Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 16
1.1. Внутрибольничные (нозокомиальные) инфекции 16
1.2. Клинико-лабораторные прогностические признаки развития инфекционно-септических осложнений у пациентов
1.3. Возбудители внутрибольничных инфекций 19
1.4. Устойчивость к противомикробным препаратам 20
1.5. Наблюдение за устойчивостью к противомикробным препаратам.. 21
1.6. Антибиотики 23
1.7. Современные методы оценки резистентности грамотрицательных микроорганизмов к карбапенемам 26
1.8. Поиск способов преодоления устойчивости грамотрицательных микроорганизмов к карбапенемам 28
1.9. Антисептики 32
ГЛАВА 2. Материалы и методы
2.1. Отбор материала для исследования 38
2.2. Материалы исследования 39
2.3. Микробиологические методы исследования 44
2.4. Иммунологический метод исследования 46
Глава 3. Этиологическая структура инфекционно-септических осложнений у пациентов хирургического профиля 47
Глава 4. Оценка возможности бисфосфонатов (клодроновой и этидроновой кислот) ингибировать стандартный реактив фермента металло-бета лактамазы p.aeruginosa in vitro 56
4.1. Моделирование приобретения резистентности к карбапенемам чувствительными грамотрицательными микроорганизмами 56
4.2. Оценка способности бисфосфонатов предупреждать развитие резистентности к карбапенемам у ранее чувствительных к ним штаммов грамотрицательных бактерий в модельной системе в присутствии стандартного реактива фермента МБЛ 62
ГЛАВА 5. Оценка эффективности бисфосфонатов как ингибиторов металло-бета-лактамазы резистентных к карбапенемам клинических изолятов грамотрицательных бактерий методом «шахматной доски» 78
5.1. Оценка наличия синергидного действия ЭДТА и карбапенемов в отношении клинических штаммов грамотрицательных микроорганизмов, продуцирующих металло-бета-лактамазы 81
5.2. Оценка наличия синергидного действия бисфосфонатов и карбапенемов в отношении клинических штаммов грамотрицательных микроорганизмов, продуцирующих металло-бета лактамазы 82
5.3. Оценка зависимости «время – летальное действие» комбинаций карбапенемов и бисфосфонатов в отношении клинических штаммов грамотрицательных микроорганизмов, продуцирующих металло-бета лактамазы 87
ГЛАВА 6 Лабораторная оценка влияния антисептика и бисфосфонатов на резистентность грамотрицательных бактерий к карбапенемам 93
ГЛАВА 7. Оценка эффективности антимикробной комбинации карбапенемов, бисфосфонатов и антисептика - полигексанида в комплексной терапии пациентов с инфекционно-септическими осложнениями, вызванными грамотрицательными бактериями, продуцирующими металло-бета-лактамазы, по анализу показателей клинической лабораторной диагностики 100
Заключение 110
Выводы 117
Практические рекомендации 118
Перспективы дальнейшей разработки темы 118
Список сокращений 119
Список литературы 120
- Клинико-лабораторные прогностические признаки развития инфекционно-септических осложнений у пациентов
- Микробиологические методы исследования
- Оценка способности бисфосфонатов предупреждать развитие резистентности к карбапенемам у ранее чувствительных к ним штаммов грамотрицательных бактерий в модельной системе в присутствии стандартного реактива фермента МБЛ
- Оценка зависимости «время – летальное действие» комбинаций карбапенемов и бисфосфонатов в отношении клинических штаммов грамотрицательных микроорганизмов, продуцирующих металло-бета лактамазы
Введение к работе
Актуальность темы
В настоящее время серьезной проблемой здравоохранения всех стран мира являются нозокомиальные инфекции (НИ), или инфекционные осложнения, связанные с оказанием медицинской помощи (Б.Р.Гельфанд и др. 2013; ВОЗ, 2013; М.Н.Агибалова и др., 2015). Частота их возникновения, летальность от них и стоимость лечения продолжают расти. У пациентов с нозокомиальными инфекциями отмечено быстрое нарастание уровня интоксикации, что подтверждается клинически и лабораторно (общий клинический и биохимический анализ крови, микробиологический посев крови и другого биоматериала), а также развитие полиорганной недостаточности, которые приводят к инвалидизации, а нередко и к смерти пациентов.( Icardi M. et al., 2009; Хирургические инфекции под ред. Ерюхина Е.А., Шляпников С.А. с соавт., 2015). Антимикробная терапия таких инфекций стандартными схемами оказывается неэффективной ввиду высокой резистентности возбудителей. Критериями оценки достаточности антибактериального лечения могут быть нормализация температуры, а также положительная динамика клинико-лабораторных показателей (снижение лейкоцитоза, улучшение лейкоцитарной формулы, нормальная концентрация прокальцитонина, отсутствие системной воспалительной реакции, отрицательные посевы из очагов инфекции) (Гельфанд Б.Р., 2007; Савельев В.С. с соавт., 2011; Вельков В.В., 2015).
Одной из причин развития внутрибольничных инфекций является рост числа антибиотикорезистентных возбудителей инфекции на фоне нерационального применения антибиотиков (Мешаков Д.П., 2005; Dutton R., 2005; Родина Н.А., 2008; Самохвалов И.М., 2008; Полушин Ю.С., 2009; Шурупов Р.А., 2014; Шляпников С.А., 2015;). Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) в 2001 г. разработала стратегии и опубликовала рекомендации по сдерживанию антимикробной резистентности (АМР). Согласно данным по Европейскому региону НИ приводят к значительному увеличению нагрузки на экономику и здравоохранение европейских стран: число пациентов, погибших в результате резистентных бактериальных внутрибольничных инфекций, ежегодно превышает 25 тыс. человек. Помимо роста уровня заболеваемости и смертности среди пациентов следует принимать во внимание и такие факторы, как увеличение сопутствующих расходов на здравоохранение, которые ежегодно составляют более 1,5 млрд. евро. (Antimicrobial resistance surveillance in Europe 2012, 2015). Возбудителями НИ являются полирезистентные, а в ряде случаев и панрезистентные микроорганизмы, которые вызывают трудности при подборе схем лечения
пациентов, создают угрозу развития неизлечимых осложнений (Европейский стратегический план действий по проблеме устойчивости к антибиотикам 2011г., С.А.Шляпников с соавт., 2013, Гординская Н.А., 2013). Эпидемиологический надзор за НИ, включающий изучение распространенности и структуры возбудителей, исследование резистентности микробных популяций в очагах инфекции, является важным звеном в борьбе с этими инфекциями. В результате мониторинга микрофлоры лечебно-профилактических организаций, в т.ч. отделений реанимации и интенсивной терапии (ОРИТ), в странах Европы и в России были определены наиболее проблемные микроорганизмы – так называемая группа ESKAPE - это Escherichia coli, ESBL(+), Staphylococcus aureus MRSA, Klebsiella pneumoniae ESBL(+), Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa, MBL(+), Enterococci (VRE) (Шагинян И.А., 2005; Juan C., 2008; Canton R., 2012; Серегина Н.В., 2013; Шляпников С.А., 2013; Первухин С.А., 2014; Перьянова О.В., 2014; Gastanherira M., 2014; Biedenbach D., 2015). Долгое время наиболее эффективными антибактериальными препаратами считались карбапенемы, однако, в последние годы повсеместно в многопрофильных стационарах выявлено нарастание количества резистентных к ним грамотрицательных бактерий, от 20% до 90% среди выделенных изолятов, несмотря на то, что антибиотики этой группы все еще остаются препаратами выбора при лечении гнойно-воспалительных заболеваний любой этиологии (Гельфанд Б.Р., 2013; Шляпников С.А. с соавт., 2013; Biedenbach D. et al., 2015). Создание новых антибактериальных препаратов, способных воздействовать на панрезистентные грамотрицательные бактерии, представляет определенные трудности, связанные с большими финансовыми затратами и значительными временными промежутками, необходимыми на проведение клинических испытаний. За последнее десятилетие появилось всего несколько антибиотиков, но на микроорганизмы, продуцирующие МБЛ, они не действуют.
До сих пор не существует эффективных схем терапии инфекционных осложнений, вызванных полирезистентными грамотрицательными бактериями, продуцирующими металло-бета-лактамазы (МБЛ). Ферменты этого класса разрушают все бета-лактамные антибиотики – пенициллины, цефалоспорины, карбапенемы (Агеевец В.А. с соавт., 2015.). В настоящее время ведется интенсивный поиск эффективных ингибиторов МБЛ карбапенемрезистентных микроорганизмов (Егорова С.А. с соавт., 2013; Тренин А.С., 2015) среди препаратов, разрешенных к применению в клинике и усиливающих действие карбапенемов, что представляет собой актуальную задачу в борьбе с распространением резистентности микроорганизмов. Разработка на основании клинико-лабораторных исследований теоретической базы для оценки использования обнаруженных ингибиторов
МБЛ у пациентов является основой проводимых поисковых диагностических программ, что и послужило поводом для выполнения данного исследования.
Степень разработанности темы исследования
Одним из механизмов развития резистентности к бета-лактамным антибиотикам является ферментативный гидролиз бета-лактамазами. Известно несколько классов бета-лактамаз. Особого внимания заслуживают ферменты, обуславливающие резистентность грамотрицательных бактерий к карбапенемам, относящиеся к карбапенемазам (Walsh T.R.,2005, Poirel L.,2000,2010). Особую тревогу вызывают микроорганизмы, обладающие металло-бета-лактамазами, поскольку они способны инактивировать все бета-лактамные антибиотики, в т.ч. карбапенемы, и в последнее время стремительно распространяются во всем мире. Карбапенемы – сильнейшие из антибиотиков широкого спектра действия – оказались неэффективны для лечения инфекций, вызванных грамотрицательными бактериями, продуцирующими МБЛ. Для назначения адекватной антимикробной терапии пациентам с инфекциями, вызванными грамотрицательными бактериями, необходимо знать о наличии основного мезанизма резистентности, поэтому выявление МБЛ у клинических изолятов является важным диагностическим тестом.
Выбор антибиотиков для лечения инфекций, вызванных резистентными грамотрицательными бактериями, весьма ограничен. Известно, что различные антисептики повышают проницаемость клеточных мембран стафилококков и ингибируют их бета-лактамазы, а также ферменты-инактиваторы грамотрицательных бактерий, разрушающие аминогликозиды и хлорамфеникол (Афиногенов Г.Е. с соавт., 1993; Красильников А.П., 1995; Крамер 2005; Lim T.-P., 2015).
В настоящее время для лечения пациентов с нозокомиальными инфекциями используют защищенные антибиотики из класса пенициллинов (ампициллин/сульбактам, амоксициллин/клавулановая кислота, пиперацицилин/тазобактам) (Поляк М.С., 2015), кроме того, применяют фосфомицин, полимиксины, а также сочетания из 2-4 антимикробных препаратов, синергидное действие которых оценивают методом «шахматной доски» (Eliopoulos G.M. & Moellering R.C., 1996; Drawz S., 2010; Paul M., 2014; Lim T.-P., 2015; Ni W., 2015; Falagas M., 2015; Bowers D.R. 2015).
В связи с возросшей частотой выделения изолятов грамотрицательных микроорганизмов, резистентных к карбапенемам, актуальным остается поиск способов усиления действия антибиотиков этого класса, например, разработка их комбинаций с препаратами – эффективными ингибиторами МБЛ. К сожалению,в настоящее время
ингибиторов МБЛ карбапенемрезистентных грамотрицательных микроорганизмов, разрешенных для применения в клинике, нет. Как правило, лечение пациентов с НИ, вызванными такими возбудителями, неэффективно традиционными схемами, и для терапии подбирают комбинации антибиотиков из 2-3, а иногда и 4-х препаратов (Тапальский Д.В.,2014, Paul M., 2014, Bowers D.R., 2015, Falagas M.E., 2015, Lim T.-P., 2015).
Поиск эффективных ингибиторов МБЛ карбапенемрезистентных грамотрицательных микроорганизмов, разрешенных к применению в клинике и усиливающих действие карбапенемов, послужил основанием для выполнения данного исследования.
Цель исследования
Разработать лабораторную модельную систему для оценки влияния бисфосфонатов и антисептика на резистентность грамотрицательных бактерий к карбапенемам, а также антимикробную комбинацию для преодоления резистентности у клинических штаммов, продуцирующих металло-бета-лактамазы, и оценить ее эффективность методами клинической лабораторной диагностики.
Задачи исследования
-
Провести мониторинг микрофлоры пациентов многопрофильного стационара и выявить роль грамотрицательных бактерий, резистентных к карбапенемам, в развитии инфекционно-септических осложнений у пациентов хирургического профиля.
-
На основе метода «шахматной доски» создать экспериментальную лабораторную модельную систему для поиска перспективных ингибиторов металло-бета-лактамаз грамотрицательных бактерий среди известных лекарственных препаратов в присутствии стандартного реактива фермента металло-бета-лактамазы P. aeruginosa, экспрессированной в E.coli, in vitro, и изучить возможность бисфосфонатов (клодроновой и этидроновой кислот) ингибировать стандартный реактив металло-бета-лактамазы.
-
В созданной лабораторной модельной системе оценить ингибирующий эффект бисфосфонатов в отношении металло-бета-лактамаз клинических изолятов грамотрицательных бактерий, выделенных от пациентов с инфекционно-септическими осложнениями, а также оценить бактерицидную активность антисептика из группы полигексанидов в отношении таких микроорганизмов, и его способность усиливать действие карбапенемов в небактерицидных концентрациях.
-
Разработать антимикробную комбинацию бисфосфонатов, полигексанида и карбапенемов для местного и системного применения для лечения пациентов с инфекционными осложнениями, вызванными грамотрицательными бактериями, продуцирующими металло-бета-лактамазы.
5. Методами клинической лабораторной диагностики (гематологическими, биохимическими, иммунологическими, микробиологическими) оценить эффективность разработанной антимикробной комбинации при лечении пациентов с инфекционно-септическими осложнениями, вызванными грамотрицательными микроорганизмами, продуцирующими металло-бета-лактамазы.
Научная новизна исследования
Создана экспериментальная лабораторная модельная система на основе «шахматной доски» для поиска ингибиторов металло-бета-лактамазы грамотрицательных бактерий среди известных лекарственных средств.
Впервые модифицированным методом «шахматной доски» выявлено повышение уровня минимальных подавляющих концентраций (МПК) карбапенемов в отношении ранее чувствительных к ним тест-штаммов грамотрицательных бактерий в зависимости от дозы фермента металло-бета-лактамазы P. aeruginosa, экспрессированной в E.coli и показана способность бисфосфонатов ингибировать стандартный реактив фермента металло-бета-лактамазы.
Впервые модифицированный метод «шахматной доски» использован для выявления синергидного и бактерицидного эффекта сочетания антибиотика и бисфосфонатов – ингибиторов металло-бета-лактамазы клинических штаммов грамотрицательных бактерий.
Впервые разработана антимикробная комбинация карбапенемов, бисфосфонатов и антисептика из группы полигексанидов для местного и системного применения.
Методы клинической лабораторной диагностики (гематологические, биохимические, иммунологические, микробиологические) подтвердили эффективность разработанной комбинации при использовании у пациентов с инфекционно-септическими осложнениями, вызванными полирезистентными грамотрицательных бактериями.
Теоретическая и практическая значимость работы
С помощью созданной лабораторной модельной системы с использованием модификации метода «шахматной доски» доказана возможность воспроизведения «резистентности» грамотрицательных бактерий к карбапенемам.
Разработанная лабораторная модельная система позволяет оценить эффективность перспективных ингибиторов МБЛ при тестировании стандартного реактива фермента, что совпадает с данными при использовании клинических карбапенемрезистентных изолятов грамотрицательных бактерий, продуцирующих МБЛ.
Предложенная комбинация карбапенемов, бисфосфосфонатов и антисептика позволит клиницистам рационально использовать антимикробные препараты с соответствующим механизмом действия.
Создана лабораторная модельная система для поиска эффективных ингибиторов металло-бета-лактамазы среди известных лекарственных средств.
Данная система эффективна при оценке синергидного действия сочетанного использования антибиотика и бисфосфонатов – ингибиторов МБЛ грамотрицательных бактерий.
Метод оценки зависимости «время – летальное действие» дает возможность выявить бактерицидное действие сочетанного использования антибиотика и бисфосфоната – ингибитора МБЛ грамотрицательных бактерий при различных экспозициях (через 4-8-12-24 часа).
Созданная антимикробная композиция карбапенемов, бисфосфонатов и антисептика усиливает действие антибиотиков в отношении резистентных грамотрицательных бактерий, что повышает эффективность антимикробной терапии пациентов с инфекционно-септическими осложнениями.
Положения, выносимые на защиту.
1. Экспериментальная лабораторная модельная система на основе
модифицированного метода «шахматной доски» позволяет тестировать потенциальные
ингибиторы МБЛ грамотрицательных бактерий в присутствии стандартного реактива
фермента металло-бета-лактамазы P. aeruginosa, экспрессированной в E.coli, in vitro.
2. Антимикробная комбинация карбапенемов, бисфосфонатов и антисептика из класса
полигексанидов эффективна в отношении устойчивых к этим антибиотикам клинических
изолятов грамотрицательных бактерий, продуцирующих металло-бета-лактамазы,
выделенных у пациентов с инфекционно-септическими осложнениями.
3. Комплекс методов клинической лабораторной диагностики для мониторинга
эффективности антимикробной комбинации, используемой для лечения пациентов с
инфекционно-септическими осложнениями, должен включать определение следующих
показателей: СОЭ, общее количество лейкоцитов, билирубин, креатинин, АСТ, АЛТ,
прокальцитонин, уровень экспрессии CD64 на нейтрофилах периферической крови, посев
крови и другого биологического материала пациента по показателю колониеобразующих
единиц (КОЕ).
Методология и методы исследования
В работе использованы методы научного познания: аналитический, статистический, современные методы клинической лабораторной диагностики (гематологический, биохимический, молекулярно-генетический, иммунологический, микробиологический).
Степень достоверности и апробация результатов
Достоверность и обоснованность полученных результатов научной работы обеспечена детальным теоретическим анализом проблемы, достаточным количеством проведенных лабораторных исследований и репрезентативным объемом изученного биологического материала пациентов, адекватным статистическим анализом полученных данных, которые были сопоставимы с поставленными задачами.
Результаты работы представлены и обсуждены на ХVI Международном конгрессе МАКМАХ (Москва, 2014), Российско-Китайской научно-практической конференции «Кашкинские чтения» (Санкт-Петербург, 2014, 2015, 2016), Международном научном форуме «Многопрофильная клиника ХХI века. Экстремальная медицина» (Санкт-Петербург, 2015), на заседании отделения ВНПОЭМП в Санкт-Петербурге и Ленинградской области (ФБУН НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера, 2016).
Организация и проведение диссертационного исследования одобрены независимым этическим комитетом ФГБУ ВЦЭРМ им. А.М. Никифорова МЧС России (Протокол №10 от 26.11.13 г.).
Результаты диссертационной работы внедрены и реализованы в клинике ФГБУ ВЦЭРМ им. А.М. Никифорова МЧС России, ФГБУ Российский научный центр радиологии и хирургических технологий МЗ РФ (акт внедрения от 22.08.16г.).
Личный вклад автора
Автором лично проведено планирование и организация микробиологических анализов биоматериала в клинике ВЦЭРМ им. А.М. Никифорова, выполнены исследований по идентификации и изучению чувствительности выделенных микроорганизмов, а также выявлен основной механизм резистентности у карбапенемустойчивых грамотрицательных бактерий (наличие МБЛ) фенотипическими методами. Автор провела анализ сформированных баз данных бактериологических исследований клиники для мониторинга ведущей микробиоты в соответствии с компьютерной программой qMS. Лично автором предложена и апробирована модификация метода «шахматной доски» и метода оценки зависимости «время – летальное действие» для определения эффективности ингибиторов МБЛ, разрешенных к применению в клинической практике. На основании анализа микробиологических и клинико-лабораторных показателей пациентов сделано заключение
об эффективности и обоснование перспективности применения разработанной антимикробной комбинации карбапенемов, бисфосфонатов и антисептика полигексанида для лечения больных с гнойно-септическими осложнениями. Автором проведен сбор, обобщение, статистическая обработка полученных результатов, написание и оформление диссертации.
Публикации результатов исследования
По материалам диссертации опубликовано 24 печатных работы, в том числе 7 статей в рецензируемых научных изданиях и журналах. Зарегистрирована Заявка № 2015133469 от 10.08.2015 на выдачу патента РФ на изобретение «Антимикробная комбинация сочетанного применения карбапенемов и бисфосфонатов в отношении устойчивых к карбапенемам грамотрицательных микроорганизмов».
Объем и структура диссертации
Диссертация изложена на 144 страницах текста и состоит из введения, обзора литературы, главы материалов и методов исследования, результатов собственных исследований и их обсуждения, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы, включающего 206 источника, из них 112 отечественных и 94 зарубежный. Работа содержит 39 таблиц, 25 рисунков.
Клинико-лабораторные прогностические признаки развития инфекционно-септических осложнений у пациентов
Согласно данным по Европейскому региону резистентные инфекции приводят к значительному увеличению нагрузки на экономику и здравоохранение этих стран: число пациентов, погибших в результате резистентных бактериальных внутрибольничных инфекций, ежегодно составляет свыше 25 тыс. человек. Помимо роста уровня заболеваемости и смертности среди пациентов следует принимать во внимание и такие факторы, как увеличение сопутствующих расходов на здравоохранение, которые, согласно существующим оценкам, ежегодно достигают, более 1,5 млрд. евро [20, 24, 25, 34, 100, 101, 107]. Аналогичная картина складывается и в других частях света [43, 47, 57, 143, 180].
Ситуация в нашей стране с распространенностью ВБИ на протяжении многих лет остается весьма серьезной. Данные заболевания резко повышают стоимость лечения и удлиняют сроки нахождения пациента в стационаре, также отмечается высокая летальность или инвалидизация больных. По данным локальных мониторингов НИ можно предположить, что ежегодно в ЛПО России возникает не менее 2-2,5 млн. случаев ВБИ [6, 24, 25, 39, 45, 62, 72, 78, 87, 88].
Общеклинические и биохимические показатели крови, а также микробиологические данные контаминации ран являются важнейшими диагностическими критериями, отражающими реакцию организма на патологические факторы. Чаще всего в качестве прогностического признака клиницисты использовали следующие показатели: СОЭ, лейкоцитоз, прямой билирубин, АСТ, АЛТ, креатинин, лактат [11, 12, 21, 23, 37, 65, 66, 93]. В последние годы важным диагностическим тестом стал показатель прокальцитонина (ПКТ). При воспалительном процессе, вызванном бактериями, в первую очередь грамотрицательными палочками, повышается уровень ПКТ в течение 6-12 часов [26, 27, 185, 186]. Мониторинг ПКТ – это быстрый и надежный подход для определения септического синдрома полиорганнной недостаточности (ПОН) и для построения общего прогноза [17, 138]. По мере затухания инфекции ПКТ стабильно возвращается к значениям ниже 0,5 нг/мл с периодом полувыведения 24 часа. Определение ПКТ in vitro может быть использовано для контроля эффективности проводимой терапии опасных для жизни системных бактериальных инфекций [193].
Изменение лейкоцитарной формулы сопутствует многим заболеваниям, но нередко является неспецифическим, в то же время дает представление о тяжести состояния пациента и эффективности проводимого лечения. СОЭ служит достоверным признаком развития гнойных осложнений инфекционных и воспалительных процессов в организме, и ее изменения имеют диагностическое и прогностическое значение. Повышение креатинина и прямого билирубина свидетельствует о нарушении функции почек и печени. Одновременное определение в сыворотке крови АСТ и АЛТ несет больше информации о локализации и глубине поражения, позволяет прогнозировать исход болезни[37, 79].
Большое внимание уделяют исследованию роли различных звеньев иммунной системы в патогенезе сепсиса. Ответ на бактериальную инфекцию реализуют клетки врожденного иммунитета: нейтрофилы, моноциты и макрофаги, эндотелиоциты и т.д. Они участвуют в распознавании антигена, активно синтезируют медиаторы воспаления для локализации очага инфекции и для запуска и поддержания адаптивного иммунного ответа, эффекторная фаза которого включает, в том числе, продукцию антител. Экспрессия рецепторов к иммуноглобулинам позволяет гранулоцитам и моноцитам/макрофагам осуществлять фагоцитоз опсонизированных иммуноглобулинами бактериальных антигенов[79].
CD64 – высокоаффинный рецептор к IgG (Fc gamma RI) – конститутивно экспрессируется на поверхности моноцитов/макрофагов и эозинофильных гранулоцитов. В норме экспрессия CD64 нейтрофилами незначительна, однако она резко повышается в течение 15 минут после взаимодействия этих клеток с активированным эндотелием, компонентами микробных стенок (липополисахаридами) и продуктами расщепления компонентов комплемента. Высокие концентрации в сыворотке провоспалительных цитокинов IFNgamma, GM-CSF, IL-8, IL-12 в течение суток также приводят к повышению экспрессии нейтрофилами CD64 [146, 150]. Таким образом, повышение экспрессии CD64 на мембране нейтрофильных гранулоцитов является наиболее ранним показателем развития иммунного ответа на бактериальную инфекцию. В течение последних лет в ряде зарубежных работ было предложено определение экспрессии нейтрофилами CD64 для ранней диагностики бактериальной инфекции и сепсиса [122, 146, 150, 188].
Ретроспективное изучение историй болезней пациентов хирургического профиля с гнойными осложнениями показало, что у всех больных наблюдали от 2 до 6 лабораторных признаков, сигнализирующих о возможном развитии гнойно-воспалительного процесса. Обнаружение общеклинических и биохимических показателей крови, превышающих референс-значения нормы, должно предупредить хирургов о возникновении послеоперационного гнойного осложнения. В то же время нормализацию этих показателей можно расценивать как положительную динамику разрешения инфекционного процесса на фоне правильно подобранного лечения, в том числе и антибактериального. Одним из основных критериев, используемых для прогноза и оценки эффективности лечения пациентов с гнойными осложнениями, является микробная контаминация биоматериалов.
Микробиологические методы исследования
Работа выполнена на базе лаборатории бактериологических исследований отдела лабораторной диагностики ФГБУ «Всероссийский центр экстренной и радиационной медицины им.А.М.Никифорова МЧС России» (далее ФГБУ ВЦЭРМ им. А.М. Никифорова МЧС России).
ФГБУ ВЦЭРМ им. А.М. Никифорова МЧС России является многопрофильным медико-профилактическим учреждением, оказывающим высокотехнологичную медицинскую помощь по различным направлениям медицины. С 2012г. в Центре работает клиника №2 на 450 коек, в состав которой входит 3 отделения реанимации, отделения хирургического профиля – ожоговое, торако-абдоминальное, кардиохирургия, отделение экстренной хирургической помощи, отделение гематологии и трансплантации костного мозга, гинекология, урология, челюстно-лицевая хирургия, офтальмология, ЛОР, а также отделения терапевтического направления, в том числе отделение клинической реабилитации. С 2012г. в Центре работает лаборатория бактериологических исследований. За период с июля 2012г. по декабрь 2015 г. исследовали 25500 образцов биоматериалов.
Сбор биоматериала от пациентов проводили в соответствии с правилами по сбору материалов [49].
Для проведения данного исследования были отобраны 549 штаммов полирезистентных грамотрицательных микроорганизмов, выделенных от больных, пострадавших при ликвидации последствий чрезвычайных ситуаций. Ежегодно в мире на пожарах погибает до 80 тысяч человек, в России более 11 тысяч получают тяжелые травмы и ожоги[30]. У таких пациентов развивались осложнения – нозокомиальная пневмония, инфицированные раны и ожоги, сепсис. Возбудители инфекций представлены следующими видами микроорганизмов: A. baumannii – 190 штаммов, P. aeruginosa – 334 штамма, K. pneumoniae – 25 штаммов.
Методом ПЦР на наличие карбапенемаз оценивали 176 культур выделенных изолятов, в результате чего выявлены следующие генотипы: VIM – 19 штаммов P. aeruginosa, NDM – 17 штаммов K. pneumoniae, OXA-48 – 8 штаммов K. pneumoniae, OXA-40 – 32 штамма A. baumannii, OXA-23 – 19 штаммов A. baumannii. Все микроргранизмы отличались высоким уровнем резистентности к карбапенемам – МПК составили от 64 мкг/мл до более 512 мкг/мл. 2.2. Материалы исследования
В исследование включены клинические штаммы грамотрицательных микроорганизмов, выделенные от пациентов с инфекционными осложнениями, – P. aeruginosa 532/14, A. baumannii 346/14, K. pneumoniae 4058/13, продуцирующие МБЛ и характеризующиеся высокой степенью резистентности к карбапенемам. Для моделирования приобретения резистентности к карбапенемам грамотрицательными бактериями использованы контрольные референс-штаммы P. aeruginosa ATCC 27853, A. baumannii ATCC BAA-747, K. pneumonia ATCC 70603 чувствительные к данной группе антибиотиков.
Для выявления МБЛ фенотипическим методом использовали диски карбапенем/карбапенем+ЭДТА (имипенем, меропенем) фирмы Биорад, Франция, Е-тесты карбапенем/карбапенем+ЭДТА (имипенем) фирмы Биомерье, Франция. Определение генотипов карбапенемаз методом ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией продуктов амплификации в режиме «реального времени» с использованием наборов реагентов (предоставлены ФГБУ ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора): - «АмплиСенс MDR Ab-OXA-FL», предназначенные для выявления генов OXA-карбапенемаз ацинетобактеров (групп OXA-23 - подобных, OXA-58 -подобных и OXA-40 - подобных) и генов-маркеров A. baumannii (генов OXA-51-подобных карбапенемаз), - «АмплиСенс MDR MBL-FL», предназначенные для выявления генов приобретенных карбапенемаз класса МБЛ групп VIM, IMP и NDM, - «АмплиСенс MDR KPC/OXA-48-FL», предназначенные для выявления генов приобретенных карбапенемаз групп KPC и OXA-48-подобных (типы OXA-48 и OXA-162).
Для определения относительного количества CD64+нейтрофилов использовали антитела: IgG1FITC, CD64FITC, CD14PE, CD16PC5, CD45PC7. Популяцию нейтрофилов определяли как CD45+dimSSCbrightCD16+ клетки. В качестве внутреннего позитивного контроля использовали популяцию моноцитов (CD14+SSCdim клетки), конститутивно экспрессирующих CD64 (Beckman-Coulter, США).
Использовали готовые питательные среды производства ООО «Биомедиа», Санкт-Петербург (колумбийский агар с 5% бараньей крови, элективный солевой агар, среда Эндо, агар Шедлера, Сабуро агар, шоколадный агар, агар Мюллера-Хинтона), а также среды собственного производства на основе коммерческих сухих смесей: бульон Мюллера-Хинтона (Оксоид, Великобритания), «Уриселект 4» (Биорад, Франция), CandidaBrillians (Оксоид, Великобритания), CHROMagar ESBL, CHROMagarKPC (DRG, Франция), среды для культивирования гемокультур и других в норме стерильных биологических жидкостей для анализатора БактАлерт (флаконы BacT/ALERT FA Plus, FN Plus, PF Plus) фирмы Биомерье, Франция.
Для идентификации и определения чувствительности грамотрицательных микроорганизмов использовали карты VITEK2 GN,GP, VITEK2 AST-N102 (Биомерье, Франция), диски с антибактериальными препаратами (Оксоид, Великобритания). Для титрования антибиотиков, бисфосфонатов, антисептика, а также их сочетаний использовали полистирольные иммунологические планшеты («Медполимер» Россия).
Оценка способности бисфосфонатов предупреждать развитие резистентности к карбапенемам у ранее чувствительных к ним штаммов грамотрицательных бактерий в модельной системе в присутствии стандартного реактива фермента МБЛ
За период с июля 2012 года по декабрь 2015 года исследовали 25500 образцов биоматериалов, в том числе 8194 образца клинического материала от 3485 пациентов, находящихся на стационарном лечении в отделениях хирургического профиля и реанимации. При этом проводили мониторинг микробиоты стационара.
Структура исследованных биоматериалов представлена в таблице 5 и на рисунке 1. В структуре биоматериалов, поступивших на исследование от пациентов хирургического профиля, значительную часть составляет моча, раневое отделяемое, кровь, отделяемое нижних дыхательных путей (мокрота, бронхо-альвеолярный лаваж).
При проведении бактериологических исследований были выявлены ведущие возбудители инфекционных осложнений (таблица 6, рисунок 2). Таблица 6. Ведущая микробиота инфекционных осложнений у пациентов
При диагностике инфекционных осложнений было обнаружено, что в 69% случаев возбудители находились в ассоциациях, состоящих из двух-пяти микроорганизмов. Так 71% всех ассоциаций был представлен сочетанием двух грамотрицательных бактерий и 29% – грамотрицательным и грамположительным микроорганизмами.
Распределение ведущей микробиоты по биоматериалам представлено в таблице 7. При этом необходимо отметить достаточно высокую высеваемость из раневого отделяемого S. aureus – 18,6% и Enterococcus spp. – 18%. При этом особое внимание должно быть уделено высокой частоте выделения грамотрицательных бактерий – 30,9%. В крови количество грамположительных бактерий составило 19,7%, а грамотрицательных бактерий – 24,2%. Ведущими возбудителями инфекций нижних дыхательных путей были грамотрицательные бактерии – 47%, а грамположительные бактерии – 13,3%. Основными возбудителями инфекций мочевыводящих путей являлись грамотрицательные бактерии – 53% и энтерококки – 17,4%, доля S. aureus составила 2,4%. Очень важные данные получены при анализе изолятов, обнаруженных на поверхности венозных катетеров, где наибольшее количество представлено грамотрицательными бактериями – 48,2%; грамположительные бактерии составили 17,4%.
На рисунке 3 представлено количество в процентах резистентных штаммов стафилококков, где отчетливо прослеживается более высокая устойчивость коагулазонегативных стафилококков (КНС) по сравнению с резистентностью S. aureus. Таким образом, КНС также являются этиологически значимыми возбудителями раневой инфекии и инфекции кровотока. Стафилококки сохраняют чувствительность к ванкомицину, линезолиду, цефтаролину и тигециклину, при этом отмечается высокий процент метициллинрезистентных КНС – 75%-80%, S. aureus – 38%. Стафилококки характеризовались высокой степенью резистентности к фторхинолонам: S. epidermidis и другие КНС были устойчивы к левофлоксацину 57 – 61%, к моксифлоксацину – 48 – 60%; S. aureus соответственно – 33% и 31%. S. epidermidis и другие КНС отличались более высокой резистентностью к тетрациклинам, эритромицину, клиндамицину, тобрамицину и гентамицину, соответственно
Анализируя чувствительность грамотрицательных микроорганизмов к АМП in vitro (рис. 4), выявили, что 81% штаммов K. pneumoniae продуцировали бета-лактамазы расширенного спектра, 20% – карбапенемазы. Ацинетобактеры были устойчивы к карбапенемам: в 94% случаев – к меропенему и в 90% случаев – к имипенему, при этом отмечали сочетанную резистентность к другим классам АМП и сохранение чувствительность к колистину в 100% случаев, к цефаперазону/сульбактаму (за счет природной чувствительности к сульбактаму) – в 18% случаев. Штаммы P. aeruginosa резистентны к карбапенемам: в 77,7% случаев – к меропенему и в 78% случаев – к имипенему, и также обладали повышенной резистентностью к остальным классам антибиотиков.
Таким образом, инфекционные осложнения, вызванные резистентными штаммами грамотрицательных бактерий, не поддавались лечению стандартными схемами антибиотикотерапии (АБТ). Длительность нахождения пациентов в стационаре нередко составляла 30 и более суток, в ряде случаев течение болезни заканчивалось летальным исходом.
Для усиления эффекта АБТ разные авторы предлагают различные сочетания антибиотиков – от 2 до 4 препаратов[142]. Выявлен синергизм полимиксина с другими классами АМП, например, полимиксина с рифампицином или миноциклином [125, 177, 178].
В связи с этим, нами проведены исследования по поиску эффективных комбинаций лекарственных препаратов для воздействия на резистентные штаммы грамотрицательных бактерий, продуцирующих карбапенемазы.
Оценка зависимости «время – летальное действие» комбинаций карбапенемов и бисфосфонатов в отношении клинических штаммов грамотрицательных микроорганизмов, продуцирующих металло-бета лактамазы
Целью нашего исследования было изучение возможности усиления действия карбапенемов в отношении резистентных грамотрицательных микроорганизмов с помощью лекарственных препаратов из группы бисфосфонатов.
Предварительно опыты проводили с ЭДТА – стандартным реактивом для выявления наличия МБЛ у грамотрицательных бактерий.
В работе использовали карбапенемы (меропенем, имипенем), ЭДТА, бисфосфонаты (клодроновая и этидроновая кислоты).
Для выявления сочетанного действия антибиотиков и ЭДТА (или бисфосфонатов) применили модификацию метода «шахматной доски», предложенного еще в середине 20 века L.Garrod и D.Waterworth, L.Sabath для изучения взаимодействия двух антибиотиков, или, так называемый, метод перекрестного титрования.
Исследование проводили микрометодом. Данный метод заключается в обнаружении синергизма или антагонизма сочетания тестируемых лекарственных препаратов в отношении исследуемых штаммов, использовали разные концентрации препаратов и определяли активность в разных комбинациях лекарственных средств, что было достигнуто титрованием в иммунологических планшетах: по горизонтали оценивали разведения хелатирующего агента (ЭДТА или бисфосфонатов), а по вертикали – антибиотиков-карбапенемов. Титрование в бульоне Мюллера-Хинтона проводили в объеме 100 мкл, общий объем ячейки составлял 200 мкл. Для приготовления инокулюма тест-штаммов использовали суточную культуру микроорганизмов и по стандарту 0,5 McFarland готовили исходную суспензию, получая 1,5х108 КОЕ/мл. Суспензию разводили в 31 раз, 1 мл суспензии вносили в 30 мл бульона Мюллера-Хинтона, образовавшаяся взвесь содержала 5х106 КОЕ/мл, по 10 мкл этой взвеси вносили во все ячейки, кроме ячейки «контроль среды», в каждой ячейке получали 5х104 микробных клеток. Планшеты инкубировали при температуре 370С 24 часа, после чего оценивали рост микроорганизмов в ячейках. Данные о наличии/отсутствии роста вносили в таблицы. По формуле рассчитывали индекс фракционной ингибирующей концентрации (ФИК) сочетанного действия тестируемых препаратов.
При обосновании заключения об усилении действия карбапенемов в отношении резистентных клинических штаммов грамотрицательных микроорганизмов в присутствии ЭДТА, или этидроновой кислоты, или клодроновой кислоты методом «шахматной доски» оценивали индекс фракционной ингибирующей концентрации (I ФИК) по формуле [140] ЛТП/" МПКлс МПКвс 1ФИК= 1 , где МПКа МПКб МПКас - минимальная концентрация антибиотика (в мкг/мл), взятого в сочетании с хелатирующим агентом; МПКа - минимальная подавляющая концентрация антибиотика, взятого как монопрепарат (в мкг/мл); МПКбс - минимальная концентрация хелатирующего агента (в мкг/мл), взятого в сочетании с антибиотиком; МПКб - минимальная подавляющая концентрация хелатирующего агента, взятого как монопрепарат (в мкг/мл). Авторами метода [140] предложена следующая трактовка индекса ФИК: синергизм - индекс до 0,5; индифферентность - индекс от 0,51 до 4; антагонизм - индекс более 4.
Исследование проводили с использованием трех клинических штаммов грамотрицательных микроорганизмов с высоким уровнем резистентности к карбапенемам, продуцирующих МБЛ, P. aeruginosa 532/14, A. baumannii 346/14, K. pneumoniae 4058/13, у которых фенотипическими (рисунки 8-9) и/или генотипическими (см. табл. 8) методами были выявлены МБЛ.
Оценка наличия металло-бета-лактамазы у A. baumannii 346/14 с помощью Е-теста (полоски имипенем – имипенем+ЕДТА) 5.1. Оценка наличия синергидного действия ЭДТА и карбапенемов в отношении клинических штаммов грамотрицательных микроорганизмов, продуцирующих металло-бета-лактамазы
В опыт с ЭДТА взяты антибиотики меропенем и имипенем в разведениях от 1/16 до 1/1024 МПК. Использовали комплексон в дозах как превышающих его МПК в 2-4-8 раз, так и ниже МПК в 2-4-8 раз. Следует отметить, что наши данные по МПК ЭДТА (1562 мкг/мл) совпадают с данными литературы [160, 162].
Таким образом, в таблице 25 минимальная концентрация имипенема в первом эффективном сочетании с ЭДТА составила 0.5 мкг/мл, а комплексона, соответственно, 390 мкг/мл (ячейка Б2).
По формуле получали, что индекс ФИК составил 0.25, то есть в отношении штамма P. aeruginosa 532/14 наблюдали синергидный эффект таких концентраций комплексона и имипенема, что позволило повысить чувствительность микроорганизма к антибиотику в 1024 раза.