранении» 8-9 декабря 2010, г. Новосибирск; на конференции молодых ученых НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН 15-16 марта 2011 г (2-е призовое место), г. Москва; на XVII Россиийском национальном конгрессе «Человек и лекарство» 11-15 апреля 2011, г. Москва; Апробация диссертации состоялась на конференции отдела иммунологии НИИВС им. И.И.Мечникова РАМН, 18 апреля 2011, г. Москва.
Публикации. По теме диссертационной работы опубликовано 15 печатных работ, в том числе 7 в журналах, рекомендованных ВАК.
Структура и объем диссертации. Материалы работы изложены на 141 странице компьютерного текста и состоят из введения, обзора литературы, глав «материалы и методы», «результаты исследований», обсуждения, выводов, списка литературы – 238 источников (23 отечественных и 215 зарубежных авторов). Диссертация иллюстрирована 6 таблицами, 31 рисунком.
