Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Лабораторные биомаркеры в оценке степени повреждения головного мозга при черепно-мозговых травмах (обзор литературы) 16
1.1. Трудности лабораторной диагностики легких ЧМТ 16
1.2. Аксональное повреждение после легких ЧМТ 20
1.3. Дефицит рабочей памяти при легких ЧМТ 20
1.4. Биомаркеры астроглиального повреждения 22
1.4.1. Белок S100 22
1.4.2. Глиальный фибриллярный кислый белок астроглии 24
1.5. Биомаркеры нейронального повреждения 25
1.5.1. Нейрон-специфическая енолаза 25
1.6. Биомаркеры аксонального повреждения 29
1.6.1. Продукты для расщепления альфа-II спектрина 29
1.6.2. TAU белок 30
1.6.3. Основной белок миелина 31
Заключение по главе 1 32
Глава 2. Материалы и методы исследования 36
2.1. Описание выборки из целевой популяции для исследования 36
2.2. Дизайн исследования 39
2.3. Лабораторные методы исследования 44
2.3.1. Методика определения pNF-H в сыворотке крови 44
2.3.2. Методика определения GFAP в сыворотке крови 44
2.3.3. Методика определения Тau-белка в сыворотке крови 45
2.3.4 Методики определения лабораторных показателей 46
2.4. Методы статистической обработки 47
Глава 3. Результаты собственных исследований 48
3.1. Оценка количественных и категориальных клинико-лабораторных параметров в группах наблюдения 48
3.1.1. Оценка показателей концентрации изучаемых биомаркеров клеточного повреждения мозга (Tau-, GFAP- и pNF-H-белков) в динамике в основной и контрольной группах 48
3.1.2 Оценка показателей концентрации изучаемых биомаркеров клеточного повреждения мозга (Tau-, GFAP- и pNF-H-белков в динамике) и биохимических исследований в трех группах наблюдения 54
3.2. Сравнение изучаемых клинико-диагностических параметров в трех группах наблюдения (результаты многофакторного анализа) .64
3.3. Результаты ROC-анализа по оценке чувствительности/специфичности метода определения изучаемых биомаркеров клеточного повреждения мозга (Tau-, GFAP- и pNF-Н-белков) 73
3.4. Определение диапазонов концентраций изучаемых биомаркеров клеточного повреждения мозга (Tau-, GFAP- и pNF-Н-белков) в группе пострадавших с легкими черепно-мозговыми травмами 74
3.5. Сравнение изучаемых клинико-диагностических параметров в трех блоках сравнения по квартилям концентрации (результаты многофакторного анализа: качественного и количественного) (основная группа) 78
3.6. Разработка клинико-лабораторного алгоритма верификации клеточного повреждения мозга у пострадавших с легкими ЧМТ 83
Глава 4. Обсуждение результатов 89
Выводы 100
Практические рекомендации 102
Список литературы 104
Приложения 126
- Трудности лабораторной диагностики легких ЧМТ
- Оценка показателей концентрации изучаемых биомаркеров клеточного повреждения мозга (Tau-, GFAP- и pNF-H-белков) в динамике в основной и контрольной группах
- Сравнение изучаемых клинико-диагностических параметров в трех группах наблюдения (результаты многофакторного анализа)
- Разработка клинико-лабораторного алгоритма верификации клеточного повреждения мозга у пострадавших с легкими ЧМТ
Трудности лабораторной диагностики легких ЧМТ
Легкая ЧМТ, также известная как сотрясение, является травмирующей силой, приводящей к нарушению функционирования головного мозга [64]. Это нарушение может оказаться временным, но может иметь долгосрочные последствия. Ошибочно полагают, что потеря сознания должна иметь место при легкой черепно-мозговой травме или сотрясении головного мозга. По официальным оценкам, ежегодно во всем мире от ЧМТ страдают 10 миллионов человек [64]. Но поскольку многие пострадавшие с легкими ЧМТ не обращаются за помощью, а медицинские работники не признают, что ЧМТ имела место, реальное количество пострадавших значительно выше.
ЧМТ классифицируют как легкую, среднюю и тяжелую по шкале комы Глазго (GCS), хотя на самом деле это целый спектр травм. GCS представляет собой 15-балльную неврологическую шкалу, используемую для характеристики тяжести ЧМТ [155]. GCS, равная или меньше 8, считается «тяжелой» ЧМТ, GCS 9–12 - «умеренной» ЧМТ, а GCS 13–15 – «легкой» ЧМТ. Лица, перенесшие ЧМТ и имеющие начальный балл GCS 13–15, подвергаются острому риску внутричерепного кровотечения и диффузного повреждения аксонов [151]. Кроме того, значительная часть пациентов с данными показателями подвержена риску нарушения физических, когнитивных и психосоциальных функций [7, 8, 13, 95, 131].
Российские ученые используют Шкалы ВПХ-П (МТ), ВПХ-П (ОР), ВПХ-П (Р) для оценки состояния головного мозга после травмы. Шкалы ориентированы на окончательный исход травмы, учитывающий не только вероятность летальности, но и вероятность постоянной инвалидности и длительность утраты трудоспособности. Тяжесть повреждения оценивают путем присвоения каждому конкретному повреждению соответствующего балла тяжести [4].
Важным последствием ЧМТ является диффузное (или травматическое) повреждение аксонов (ДПА/ТПА) [124, 125], которое возникает после быстрых сил ускорения и замедления, например, при дорожно-транспортных происшествиях (ДТП). ДПА / ТПА включает ряд отклонений от прямого повреждения аксонального цитоскелета до вторичного повреждения в результате нарушения транспорта, протеолиза и отека [72-74]. Например, ионный дисбаланс, через отток калия и приток натрия, приводит к притоку кальция в клетки, создавая повреждение митохондрий и нарушая окислительный метаболизм с продукцией лактата [26-28, 86].
Диагноз ЧМТ в остром периоде основан на неврологическом обследовании и средствах нейровизуализации (компьютерная томография (КТ) и магнитно-резонансная томография (МРТ)). Тем не менее, КТ имеет низкую чувствительность к диффузному повреждению головного мозга и, в качестве побочного действия, обеспечивает воздействие радиацией [16, 93]. Диффузионная тензорная визуализация (ДТВ) - это многообещающий метод нейровизуализации, однако роль МРТ и ДТВ в остром периоде ЧМТ не установлена [63, 70, 71, 76].
Хотя некоторые пострадавшие с легкой ЧМТ могут быть госпитализированы в течение суток, подавляющее большинство из них получают лечение и выписывается из отделений неотложной помощи с общими инструкциями. Эта группа пострадавших с ЧМТ представляет наибольшую проблему для постановки точного диагноза и прогнозирования результатов. Отсутствие объективных критериев (в том числе, лабораторных) для выявления неврологического или психологического дефицита, который влияет на ежедневное функционирование, оставило данных пациентов практически без вариантов лечения.
В отличие от других заболеваний органов, при которых быстрая диагностика с использованием биомаркеров в анализах крови является клинически необходимой для постановки диагноза и лечения, таких как ишемия миокарда или дисфункция почек и печени, быстрых, точных лабораторных тестов на ЧМТ нет. Несмотря на большое количество опубликованных исследований [80, 115], по-прежнему, не хватает биомаркеров, одобренных для клинического применения у взрослых и детей [114]. В настоящее время существует острая необходимость в проверке и внедрении их в клиническую практику.
Далее будут рассмотрены некоторые из наиболее широко изученных биомаркеров ЧМТ в клинических условиях, с акцентом на те, которые были оценены при легких ЧМТ. На рисунке 1. показаны нейроанатомические положения биомаркеров, которые будут рассмотрены.
Оценка показателей концентрации изучаемых биомаркеров клеточного повреждения мозга (Tau-, GFAP- и pNF-H-белков) в динамике в основной и контрольной группах
При сравнении средних (среднее, стандартное отклонение и медиана) лабораторных показателей в основной группе (пострадавшие с легкой черепно-мозговой травмой) и контрольной группе (здоровые добровольцы), которые представлены в таблице 5, нами выявлены статистически значимые различия по всем изучаемым биомаркерам в динамике, а также по показателям уровня глюкозы, АЛТ, АСТ, мочевины и ЛДГ. При этом в основной группе показатели концентрации всех трех изучаемых биомаркеров (Tau-, GFAP- и pNF-H-белков) в динамике (р 0,0001), а также глюкозы (р 0,001) и мочевины (р 0,0001) были статистически значимо выше, а показатели печеночных трансаминаз (АЛТ и АСТ) (р 0,0001) и ЛДГ (р 0,0001) были статистически значимо ниже, чем в контрольной группе.
При оценке значений уровней концентрации Tau-белка в основной группе отмечается выраженная динамика в зависимости от сроков травмы (которые в нашем исследовании сопадают со сроками госпитализации), а именно TAU1 TAU2 TAU3 (Рис. 2). В контрольной группе подобной закономерности не обнаружено. Мы сравнили значения концентрации и разности концентраций Tau– белка в динамике у пострадавших с легкими черепно-мозговыми травмами (основная группа) по сравнению со здоровыми добровольцами без признаков повреждения головного мозга (контрольная группа) (Рис. 3, А и Б). Так в основной группе показатели концентрации (А) были статистически значимо выше (р 0,0001), чем в контрольной группе (Табл. 6), вне зависимости от сроков взятия проб. При оценке разности концентраций Tau–белка (Б) между пробами: 2 и 1 (вторые и первые сутки после травмы), 3 и 1 (седьмые и первые сутки после травмы), 3 и 2 (седьмые и вторые сутки после травмы) – нами получены максимальные значения разности концентраций в 3 и 1 пробах, несколько ниже значения разности во 2 и 1 пробах и минимальные значения разности концентраций в 3 и 2 пробах, причем все выявленные различия в полученных показателях были статистически значимы (р 0,0001) (см. Табл.2 Приложения 1). Полученные данные свидетельствуют о выраженной динамике снижения уровней Tau-белка в крови по мере увеличения сроков госпитализации, что соответствует и срокам получения травмы, причем к 7-му дню после травмы средние показатели концентрации данного белка в основной группе не отличались от показателей контрольной группы.
При сравнении значений концентрации и разности концентраций GFAP–белка в динамике у пострадавших с легкими черепно-мозговыми травмами по сравнению с пациентами без признаков повреждения головного мозга (здоровые добровольцы) (Рис. 4, А и Б) нами обнаружено, что концентрации данного биомаркера (А) у пострадавших с легкими черепно-мозговыми травмами (основная группа) статистически значимо выше, чем в контрольной группе, но не выявлено динамики глиофибриллярного кислого белка астроглии по пробам в зависимости от срока наблюдения (в течение 7 дней после получения ЧМТ), причем в обеих группах.
При оценке разности концентраций GFAP–белка (Б) между пробами выявлено незначительное статистически незначимое преобладание разности концентраций между 2 и 1 пробами (2 и 1 сутки после травмы) (см. Табл.2 Приложения 1).
При сравнении значений концентрации и разности концентраций pNF-Н–белка в динамике у пострадавших с легкими черепно-мозговыми травмами по сравнению с контрольной группой (Рис. 5, А и Б) нами также обнаружено, что показатели концентрации данного биомаркера (А) были статистически значимо выше в основной группе (у пострадавших с легкими черепно-мозговыми травмами), и выявлена статистически значимая динамика изучаемых параметров в зависимости от сроков получения травмы в основной группе.
При оценке разности концентраций pNF-Н–белка (Б) в зависимости от сроков получения травмы выявлено статистически значимое преобладание разности концентраций в равной степени между 2 и 1 пробами (2 и 1 сутки после ЧМТ), 3 и 1 пробами (7 и 1 сутки после ЧМТ), 3 и 2 пробами (7 и 2 сутки после ЧМТ), причем все выявленные различия в полученных показателях были статистически значимы (р 0,0001) (см. Табл.2 Приложения 1).
Таким образом, высокие концентрации всех трех изучаемых биомаркеров клеточного повреждения мозга статистически значимо преобладали в группе пострадавших с легкими ЧМТ, но демонстрировали различную динамику значений концентрации между пробами в зависимости от времени взятия крови после травмы. Наиболее динамичными статистически значимыми показателями обладал Tau-белок и в меньшей степени pNF-H–белок, а GFAP-белок практически не претерпел динамических изменений.
Сравнение изучаемых клинико-диагностических параметров в трех группах наблюдения (результаты многофакторного анализа)
Далее нами проведен многофакторный анализ лабораторных (потенциальные маркеры клеточного повреждения мозга) и инструментальных (функциональных и лучевых) (КТ, МРТ, ЭКГ) показателей, а также клинических исходов с использованием таблиц сопряженности и определением хи-квадрата (2) Пирсона. Результаты многофакторного анализа представлены в таблицах 1-6 Приложения 2.
По результатам проведенного многофакторного анализа нами не выявлено статистически значимых различий по ряду клинико-диагностических параметров в группах наблюдения в зависимости от клинических исходов, а именно: влияние пола (р=0,99 и р=0,59 соответственно), наличие патологии на ЭКГ (р=0,58 и р=0,74 соответственно), наличие патологии на МРТ (р=0,34 и р=0,29). Возможные варианты клинических исходов: улучшение, летальный исход. Однако по параметрам наличия или отсутствия патологии на КТ головного мозга в группах наблюдения (Табл. 8) и по клиническим исходам (Табл. 9) обнаружены статистически значимые различия (р=0,000048 и р=0,011 соответственно), которые будут более подробно рассмотрены ниже в сопоставлении с концентрацией исследуемых биомаркеров. Итак, КТ как инструментальный метод лучевой диагностики, предназначенный для визуализации повреждений головного мозга, в достаточной степени имеет субъективный характер, т.к. зависит от квалификации и опыта врача, проводящего и дающего заключение по исследованию. При проведении КТ головного мозга в группе пострадавших с легкими ЧМТ патология выявлена только в 27,3% случаев в отличие от группы сравнения (пациенты, перенёсшие плановое оперативное вмешательство на центральной нервной системе), у которых закономерно патология на КТ отмечалась в 100% случаев. Данный факт подтверждает существующие в реальной клинической практике сложности диагностики и объективизации легких черепно-мозговых травм.
Затем мы сопоставили полученные данные по группам наблюдения с анализом значений концентрации исследуемых биомаркеров в зависимости от наличия или отсутствия патологии на КТ. При сравнении показателей концентрации (А) и разности концентраций Tau–белка между пробами (Б) по КТ: патологии нет, патология есть (Рис. 12), - обнаружено статистически значимое преобладание высоких концентраций TAU1 и TAU2 в группе наличия патологии на КТ. Однако по разности концентраций статистически значимых различий по наличию или отсутствию патологии на КТ головного мозга получено не было.
При сравнении показателей концентрации (А) и разности концентраций GFAP–белка между пробами (Б) и результатами по КТ: патологии нет, патология есть (Рис. 13), - обнаружено статистически значимое преобладание высоких концентраций GFAP1, GFAP2 и GFAP3 в группе наличия патологии на КТ. Однако по разности концентраций статитстически значимых различий по наличию или отсутствию патологии на КТ головного мозга также получено не было.
При сравнении показателей концентрации (А) и разности концентраций pNF-Н–белка между пробами (Б) и результатами по КТ: патологии нет, патология есть (Рис. 14), - обнаружено статистически значимое преобладание высоких концентраций pNF-Н1, pNF-Н2 и pNF-Н3 в группе наличия патологии на КТ. Однако по разности концентраций статистически значимых различий по наличию или отсутствию патологии на КТ также получено не было.
При анализе КТ головного мозга в зависимости от клинических исходов (Табл. 9) патология выявлена только в 36,4% случаев при благоприятном исходе (улучшение) и в 100% - при летальном исходе, что косвенно свидетельствует о более точной диагностике при КТ у пациентов с признаками клеточного повреждения мозга более тяжелого течения заболевания, однако по причине малочисленности группы с летальным исходом (n=4) утверждать данный факт не представляется возможным. С другой стороны слишком малый процент выявленной патологии на КТ у пациентов с исходом в улучшение подтверждает трудности объективизации легких ЧМТ при использовании данного диагностического метода.
Далее мы провели сопоставление полученных данных с анализом средних значений концентрации исследуемых биомаркеров в зависимости от клинических исходов. При сравнении показателей концентрации (А) и разности концентраций Tau–белку между пробами (Б) по клиническим исходам: улучшение, летальный исход (Рис. 15), - обнаружено статистически значимое преобладание высоких концентраций TAU1, TAU2 и TAU3 в группе летального исхода, что свидетельствует о более высоких уровнях концентрации данного биомаркера у пациентов с признаками клеточного повреждения мозга более тяжелого течения заболевания. По разности концентраций между пробами также были получены статистически значимые различия по всем разностям концентраций между пробами (2 и 1: вторые и первые сутки после травмы, 3 и 1: седьмые и первые сутки после трравмы, 3 и 2: седьмые и вторые сутки после травмы), что подтверждает данное предположение.
При сравнении средних показателей концентрации (А) и разности концентраций GFAP–белка между пробами (Б) по клиническим исходам: улучшение, летальный исход (Рис. 16), - обнаружено стаитстически значимое преобладание высоких концентраций GFAP1, GFAP2 и GFAP3 в группе летального исхода, что свидетельствует о более высоких уровнях концентрации данного биомаркера у пациентов с признаками клеточного повреждения мозга более тяжелого течения заболевания. По разности концентраций между пробами были получены статистически значимые различия по разности концентраций между 2 и 1 пробами (2 и 1 сутки после травмы), что частично подтверждает данное предположение и связано с более долгим периодом выведения GFAP–белка из организма (период наблюдения составил 7 дней, а GFAP–белок возвращается к нормальным значениям только к концу 1 месяца после травмы).
Разработка клинико-лабораторного алгоритма верификации клеточного повреждения мозга у пострадавших с легкими ЧМТ
ЧМТ в остром периоде основана на клинической картине, включающей неврологическое обследование, анамнестических данных и данных нейровизуализации, таких как компьютерная томография (КТ) и/или магнитно-резонансная томография (МРТ). И как указывалось выше, КТ имеет низкую чувствительность к диффузному повреждению головного мозга, а стандартные методы нейровизуализации (рентгенография) могут не обнаруживать ЧМТ. При этом роль МРТ в остром периоде после травмы еще четко не установлена. Лабораторная диагностика ЧМТ в настоящий период носит прикладной характер, отражающий общее состояние внутренних органов и систем. Таким образом, нет объективных критериев для постановки диагноза.
Поэтому традиционный алгоритм диагностики повреждения головного мозга после ЧМТ, отраженный в Клинических рекомендациях по легкой черепно-мозговой травме, утвержденных на XXXXIII Пленуме Правления Ассоциации нейрохирургов России в г. Санкт-Петербурге 15 апреля 2016 года (Рис. 20) [6], как и Стандарт оказания специализированной медицинской помощи при внутричерепной травме 2012 г., включают в себя оценку состояния сознания (была потеря сознания или нет), определение неврологического дефицита (есть дефицит или нет), нейровизуализацию при КТ (есть повреждение или нет), а также общие биохимические методы исследования, напрямую не связанные с клеточным повреждением головного мозга.
И результат недостаточной диагностики легких ЧМТ виден в снижении качества оказания или в отсутствии медицинской помощи пострадавшим с подобными патологическими состояниями, снижении их качества жизни в будущем из-за последствий нелеченной ЧМТ.
По результатам проведенного исследования белковых маркеров легких ЧМТ, а именно: Tau-, GFAP-, pNF-Н-белков, - нами предложен новый клинико-лабораторный алгоритм диагностики клеточного повреждения головного мозга (Рис. 21), который позволяет вне зависимости от результатов оценки состояния сознания, наличия или отсутствия неврологического дефицита и подтверждения повреждения головного мозга на КТ верифицировать легкие ЧМТ на самых ранних этапах ЧМТ (в первые 7 суток от момента получения травмы) и определить прогноз заболевания.
Пострадавшим Категории 1 (ШКГ 15 и нет факторов риска) рекомендуется провести определение концентрации TAU-, GFAP-, pNF-Н-белков в крови и, если концентрации исследуемых белков будут в пределах Q1, а именно: по TAU-белку 9,24 нг/мл, по GFAP- 7,17 нг/мл и pNF-Н- 19,03 нг/мл, то пострадавший может быть отпущен домой с рекомендациями по соблюдению покоя и ведению здорового образа жизни. Аналогичные рекомендации применимы и для пострадавших Категории 2 (ШКГ 15 + факторы риска) и Категории 3 (ШКГ 13-14) при отсутствии патологии на КТ и неврологическом обследовании, а также при отсутствии показаний к операции. Если же концентрации исследованных белков окажутся в пределах Q2-3 и выше, а именно: по TAU- 9,24-78,07 нг/мл, GFAP- 7,17-51,03 нг/мл и pNF-Н- 19,03-64,88 нг/мл, то необходима госпитализация пострадавшего для наблюдения (не менее 24 часов) и уточнения диагноза (КТ, МРТ, консультация нейрохирурга (нейротравматолога)).
При этом повышенная концентрация всех трех белков и их динамика в семидневный период позволяют исключить нетравматические причины повреждения головного мозга.
Предлагаемый новый клинико-лабораторный алгоритм верификации легких ЧМТ с учетом результатов определения концентрации по TAU-белку (9,24-78,07 нг/мл), по GFAP- (7,17-51,03 нг/мл) и pNF-Н-(19,03-64,88 нг/мл) белкам: для Категории 1 – обследование в день обращения за медицинской помощью (в день получения травмы); для Категорий 2 и 3 в первые 1-2 дня госпитализации (1-2 сутки после получения травмы) Полученные нами данные о динамике концентрации Tau-, GFAP-, pNF-Н-белков в крови позволяют иметь возможность определения концентрации белковых маркеров клеточного повреждения головного мозга в течение первых 7 дней госпитализации после травмы, однако максимально точный уровень концентрации может быть получен в 1-й или 2-й день после травмы, т.е. в минимальные сроки от момента получения травмы, особенно для двух белков Tau- и pNF-Н-, которые подвергаются выраженной достоверной динамике в отличие от GFAP-белка, который практически не подвергается динамике в указанный период времени.
Полученные данные позволили сформировать и запатентовать «Способ диагностики черепно-мозговой травмы с использованием белковых биомаркеров» (Патент №2741227 от 21.01.2021).
Для дальнейших научных разработок с большими выборками, чем в данном исследовании, проведение оценки концентрации белковых биомаркеров в динамике целесообразно по следующей схеме (Рис. 22). Таким образом, модифицированный клинико-лабораторный алгоритм верификации клеточного повреждения головного мозга с помощью определения концентрации Tau-, GFAP-, pNF-Н-белков в крови в пределах концентраций: по TAU-белку 9,24-78,07 нг/мл, по GFAP- 7,17-51,03 нг/мл и pNF-Н-19,03-64,88 нг/мл, - позволит сделать объективной лабораторную диагностику, а также определиться с лечением и прогнозом течения черепно-мозговых травм.