Содержание к диссертации
Введение
1 Вирус гепатита В и вакцинация 17
1.1 Динамика эпидемического процесса гепатита В в условиях широкомасштабной вакцинации 17
1.2 Генотипы и субтипы HBV и их географическая распространенность 19
1.3 Гуморальный иммунный ответ при гепатите В 20
1.4 Проблема соответствия вакцин эндемичным вариантам HBV 22
1.5 Мутанты вакцинального ускользания и их распространенность 24
2 Морфологические и структурные особенности вируса гепатита В 28
2.1 Морфологические и структурные особенности HBV 28
2.2 Структурные особенности мутанта G145R HBV 30
3 Инфекция HBV и клеточный иммунитет 31
3.1 Система врожденного иммунитета в борьбе с HBV 31
3.1.1 Контроль инфекции вируса гепатита В системой врожденного иммунитета 31
3.1.2 Дисфункция NK-клеток и NKT-клеток 36
3.1.3 Инактивация функций дендритных клеток 37
3.1.4 Вирусная апоптотическая мимикрия 40
3.2 Система адаптивного иммунного ответа в борьбе с HBV 42
3.2.1 Изоляция в клетках и тканях организма как один из механизмов ускользания от Т-клеточного надзора 43
3.2.2 HBV-специфичная CD8+ Т-клеточная дисфункция 44
3.2.3 Ускользание HBV от распознавания CD8+ Т-клетками 47
4 Существующие вакцины против гепатита В и перспективные разработки 48
4.1 Лицензированные вакцины 48
4.1.1 Вакцины «первого» и «второго» поколения 49
4.1.2 Вакцины «третьего поколения» 51
4.2 Перспективные разработки вакцин против гепатита В 53
4.2.1 Применение новых адъювантов 53
4.2.2 Вакцины на основе HBcAg и HBsAg 54
4.2.3 Вакцины против мутантов вакцинального ускользания 56
Материалы и методы 58
5 Материалы 58
5.1 Клинический материал 58
5.1.1 Группы пациентов и сыворотки крови 58
5.1.2 Лейкотромбомасса от здоровых доноров 59
5.2 Коммерческие тест-системы 59
5.1 HBsAg дикого и мутантного типов 60
5.1.1 Природные HBsAg 60
5.1.2 Рекомбинантные HBsAg 60
5.2 Антитела 61
5.2.1 Моноклональные и поликлональные анти-HBsAg антитела 61
5.2.2 Моноклональные антитела для проточной цитометрии 61
6 Методы исследования 62
6.1 Выявление эскейп-мутантов HBV в сыворотках крови человека методом иммуноферментного анализа 62
6.2 Метод серологического портретирования 65
6.3 Полногеномное глубокое секвенирование изолятов HBV 66
6.3.1 Амплификация ДНК и приготовление геномных библиотек 66
6.3.2 Секвенирование NGS 67
6.3.3 Генетический и филогенетический анализ 6.4 Получение очищенного HBV дикого типа и мутантных форм вируса 67
6.5 Микроскопические методы исследования 68
6.5.1 Метод трансмиссионной электронной микроскопии 68
6.5.2 Метод негативного контрастирования 68
6.5.3 Реакция непрямого иммуномечения 69
6.6 Иммунизация 69
6.6.1 Иммунизация мышей 69
6.6.2 Иммунизация овец 71
6.7 Характеристика спектра HBsAg–специфичных антител у иммунизированных животных 72
6.7.1 Скрининговый сэндвич-ИФА для определения спектра HBsAg–специфичных мышиных и овечьих антител 72
6.7.2 Выявление титра антител к различным вариантам HBsAg в мышиных сыворотках методом сэндвич-ИФА 74
6.8 Проточная цитометрия 75
6.8.1 Иммунофенотипирование мононуклеаров периферической крови доноров 75
6.8.2 Стимуляция PBMC с помощью рекомбинантных HBsAg 77
6.8.3 Оценка экспрессии маркеров активации мононуклеаров периферической крови доноров после антигенной стимуляции 77
6.9 Статистические методы 81
7 Результаты 82
7.1 Серологическая характеристика сывороток крови хронических HBsAg-носителей и онкогематологических больных с инфекцией HBV 82
7.1.1 Общая характеристика образцов 82
7.1.2 Серологический поиск эскейп-мутантов HBV 83
7.2 Генетические исследования изолятов HBV 84
7.2.1 Полногеномное глубокое секвенирование изолятов HBV 85
7.2.2 Проведение филогенетического анализа 86
7.2.3 Определение субтипов HBV 87
7.2.4 Анализ мутаций в S-HBsAg 88
7.3 Серологическое портретирование различных вариантов HBsAg 90
7.4 Исследование методом трансмиссионной электронной микроскопии с применением иммуномечения морфологии природного G145R мутанта и отобранного рекомбинантного HBsAg 94
7.4.1 Исследование ультраструктуры и морфологических особенностей природных HBV дикого типа и мутантов с заменами G145R и S143L 94
7.4.2 Исследование морфологических особенностей рекомбинантных HBsAg с мутацией G145R, полученных в разных технологических условиях 98
7.5 Сравнительное исследование иммуногенных свойств рекомбинантного HBsAg дикого типа и HBsAg с мутацией G145R в условиях in vitro 100
7.5.1 Иммунофенотипирование PBMC здоровых доноров 100
7.5.2 Оценка экспресси маркеров активации на PBMC здоровых доноров после их стимуляции рекомбинантными HBsAg в условиях in vitro 101
7.5.3 Исследование цитокинового профиля PBMC здоровых доноров после их стимуляции рекомбинантными HBsAg в условиях in vitro 105
7.6 Исследование иммуногенности рекомбинантного мутантного G145R HBsAg in vivo 112
7.6.1 Разработка иммуноферментных тест-систем для оценки специфичности антител к различным вариантам HBsAg в сыворотках иммунизированных животных 113
7.6.2 Исследование иммуногенности рекомбинантного мутантного G145R HBsAg in vivo на мышах 117
7.6.3 Исследование иммуногенности рекомбинантного мутантного G145R HBsAg in vivo на овцах 122
Обсуждение 126
Выводы 139
Список литературы 141
- Мутанты вакцинального ускользания и их распространенность
- Вакцины «первого» и «второго» поколения
- Серологическое портретирование различных вариантов HBsAg
- Исследование иммуногенности рекомбинантного мутантного G145R HBsAg in vivo на овцах
Мутанты вакцинального ускользания и их распространенность
Антигенные свойства НВsAg могут изменяться, что приводит к существенной потере способности анти-НВs антител нейтрализовывать HBV. Такие изменения антигенности могут быть следствием появления мутации как внутри, так и около а-детерминанты [27]. Существование мутантов HBV, ускользающих от протективного действия иммунной системы на фоне проведенной вакцинации, впервые было зарегистрировано в Италии [28, 29] у ребенка, рожденного от HBV-инфицированной матери, который при рождении был вакцинирован от гепатита В, а также получал пассивную вакцинацию специфическими иммуноглобулинами (HBIG) [28]. Прорыв инфекции у этого ребенка был ассоциирован с точечной заменой гуанозина на аденозин в 587 нуклеотиде и сопровождался аминокислотной заменой глицина на аргинин в (sG145R) во второй петле а-детерминанты. В результате этого наблюдалась постоянная виремия и антигенемия в течение более чем 12 лет, несмотря на серопротективный уровень антител к HBsAg. Такого варианта вируса у матери не было [28]. Впоследствии появились и другие аналогичные сообщения [30, 31, 32, 33, 34, 35]. Варианты HBV, в отношении которых вакцинация оказалась неэффективной, получили название мутантов «вакцинного ускользания», или «escape»-мутантов. Практически все они имеют замены в а-детерминанте HBsAg [36, 37]. Эпидемиологические данные по распространенности мутантов вакцинального ускользания, а также мутанта G145R на территории разных стран приведены в таблице 2.
Динамика проявлений эпидемического процесса гепатита В на различных территориях зависит от социальных, экономических, биологических, демографических факторов и поведенческих стереотипов населения. Их совокупность влияет на формирование и масштабы группы риска, на доминирование тех или иных путей передачи HBV и их интенсивность [48]. Wilson J.N. и соавт. в 1998 – 1999 гг. разработали эпидемиологическую модель HBV (апробировали для HBV в Гамбии), для того чтобы исследовать возможные схемы появления вакциноустойчивого штамма вируса. При пессимистичных предположениях, например, что действующая вакцина не обеспечивает перекрестного иммунитета против мутантного штамма, а мутант обладает инфекционностью, сравнимой с вирусом дикого типа, модель предсказывает, что успешная вакцинация может привести к тому, что HBV дикого типа исчезнет через 200 лет, а мутант G145R не будет доминировать над вирусом дикого типа по крайней мере в течение 50 лет, но станет повсеместно распространенным через 60 – 100 лет [49, 50], то есть примерно к 2060 году. Точные временные параметры, предсказываемые моделью Wilson, зависят от первоначального количества индивидуумов, инфицированных мутантным штаммом HBV. В 1999 г. варианты, ассоциированные с вакцинным ускользанием в Гамбии, выявлялись у 10% вирусоносителей [49].
В 2013 году российскими учеными также была разработана математическая модель распространения мутантного G145R варианта HBV в условиях вакцинации, основанной на использовании HBsAg дикого типа, рассчитанная для Российской Федерации. Согласно Российской модели, сейчас происходит «накопление потенциала» для распространения HBsAg-мутантных вариантов HBV на территории России: показатель заболеваемости острым гепатитом В, вызванный мутантными вариантами, может находиться на низком уровне и иметь незначительный рост на протяжении 40 – 50 лет, после чего возможен выраженный подъем и пик заболеваемости после 2060 года [51]. Применение данной модели для исследований распространения эскейп 27 мутантов на территориях 7 федеральных округов РФ показало, что при достигнутом к настоящему времени масштабе вакцинации против гепатита В и при сохранении существующих тенденций, схожести факторов и условий, влияющих на распространение HBV, существует риск распространения мутантных вариантов вакцинального бегства HBV, который может привести к изменениям динамики и тенденций проявления эпидемического процесса гепатита В на территории всей страны [48].
Наряду с мутациями, возникающими внутри а-детерминанты HBsAg, опубликовано большое количество работ, в которых описаны мутации и делеции в Pre-S области. В некоторых случаях делеции могут доходить до половины целого Pre-S2 региона [52, 38]. Например, обнаружена делеция трансляционного стоп-кодона Pre-S2, полностью прекращающая экспрессию белка M-HBsAg, а также другие многочисленные точечные мутации [53, 38, 54]. Некоторые делеции не только уничтожают регион Pre-S2 промотора, но также затрагивают сайты, распознаваемые Т-клетками и В-клетками. Напротив, регион Pre-S1, в котором расположены сайты связывания с гепатоцитами, является очень консервативным и практически не подвергается мутациям. Варианты вируса с делециями и мутациями в Pre-S2 регионе могут остаться нераспознанными Т- и В-клетками, а при сохранении их способности прикрепляться к гепатоцитам с последующим их инфицированием, подобные мутанты могут способствовать развитию хронической инфекции HBV и долго персистировать в организме, не подвергаясь элиминации. Кроме того, подобные мутанты могут получать селективное преимущество в условиях, когда иммунный ответ направлен в сторону уничтожения дикого варианта HBsAg [38].
Вакцины «первого» и «второго» поколения
В конце 1970-х гг. В США и Франции было разработано две вакцины против HBV, обе содержащие очищенный HBsAg, полученный из сыворотки HBsAg-носителей [168; 169; 170]. Эти полученные из плазмы вакцины содержали суспензию HBsAg, подвергнутую комбинированной процедуре агрессивной биофизической и биохимической обработки, которая приводит к частичному разрушению поверхностного антигена. Окончательно очищенный HBsAg был подвергнут обработке формальдегидом и адсорбирован на алюминиевые квасцы. Продукт США содержал 22 нм частицы HBsAg, лишенные pre-S белков, в то время как французская вакцина против гепатита В содержала дополнительно небольшое и изменчивое количество pre-S2 и pre-S 1 антигенов в финальных препаратах. Впоследствии аналогичные вакцины были разработаны в Корее и Китае. Было показано, что полученные из плазмы вакцины высокоиммуногенны, эффективны и безопасны [171; 172; 173].
Несоответствие такого источника сырьевого материала как плазма требованию безопасности продуктов крови, а также развитие рекомбинантной ДНК-технологии привело к появлению «второго поколения» вакцин: рекомбинантных вакцин, получаемых из дрожжей, трансфецированных последовательностью ДНК, кодирующей S-HBsAg [170; 172; 173; 174; 175] Подавляющее большинство результатов испытаний, доступное на сегодняшний день, было получено с использованием двух рекомбинантных вакцин, Engerix-B (SmithKline Biologicals, Бельгия) и RECOMBIVAX/ HB-Vax II (Merck & Co., США) [173; 174]. Эти две вакцины содержат негликозилированный S-HBs р24, который выделяется из дрожжей в ходе производственного процесса [175].
Дрожжевые HBV-вакцины эффективны в предотвращении гепатита В и в снижении заболеваемости хронической инфекцией, а также гепатоцеллюлярной карциномой. Такие выводы подтверждены в 181 клиническом исследованиии, в которых были рассмотрены 24,277 индивидуума, иммунизированные вакциной Engerix-B и 8627 - Recombivax/HB-Vax II [176]. Серопротекция ( 10 mIU/мл) была достигнута в 95,8% и 94,3% соответственно при использовании лицензированного графика введения трех доз через 0, 1 и 6 месяцев. Дети и подростки (1-19 лет) достигали высокого уровня сероконверсии, а именно 98,6% и 98,8% соответственно.
Таким образом, сывороточные и рекомбинантные вакцины против гепатита В получили всемирное признание, основанное на демонстрации эффективности, безопасности и экономической целесообразности [177].
Несмотря на экстраординарную эффективность вакцин «второго поколения» против гепатита В, при иммунизации могут случаться неудачи, которые иногда могут объясняться различными факторами, такими, как неправильные условия хранения или применения, преклонный возраст, ожирение, почечная недостаточность, хронические заболевания печени и особенно иммуносупрессия. Другими важными причинами снижения эффективности вакцин против гепатита В могут быть так называемые «нон-респондеры», то есть лица, не отвечающие иммунным ответом на данный набор иммуногенных эпитопов вакцины, а также появление в ходе вакцинации мутантов вакцинного «ускользания» («эскейп-мутантов»).
Недостатком рекомбинантных вакцин против гепатита В второго поколения является их относительно узкая по сравнению с природными антигенами антигенная специфичность. Эти вакцины имеют более ограниченный спектр эпитопов, против которых индуцируются нейтрализующие антитела. Массовая вакцинация против гепатита В рекомбинантными вакцинами, а также серодиагностика инфекции HBV, проводимая путем иммунодетекции HBsAg с помощью узконаправленных моноклональных анти-HBsAg антител, способствуют селекции и распространению HBsAg мутантных форм HBV, ускользающих от вакцинального и диагностического контроля. Свой вклад в распространение эскейп-мутантов вносит также использование противовирусных препаратов, провоцирующих возникновение мутаций. Попытки преодолеть этот недостаток выразились в разработке рекомбинантных вакцин против гепатита В нового поколения, расширяющих спектр эпитопов.
Серологическое портретирование различных вариантов HBsAg
Серологический портрет природной мутации G145R был получен в ходе предварительных исследований [42]. Сыворотки, содержащие такой вариант вируса, являются крайне труднодоступными. Кроме того, для фундаментальных исследований антигенных и иммуногенных свойств варианта HBV с мутацией G145R в S-гене необходимо располагать выделенным из сыворотки вирусом высокой степени очистки, что, в действительности, невозможно. Поэтому необходимо было выбрать рекомбинантный аналог HBsAg с такой мутацией. Выбор рекомбинантного аналога природного HBsAg с мутацией G145R, помимо решения ряда фундаментальных задач, имеет научно-практическое значение, поскольку позволяет выбрать антиген для разработки вакцины, защищающей от наиболее значимой мутации вакцинального ускользания. Вторым определяющим фактором для оценки адекватности рекомбинантного антигена природному аналогу и определения его пригодности для включения в вакцину является исследование иммуногенных свойств в условиях in vitro и in vivo.
С целью выбора рекомбинантного аналога природного HBsAg с мутацией G145R было проведено серологическое портретирование различных рекомбинантных эскейп-мутантов HBsAg с такой заменой, экспрессированных в различных генетических системах при различных технологических условиях. Для контроля использовали рекомбинантные HBsAg дикого типа субтипов ay и ad.
Результаты сравнительного исследования различных рекомбинантных и природных вариантов HBsAg методом серологического портретирования показали, что рекомбинантные антигены дикого типа ay и ad распознаются всей панелью конъюгатов (см. таблицу 18). Это согласуется с понятием об универсальности а-детерминанты HBsAg в HBV дикого типа.
Серологическое портретирование антигенов с эскейп-мутацией G145R показало неоднородные результаты. Рекомбинантные образцы AHBV203 и HBs-878 не имели ни одного дефекта распознавания моноклональными конъюгатами, что означает подобие конформации этих рекомбинантных молекул HBsAg дикого типа. Однако все исследованные рекомбинантные антигены серии ESC (субтип HBsAg ayw2), также содержащие мутацию G145R, имели многочисленные глубокие «провалы» в реактивности с большинством конъюгатов, причем их реакционная способность была почти идентичной таковой нативных HBsAg с той же мутацией (субтипов ayw2 и adw3) (см. табл. 18).
Тем не менее, глубина дефектов распознавания была неодинакова для разных вариантов ESC-антигенов, полученных в разных экспериментальных условиях. Например, нарушения распознавания антигенов ESC-1 и ESC-2 по конъюгату HB4 почти в 100 раз, по конъюгату Х7 – в 20 раз меньше, чем у всех трех природных изолятов с мутацией G145R. У этих антигенов нарушения по конъюгатам 11F3 и 10D10 также меньше, чем у нативных мутантных антигенов и других рекомбинатных вариантов из серии «ESC». Это позволяет сделать вывод о некотором нарушении правильного фолдинга антигенов ESC-01 и ESC 02, не позволяющем им полностью соответствовать природной конформации мутантного эпитопа G145R. Поэтому такие варианты антигенов нельзя применять при разработке специфических компонентов вакцины. Напротив, серологический портрет антигена ESC-03 наиболее приближен к природному G145R HBsAg из сыворотк 1537 и 2043, имеющим тот же субтип (ayw2), и такой вариант получения специфического антигена, по-видимому, предпочтительней.
Полученные результаты свидетельствуют о том, что условия экспрессии и очистки получаемого рекомбинантного HBsAg с мутацией G145R играют не менее важную роль, чем замена нуклеотидов в таргетном кодоне, от них зависит правильный фолдинг мутантного антигена.
Таким образом, в результате проведенного серологического портретирования ряда рекомбинантных эскейп-мутантов HBsAg с заменой G145R, экспрессированных в различных генетических системах при различных технологических условиях, был выбран HBsAg с точечной мутацией G145R, обладающий конформационными и антигенными свойствами природного HBsAg с той же мутацией (ESC-антиген, производство ЗАО НПК «Комбиотех»).
По серологическим свойствам и при иммунизации дикий тип HBsAg HBV и его мутант G145R ведут себя как различные антигены. Это свидетельствует о серьезных структурных изменениях, которые предположительно способны оказать существенное влияние на морфогенез вирионов и субвирусных частиц.
Однако морфологические и ультраструктурные исследования HBV с мутацией G145R ранее не проводились. Поэтому дальнейшая работа была направлена на изучение структурно-морфологической организации HBV при наличии эскейп мутации G145R. Помимо этого изучили влияние различных технологических условий на формирование субвирусных частиц при получении рекомбинантного HBsAg с точечной мутацией G145R, обладающего конформационными и антигенными свойствами природного HBsAg с той же мутацией (ESC-антигена).
Исследование иммуногенности рекомбинантного мутантного G145R HBsAg in vivo на овцах
Для выявления овечьих антител к различным вариантам HBsAg полученные сыворотки исследовали индивидуально от каждого животного разработанным скрининговым вариантом сэндвич-ИФА (см табл.31).
Количественные результаты тестирования, представленные в таблице 31, для наглядности можно выразить графиками (см. рис.17).
Полученные результаты свидетельствуют о том, что ESC-антиген обладал иммуногенностью не только на мышиной модели, вызывая образование у иммунизированных овец специфических антител, реагирующих с нативным HBsAg дикого и мутантного типа (рис. 17). При этом итоговый иммунный ответ на природные мутантные G145R-варианты (ayw и adw), развившийся после реиммунизации антигеном ESC, был намного сильнее, чем при реиммунизации бивалентной антигенной композицией ayw + adw, а также трехвалентной антигенной композицией ayw + ad + ESC.
По профилям тестирования специфичности сывороток в ходе иммунизации овец установлено, что первичный ответ на изолированный ESC-антиген развивался медленнее, чем на другие антигенные варианты, и давал существенно меньший уровень анти-HBsAg. Особенно заметно это проявилось в случае анализа кросс-реакций сывороточных антител с природным эскейп-антигеном субтипа adw3 (антиген 111). Несколько меньшую интенсивность взаимодействия мутантспецифических антител с антигеном 111 по сравнению с антигеном 2043 (субтип ayw2) можно объяснить не только разницей субтипов, но и тем, что содержание HBsAg в случае изолята 111 было ниже, что можно предположить, исходя из уровня вирусной нагрузки в образцах. В целом удалось показать, что иммунизация овец смесью HBsAg дикого типа (ayw + adw) стимулирует образование преимущественно антител против дикого типа, а мутантным рекомбинантным – против нативного мутантного G145R-варианта вируса. Полученные данные, в целом, согласуются с результатами по иммунизации мышей.
Проблема гепатита В, несмотря на успех современной стратегии вакцинации и наличие эффективной вакцины, остается острой как в мире, так и в России [2]. Одной из важных причин распространения гепатита В в условиях вакцинального прессинга является возникновение мутаций «ускользания» (эскейп-мутаций) от диагностического и вакцинального контроля. Именно поэтому во всем мире активно продолжается работа по усовершенствованию вакцин против гепатита В [209; 210; 211].
Массовая вакцинация против гепатита В, внедренная более чем в 170 странах мира, способствует селекции и распространению HBsAg мутантных форм HBV, ускользающих от вакцинального контроля [32]. Свой вклад в распространение эскейп-мутантов вносит также использование противовирусных препаратов, провоцирующих возникновение мутаций. Отдельные мутации S-гена приводят к столь радикальным изменениям серологических свойств универсальной а-детерминанты HBsAg, что протективные специфические антитела против HBsAg практически полностью теряют способность взаимодействовать с мутантным HBsAg [34; 254]. К наиболее выраженным изменениям серологических свойств приводит мутация в 145 позиции S-гена HBV, приводящая к замене в 145 а.о. глицина на аргинин (G145R). В результате HBsAg эскейп-мутанта модифицируется столь существенно, что практически не распознается подавляющим большинством ( 90%) анти-HBsAg.
Результаты компьютерного моделирования эпидемиологического процесса распространения эскейп-мутанта G145R вируса гепатита В, полученные учеными из Великобритании и России, оказались схожими и показывают, что в настоящее время происходит «накопление потенциала» для распространения HBsAg-мутантных вариантов и приблизительно через 50 лет эскейп-мутант G145R станет повсеместно распространенным и будет доминировать над вирусом дикого типа. В обеих моделях ставится условие отсутствия перекрестной защиты против мутантных форм HBV при использовании стандартных вакцинацин [49; 50; 48].
Ряд исследований показывает, что перекрестная защита, обеспечиваемая действующими вакцинами, действительно невелика [27;28]. Оценка эффективности вакцин, используемыми на территории РФ, показала отсутствие перекрестной защиты против мутанта G145R. Вакцинация людей препаратами, содержащими HBsAg дикого типа, индуцирует образование антител как к HBsAg дикого типа, так и к мутанту S143L, но практически не вызывает образования антител к HBsAg, несущему мутацию G145R. В то же время в сыворотке людей, переболевших гепатитом В, обнаруживаются антитела, кросс-реагирующие с мутантом G145R, то есть в принципе, образование антител, реагирующих с мутантным G145R HBsAg, возможно [255; 256].