Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 17
1.1. Факторы, влияющие на уровень иммунной защиты в лёгких 17
1.1.1. Роль сурфактантного белка А в иммунной защите 17
1.1.2. Загрязнение воздушной среды и заболевания лёгких. Роль озона ... 27
1.1.3. Гендер и заболевания лёгких 29
Собственные исследования 32
Глава 2. Материалы и методы исследования
2.1. Питательные среды и реактивы 32
2.2. Бактериальные штаммы, использованные в работе 32
2.3. Животные для экспериментальной пневмонии 32
2.4. Методы исследования
2.4.1. Культивирование бактерий 33
2.4.2. Мечение бактерий красителем FITC 33
2.4.3. Проведение бронхоальвеолярного лаважа лёгких человека 34
2.4.4. Очистка белка SP-A из бронхоальвеолярного лаважа человека 34
2.4.5. Очистка рекомбинантных SP-А1 и SP-A2 вариантов человека 35
2.4.6. Создание мутантных вариантов SP-A методом сайтнаправленного мутагенеза 36
2.4.7. Обработка белка SP-A озоном in vitro и оценка уровня его окисления 38
2.4.8. Выделение крысиных альвеолярных макрофагов 38
2.4.9. Выделение человеческих альвеолярных макрофагов 39
2.4.10. Оценка фагоцитоза in vitro методом световой микроскопии 40
2.4.11. Оценка фагоцитоза in vitro методом проточной цитофлуориметрии 41
2.4.12. Оценка ингибирования гемагглютинирующей активности вирусов Influenza А препаратами SP-A 42
2.4.13. Проведение электрофореза (SDS-PAGE) и иммуноблоттинга 43
2.4.14. Продукция и очистка антител, специфичных к SP-A1 44
2.4.15. Детекция SP-A методом иммунофлуоресценции 44
2.4.16. Количественный анализ содержания SP-A1 в бронхоальвеолярном лаваже иммуноферментным методом (ELISA) 45
2.4.17. Ингалирование мышей озоном 46
2.4.18. Заражение мышей бактериями K. pneumoniae 46
2.4.19. Интегральный метод оценки иммунитета по уровню выживаемости мышей от пневмонии 47
2.4.20. Оценка уровня фагоцитоза в условиях in vivo 47
2.4.21. Оценка микробиологического показателя иммунорезистентности по уровню бактериальной колонизации лёгких и диссеминации бактерий K. pneumoniae 47
2.4.22. Анализ гистологических изменений 48
2.4.23. Определение содержания кортизола в плазме крови 49
2.4.24. Оценка влияния половых гормонов на уровень иммунной защиты при экспериментальной пневмонии 51
2.4.25. Анализ общего содержания белков, SP-A, уровня белкового окисления в бронхоальвеолярном лаваже самцов и самок мышей после их ингалирования озоном 54
2.4.26. Анализ количества нейтрофилов, общего содержания белков и уровня белкового окисления, содержания SP-A и уровня его окисления, содержания фосфолипидов, хемокина MIP-2 в
бронхоальвеолярном лаваже самцов и самок мышей после ингалирования их озоном и инфицирования бактериями K. pneumoniae 55
2.4.27. Исследование протеома бронхоальвеолярного лаважа у SP-A нокаут мышей 56
2.4.28. Методы статистической обработки данных 56
ГЛАВА 3. Сравнительный анализ профагоцитарной активности sp-a1 и sp-a2 вариантов человека в условиях in vitro 57
3.1. Исследование профагоцитарной активности рекомбинантных SP-A1 и SP-A2 вариантов 57
3.2. Анализ механизмов, отвечающих за различную профагоцитарную активность SP-A1 и SP-A2 вариантов 70
ГЛАВА 4. Оценка влияния озона на профагоцитарную активность белка sp-a и его sp-a1 и sp-a2 вариантов In vitro 74
4.1. Изучение влияния окисления человеческого SP-A на его способность повышать фагоцитоз в условиях in vitro 74
4.2. Анализ влияния окисления рекомбинантных человеческих SP-A1 и SP-A2 вариантов на их профагоцитарную активность 78
Глава 5. Получение антител, специфичных к sp-a1, и оценка влияния различных факторов на геноспецифический состав sp-a в лёгких человека 83
Глава 6. Изучение иммуномодулирующего влияния белка sp-a на уровень иммунной защиты при экспериментальной пневмонии в условиях окислительного стресса 89
6.1. Экспериментальная модель пневмонии в условиях оксидантной нагрузки 89
6.2. Анализ показателей антиинфекционной резистентности
мышей, лишённых гена SP-A, при экспериментальной пневмонии в условиях окислительного стресса 92
6.2.1. Оценка состояния иммунитета у SP-A (-/-) мышей по уровню их выживаемости от пневмонии: влияние ингаляции озона и половой принадлежности 92
6.2.2. Оценка уровня фагоцитоза бактерий K. pneumoniae альвеолярными макрофагами SP-A (-/-) мышей в условиях in vivo 96
6.2.3. Исследование бактериальной колонизации лёгких и диссеминации бактерий K. pneumoniae у мышей, лишённых гена сурфактантного белка А, при экспериментальной пневмонии 99
6.3. Анализ клеточного состава, общего содержания белка, SP-A, и уровня белкового окисления в бронхоальвеолярном лаваже мышей «дикого типа» после ингаляции озона 101
6.4. Исследование протеома бронхоальвеолярного лаважа у SP-A нокаут мышей 107
ГЛАВА 7. Оценка влияния половой принадлежности на уровень иммунной защиты при экспериментальной пневмонии в условиях оксидантной нагрузки 119
7.1. Определение содержания кортизола в плазме крови животных, зараженных бактериями K. pneumoniae 119
7.2. Изучение влияния ингаляции озона на различные показатели в бронхоальвеолярном лаваже лабораторных мышей при пневмонии 121
7.3. Оценка гистологических изменений в органах и тканях животных при экспериментальной пневмонии 127
7.3.1. Влияние ингаляции озона 128
7.3.2. Влияние половой принадлежности 137
7.4. Оценка влияния половых гормонов на уровень иммунной защиты у лабораторных мышей при пневмонии в эксперименте
7.4.1. Выживаемость гонадэктомированых мышей от пневмонии после ингалирования озоном 141
7.4.2. Выживаемость гонадэктомированных и имплантированных препаратами половых гормонов мышей от пневмонии после ингалирования озоном 142
Глава 8. Экспериментальная модель, описывающая общие и гендерспецифические факторы, влияющие на уровень иммунной защиты при пневмонии в условиях оксидантной нагрузки 145
Заключение 149
Выводы 165
Рекомендации по использованию научных выводов и перспективы дальнейших исследований 167
Список принятых сокращений 168
Список литературы
- Загрязнение воздушной среды и заболевания лёгких. Роль озона
- Проведение бронхоальвеолярного лаважа лёгких человека
- Количественный анализ содержания SP-A1 в бронхоальвеолярном лаваже иммуноферментным методом (ELISA)
- Анализ влияния окисления рекомбинантных человеческих SP-A1 и SP-A2 вариантов на их профагоцитарную активность
Загрязнение воздушной среды и заболевания лёгких. Роль озона
Механизмы, посредством которых белок SP-A оказывает влияние на иммунную защиту в лёгких, можно условно разделить на 3 группы: регуляция фагоцитоза, регуляция воспалительного ответа, и другие механизмы, включая способность SP-A координировать врождённый и приобретённый компоненты иммунитета, и работать в качестве «гормона». 1) Регуляция фагоцитоза посредством SP-A. Была предложена модель [230], согласно которой коллектины, включая SP-A, способствуют увеличению поверх ностной локализации специфических рецепторов на поверхности клетки хозяина посредством их мобилизации из внутриклеточного пула без стимулирования бел кового синтеза [36, 155, 158]. Кроме того, SP-A повышает киллинг, заключитель ный этап фагоцитоза. В одних исследованиях было показано, что SP-A повышает киллинг Mycoplasma pneumonia [114], Mycoplasma pulmonis [112] or BCG [271] по средством повышения уровня оксида азота. Другие исследования свидетельствуют о том, что в случае, если макрофаги были предварительно стимулированы гамма интерфероном (INF-Y), SP-A снижал продукцию оксида азота [124, 210] путём ин гибирования секреции TNF-oc и активации NF-KB [124]. Таким образом, влияние SP-A на продукцию оксида азота может зависеть от внешних факторов. 2) Регуляция воспалительного ответа посредством SP-A. Долгое время су ществовало определённое противоречие между данными, полученными исследова телями из разных лабораторий, относительно того, проявляет белок SP-A провос палительную или противовоспалительную активность. В 2003 году Gardai с соавт. [92] предложили модель, согласно которой SP-A может опосредовать как провос палительные, так и противовоспалительные процессы в лёгких в зависимости от обстоятельств. В случае, если углеводузнающий домен (CRD, carbohydrate recognition domain) белка SP-A не связан микробными лигандами, он может взаи модействовать с рецептором SIRP, приводя к снижению активации NF-B, что, в конечном итоге, будет снижать продукцию провоспалительных цитокинов и акти вацию альвеолярных макрофагов. В случае лёгочной инфекции, CRD домен связы 22 вается с микробными лигандами и поэтому связь CRD с SIRP становится невозможной. Вместо этого, появляется возможность связывания «коллагенового хвоста» SP-A с рецепторами calreticulin/CD91. Такое взаимодействие стимулирует активацию NF-B, что, в конечном итоге, приводит к повышению продукции провос-палительных цитокинов и активации альвеолярных макрофагов. Данная модель объясняет, каким образом один и тот же белок, в данном случае белок SP-A, может оказывать как позитивный, так и негативный эффект на регуляцию воспаления в лёгких в зависимости от наличия или отсутствия лёгочной инфекции, соответственно. В то же время, показано, что SP-A всё же проявляет базовый уровень про-воспалительной активности и в отсутствии микробных лигандов [148, 153, 215]. Это может иметь большое физиологическое значение в поддержании иммунного статуса лёгких в состоянии постоянной готовности, поскольку лёгкие находятся в постоянном контакте с бактериями, вирусами, токсинами, аллергенами и т.д., поступающими вместе с вдыхаемым воздухом. 3) Другие механизмы, опосредуемые SP-A. Исследования последних лет показали, что SP-A, являясь частью системы врождённого иммунитета, способен координировать врождённый и приобретённый компоненты иммунитета посредством взаимодействия с дендритными клетками и Т-клетками, регулируя, таким образом, иммунный ответ в лёгких [51, 209, 274]. Дендритные клетки имеют костномозговое происхождение. Они обнаружены во всех лимфоидных органах, включая тимус, селезёнку, лимфатические узлы, а также в нелимфоидных органах и тканях, и обладают способностью презентировать антиген для стимулирования Т-клеток [168]. В респираторной системе дендритные клетки располагаются в эпителии верхних дыхательных путей, лёгочной паренхиме и альвеолярном пространстве [168]. Участие дендритных клеток в регулировании иммунного ответа зависит от уровня их «созревания». «Незрелые» дендритные клетки обладают фагоцитирующей активностью, в то время как «зрелые» дендритные клетки презентируют антиген Т-клеткам и стимулируют Т-клетки в региональных лимфатических узлах и тканях. Дендритные клетки начинают дифференцироваться из «незрелых» в «зре 23
лые» после контакта с микробными продуктами, такими как липополисахарид, пеп-тидогликан и бактериальная ДНК [132], или с медиаторами воспалительного ответа, такими как TNF- [229]. Количество дендритных клеток также увеличивается в ответ на контакт как с продуктами микроорганизмов [110], так и с медиаторами воспалительного ответа [127]. На «зрелых» дендритных клетках обнаружено большое количество рецепторов к хемокину «secondary lymphoid tissue» (который представлен в эндотелии лимфатических узлов), и к макрофагальному воспалительному белку 3 (который находится в Т-клеточной области лимфатических узлов), что способствует их миграции к лимфатическим узлам. Повышенное количество МНС класса II, CD80, CD86 и CD40 на «зрелых» дендритных клетках способствует связыванию с рецепорами на T-клетках. В то же время, ряд факторов, такие как интер-лейкин-10 [54, 231], 1-а,25-дигидроксивитамин D3 [212], лиганды к CD36 и CD51 [252], и простагландин E2 [133], ингибируют дифференциацию дендритных клеток и, соответственно, активацию Т-клеток. Таким образом, способность дендритных клеток инициировать механизмы иммунной защиты критически зависит от сигналов, поступающих из локального окружения. Одним из таких сигналов является белок SP-A.
SP-A ингибирует пролиферацию Т-клеток двумя способами: 1) опосредованно, т.е. через торможение созревания дендритных клеток (снижая экспрессию МНС класса II и CD86 на дендритных клетках) [51]; 2) путём прямого взаимодействия с Т-клетками [46, 48, 49]. Более того, стимулирование незрелых дендритных клеток белком SP-A повышает их фагоцитарную активность и хемотактический ответ на хемокины [51]. Показано, что способность SP-A связывать дендритные клетки зависит от присутствия кальция [209], что предполагает участие углево-дузнающего региона CRD молекулы SP-A в этом процессе. Однако, в процесс ин-гибирования пролиферации Т-клеток вовлечены как углеводузнающий [266], так и коллагеноподобный регионы [46] молекулы SP-A. На основании накопленных данных было предложено [274], что основной функцией SP-A в лёгких является регулирование «иммунологической среды» и предотвращение чрезмерной активации каскадов воспалительного ответа, что потенциально может привести к повреждению лёгочной ткани и, как следствие, к нарушению газообмена.
Описанные выше функции SP-A были изучены преимущественно при использовании SP-A, полученного от грызунов, или SP-A человека, полученного из бронхоальвеолярного лаважа (БАЛ) пациентов, больных альвеолярным протеино-зом. Следует отметить, что в отличие от грызунов, SP-A человека состоит из двух генных продуктов, SP-A1 и SP-A2, функция, структура и стабильность которых различна. Поэтому, следующая часть обзора будет посвящена различиям между вариантами белка SP-A - SP-A1 и SP-A2.
Генетический локус SP-A человека расположен на длинном плече хромосомы 10 [53] и представлен двумя функциональными генами – sftpa1 (или SP-A1) и sftpa2 (или SP-A2), расположенных в противоположной транскрипционной ориентации, и псевдогеном [118]. На основе различий в кодирующей последовательности, более чем 30 аллельных вариантов, или внутригенных гаплотипов, охарактеризованы для обоих генов SP-A человека [74, 137]. Среди них четыре SP-A1 (6A, 6A2, 6A3, 6A4) и шесть SP-A2 (1A, 1A0, 1A1, 1A2, 1A3, 1A5) обнаружены с более высокой частотой в популяции человека [74] (Рисунок 3).
Проведение бронхоальвеолярного лаважа лёгких человека
Рекомбинантные человеческие SP-A1 и SP-A2 были продуцированы в двух системах: системе клеток насекомых и системе клеток млекопитающих. Рекомбинантные SP-A1 (6А2, 6А4) и SP-A2 (1А, 1А) продуцировали в системе клеток насекомых (baculovirus-mediated insect expression system) как описано ранее [263]. Для этого экспрессия SP-A была индуцирована путём инокулирования вируса, содержащего ген SP-A человека [263] в клетки насекомых, культивируемые в питательной среде Sf-900 II SFM фирмы «Invitrogen» (США). Клетки затем культивировали в течение 72 часов при температуре 2 8 C при начальной плотности клеток 2 х 106 клеток/мл.
Рекомбинантные человеческие SP-A варианты, SP-A1 (6А2 и 6А4) и SP-A2 (1А1 и 1А) были также продуцированы с использованием клеток млекопитающих (CHO)-Kl (Chinese hamster ovary), как описано ранее [264]. Для этого гены SP-A1 и SP-A2 клонировали в вектор рЕЕ14 под промотор CMV (cytomegalovirus) и рекомбинантные конструкции трансфецировали в клетки (CHO)-К1, которые культивировали в условиях, обеспечивающих оптимальную экспрессию SP-A [264]. Для этого сначала клетки выращивали в культуральной среде GMEM (Glascow s Modified Eagle s Medium) с добавлением 10 % бычьей сыворотки (диализованной и инактивированной при 56C в течение 1 часа) при 37С в присутствии 5 % С02 до 80 % покрытия поверхности культуральной чашки. Затем среда была заменена на среду, оптимальную для экспрессии белка SP-A, не содержащую сыворотку. Су-пернатант собирали и использовали для очистки рекомбинантных SP-A1 и SP-A2.
SP-A варианты были очищены из культуральной среды культивируемых клеток насекомых или млекопитающих, как описано ранее [263]. Для этого использовали метод аффинной хроматографии, используя иммобилизованную на сефарозе (Separose 6B, «Pharmacia», Швеция) D-маннозу, с которой SP-A способен связываться в присутствие кальция. Культуральную среду центрифугировали при скорости 1430 g в течение 10 мин для удаления фрагментов клеток и к супернатанту добавляли хлорид кальция до конечной концентрации 2 мМ непосредственно перед проведением очистки SP-A. После связывания с иммобилизованной на сефарозе маннозой, белок SP-A элюировали с использованием буфера, содержащего 5 мМ триса и 2 мМ EDTA (рН 7,5). Элюат диализовали в буфере, содержащем 0,5 М трис (рН 7,5). Все процедуры совершали при температуре 4С или на льду. Концентрацию SP-A определяли с помощью коммерческого набора «Micro BCA Protein Assay Kit» («Pierce» США), используя РНКазу А в качестве стандарта. Степень чистоты полученных препаратов оценяли с помощью электрофореза в полиакриламидном геле (SDS-PAGE) с последующей окраской серебром, а также с помощью метода иммуноблоттинга. Аликвоты препаратов SP-A хранили при температуре -20С.
Для того, чтобы исключить специфическое влияние процесса очистки белков на их функциональную активность, в работе использовали не менее трёх очищенных в разное время препаратов каждого SP-A варианта.
Замену аминокислотного остатка в позиции 85 белка SP-A осуществляли с помощью метода сайт-направленного мутагенеза. В данной работе использовали систему клеток мелокопитающих T-REx-CHO, которая представляет собой индуцируемую тетрациклином систему экспрессии (Tetracycline-Regulated Expression system) на основе линии клеток СНО («Invitrogen», США). Праймеры были сконструированы и произведены в «Macromolecular Core Facility» Пенсильванского государственного медицинского университета (Херши, США).
Для клонирования использовали ДНК человеческих SP-A1 (6А2) и SP-A2 (1А) вариантов, которые амплифицировали методом ПЦР (полимеразной цепной реакции), с использованием соответствующих плазмидных конструкций, созданных ранее в лаборатории профессора J. Floras [137]. ПЦР продукты обрабатывали рестриктазами EcoRY/XhoI и клонировали в вектор pcDNA5/TO («Invitrogen», США), несущий гены устойчивости к гигромицину и бластицидину, под CMV (cytomegalovirus) промотор. Полученные рекомбинантные конструкции (pcDNA5/TO-1А и pcDNA5/TO-6А2) затем подвергали сайт-направленному мутагенезу с помощью коммерческого набора «QuikChange XL site-directed mutagenesis kit» («Stratagene», USA). Мутационный процесс проводили согласно инструкции производителя («Stratagene», USA). После проведённого мутагенеза плазмидные ДНК транформировали в Escherichia coli. Изменение в последовательности было подтверждено с использованием метода секвенирования ДНК, выполненного «Macromolecular Core Facility» Пенсильванского государственного медицинского университета (Херши, США). Последующую очистку плазмидной ДНК совершали с использованием коммерческого набора «Qiagen plasmid maxi kit» («Qiagen», США). Каждую из четырёх рекомбинантных конструкций (изначальные pcDNA5/TO-1А и pcDNA5/TO-6А2, а также мутированные pcDNA5/TO-1А(R85С) и pcDNA5/TO-6А2(C85R)) транфецировали в T-REx-CHO клетки с помощью коммерческого набора «Lipofectamine Plus reagent kit» («Invitrogen», США), как описано ранее [265]. Селекцию позитивных клонов проводили с использованием среды GMEM (Glascow s Modified Eagle s Medium) с добавлением 10 % бычей сыворотки, гигромицина (hygromicin, 400 мкг/мл) и бластицидина (blasticidin, 20 мкг/мл). Экспрессия SP-A каждым клоном была анализирована с помощью метода иммуноблот-тинга.
С целью продукции исходных и мутантных форм SP-A1 и SP-A2 клетки Т-REx-CHO выращивали при 37С в присутствии 5 % СCh с использованием среды GMEM (Glascow s Modified Eagle s Medium) с добавлением 10 % бычей сыворотки, гигромицина (400 мкг/мл) и бластицидина (20 мкг/мл) до 80 % покрытия поверхности культуральной чашки. Затем среда была заменена на среду, оптимальную для экспрессии белка SP-A, содержащую тетрациклин и аскорбиновую кислоту. Супер-натант собирали и использовали для очистки рекомбинантных SP-A1 и SP-A2 методом аффинной хроматографии, как описано выше. 2.4.7. Обработка белка SP-A озоном in vitro и оценка уровня его окисления
Препараты белка SP-A (человеческий нативный и очищенные рекомбинант-ные) в концентрации 100 мкг /мл помещали в 24-луночные планшеты в объёме 100 мкл/лунку и обрабатывали озоном в условиях in vitro, как описано ранее [250]. Для этого планшеты с белком SP-A инкубировали в присутствии различных концентраций озона: 0,01; 0,1; 1 и 10 ррт в течение 4 часов. В качестве контроля использовали SP-A, инкубированный в условиях обработки фильтрованным воздухом, в идентичных условиях. Ранее было выявлено [250], что инкубирование препаратов белка SP-A в условиях содержания озона в концентрации 1 ррт в течение 4 часов является оптимальным для достижения его окисления. Уровень окисления белка SP-A затем анализироли с помощью коммерческого набора «OxyBlot Oxidized Protein Detection Kit» («Chemicon International», США), принцип действия которого основан на выявлении карбониловых групп, внедрённых в белковую молекулу вследствие окислительных реакций. Для этого карбониловые группы в обработанных озоном препаратах были модифицированы с помощью 2,4-динитрофенилгидразина (DNPH) и 200 нг модифицированного белкового препарата были нанесены на нит-роцеллюлозную мембрану. Для иммунодетекции модифицированных препаратов использовали кроличьи анти-DNPH IgG в качестве первичных антител, а в качестве вторичных антител использовали коньюгированные с пероксидазой хрена козьи антикроличьи IgG. Блоты визуализировали с помощью набора для хемилюминис-центной детекции с последующей экспозицией блота на рентгеновскую плёнку и её проявлением. Количественный анализ проводили путём денситометрии. Уровень окисления был представлен как оптическая плотность зоны каждого препарата, умноженную на площадь зоны (О.П. х площадь, мм2).
Количественный анализ содержания SP-A1 в бронхоальвеолярном лаваже иммуноферментным методом (ELISA)
Однако активность SP-A вариантов, экспрессированных в системе клеток млекопитающих, была в 60 раз выше активности SP-A вариантов, продуцированных в системе клеток насекомых (Рисунок 11). При этом уровень профагоцитарной активности SP-A вариантов, продуцированных в клетках млекопитающих, был близок к уровню активности нативного человеческого SP-A из бронхоальвеоляр-ного лаважа (Рисунок 9). Полученные данные свидетельствуют о том, что хотя посттрансляционные модификации, характерные для клеток млекопитающих, повышают общую активность SP-A1 и SP-A2 в 60 раз, различие в профагоцитарной активности между SP-A1 и SP-A2 (SP-A2 SP-A1) наблюдается независимо от системы экспрессии, и посттрансляционных модификаций. Схожие выводы были сделаны другими исследователями при изучении регулятора трансмембранной проводимости (CFTR, Сystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator) при муковисцидозе [200]. Было показано, что белок, экспрессированный в обеих системах (в клетках насекомых или клетках млекопитающих), обладал функциональной активностью. Однако активность белка CFTR, экспрессированного в клетках насекомых, была ниже [35, 138, 199]. Кроме того, был сделан вывод, что состояние гли-козилирования белка CFTR может влиять на его стабильность в плазматической мембране [171, 270].
Ранее было установлено, что гликозилирование [164] или гидроксилирова ние пролина [90] имеет важное значение для осуществления фолдинга белка, сборки олигомеров, стабильности структуры, специфической сигнальной транс дукции, процессов узнавания и секреции. Клетки насекомых неспособны осу ществлять некоторые посттрансляционные модификации, включая гидроксилиро вание пролина и комплексное N-связанное терминальное сиалирование [130, 177]. SP-A подвергается нескольким посттрансляционным модификациям, включая гид роксилирование пролина, N-связанное гликозилирование, сиалирование N-гликанов и другие [85, 216, 217]. У белка SP-A, экспрессированного клетками насекомых, отсутствует гидроксилирование пролина [90, 184] и, предположи тельно, комплексное гликозилирование, как показано на других белках [130]. Ранее было показано, что несмотря на то, что гидроксилирование пролина в коллагено подобном домене белка SP-A необходимо для сборки олигомеров (что может быть необходимо для повышения эффективности связывания SP-A с рецепторами), этот тип модификации, вероятно, не влияет на способность SP-A связываться с углево дами, поскольку SP-A, экспрессированный клетками насекомых, способен связы ваться с иммобилизованной маннозой с эффективностью более, чем 95 % [90, 184]. Следовательно, отсутствие гидроксилирования пролина, комплексного N-связанного гликозилирования или других модификаций (в том числе, О-связанное гликозилирование, С-маннозилирование), которые не происходят в клетках насекомых [88, 164], могут отвечать за сниженную профагоцитарную активность экспрессированных в клетках насекомых препаратов SP-A1 и SP-A2.
Таким образом, хотя посттрансляционные модификации и позитивно (количественно) влияют на профагоцитарную активность SP-A1 и SP-A2 вариантов, они не отвечают за геноспецифические (качественные) различия в функциональной (профагоцитарной) активности SP-A1 и SP-A1, т.к. эти различия сохраняются независимо от присутствия или отсутствия посттрансляционных модификаций. Следовательно, внутренние различия, такие как различия в аминокислотной последовательности между SP-A1 и SP-A2, могут обусловливать отмеченные геноспецифи-ческие различия в профагоцитарной активности между SP-A1 и SP-A2.
Ранее было предложено [261], что белок человеческого SP-A собирается как октадекамер, состоящий из шести тримерных субъединиц. При этом каждый тример SP-A состоит из двух молекул SP-A1 и одной молекулы SP-A2, являясь гетеро-тримером. Однако, учитывая, что соотношение мРНК белков SP-A1 к SP-A2 среди различных индивидуумов в популяции человека отличается от ожидаемого соотношения 2:1 [136], вероятно, существуют продукты одного гена, которые, в свою очередь, могут участвовать в формировании функциональных гомотримеров и/или го-моолигомеров (Рисунок 12). Действительно, при исследовании способности SP-A модулировать продукцию цитокинов и других свойств было показано, что продукты одного гена могут быть функциональными [262-264] и имеют структурные различия [91]. Результаты данного исследования свидетельствуют в пользу гипотезы II, предполагающей существование не только гетереолигомеров, но и функциональных продуктов одного гена (SP-A1 или SP-A2).
Альвеолярные макрофаги являются важным компонентом врождённого иммунитета в лёгких. Однако, было показано, что альвеолярные макрофаги, полученные от животных разных видов, могут отличаться в их способности фагоцитировать бактерии [196]. На рисунке 13 представлены результаты сравнения фагоцитирующей активности крысиных альвеолярных макрофагов (использованных в экспериментах, описанных выше) с активностью альвеолярных макрофагов человека в ответ на стимулирование белком SP-A. Хотя фагоцитарная активность крысиных и человеческих альвеолярных макрофагов в ответ на стимулирование препаратами SP-A1 и SP-A2 была качественно сходной, были отмечены количественные видо-специфические различия. Варианты белка SP-A2 повышали фагоцитоз как крысиными, так и человеческими альвеолярными макрофагами более эффективно (p 0,05), чем SP-A1 (SP-A2 SP-A1) (Рисунки 11 и 13). В то же время фагоцитарная активность крысиных альвеолярных макрофагов в ответ на стимулирование белком SP-A была в 6 раз выше, чем активность альвеолярных макрофагов человека (Рисунок 13). Следовательно, видоспецифические различия могут проявляться в степени функциональной активности. Однако, качественный ответ крысиных и человеческих альвеолярных макрофагов на стимулирование вариантами SP-A1 и SP-A2 был схожим, что свидетельствует о том, что крысиные альвеолярные макрофаги являются удобной моделью при изучении стимулирующего эффекта белка SP-A на альвеолярные макрофаги человека.
Анализ влияния окисления рекомбинантных человеческих SP-A1 и SP-A2 вариантов на их профагоцитарную активность
Проведённое исследование, описанное в данной главе, позволяет сделать следующие выводы: 1) ингаляция озона приводит к статистически достоверному снижению уровня выживаемости и фагоцитарной функции альвеолярных макрофагов у SP-A (-/-) мышей и мышей «дикого типа» при экспериментальной пневмонии; 2) данное снижение более выражено у самок по сравнению с самцами, и у SP-A (-/-) мышей по сравнению с мышами «дикого типа»; 3) обработка озоном приводит к повышению количества нейтрофилов и уровня окисления SP-A в брон-хоальвеолярном лаваже мышей «дикого типа»; 4) окисление белка SP-A в условиях окссидативного воздействия более выражено у самок мышей «дикого типа» по сравнению с самцами; 5) экспрессия большинства белков в БАЛ, участвующих в регулировании иммунной защиты и окислительно-восстановительного баланса в лёгких снижена у SP-A (-/-) мышей по сравнению с мышами «дикого типа»; 6) при пнемонии, SP-A модулирует экспрессию многих белков в БАЛ, участвующих в регулировании иммунной защиты и окислительно-восстановительного баланса в лёгких.
Полученные нами результаты позволяют предполагать, что при отсутствии SP-A у SP-A (-/-) мышей, или в случае модифицирования структуры белка SP-A вследствие таких процессов, как окисление (например, озоном), нитрование [281, 282] или воздействие протеолитических факторов [166], функции альвеолярных макрофагов, связанные с влиянием SP-A, могут быть поражены. Результаты фагоцитоза в условиях in vivo, представленных в данной главе, свидетельствуют в пользу данного предположения. Более того, как показано ранее, белок SP-A подвержен окислению непосредственно после индуцированного озоном окислительного стресса и перед тем, как повышается окисление суммарного белка в брон-хоальвеолярном лаваже [105]. Эти результаты могут свидетельствовать в пользу наличия антиоксидантной функции у SP-A [43, 228, 245]. Эта функция может быть связана со способностью SP-A удалять реактивные оксиданты, образующиеся в результате ингаляции озона, и, таким образом, защищать другие молекулы от окисления. В отсутствие SP-A (в случае SP-A (-/-) мышей) ингаляция озона может приводить к повышению базового уровня окислительного стресса, что может, в свою очередь, оказать негативное воздействие на функции альвеолярных макрофагов. Результаты данного исследования (т.е. то, что альвеолярные макрофаги, полученные от ингалированных озоном мышей «дикого типа» и от обработанных воздухом SP-A (-/-) мышей проявляют схожую фагоцитирующую активность) свидетельствуют в пользу данного предположения.
Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что блокирование синтеза SP-A в лёгких (в результате элиминирования гена SP-A у SP-A (-/-) мышей) или снижение функциональной активности SP-A (в результате окисления SPA у мышей «дикого типа») приводят к снижению иммунорезистентности мышей при пневмонии в эксперименте. Кроме того, результаты, представленные в данной главе, выявили, что существуют половые различия в иммунорезистентности при пневмонии и фагоцитирующей способности альвеолярных макрофагов в ответ на индуцируемый озоном окислительный стресс и что особи женского пола находятся в зоне риска. Более того, представленные исследования указывают на важную роль SP-A в регулировании окислительного стресса и функции макрофагов. Вышеизложенное позволяет предполагать, что поражение врождённого компонента иммунитета, связанного с функцией SP-A, может привести к проблемам, связанным с купированием пневмонийной инфекции перед лицом оксидантных стрессорных факторов окружающей среды, особенно в лёгких представителей женского пола. Данная работа свидетельствует о необходимости учитывать половые различия при проведении подобных исследований и при планировании профилактики и лечения пациентов, больных пневмонией.
Результаты исследований, представленных в предыдущей главе, позволяют предполагать, что за половые различия в уровне выживаемости животных при пневмонии в условиях окислительного стресса могут отвечать как половые различия в уровне фагоцитоза, так и половые различия в уровне бактериальной колонизации лёгких и диссеминации бактерий из лёгких в течение пневмонии. Белок SPA также может быть вовлечён в детерминирование половых различий в уровне иммунной защиты при пневмонии в условиях оксидантной нагрузки, т.к. выявлены различия в уровне экспрессии SP-A и степени его окисления в лёгких у животных разного пола в ответ на ингаляцию озона. Поскольку низкая функциональная активность SP-A вследствие его окисления озоном может приводить к «неадекватному» иммунному ответу при пневмонии, этот иммуномодулирующий белок может являться одним из критических факторов, влияющих на гендерспецифический уровень иммунитета при пневмонии в условиях присутствия оксидантов в воздушной среде. Полученные данные позволяют предполагать, что в условиях окислительного стресса половая принадлежность может оказывать существенное влияние на уровень иммунной защиты при пневмонии у человека. С целью дальнейшего исследования механизмов, отвечающих за половые различия в уровне иммунной защиты при пневмонии в условиях окислительного стресса, нами была поставлена серия экспериментов на модели мышей «дикого типа» (т.е. полноценных, имеющих SP-A в лёгких).