Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Современное представление о целиакии (обзор литературы) 17
1.1 Исторические аспекты и эпидемиология целиакии 17
1.2 Группы риска больных целиакией 20
1.3 Клинические проявления и классификация целиакии 22
1.4 Целиакия как мультифакторная болезнь 25
1.5 Патогенез целиакии
1.5.1 Влияние глютена на врожденный иммунитет 26
1.5.2 Влияние глютена на адаптивный иммунитет 28
1.5.3 Результаты полногеномного анализа ассоциаций (Genome Wide Association Studies – GWAS), как альтернативное понимание патогенеза целиакии 31
1.5.4 Значение основных генов целиакии для развития патогенеза глютеновой энтеропатии 33
1.5.5 Роль тканевой трансглутаминазы в патогенезе целиакии 37
1.6 Антитела как сывороточные маркеры целиакии 38
1.6.1 Антитела к глиадину: антиглиадиновые антитела (АГА) и антитела к дезаминированным пептидам глиадина (ДПГА) 38
1.6.2 Аутоантитела к ретикулину (ARA, АРА), эндомизию (ЭМА) и тканевой трасглутаминазе (ТТА)
1.7 Значение сывороточных маркеров для выявления целиакии 44
1.8 Новые методы и маркеры в диагностике целиакии 45
1.9 Неспецифические (дополнительные) маркеры целиакии 48
1.10 Морфологические изменения слизистой оболочки тонкого кишечника и гистологическая классификация целиакии
1.11 Диагностические критерии целиакии
1.12 Осложнения целиакии
1.13 Реабилитация больных целиакией
1.14. Заключение по литературному обзору
ГЛАВА 2. Материалы и методы
2.1 Материалы исследования
2.1.1 Клиническая характеристика больных по группам .
2.2 Методы исследования
2.2.1 Методы определения антител
2.2.2 Определение свободного карнитина и ацилкарнитинов
2.2.3 Молекулярно-генетические исследования
2.2.4 Определение состава авенина сортов овсов, используемых в питании больных целиакией
2.2.5 Исследование биоптатов слизистой оболочки тонкой кишки 2.3 Методы статистического анализа данных
ГЛАВА 3. Антитела к тканевой трансглутаминазе и эндомизию как значимые маркеры целиакии .
3.1 Диагностическая информативность антител к тканевой трансглутаминазе (ТТА) и эндомизию (ЭМА) для дифференциальной диагностики воспалительных заболеваний кишечника
3.2 Анализ целесообразности модификации верхнего предела референтного интервала ТТА для достижения 100% предсказательной ценности положительного результата на первом этапе диагностики целиакии и сокращения сроков обследования 97
ГЛАВА 4. Диагностические возможности сывороточных антител к дезаминированным пептидам глиадина и антител к тканевой трансглутаминазе в капиллярной крови 107
4.1 Диагностическая информативность антител к дезаминированным пептидам глиадина 107
4.2 Оценка аналитических возможностей иммуно-хроматографического экспресс-метода для определения ТТА в капиллярной крови 117
ГЛАВА 5. Прогностическая значимость субэпителиальных депозитов к тканевой трансглутаминазе в слизистой оболочке тонкого кишечника для выявления субклинических форм и ранней диагностики целиакии. взаимосвязь соответствия дефицита карнитина со степенью поражения сотк у больных целиакией для эффективности лечения 124
5.1 Прогностическая значимость субэпителиальных депозитов к тканевой трансглутаминазе в слизистой оболочке тонкого кишечника для выявления субклинических форм и ранней диагностики целиакии 124
5.2 Взаимосвязь соответствия дефицита карнитина со степенью поражения СОТК у больных целиакией 135
ГЛАВА 6. Распределение hla-гаплотипов (HLA-DQ2, HLA-DQ8), ассоциированных с целиакией, в популяции российской федерации. диагностическая информативность их тестирования 145
6.1 Распределение HLA-гаплотипов (HLA-DQ2, HLA-DQ8), ассоциированных с целиакией, в популяции Российской Федерации 145
6.2 Диагностическая информативность тестирования HLA-гаплотипов 148
ГЛАВА 7. Лабораторная оценка иммунологической толерантности у больных целиакией к наиболее распространенным пищевым сортам
овсов для включения их в диетотерапию 163
ГЛАВА 8. Принципы, клинико-диагностические критерии и алгоритмы лабораторного выявления целиакии 175
Заключение 192
Выводы 193
Практические рекомендации 195
Список сокращений 196
Список литературы
- Клинические проявления и классификация целиакии
- Клиническая характеристика больных по группам
- Анализ целесообразности модификации верхнего предела референтного интервала ТТА для достижения 100% предсказательной ценности положительного результата на первом этапе диагностики целиакии и сокращения сроков обследования
- Взаимосвязь соответствия дефицита карнитина со степенью поражения СОТК у больных целиакией
Введение к работе
Актуальность исследования. Целиакия (coeliakia; греч.: koilikos; англ.: coeliac disease — кишечный, страдающий расстройством кишечника; син.: глютен-чувствительная энтеропатия, идиопатическая стеаторея, нетропическая спру, шифр по МКБ Х – К90.0) — генетически детерминированное заболевание, которое характеризуется стойким отсутствием толерантности к глютену (клейковинный белок злаковых культур - пшеница, рожь, ячмень, овес), и развитием атрофической энте-ропатии. Долгое время целиакия считалась редким заболеванием раннего возраста. Однако в настоящее время установлена высокая частота целиакии (1-3% от численности Европейской популяции), с возможностью манифестировать в любом возрасте F., 2012; Bai J.C., Fried M. et al., 2013).
Целиакия, как мультифакторное заболевание, характеризуется клиническим полиморфизмом и многочисленностью трудно диагностируемых форм, которые, составляют до 59% у взрослого контингента больных и до 40% - в детской возрастной категории (Ludvigsson J.F., 2013; Singh P., Makharia G.K., 2014). Запаздывание с диагностикой и лечением сказывается на тяжести клинических проявлений, часто приводит к развитию аутоиммунных осложнений и онкологических заболеваний желудочно-кишечного тракта со снижением трудоспособности и увеличением риска инвалидизации и смертности, в том числе у молодого, трудоспособного населения (Бельмер С.В., 2012; Kumar V., 2012). Сложности в постановке диагноза «це-лиакия» усугубляются несовершенством лабораторной диагностики. Установленная зависимость чувствительности диагностических тестов от степени поражения слизистой оболочки тонкого кишечника (СОТК) определяет ложноотрицательные результаты при начальных признаках поражения СОТК, которые вместе с возможностью получения ложноположительных результатов, способствуют увеличению количества диагностических ошибок (DeGaetani M., Tennyson C.A. et al., 2013; Rubio-Tapia A., D.Hill I. et al., 2013). По данным разных авторов, ложноотрицатель-ные результаты обследования могут составлять от 6,0% до 22%, а ложноположи-тельные результаты, например, при других заболеваниях тонкого кишечника, имеющих схожую с целиакией клиническую картину – 27,83% (Анциферова О.В., 2014; Захарова И.Н., Боровик Т.Э. и др., 2011; Dharmesh H., Kaswala D. et al., 2015). Кроме этого, необоснованные ограничения в употреблении глютенсодержащих продуктов до проведения первичного обследования, неправильная интерпретация результатов гистоморфологического и морфометрического исследования биопсий-ного материала также являются причиной неправильной постановки диагноза (Bai J.C., Fried M. et al., 2013).
Степень разработанности темы исследования.
Увеличивающаяся распространенность вместе с необходимостью обобщения и анализа накопившегося материала по изучению диагностики и лечения целиакии привели к разработке новых диагностических подходов и методов, отвечающих современным требованиям. В 2012 году Европейским обществом педиатрической гастроэнтерологии, гепатологии и нутрициологии (ESPGHAN) были опубликованы рекомендации по диагностике и лечению целиакии у детей (European Society for Pediatric Gastroenterology, Hepatology, and Nutrition Guidelines for the Diagnosis of Coeliac Disease). Для взрослой категории пациентов последние практические рекомендации приняты в 2013 году Американской коллегией гастроэнтерологов (ACG Clinical Guidelines: Diagnosis and Management of Celiac Disease), Британским обще-
ством гастроэнтерологов (Diagnosis and management of adult coeliac disease: guidelines from the British Society of Gastroenterology), а также Всемирной организацией гастроэнтерологов (World Gastroenterology Organisation global guidelines on celiac disease). Представленные в рекомендациях по диагностике и лечению целиакии результаты и подробный анализ по изучению известных маркеров расширили диагностические возможности выявления целиакии. Однако, имеющие место отличия в диагностическом подходе и разная оценка диагностических возможностей лабораторных тестов определяют необходимость дальнейшего совершенствования протоколов обследования.
В России в 2014 году приняты Национальные рекомендации по диагностике и лечению целиакии взрослых. В 2015 году утверждены Федеральные клинические рекомендации по оказанию медицинской помощи детям с целиакией. Тем не менее, задача своевременного выявления целиакии продолжает оставаться актуальной в связи с отсутствием четко обозначенных принципов лабораторной диагностики, диагностической информативности новых тестов и единого комплексного диагностического подхода с учетом системного анализа накопленных данных. Рекомендованные Федеральными клиническими рекомендациями по оказанию медицинской помощи детям с целиакией (2015г.) алгоритмы обследования ESPGHAN (2012г.) не адаптированы к отечественным лабораторным тестам, которые используются для диагностики целиакии в России. Другие операционные характеристики и верхний предел референтного интервала у отечественных тестов определяют иной уровень антител для достижения 100% предсказательной ценности положительного результата, что приводит к увеличению диагностических ошибок при использовании протоколов ESPGHAN.
Таким образом, совершенствование диагностических протоколов с учетом четко обозначенных принципов, вновь сформулированных и известных клинико-диагностических критериев, реализованных в алгоритме лабораторной диагностики, обеспечит возможность своевременного выявления целиакии, позволит существенно снижать процент не диагностируемых форм, тяжесть исходов заболевания и будет способствовать эффективному лечению и мониторингу диетотерапии. Успешное выполнение адекватных лечебно-оздоровительных мероприятий, предупреждающих формирование осложнений заболевания, значительно повысит уровень социальной адаптации и психологической реабилитации больных целиакией. Все вышесказанное определяет актуальность темы диссертационного исследования.
Цель исследования
На основе оценки диагностической информативности современных лабораторных тестов обосновать диагностические критерии, принципы лабораторной диагностики целиакии и разработать алгоритмы обследования для своевременного выявления заболевания и оптимизации лечения.
Задачи исследования
1. Оценить диагностическую информативность тестов по определению антител к тканевой трансглутаминазе (ТТА) и к эндомизию (ЭМА) для дифференциальной диагностики воспалительных заболеваний кишечника с формированием критерия дифференциальной диагностики и проанализировать с применением принципов этапности и взаимозависимости целесообразность модификации верхнего предела референтного интервала ТТА для достижения 100% предсказательной ценности положительного результата на первом этапе диагностики целиакии.
2. На основании операционных характеристик лабораторных тестов по опре
делению антител к дезаминированным пептидам глиадина (ДПГА) и к тканевой
трансглутаминазе в капиллярной крови (ТТА-к) определить диагностическую ин
формативность, а также провести анализ комбинаций тестов ДПГА и ТТА с учетом
принципа системной интеграции.
3. Установить прогностическую значимость субэпителиальных тканевых
трансглутаминазных депозитов (ТТ-д) в слизистой оболочке тонкого кишечника
для выявления субклинических форм и ранней диагностики целиакии. Изучить
взаимосвязь дефицита карнитина, как дополнительного маркера целиакии, со сте
пенью поражения слизистой оболочки тонкого кишечника у больных целиакией
для оценки эффективности проводимого лечения.
-
Изучить распределение HLA-гаплотипов (HLA-DQ2, HLA-DQ8), ассоциированных с целиакией, в популяции Российской Федерации, установить их диагностическую значимость и сформулировать диагностический критерий исключения целиакии для пациентов, имеющих генетический риск.
-
Для оптимизации лечения разработать новый диагностический подход по выявлению иммунологической толерантности у больных целиакией к авенинам наиболее распространенных пищевых сортов овсов.
-
Разработать алгоритмы обследования для групп риска и пациентов с подозрением на целиакию с учетом сформированных критериев и основных принципов лабораторной диагностики.
Научная новизна и теоретическая значимость работы
На основании проведенных лабораторных исследований систематизирована значимость сывороточных маркеров целиакии, которые дают четкое представление о механизмах длительно протекающего воспалительного (иммунологического) процесса, вызванного действием глютена.
Подтверждено, что наличие субэпителиальных тканевых трансглутаминаз-ных депозитов в слизистой оболочке тонкой кишки свидетельствует о генерализации патологического иммунного процесса.
Установленная высокая специфичность антител к дезаминированным пептидам глиадина подтверждает феномен молекулярной (эпитопной) мимикрии, предполагающей формирование антигенной детерминанты, похожей на эпитоп тканевой трансглутаминазы.
Впервые показано отсутствие ложноположительных результатов у теста по определению антител к эндомизию при проведении дифференциальной диагностики в группах пациентов с воспалительными заболеваниями кишечника (болезнь Крона и язвенный колит) определяет ЕМА как критерий дифференциальной диагностики.
Впервые выявлено отсутствие зависимости субэпителиальных депозитов к тканевой трансглутаминазе от степени поражения слизистой оболочки тонкой кишки и показано значение субэпителиальных депозитов к тканевой трансглута-миназе, как дополнительного маркера, для ранней диагностики целиакии и ее субклинических форм. Установлена диагностическая эффективность субэпителиальных депозитов к тканевой трансглутаминазе слизистой оболочки тонкой кишки для выявления эпизодического нарушения диетотерапии.
Впервые определено значение дополнительных маркеров целиакии, на примере карнитина и его эфиров (ацилкарнитинов) для оценки поражения слизистой оболочки тонкой кишки и эффективности лечения.
Изучены HLA-гаплотипы в популяции Российской Федерации, ассоциированные с целиакией, определена распространенность и подтверждена их значимость для развития болезни. Впервые установлено, что увеличение доли носитель-ства рисковых гаплотипов при нарастании степени поражения слизистой тонкого кишечника позволяет прогнозировать клиническое течение целиакии.
Разработан новый диагностический подход для выявления иммунологической толерантности у больных целиакией к определенным сортам овсов («Пушкинский» и «Астор»), позволяющий оптимизировать лечение.
Впервые разработаны новые диагностические критерии для исключения це-лиакии – комбинация тестов ЕМА + IgA-ТТА (прогностическая ценность отрицательного результата - 100%) и подтверждения целиакии – комбинация тестов IgA-ТТА + определение субэпителиальных депозитов в биоптатах СОТК + характерные для целиакии гистоморфологические и морфометрические изменения в биоптатах СОТК (прогностическая ценность положительного результата - 100%).
Сформулированы основные принципы лабораторной диагностики и диагностические критерии для выявления целиакии.
Практическая значимость работы
Обоснована возможность включения дезаминированных пептидов глиадина в программу обследования, как информативного теста, для диагностики целиакии. Доказана необходимость определения антител к дезаминированным пептидам глиадина IgG-класса вместо неспецифических антител к тканевой трансглутамина-зе и к глиадину IgG-класса (IgG-ТТА и IgG-АГА) для достоверного выявления це-лиакии у больных с селективным IgA–иммунодефицитом.
Определены условия использования иммунохроматографического экспресс-метода для мониторирования диетотерапии у больных целиакией
Предложен лабораторный метод определения субэпителиальных тканевых трансглутаминазных антител в слизистой оболочке тонкой кишки, позволяющий выявлять субклинические формы целиакии и проводить мониторинг диетотерапии.
Определены сорта овсов («Пушкинский», «Астор»), не вызывающие патологическую иммунную реакцию и являющиеся наиболее безопасными для включения в рацион питания больных целиакией.
Разработаны алгоритмы лабораторного обследования больных с подозрением на целиакию и групп риска, которые позволяют своевременно выявлять данное заболевание и эффективно мониторировать диетотерапию у больных с глютеновой энтеропатией.
Положения, выносимые на защиту:
-
IgА–ТТА являются чувствительными маркерами целиакии, но высокая вероятность получения ложноположительных результатов вызывает необходимость верификации диагноза более специфичным ЭМА-тестом. Модификация верхнего предела референтного интервала ТТА для соответствия 100% предсказательной ценности положительного результата с целью сокращения сроков обследования, приводит к увеличению ложноотрицательных результатов и не решает проблем с ранней диагностикой целиакии.
-
Высокая диагностическая информативность лабораторного теста по определению ДПГА и специфичность IgG–ДПГА для выявления селективного IgA-дефицита повышают эффективность диагностики целиакии. Операционные характеристики экспресс-теста для определения антител к тканевой трансглутаминазе в капиллярной крови не могут конкурировать с другими лабораторными тестами
(ЭМА, ТТА), поэтому применение этого теста в настоящее время диагностически не оправдано.
-
Протективный ретротрансцитоз объясняет возможность раннего субэпителиального депонирования в СОТК антител к тканевой трансглутаминазе (IgA-ТТ-д), независимо от степени ее повреждения, что повышает диагностическую эффективность определения IgA-ТТ-д для своевременного выявления целиакии и эпизодического нарушения диетотерапии. Вторичный дефицит карнитина и его эфиров (ацилкарнитинов), связанный с поражением СОТК, служит дополнительным критерием эффективности терапии, позволяющей избегать развитие осложнений заболевания.
-
Отсутствие носительства HLA-DQ2 и HLA-DQ8 гаплотипов у лиц групп риска исключает целиакию на начальном этапе обследования, способствуя снижению количество повторных лабораторных исследований, сокращению цикла обследования, уменьшению ошибок и задержек в принятии клинического решения.
-
Разная иммунологическая толерантность к авенинам овсов у больных це-лиакией обеспечивает основу индивидуализации и сбалансированности питания, оптимизирующих лечение больных целиакией.
6. Основными принципами лабораторной диагностики целиакии являются
этапность выполнения исследований, их взаимозависимость, системная интегра
ция, синергизм, которые вместе с разработанными клинико-диагностическими кри
териями определяют построение алгоритмов с высокой диагностической эффек
тивностью, обуславливающей раннее выявление целиакии.
Возможные области применения и формы внедрения. Клиническая лабораторная диагностика, гастроэнтерология, терапия. Экономический эффект от внедрения будет определяться своевременным выявлением целиакии, а также оценкой успешного выполнения адекватных лечебно-оздоровительных мероприятий, предупреждающих формирование многочисленных осложнений и инвалиди-зацию пациентов.
Методология и методы исследования. Методoлогической основой диссертационного исследования явилось последовательное применение методов научного познания. Рaбота выполнена в дизайне сравнительного открытого исследования с использованием клинических, лабораторных, аналитических и статистических методов. Для реализации цели исследования и обоснования основных положений был проведен аналитический обзор отечественной и зарубежной литературы.
Степень достоверности и апробация результатов исследования. Достоверность полученных результатов обеспечивалась как теоретическим анализом проблемы, так и репрезентативностью объема выборок обследованных пациентов, использованием современных методов исследований и достоверным статистическим анализом данных.
Основные положения работы, а также результаты исследований доложены на Международных Славяно-Балтийских научных форумах «Санкт-Петербург – Гастро – 2003, 2004, 2005, 2006, 2007, 2008, 2009, 2010, 2011, 2012, 2013, 2014, 2015»; 3-ем Российском конгрессе «Современные технологии в педиатрии и детской хирургии» (Москва, 2004); 11-ом Конгрессе детских гастроэнтерологов России «Актуальные вопросы абдоминальной патологии у детей» (Москва, 2004); юбилейной конференции «Медико-генетическая служба Санкт-Петербурга (к 35-летию медико-генетического центра, Санкт-Петербург, 2004); 5-ом съезде Российского общества медицинских генетиков (Уфа, 2005); 6-ом съезде Научного обще-
ства гастроэнтерологов России (Москва, 2006); 4-ом съезде медицинских генетиков Украины (Львов, 2008); 2-ом Российском форуме «Здоровье детей: профилактика социально-значимых заболеваний» (Санкт-Петербург, 2008); 3-ем Международном конгрессе «Наследственные метаболические заболевания» (Харьков, Украина, 2008); Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Оптимизация диалога клинициста и лаборатории у постели больного» (Санкт-Петербург, 2008); юбилейной конференции «Современные технологии профилактики наследственных болезней и детской инвалидности» (к 40-летию Медико-генетического центра, Санкт-Петербург, 2009); 4-ой Междисциплинарной конференции по акушерству, перинатологии, неонатологии «Здоровая женщина-здоровый новорожденный» (Санкт-Петербург, 2009); Конгрессе с международным участием «Актуальные проблемы акушерства и гинекологии, клинической иммунологии и медицинской генетики» (Киев, 2010); Первой Всероссийской конференции по редким болезням и редко применяемым медицинским технологиям «Дорога жизни» (Санкт-Петербург, 2010); Заседании Санкт-Петербургского филиала Российского научного общества детских гастроэнтерологов (Санкт-Петербург, 2010); Международном форуме «Биоиндустрия» (номинация «Биотехнологические решения для здравоохранения»), Санкт-Петербург, 2011; Симпозиуме «Плюсы и минусы современной диагностики целиакии» в рамках XII съезда Научного общества гастроэнтерологов России «Классическая и прикладная гастроэнтерология» (Москва, 2012); Научно-практической конференции «Новые аспекты дието- и фармакотерапии при патологии органов пищеварения у детей» (Санкт-Петербург, 2012); 5-ой Всероссийской конференции с международным участием «Пренатальная диагностика и генетический паспорт – основа профилактической медицины в век нанотехнологий» (Санкт-Петербург, 2012); 2-ом Российском конгрессе с международным участием «Молекулярные основы клинической медицины – возможное и реальное» (Санкт-Петербург, 2012); 39 научной сессии Центрального научно-исследовательского института гастроэнтерологии «Мультидисциплинарный подход к гастроэнтерологическим проблемам» (Москва, 2013); 42 научной сессии Центрального научно-исследовательского института гастроэнтерологии «Принципы доказательной медицины в клиническую практику» (Москва, 2016); Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием «Пищевая непереносимость у детей. Современные аспекты диагностики, лечения, профилактики и диетотерапии», Санкт-Петербург, 2016.
Результаты проведенной работы используются в практической деятельности СПб ГКУЗ «Медико-генетический центр», ГБУЗ «Городская поликлиника №23», в гастроэнтерологическом отделении клиник СЗГМУ им. И.И. Мечникова Минздрава России, отделения гастроэнтерологии Республиканского специализированного научно-практического центра педиатрии Республики Узбекистан. Теоретические результаты работы и апробированные диагностические методы целиакии нашли применение в учебном процессе на кафедре клинической лабораторной диагностики с курсом молекулярной медицины ГБОУ ВПО ПСПбГМУ им. И.П. Павлова Минздрава России.
По теме диссертации опубликовано 49 работ, среди них монография, учебное пособие и методические рекомендации, 17 статей в изданиях, определенных перечнем ВАК.
Личное участие автора. Диссертант лично участвовал в планировании и организации работы, проведении большей части лабораторных исследований, обра-
ботке, анализе, формулировании выводов, рекомендаций и алгоритма обследования.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 233 страницах машинописного текста, иллюстрирована 28 таблицами и 40 рисунками. Состоит из введения, основной части, включающей обзор литературы, описание материалов и методов исследования, 6 глав результатов собственных исследований, заключение, список сокращений и условных обозначений, список литературы из 69 отечественных и 287 иностранных источников.
Клинические проявления и классификация целиакии
Как одна из задач по уменьшению не диагностированной целиакии является понимание и достаточная изученность патогенеза. В настоящее время в этом направлении сделан революционный прорыв с помощью полногеномного анализа ассоциаций (Genome Wide Association Studies – GWAS), сумевшего объяснить все стороны патогенеза, подтвердив мультифакторность целиакии, развитие которой контролируется множественными взаимодействующими факторами, как генетической, так и средовой природы [209]. К наиболее значимым внешним (средовым) факторам относят инфекции, особенно ротавирусную у детей и кампилобактериоз у взрослых, а также такие факторы, как: раннее отнятие ребенка от груди, характер питания, лекарственные препараты, экологические, социально-экономические факторы [217,349]. Так, установлено, что тяжелая манифестация болезни, как правило, наблюдается при раннем переводе грудного ребенка на искусственное вскармливание (от четырех до шести месяцев жизни) и изменение пищевого рациона у лиц с наследственной предрасположенностью к целиакии, включающего высокое содержание злаковых белков. Кроме этого, проведенные исследования, установили, что определенные лекарственные препараты, например, препараты железа, которые принимаются во время беременности, могут воздействовать на врожденную иммунную систему и повышать риск развития целиакии у ребенка, также как изменение микрофлоры кишечника под воздействием антибиотиков [217,244]. Как один из главных факторов риска, определяющий наследственную предрасположенность к целиакии, были признаны HLA-гены, которые, помимо участия в патогенезе целиакии, у грудных детей могут определять другую микробиоту [349]. Было также установлено, что курение беременной, кесарево сечение также повышают риск развития целиакии у ребенка. Проведенные исследования подтвердили многофакторность целиакии и выделили из достаточно большого количества внешних факторов основные: глютен, генетическая предрасположенность, кишечные, вирусные инфекции [209,28].
Общепризнанным остается факт, что начальными, но не определяющими событиями для формирования иммунного ответа у больных целиакией являются изменение проницаемости поверхности кишечного эпителиального слоя и несостоятельность кишечных пептидаз, что позволяет проникнуть необработанным пептидам глютена в собственную пластинку слизистой оболочки тонкого кишечника (lamina propria). Обычно олигопептиды глютена эффективно обрабатываются кишечными пептидазами, локализованными в щеточной кайме мембраны энтероцитов до аминокислот, ди- и/или трипептидов, прежде чем транспортируются через эпителий кишечника [4]. При целиакии содержание большого количества пролина и глутамина в пептидах глютена выявляет недостаточную эффективность ферментов кишечника и обеспечивает резистентность пептидов к кишечному протеолизу. Необработанные пептиды глютена, попадая в собственную пластинку слизистой тонкого кишечника, предположительно приводят к стимуляции как врожденного, так и приобретенного иммунитетов, как это будет показано ниже в разделе 1.5.2. В настоящее время токсико-иммуногенными пептидами глютена признаны 33-mer, состоящий из 33 аминокислот, и 25 mer (25 аминокислот) которые, как показали проведенные исследования, продолжают оставаться активными в условиях in vivo после приема глютена [243,262]. Главным медиатором клеточного стресса и активации врожденного иммунитета после поступления в собственную пластинку слизистой тонкого кишечника пептидов глютена считается интерлейкин-15 (ИЛ-15, IL-15), который вырабатывается кишечным эпителием, активированными макрофагами, дендритными клетками. Основными функциями ИЛ-15 в патогенезе целиакии является наращивание цитотоксической активации межэпителиальных лимфоцитов (IELs, МЭЛ), апоптоза эпителиоцитов, а также снижение устойчивости СОТК к глиадину [90,252,254,43]. Кроме этого, ИЛ-15 стимулирует созревание антигенпредставляющих клеток, тем самым расширяя презентацию глиадиновых пептидов. Это приводит к активации CD4+Т-лимфоцитов и инициирует связь между врожденным и адаптивным иммунитетами [354,94,73]. Выявлено влияние ИЛ-15 на ингибирование трансформирующего фактора роста бета (ТФР-, TGF-), который приводит к развитию и поддержанию воспалительных процессов в слизистой тонкого кишечника [190].
Помимо иммунологических механизмов токсичности глютена, изучение протеомики целиакии позволило понять и биохимические процессы, определяющие повреждения СОТК, связанные с действием глютена [159]. Было показано, что высокая концентрация глутамина и пролина в тонком кишечнике, может формировать токсические эффекты у пациентов с наследственной предрасположенностью к целиакии [328]. Так, накопление пептидов глиадина в лизосомах активизирует перекисное окисление липидов, что влияет на изменение сигнальной трансдукции и накопление свободных радикалов (активные формы кислорода, оксида азота, липидов) [216,319,18]. Усиление процессов пероксидации липидов способствует изменению поверхностного заряда мембран, уменьшению гидрофобного объема липидного слоя мембран, с увеличением их микровязкости, отражаясь на окислительно-восстановительном потенциале клетки, а также на рецепторных функциях мембран кишечного эпителия [314,289]. Перечисленные процессы приводят к изменению клеточной морфологии, пролиферации, дифференцировке, апоптозу, модуляции генетической экспрессии [234,302,138]. Изменение окислительного баланса становится причиной активации ядерного фактора транскрипции (NF-B) и стимулирует продукцию провоспалительных цитокинов, а также таких ферментов, как циклооксигеназа COX, липоксигеназа LOX, индуцибельная синтаза оксида азота iNOS, участвующих в синтезе простагландинов, простациклинов, тромбоксанов и оксида азота, способствующих усилению оксидативного стресса [174,240]. Увеличение активного кислорода, как следствие оксидативного стресса, меняет свойства убиквитин-зависимой системы протеолиза, что приводит к уменьшенной деградации тканевой трасглутаминазы (TG2) и к ее не контролируемой активации. Все эти процессы способствуют изменению экспрессии воспалительных генов и являются причиной формирования патологических изменений в СОТК [234,132]. Таким образом, основным итогом воздействия глютена на врожденный иммунитет является избыточная продукция ИЛ-15, цитотоксическая активизация МЭЛ и активация глютеном оксидативного стресса, приводящие в целом к процессам активного апоптоза и воспалительным изменениям в СОТК.
Клиническая характеристика больных по группам
Для оценки диагностической информативности антител к эндомизию и к тканевой трансглутаминазе при проведении дифференциальной диагностики воспалительных заболеваний кишечника в группу сравнения были включены 39 больных с диагнозом «болезнь Крона» (по МКБ Х – К50.0, К50.1, К50.8) и 45 больных с диагнозом «язвенный колит» (по МКБ Х – К51.0 - К51.8). Диагнозы «болезнь Крона» и «язвенный колит» были выставлены на основании сочетания данных анамнеза, клинической картины, лабораторных данных и типичных эндоскопических и гистологических изменений кишечника в ГБОУ ВПО «Первый Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. академика И.П. Павлова». Средний возраст пациентов составил 41,20±15,77 лет.
Группа популяционного контроля. Данная группа (n=2491) была сформирована по опубликованным в открытой литературе результатам HLA-генотипирования в различных популяциях, полученным при обследовании лиц, не имеющих хронических заболеваний и не предъявлявших жалоб на момент обследования. Группа включала: - подгруппу практически здоровых лиц, составленную отдельно по локусам DQA1 (n=1054) и DQB1 (n=1045) из Санкт-Петебурга, Северо-Западного округа, Москвы, Архангельска и Западной Сибири [9,10,16,29,146]. Данные по HLA– генотипированию в этой подгруппе использовались для изучения численности, частот и диагностической значимости рисковых аллельных вариантов HLA-молекул DQ2 и DQ8. - подгруппу (392 практически здоровых лиц), сформированную по результатам HLA-типирования индивидуальных генотипов, которые использовались для изучения гаплотипов и их частот (данные ФГУ «Российский научно-исследовательский институт гематологии и трансфузиологии ФМБА России, Санкт-Петербург и ФГБУ «ГНЦ Институт Иммунологии» ФМБА России, Москва) [2,10,198].
Для проведения исследований использовались образцы цельной венозной и капиллярной крови, а также аликвоты образцов сывороток, хранившихся при -20С не более 6 месяцев, биоптаты СОТК.
Были включены лабораторные иммунологические методы для выявления антител (иммуноферментный анализ, метод непрямой иммунофлуоресценции, иммунохроматографический метод), метод тандемной масс-спектрометрии для определения уровня свободного карнитина и ацилкарнитинов, метод вертикального электрофореза для определения состава авенина сортов овсов, молекулярно-генетический (ПЦР) метод для типирования генов HLA класса II (DQA1, DQB1), метод элюирования антител при исследовании биоптатов слизистой оболочки тонкой кишки.
Для определения антител использовалась сыворотка, полученная путем центрифугирования крови (3000 об/мин) не менее 10 минут. Анализ выполнялся в соответствии с инструкцией, прилагаемой к тест-системам.
Концентрацию антител к глиадину (АГА), тканевой трансглутаминазе (ТТА), дезаминированным пептидам глиадина (ДПГА) определяли «сэндвич» вариантом твердофазного иммуноферментного метода тест-системами фирмы «Хема-Медика», Москва и Orgentec, Германия на планшетном иммуноферментном анализаторе DigiScan Hitech, Австрия. Оптическую плотность измеряли при длине волны А,=450 нм. В качестве антигенов в тест-системах использовались высокоочищенный природный глиадин (а-фракция) для определения АГА, синтетический линейный дезаминированный глиадин для определения ДПГА и человеческая рекомбинантная тканевая трансглутаминаза -для ТТА. При выполнении исследования предварительно разведенную сыворотку, полученную центрифугированием из образца крови пациента, вносили в лунки планшета, где происходило связывание антител из сыворотки пациента с антигеном, нанесенным на внутреннюю поверхность лунок планшета. Образовавшийся комплекс антитело-антиген инкубировали с конъюгатом (мышиные моноклональные антитела к иммуноглобулинам класса IgА или IgG человека, коньюгированные с пероксидазой хрена). После отмывки в связанный с пластиком лунки планшета «сэндвич», содержащий пероксидазу хрена, добавляли тетраметилбензидин (ТМБ) и инкубировали. Катализируемое пероксидазой окисление ТМБ, представляющее совокупность радикальных реакций, приводило к образованию продуктов окисления (феноксильные и аминильные радикалы), имеющих синюю окраску. Ингибировали пероксидазное окисление ТМБ добавлением стоп-раствора, что обеспечивало переход окраски в желтый цвет. Аналитические характеристики тест-систем: воспроизводимость (коэффициент вариации, CV%) -5% (ДПГА) и 8% (АГА, ТТА); минимальная достоверно определяемая концентрация 1 ед/мл (ДПГА) и 5 ед/мл (АГА, ТТА); процент открытия - 90-110% (АГА, ТТА) и 86,7% (ДПГА); линейность 25-200 ед/мл (АГА, ТТА) и 0 - 100 ед/мл (ДПГА). Результаты оценивали согласно референтным пределам, установленным для данного теста.
Антитела к эндомизию (ЭМА) определяли методом непрямой иммунофлуоресценции (тест-системы фирмы IMMCO Diagnostics, США) с использованием криостатных срезов эндомизия пищевода приматов в качестве антигена, который инкубировали с образцами сывороток пациентов. Все не связавшиеся компоненты сыворотки удаляли при промывке фосфатно-солевым буфером (PBS). Связавшиеся антитела выявляли инкубированием субстрата с коньюгатом (меченные флуоресцентной меткой FITC козьи поливалентные антитела к иммуноглобулинам человека). Результат реакции регистрировали с помощью микроскопа МИКМЕД-6, имеющего люминесцентную насадку (ОАО «ЛОМО», Санкт-Петербург), объектив SP 40х/0,65оо/0,17, окуляр К10х. Присутствие антител к эндомизию проявлялось появлением яблочно-зеленой флуоресценции эндомизия гладкомышечных волокон пищевода примата, которую выражали полуколичественно, в титрах. Титр определялся при анализе серийных разведений опытного образца. Аналитические характеристики теста: специфичность 99%, точность (процент открытия) 100%, чувствительность (минимально определяемая концентрация ЭМА, выраженная в титрах 2.5) равнялась 100%, воспроизводимость 5%.
Антитела к тканевой трансглутаминазе в капиллярной крови (ТТА-к) пациентов определяли иммунохроматографическим методом с применением подвижных моноклональных мышиных антител, коньюгированных коллоидным золотом как красителем (наборы реагентов «Biocard Лабсистемс», Финляндия). В качестве стационарной фазы использовался иммобилизованный белок (желатин как гидролизат коллагена), субстратом служила эндогенная тканевая трансглутаминаза, полученная при лизисе собственных эритроцитов пациента. Присутствие в крови пациента антител к тканевой трансглутаминазе приводило к их взаимодействию с субстратом и моноклональными мышиными антителами, маркированными коллоидным золотом. Образование такого комплекса связывало тканевую трансглутаминазу со стационарной фазой, с последующим накоплением мышиных антител, коньюгированных коллоидным золотом в тест-зоне. Процесс завершался появлением красной линии как индикатора присутствия в крови пациента ТТА-к. Аналитические характеристики теста: воспроизводимость (CV) - 5%, чувствительность 96,3%, специфичность - 89,7%, точность (процент открытия) -96,9%.
Анализ целесообразности модификации верхнего предела референтного интервала ТТА для достижения 100% предсказательной ценности положительного результата на первом этапе диагностики целиакии и сокращения сроков обследования
Проведенные исследования показали вероятность получения ложноположительных результатов IgА–ТТА не только в группе больных с язвенным колитом и болезнью Крона, но и в группе сравнения (аутоиммунные заболевания, хронические заболевания желудочно-кишечного тракта, нарушения кишечного всасывания) в отличие от ЭМА, которые не имели ложноположительных результатов у этих пациентов. Связанные с этим установленные прогностическая значимость и отношения правдоподобия положительных результатов для IgА–ТТА оказались ниже, чем у ЭМА, что предполагает меньшую диагностическую значимость IgА–ТТА. Установленное значительное превосходство значений отношения правдоподобия положительного результата и предсказательной ценности положительного результата у ЭМА определяет их первостепенное значение в лабораторной панели при установлении диагноза целиакии и в дифференциальной диагностике при наличии клинических подозрений на глютеновую энтеропатию.
Имевшие место отрицательные результаты ЭМА у двух больных целиакией (ложноотрицательные результаты), позволяют сделать вывод о недостаточной чувствительности ЭМА, что также подтвердили показатели предсказательной ценности, отношения правдоподобия отрицательных результатов теста и чувствительности, которые оказались лучше у IgА–ТТА.
Диагностические характеристики определения антител и их соотношения продемонстрированы построением ROC-кривых (рисунок 3.4).
Кроме этого, в группе сравнения были зарегистрированы два ложноположительных результата. Выяснение причины получения таких результатов было связано с субъективностью интерпретации, что снижает достоверность полученных результатов и требует достаточного опыта работы для анализа флуоресцентной визуализации.
Максимальная интегральная диагностическая эффективность (площадь под кривой), превышающая таковую для IgA-ТТА, получена при определении ЭМА (рисунок 3.4). Таким образом, по результатам проведенного исследования установлено, что ЭМА является лучшим диагностическим маркером как для группы больных с болезнью Крона и язвенным колитом, так и для больных с целиакией. Отсутствие ложноположительных результатов в группах с язвенным колитом и болезнью Крона, позволяет рекомендовать включение ЭМА в алгоритм дифференциальной диагностики воспалительных заболеваний кишечника. По сравнению с ЭМА, полученные диагностические характеристики для IgА–ТТА и IgG–ТТА в группах пациентов с болезнью Крона и язвенным колитом характеризуют их как неспецифические маркеры, которые не могут включаться в алгоритм лабораторного обследования с целью проведения дифференциальной диагностики. Для группы больных с установленным диагнозом «целиакия» (таблица 3.3) IgА–ТТА являются специфичными и высоко чувствительными маркерами, однако выявленная возможность получения ложноположительных результатов вызывает необходимость их подтверждения положительными результатами антител к эндомизию, как более специфического теста. Однако возможная субъективность интерпретации результатов, а также недостаточная чувствительность ограничивает доступность для широкого практического применеиия этого теста и определяет принятие нового методического решения.
Установленная неудовлетворительная диагностическая точность теста для определения IgG–ТТА не позволяет включать IgG–ТТА для выявления целиакии.
Анализ целесообразности модификации верхнего предела референтного интервала ТТА для достижения 100% предсказательной ценности положительного результата на первом этапе диагностики целиакии и сокращения сроков обследования Известно, что снижение ложноположительных результатов исследования, которые, как установлено выше, характерны для ТТА, возможно при изменении точки отсечения (cut-off), которая отражает оптимальные соотношения чувствительности и вероятности ложноположительных результатов исследования (1-специфичность) и определяется в ходе построения ROC-кривой. Смещение (подбор) значения cut-off позволяет достичь 100% предсказательную ценность положительного результата и, тем самым, значительно повысить клиническую информативность исследований [22]. Достижение 100% предсказательной ценности положительного результата позволяет формировать группу обследуемых с несомненным диагнозом и исключает необходимость проведения дополнительного обследования, обеспечивая скрининговый режим отбора пациентов с целиакией. Использование такого подхода было предложено в 2012 году Европейским обществом педиатрической гастроэнтерологии, гепатологии и нутрициологии (ESPGHAN) и применено для антител к тканевой трансглутаминазе, которые широко используются в диагностике целиакии, имеют простоту определения, коммерческую доступность, отсутствие субъективизма при анализе получаемых результатов. Для апробации такого подхода был проведен ретроспективный анализ результатов обследования 392 пациентов, полученных на отечественных тест-системах фирмы «Хема-Медика», Москва, с установленным для них фирмой-производителем cut off = 20 Eд/мл (IgA-ТТА) и 25 Eд/мл (IgG-ТТА). Именно эти наборы лежат в основе диагностической панели и широко распространены в Российской Федерации.
Из общего количества пациентов, включенных в данный анализ (n=392), у 78 пациентов поставлен и подтвержден в ходе наблюдения диагноз целиакии, а у 9 больных, несмотря на положительные результаты сывороточных ТТА, диагноз не подтвердился.
Взаимосвязь соответствия дефицита карнитина со степенью поражения СОТК у больных целиакией
Кроме этого, наблюдалась положительная динамика на фоне лечения, назначенного согласно выставленному диагнозу. Полученные результаты подтвердили мнение о возможной схожей с целиакией выраженности морфологических изменений СОТК при других заболеваниях тонкой кишки, обусловленных иммунными нарушениями [32,20].
Присутствие генетических маркеров было зарегистрировано у 15 из 45 пациентов, что составило 33,3% и подтвердило мультифакторность целиакии с возможностью носительства HLA-гаплотипов у лиц, не болеющих этим заболеванием.
Результаты измерения IgА-ТТ-д выражались в единицах оптической плотности (оп) с дальнейшим переводом их в произвольные единицы AU (arbitrary units). Значения AU рассчитывались как отношения оптической плотности, полученное для каждого пациента к некоторому эталонному значению оптической плотности. В качестве эталонного принималось значение точки отсечения (cut-off), которое определялось при проведении ROC-анализа. На рисунке 5.2 в качестве примера показана ROC-кривая для субэпителиальных депозитов IgА-ТТ-д в биопсийном материале в группе больных целиакией до начала лечения. На ROC-диаграмме приведено значение точки отсечения (0,25) и значения чувствительности и специфичности для критерия 0,25. Аналогичные расчеты эталонных значений оптической плотности и AU проводились и для других групп пациентов, с расчетом. средних значений AU и 95% доверительного интервата для каждой группы пациентов.
Результаты, полученные в группе сравнения по IgA-ТТ-д, показали, что среднее значение AU у них было минимальным - 0,665 AU (таблица 5.2). Однако, у пяти пациентов из этой группы, имеющих в анамнезе аутоиммунные заболевания, были зарегистрированы значения IgA-ТТ-д (в среднем 2,06 AU), превышающие установленное для этой группы среднее значение, что предполагает недостаточную специфичность IgA-ТТ-д.
Результаты, полученные в группе сравнения по IgA-ТТ-д, показали, что среднее значение AU у них было минимальным - 0,665 AU (таблица 5.2). Однако, у пяти пациентов из этой группы, имеющих в анамнезе аутоиммунные заболевания, были зарегистрированы значения IgA-ТТ-д (в среднем 2,06 AU), превышающие установленное для этой группы среднее значение, что предполагает недостаточную специфичность IgA-ТТ-д.
Зарегистрированные ложноположительные результаты обследования (IgA-ТТ-д и ТТА) у пациентов с аутоиммунной патологий получили объяснение описанной выше возможностью формирования клона незрелых В-клеток с гипермутациями в V-генах, приводящие к повышению аффинности связывания антител к нетипичному для них антигену.
В группе больных с впервые выявленной целиакией до начала терапии определение IgA-ТТ-д характеризовалось высокой частотой положительных результатов при сопоставлении с группой сравнения. В группе c впервые выявленной целиакией количественная характеристика (средние значения, выраженные в произвольных единицах, AU) соответствовала как очень высокому уровню у больных с типичным течением целиакии до лечения (22,615 AU, с разбросом от 16,501 до 27,499 AU), так и умеренно повышенному при атипичных формах (5,477 AU с разбросом от 3,448 до 6,559 AU). При этом результаты гистологических маркеров были сравнимы и не отличались по своей выраженности у этих же пациентов (таблица 5.2).
Исключение составили 3 больных с высокими значениями IgA-ТТ-д из этой группы пациентов, у которых была установлена бессимптомная форма целиакии. Все они не предъявляли жалоб и обследовались в связи с выявлением целиакии у ближайших родственников.
У двух больных умеренно повышенные IgA-ТТА депозиты (6,92 AU) сочетались с не превышающими референтные пределы значениями сывороточных и морфометрических показателей. В ходе динамического наблюдения в течение 6 месяцев было отмечено нарастание тяжести клинической симптоматики, а при повторном взятии биоптата была установлена деструктивная стадия по М.Marsh и назначена безглютеновая диета.
Исследование ТТА только в 85,7% случаев при впервые выявленной целиакии дало положительные результаты. В то же время у 3 из 21 больного ТТА не превышали установленные референтные пределы, что подтвердило недостаточную чувствительность этого маркера.
Результаты молекулярно-генетических исследований в этой группе пациентов, так же как в группе больных, находящихся постоянно или нарушающих безглютеновую диету, подтвердили ассоциацию целиакии с HLA-гаплотипами (установленный процент носительства HLA-гаплотипов составил 90,5%, 85,7% и 87,0%, соответственно).
Морфометрические измерения слизистой оболочки тонкого кишечника, характерные для целиакии, отсутствовали у 3-х больных среди пациентов с впервые выявленным заболеванием. У одного из них была установлена латентная форма целиакии на основании высоких титров ЭМА, значительно превышающих референтные пределы результатов для ТТА и клинических проявлений – эпизодическое нарушение стула (до 3-4 раз в день) и повышенная утомляемость. Отсутствие характерных для целиакии гистоморфометрических изменений СОТК у двух других пациентов из этой группы может свидетельствовать о мозаичности (фрагментарности) поражения СОТК при целиакии и необходимости взятия большего количества биоптатов для получения достоверных результатов.
Большой интерес представляло изучение соотношений находок IgA-ТТ-д и степени морфометрических изменений. Проведенный корреляционный анализ зависимости между IgA-ТТ-д и стадией повреждения СОТК по Marsh показал отсутствие линейной корреляционной зависимости (rs=0,13, р 0,05), представленное на рисунке 5.3. Отсутствие корреляции позволяет использовать определение IgA-ТТ-д в сложных диагностических ситуациях и представляет это исследование важным для диагностики манифестных форм целиакии, протекающих с минимальными отклонениями морфометрических показателей.