Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 13
1.1. Протеинурия как ранний маркер ренальной патологии .13
1.2. Количественное определение общего белка мочи как аналитическая проблема
1.2.1. Колориметрические методы, основанные на связывании белка с органическими красителями 21
1.2.2. Турбидиметрические методы 23
1.2.3. Экспресс-методы .25
1.3. Клинико-лабораторная диагностика протеинурии у беременных 26
1.4. Протеом мочи и диагностическое значение определения специфических белков .32
1.4.1. Протеомный спектр мочи 32
1.4.2. Цистатин С как ранний маркер ренальной патологии 34
1.4.3. N-ацетил--D-глюкозаминидаза – маркер острого повреждения почек 39
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования .42
2.1. Список использованных материалов. 42
2.2. Список использованного оборудования 42
2.3. Объекты исследования 43
2.4. Методы исследования 47
2.5. Методы статистической обработки .49
Собственные результаты и их обсуждение .50
ГЛАВА 3. Интерпретация результатов измерения содержания общего белка в моче беременных .50
3.1. Аналитические характеристики методов .51
3.1.1. Аналитические характеристики методов определения общего белка с использованием ССК И ПГК .51
3.1.2. Распределение пациентов по уровню протеинурии в зависимости от состава используемого калибратора .54
3.2. Сравнение результатов определения общего белка в моче, полученных методами ССК, ПГК, тест-полосок .57
3.3. Диагностические характеристики тестов с учетом триместра
беременности .62
ГЛАВА 4. Исследование белкового спектра мочи беременных .66
ГЛАВА 5. Аналитические и клинические аспекты определения цистатина с в моче беременных 72
5.1. Аналитические характеристики иммунотурбидиметрического определения цистатина С в моче .72
5.1.1. Расчет предела обнаружения и предела надежного обнаружения цистатина С 72
5.1.2. Оценка влияния матрицы раствора на результат определения содержания цистатина С в образце 74
5.2. Результаты определения цистатина С в моче беременных 77
ГЛАВА 6. Результаты определения N-ацетил--d глюкозаминидазы в моче беременных 81
6.1. Аналитические характеристики спектрофотометрического метода определения активности NAG в моче 81
6.2. Активность NAG в моче беременных 85
Заключение .90
Выводы 96
Практические рекомендации 97
Список используемых сокращений 98
Список литературы
- Колориметрические методы, основанные на связывании белка с органическими красителями
- Список использованного оборудования
- Распределение пациентов по уровню протеинурии в зависимости от состава используемого калибратора
- Оценка влияния матрицы раствора на результат определения содержания цистатина С в образце
Введение к работе
Актуальность темы исследования
Общий белок является интегральным биохимическим показателем, а его определение – одним из наиболее часто выполняемых рутинных исследований в клинических лабораториях. При этом, несмотря на длительную историю и годами сложившуюся практику по определению общего белка в моче, до сих пор остается ряд нерешенных вопросов как в области аналитики, так и при клинической интерпретации полученных результатов.
С одной стороны, для использования в практике лабораторий был разработан и предложен ряд биохимических методов определения общего белка, каждый их которых имеет свои достоинства и недостатки [Эмануэль В.Л., 2010]. Однако аргументы в пользу выбора конкретного метода для ранней диагностики почечной патологии до сих пор остаются предметом обстоятельных обзоров и исследований [Петров В.И., 2012; Decramer S., 2008]. В силу чрезвычайно сложного белкового состава мочи и особенностей его изменения при разных патологиях почек, которые могут существенно влиять на результат определения общего белка мочи в случае конкретной нозологической формы, по-прежнему остается актуальным вопрос о выборе наиболее клинически информативного метода (с максимально достигаемой чувствительностью и специфичностью). В связи с этим внедрение нового метода в клиническую лабораторную практику имеет два аспекта. Первый аспект связан с тем, что аналитические характеристики метода должны быть приведены в соответствие с рекомендациями профессиональных ассоциаций. Второй аспект подразумевает клиническую интерпретацию полученных результатов метода в рамках принципов доказательной медицины. Следует отметить, что использование несертифицированных методик и реактивов в лабораторной практике приводит к существенному изменению клинического результата и снижению его достоверности.
Очевидно, что в настоящее время определение содержания только общего белка в моче для диагностики патологии почек является недостаточным [Barratt J., 2007; Ronco C., 2013]. Перспективным направлением представляется исследование специфических белков, указывающих на повреждение ткани почек [Decramer S., 2008; Ronco C., 2014]. Однако если биохимические маркеры повреждения таких органов, как печень, миокард, поджелудочная железа, хорошо изучены и их определение внедрено в клиническую практику, то биохимические маркеры повреждения почек находятся на различных стадиях разработки.
Следует отметить, что уровень протеинурии является одним из основных критериев для постановки диагноза преэклампсия и оценки степени её тяжести [Приказ МЗ РФ № 572н от 12.11.2012; Айламазян Э.К., 2012; Савельева Г.М., 2013]. Актуальность данной проблемы обусловлена тем, что преэклампсия остается одним из самых тяжелых осложнений беременности. В России, несмотря на наблюдающееся в последнее десятилетие снижение абсолютного числа родов, частота преэклампсии из года в год увеличивается и достигает 16 -
21%. По данным отечественных авторов, преэклампсия занимает 3-е место в структуре летальности беременных, на её долю приходится 15 - 25% случаев материнской смертности [Бикбов Б.Т., 2009; Антонова Т.Н., 2011]. Однако в литературе до сих пор нет четкого референтного диапазона для диагностики протеинурии беременных [Сухих Г.Т., 2012; Ray A.J., 2010; Brown M.A., 2012].
Для диагностики преэклампсии у беременных гинекологи используют критерии, предусмотренные порядком оказания медицинской помощи по профилю «акушерство и гинекология (за исключением использования вспомогательных репродуктивных технологий)» [Приказ МЗ РФ № 572н от 12.11.2012]. Базовый спектр обследования беременных женщин включает ограниченную лабораторную панель тестов (общий анализ крови, общий анализ мочи, анализ суточной мочи на белок, биохимический анализ крови), поэтому поиск новых лабораторных маркеров для более ранней диагностики преэклампсии является весьма целесообразным.
Несомненно, особый интерес представляет изучение протеомного спектра мочи беременных в целях исследования изменений белковых фракций при развитии патологии беременных. Однако потенциальными маркерами преэклампсии и острого тубулярного поражения почек могут оказаться такие сравнительно легко определяемые индивидуальные белки, как цистатин С [Каюков И.Г., 2012; Inker L.A., 2012; Voskoboev N.V., 2012] и N-ацетил--D-глюкозаминидаза (NAG) [Jacob M., 2008; Capodicasa E., 2011; Adiyanti S.S., 2012; Han W.K., 2014].
Степень разработанности проблемы
Внедрение исследования протеинурии в клиническую лабораторную практику для диагностики патологии почек относится к началу XX в. в связи с появлением ряда методов определения общего белка. Большинство из них до сих пор используется в клинических лабораториях в качестве скрининговых методов. Однако проблема количественного определения концентрации общего белка в биологических жидкостях до настоящего времени окончательно не решена из-за наличия методических сложностей при исследовании низких концентраций общего белка и отсутствия четкой клинической интерпретации для различных групп пациентов [Вельков В.В., 2010]. Следует отметить, что в настоящее время большое количество публикаций посвящено фотометрическому методу с использованием пирогаллолового красного как основного для определения протеинурии [Пупкова В.И., 2007; Козлов А.В., 2012]. Однако остается нерешенной проблема количественной оценки протеинурии. По мнению экспертов Национального почечного фонда [National Kidney Foundation, 2014], для всех клинических ситуаций окончательное заключение о выраженности протеинурии должно основываться на определении белка в суточном объеме мочи. Другие исследователи отдают предпочтение оценке суточной потери белка с мочой по величине отношения белок (альбумин)/креатинин в случайном образце мочи. Кроме того данные по клинической интерпретации и референтным интервалам для различных групп пациентов, в том числе и такого специфического контингента, как беременные
женщины, до сих пор противоречивы [Новоселова О.В., 2007; Козлов А.В., 2012; Thangaratinam S., 2009].
Достижения протеомики последнего десятилетия, связанные с появлением высокочувствительных методов, позволили обнаружить в моче здорового человека более чем 1500 различных белков, среди которых может оказаться достаточное количество перспективных белков-маркеров повреждения ткани почек [Adachi J., 2006; Barratt J., 2007]. Следовательно, в настоящее время исследование протеома мочи, поиск новых маркеров для ранней диагностики ренальной патологии и преэклампсии, а также расширение лабораторной панели обследования пациентов с нефрологическими заболеваниями, в том числе и беременных, является весьма актуальным направлением. Этим продиктованы цель и задачи настоящего исследования.
Цель исследования – обосновать диагностические критерии протеинурии при беременности в зависимости от аналитических процедур определения общего белка и отдельных специфических белков.
Задачи исследования
-
Сравнить аналитические характеристики методов, наиболее часто используемых для определения общего белка в моче, и результаты его измерения разными методами у беременных.
-
Определить референтные значения протеинурии для обследования беременных.
-
Исследовать особенности белкового спектра мочи беременных методом нативного горизонтального электрофореза в агарозном геле.
-
Установить аналитические характеристики иммунотурбидиметрического метода определения концентрации цистатина С и исследовать его содержание в моче беременных.
-
Установить аналитические характеристики спектрофотометрического метода определения активности N-ацетил--D-глюкозаминидазы и исследовать её активность в моче беременных.
-
Определить диагностические уровни протеинурии, цистатина С, активности N-ацетил--D-глюкозаминидазы и белкового спектра мочи беременных с преэклампсией.
Научная новизна
Впервые в рамках одного исследования проведена клинико-аналитическая валидация 3-х рекомендованных Минздравом РФ методов определения общего белка в моче (метод с использованием пирогаллолового красного – ПГК, метод с использованием сульфосалициловой кислоты – ССК, метод «сухой химии» - ТП). При этом установлено, что метод ПГК позволяет обнаружить общий белок уже на уровне, характерном для микроальбуминурии. Впервые были оценены диагностические характеристики метода ПГК с учетом триместра беременности и установлена верхняя граница референтного интервала протеинурии для беременных.
Определены особенности белкового спектра мочи беременных и проведена оценка клинико-диагностической значимости определения белковых
фракций мочи с различной степенью протеинурии. Получены новые данные о частоте глобулинурии.
На основании международных и отечественных правил, руководств, рекомендаций проведена валидация методов определения специфических белков (цистатина С и N-ацетил--D-глюкозаминидазы) в моче, в ходе которой разработан оптимизированный протокол спектрофотометрического определения активности N-ацетил--D-глюкозаминидазы. На основании данного валидированного протокола предложена методика определения активности данного фермента для диагностики тубулярной патологии почек у беременных. Впервые показана диагностическая значимость изменения концентрации цистатина С и активности N-ацетил--D-глюкозаминидазы в моче беременных для ранней диагностики патологии почек у беременных при преэклампсии.
Теоретическая и практическая значимость
Впервые предложен референтный интервал протеинурии, полученный для колориметрического метода определения белка в моче с использованием пирогаллолового красного, для беременных женщин вне зависимости от триместра беременности, равный 0,02 – 0,15 г/л.
Установлено, что протеинурия беременных обусловлена альбуминовой, 2- и -глобулиновой фракциями. Доказано, что учет уровня глобулиновых фракций имеет важное диагностическое значение наряду с альбуминовой фракцией.
В ходе работы получены новые данные о содержании цистатина С и активности N-ацетил--D-глюкозаминидазы в моче беременных. Установлено, что для беременных характерно увеличение содержания цистатина С в моче в І триместре. В то время как для NAG наблюдается тенденция к увеличению её активности в моче у беременных с диагнозом преэклампсия, что позволяет рассматривать данный фермент как наиболее перспективный маркер повреждения клеток проксимальных канальцев почек. Получены оценки референтных уровней концентрации цистатина С и активности NAG в моче беременных.
Методология и методы исследования
Для реализации поставленной цели научной работы были использованы анализ литературы, современные лабораторные методы исследования и методы статистической обработки данных. В основу положено проспективное когортное наблюдение.
Научные положения, выносимые на защиту
1. Концентрация общего белка в моче, равная 0,150 г/л, является верхним
пределом референтного интервала для беременных.
2. Белковый спектр мочи беременных представлен в основном
альбуминовой, 2- и -глобулиновой фракциями, следовательно, белки,
входящие в состав 2- и -глобулиновой фракций, могут являться
потенциальными маркерами повреждения почек при преэклампсии.
3. N-ацетил--D-глюкозаминидаза мочи является перспективным маркером тубулярного повреждения почек у беременных с преэклампсией.
Степень достоверности и апробация результатов исследования
Достоверность полученных результатов исследования определяется достаточным и репрезентативным количеством данных, полученных впервые, с использованием арсенала современных методов исследования и подтверждена адекватными методами статистической обработки.
Материалы диссертации доложены на 68-й открытой научно-
практической конференции молодых ученых и студентов с международным
участием «Актуальные проблемы экспериментальной и клинической
медицины» (Волгоград, 2010); на XV научно-практической конференции
«Лабораторное обеспечение стандартов медицинской помощи» (Москва, 2010);
на научно-практической конференции «Лабораторная наука – практике: первое
десятилетие XXI века» (Москва, 2010); на Всероссийском конгрессе
«Лабораторные технологии при организации медицинской помощи» (Москва,
2010); на Общероссийской научно-практической конференции
«Обеспечение доступности современных лабораторных исследований: аналитические возможности, клинические потребности, организационно-экономические условия» (Москва, 2011); на Первой Всероссийской научной конференции молодых ученых-медиков «Инновационные технологии в медицине XXI века» (Москва, 2012).
Внедрение в практику
Полученные референтные значения протеинурии для
колориметрического метода с использованием пирогаллолового красного внедрены в практику клинических лабораторий на базе ГУЗ «Волгоградский областной клинический перинатальный центр №2», ГУЗ «Волгоградский областной клинический перинатальный центр №1 им. Л.И. Ушаковой» для скрининга патологии беременности. Отдельные положения и выводы нашли применение в учебном процессе для подготовки врачей на кафедрах акушерства и гинекологии, клинической лабораторной диагностики ГБОУ ВПО «ВолгГМУ Минздрава РФ».
Личный вклад автора
Автором проанализированы современные данные литературы по теме диссертации, сформулированы цели и задачи работы, выбраны методы и подходы, отвечающие реализации поставленных задач.
Автором непосредственно проведены все указанные в работе лабораторные исследования, статистическая обработка и анализ полученного материала. Автором выполнен сбор и обработка клинических данных. Личный вклад автора в исследование составляет более 95%.
Публикации
По теме диссертации опубликовано 8 работ, в том числе 3 – в изданиях, рекомендованном ВАК Минобрнауки РФ.
Структура и объём работы
Диссертация изложена на 118 страницах машинописного текста, состоит из введения, шести глав (обзор литературы; материалы и методы; 4 главы, описывающие результаты собственных исследований и обсуждение), выводов. Список литературы включает 42 отечественные работы и 131 зарубежный источник. Диссертация иллюстрирована 19 таблицами и 23 рисунками.
Колориметрические методы, основанные на связывании белка с органическими красителями
Протеинурия - увеличение концентрации общего белка в моче. Она справедливо признана важнейшим симптомом воспалительных, дистрофических и так называемых урологических заболеваний почек, а также мочевых путей [158, 170].
Концентрация общего белка в моче, его качественные характеристики определяются функциональным состоянием гломерулярного барьера и канальцевого аппарата, особенностями гемодинамики, концентрацией и качественным составом плазменных протеинов.
Через мембрану почечных клубочков в норме большая часть белков не проходит, что объясняется большим размером белковых молекул, а также их зарядом и строением. При минимальных повреждениях в клубочках почек наблюдается, прежде всего, потеря низкомолекулярных белков (преимущественно альбумина), поэтому при большой потере белка часто развивается гипоальбуминемия. При более выраженных патологических изменениях в мочу попадают и более крупные белковые молекулы [127].
Эпителий канальцев почек физиологически секретирует некоторое количество белка (белок Тамм-Хорсфалла). Часть белков мочи может поступать из мочеполового тракта (мочеточник, мочевой пузырь, мочеиспускательный канал) – содержание этих белков в моче резко повышается при инфекциях, воспалении или опухолях мочеполового тракта [122].
Увеличение проницаемости капилляров клубочков, приводящее к протеинурии, происходит при лихорадке, интоксикации, в том числе некоторыми лекарственными препаратами, при длительных запорах и тяжелых поносах и т.д.
Почечная протеинурия бывает функциональная (физиологическая, доброкачественная) и патологическая (органическая). Функциональная почечная протеинурия обусловлена временным преходящим увеличением фильтрации белков сыворотки крови в ответ на сильные внешние раздражения (необычные статические и динамические нагрузки, повышенная мышечная работа, лихорадка, интоксикация) и не связана с поражением почек и мочевыводящих путей [127, 169]. Функциональная почечная протеинурия, как правило, не превышает 1,0 г/л и исчезает после устранения причин, ее вызвавших.
Патологическая почечная протеинурия является одним из наиболее важных признаков органического поражения клубочкового аппарата и почечных канальцев. Патологическая протеинурия бывает почечного и не почечного происхождения [139].
Почечная, или ренальная, протеинурия является одним из наиболее важных и постоянных признаков заболеваний почек и может быть вызвана поражением клубочков и/или канальцев нефрона. Не почечная протеинурия может быть преренальной и постренальной.
Преренальная протеинурия возникает при отсутствии патологического процесса в самих почках. Ее происхождение обусловлено заболеваниями или патологическими состояниями, которые приводят к изменению концентрации белка в плазме крови (гемоглобин при выраженном гемолизе, миоглобин при синдроме размозжения и др.) или к появлению патологических белков (белок Бенс-Джонса и другие парапротеины при миеломной болезни).
Постренальная протеинурия обусловлена выделением с мочой слизи и белкового экссудата при воспалении мочевых путей, заболеваниях предстательной железы или кровотечении [137].
Существует два основных механизма развития почечной протеинурии: 1. Увеличение фильтрации белков при повреждении гломерулярного фильтра (гломерулярная протеинурия); 2. Снижение реабсорбции профильтровавшихся белков клетками почечных канальцев (тубулярная протеинурия).
При сочетании этих двух механизмов развивается смешанный тип протеинурии. Следует отметить, что в клинической лабораторной практике при исследовании мочи измеряют содержание общего белка. К сожалению, общий белок мочи представляет собой группу разнородных веществ, обладающих различными физико-химическими свойствами. Поэтому белковый состав анализируемой пробы может в определенной степени влиять на результаты определения общего белка. Дополнительную сложность создает очень сильный полиморфизм белков. Несмотря на то, что большинство белков мочи образуется за счет фильтрации белков плазмы крови, идентичными им они не являются. Таким образом, альбумин мочи, как и другие белки, в результате различных конформационных изменений значительно отличается по своим свойствам от альбумина плазмы крови. В связи с последними достижениями протеомики появилась необходимость исследования белковых фракций мочи для поиска новых маркеров ранней диагностики почечной патологии.
При различных заболеваниях клубочков степень снижения их барьерных свойств по отношению к частицам разного размера различна. В связи с этим гломерулярная протеинурия может быть двух типов - селективная и неселективная [116]. При селективной гломерулярной протеинурии через гломерулярный барьер проходят альбумин и трансферрин, размеры которых 4 нм, но не более крупные иммуноглобулины IgG (радиус которых 5,5 нм). При неселективной гломерулярной протеинурии в моче содержатся уже не только альбумин, трансферрин, но и иммуноглобулины G. Именно степень уменьшения селективности (или избирательности) клубочковой фильтрации при протеинурии служит показателем степени повреждения клубочкового фильтра и, следовательно, имеет важное диагностическое и прогностическое значение [52].
Список использованного оборудования
Цистатин С продуцируется в организме с постоянной скоростью, а низкая молекулярная масса позволяет ему свободно фильтроваться через клубочковую мембрану. Он полностью метаболизируется в почках и не секретируется проксимальными почечными канальцами [138, 152]. Уровень цистатина С относительно стабилен в системной циркуляции и относительно легок для определения [158]. Именно эти свойства позволяют рассматривать цистатин С как показатель, способный отражать функцию почек.
В настоящее время в современной литературе описывается два метода определения цистатина С в биологических пробах: нефелометрический и турбидиметрический [4, 44, 71, 72, 86, 143, 163]. При описании нефело-метрического метода определения цистатина С в сыворотке и плазме крови указаны следующие референтные диапазоны: 0,52 – 0,98 мг/л (LOD = 0,17 мг/л) [44, 71]. Для турбидиметрического метода данные параметры следующие: 0,57 – 1,09 мг/л (LOD = 0,03 мг/л, LOQ = 0,28 мг/л) [156]. При исследовании цистатина С в моче нефелометрическим методом получены следующие результаты: 0,03 – 0,18 мг/л (LOD = 0,008 мг/л) [44, 163]; 0,052 – 0,15 мг/л [4].
Таким образом, данные по нормальным значениям и референтным диапазонам, указанные в литературных источниках, различны, поэтому представляется актуальным провести исследования по установлению собственных аналитических характеристик метода определения цистатина С в моче беременных.
«Золотым стандартом» в определении функции почек является изучение клиренса эндогенного инулина (экзогенный маркер СКФ) [141]. Однако до последнего времени как в клинической практике, так и в научных исследованиях с этой целью в большинстве случаев использовалось определение уровня креатинина в сыворотке или плазме крови или оценка клиренса креатинина при помощи формул Cockcroft-Gault [67], Jelliffe [100] и MDRD (Modification of Diet in Renal Disease formula) [43]. Тем не менее уровень креатинина не является надежным индикатором функции почек и подвержен влиянию таких факторов, как возраст, пол, вес, особенности питания, этническая принадлежность [110, 117]. В свою очередь, расчетные способы определения скорости клубочковой фильтрации (СКФ) предоставляют возможность лишь приблизительной оценки функционального состояния почек, поскольку существует нелинейная зависимость между концентрацией креатинина и СКФ, что ведет к переоценке последней при высоком уровне креатинина и соответственно недооценке при низком его уровне. Так, функция почек может оказаться сниженной более чем на 50% к тому моменту, как уровень креатинина превысит верхнюю границу нормы [110, 111, 140].
Многочисленные данные, полученные за последние годы, позволяют позиционировать цистатин С как более точный маркер СКФ, чем креатинин. Мета-анализ, обобщающий 46 статей и 8 неопубликованных кратких отчетов, содержащих результаты наблюдений около 4 500 пациентов и лиц контрольных групп, показал, что цистатин С дает более точное приближение к реальным (измеряемым) значениям СКФ, чем креатинин. Так, коэффициент коррелляции концентрации цистатина С со СКФ составлял 0,92 против 0,74 для креатинина. Значения AUC ROC (area under curve of receiver operator characteristic) для цистатина С составляли 0,93 против 0,84 для креатинина [76]. Показано, что значительное повышение уровня цистатина С может быть информативно уже на ранних стадиях нарушения функции почек [59, 73, 89, 114, 149]. Было также предложено несколько формул для оценки уровня СКФ с использованием цистатина С. Однако до настоящего времени не установлено международного стандарта определения СКФ с использованием этого показателя [159].
Как уже неоднократно отмечалось, цистатин С свободно экскретируется путем клубочковой фильтрации, а затем подвергается полной канальцевой реабсорбции и катаболизации (без секреции). И поэтому, как ранее полагалось, цистатин С в значимых количествах в моче обнаруживаться не должен. Оказалось, что в действительности это не так, при нарушении канальцевой функции концентрации цистатина С в моче (u-CysC, u – urinary, мочевой) могут возрастать в 200 раз (при тубулярных заболеваниях 4,31 ± 3,85 мг/л, при гломерулярных заболеваниях 0,106 ± 0,133 мг/л) [4], особенно при остром повреждении почек (ОПП) [26, 45, 64, 126].
При исследовании экскреции u-цистатина C в мочу у пациентов с протеинурией и ХПН обнаружена хорошая корреляция между уровнями u-цистатина C и концентрацией креатинина в моче [161]. Такая же закономерность обнаружена и у пациентов с персистирующей протеинурией, но без повреждений тубулярных клеток. Средние уровни креатинина в моче возрастают с возрастом и зависят от мышечной массы. В противоположность этому уровни u-цистатина C не зависят от мышечной массы и возраста. Существенно, что уровни u-цистатина C являются хорошим показателем, отражающим эффективность реабсорбции цистатина С в проксимальных канальцах. Это позволяет сделать вывод о том, что соотношение уровней цистатина С и креатинина в моче может быть маркером тубулярной дисфункции. В том случае, если это соотношение находится в нормальном диапазоне, u-цистатин C точно отражает фильтрационные функции клубочков [161]. Кроме того удалось установить, что цистатин C в образцах мочи стабилен при рН 5, при -20оС и при 4оС – 7 дней, а при + 20оС - 48 ч. Замораживание и оттаивание образцов мочи на уровни u-цистатина C не влияют, адсорбции к пластику не наблюдается [125].
Нормирование уровней биомаркеров, определяемых в моче, на концентрацию u-креатинина - методика общепринятая. Однако уровни u-креатинина отражают одновременно и СКФ, и эффективность тубулярной секреции. При этом, когда u-креатинин применяется как специфический маркер клубочковых функций, предполагается (и часто неоправданно), что тубулярная секреция отсутствует. Поэтому нормирование любого тубулярного маркера на u-креатинин, особенно у пациентов с острой и даже умеренной почечной недостаточностью, может привести к неоднозначности результатов. Для оценки степени тубулярных нарушений можно использовать уровни u-цистатина С. Нормирование уровней любого мочевого маркера, специфического для тубулярных нарушений, на уровни второго маркера, которые сильно зависят от клубочковых или от других ренальных или неренальных условий, может приводить к неправильной клинической интерпретации [151].
В настоящее время в литературе описаны исследования по изучению изменения уровня цистатина С во время беременности. Установлено, что при беременности изменяется средний сывороточный уровень цистатина С [100]. Он характеризуется увеличением в первом и третьем триместре и снижением во втором триместре. Это позволяет использовать цистатин С для ранней диагностики ренальных нарушений при беременности [148].
Установлено, цистатин С можно использовать не только как маркер тубулярной дисфункции, но и как маркер тяжести гломерулярного эндотелиоза и повышения гломерулярного объема при беременности. Для диагностики преэклампсии сывороточные уровни цистатина С имеют самую большую точность по сравнению с такими маркерами, как креатинин и мочевая кислота [150, 155]. На ранних сроках беременности сывороточные концентрации цистатина С могут иметь значение для выявления женщин с высоким риском развития преэклампсии [88, 140].
Распределение пациентов по уровню протеинурии в зависимости от состава используемого калибратора
В настоящее время выбор метода анализа общего белка в моче нормативными документами не регламентирован. Поэтому на данном этапе исследования мы выясняли, однообразны ли клинические заключения, полученные при исследовании общего белка в моче беременных альтернативными методами. Содержание общего белка в моче параллельно оценивалось: турбидиметрически - с сульфосалициловой кислотой (диагностический порог - 0,033 г/л [19, 20, 164]), колориметрически - с пирогаллоловым красным (диагностический порог, указанный производителем, -0,120 г/л), методом «сухой химии» – диагностические тест-полоски (диагностический порог - 0,033 г/л). К исследованию привлекались образцы мочи беременных, обратившихся в одну из женских консультаций за трёхмесячный период.
Результаты сопоставляли с клиническим диагнозом амбулаторных карт беременных по параметрам: возраст, наличие или отсутствие диагноза преэклампсия, сроки беременности, давление, отеки. К дальнейшему исследованию привлекались результаты анализа 291 пробы женщин, для которых удалось установить наличие или отсутствие диагноза преэклампсия на момент родоразрешения.
Распределение изученного контингента женщин по срокам беременности и наличию диагноза преэклампсия приведено на рисунке 5. Группу с диагнозом преэклампсия составили 65 женщин (22,3%). Диагноз вызванные беременностью отеки с протеинурией был установлен у 1 беременной (2,5%) из 40 обследовавшихся в триместре, диагноз преэклампсия у 19 женщин (15,5%) из 122 обследовавшихся во триместре и у 46 женщин (35,6%) из 129 обследовавшихся в триместре.
Прежде всего, была проанализирована степень связи между результатами определения общего белка в моче беременных, полученными альтернативными методами. Корреляционный анализ по Спирмену показал, что эта связь крайне слаба (табл. 7). Так, коэффициент Спирмена в парах оценки зависимости метода ССК - ПГК и ССК-ТП не превысил 0,2, в то время как данный показатель для методов ПГК - ТП оказался близким к 0,5.
Так, согласно методу ПГК содержание аналита выше диагностического порога было выявлено в 227 пробах мочи. Согласно же методу ССК содержание белка в этих же пробах в 81,0% случаев не превышало диагностический порог (0,033 г/л). Особенно настораживает то, что метод ССК приводил к отрицательному результату в 63,6% случаев в подгруппе из 66 женщин с диагнозом преэклампсия, у которых диагностический порог был действительно превышен согласно методу ПГК.
Результаты определения содержания общего белка в моче женщин с учетом срока беременности представлены в таблице 9.
При определении общего белка в моче женщин І триместра беременности значения ниже порога чувствительности метода были получены для 34 проб (85,0%) методом ССК, 26 проб (65,0%) методом «сухой химии». Значение содержания общего белка в моче беременных выше диагностического уровня 0,033 г/л были получены для 3 проб (7,5%) методом ССК, 14 проб (35,0%) методом «сухой химии», 20 проб (50,0%) методом ПГК (табл. 9).
В группе женщин без диагноза преэклампсия ІІ триместра беременности значения ниже порога чувствительности метода были получены для 79 проб (64,7%) методом ССК, 66 проб (54,0%) методом «сухой химии». Значение содержания общего белка в моче беременных выше диагностического уровня были получены для 17 проб (13,9%) методом ССК, 27 проб (22,1%) методом «сухой химии», 79 проб (64,7%) методом ПГК. В группе женщин с диагнозом преэклампсия ІІ триместра беременности значения ниже порога чувствительности метода были получены для 15 проб (78,9%) методом ССК, 5 проб (26,3%) методом «сухой химии». Значение содержания общего белка в моче беременных выше диагностического уровня были получены для 3 проб (15,7%) методом ССК, 16 проб (84,2%) методом «сухой химии», 19 проб (100%) методом ПГК.
В группе женщин без диагноза преэклампсия ІІІ триместра беременности значения ниже порога чувствительности метода были получены для 71 пробы (55,0%) методом ССК, 54 проб (41,8%) методом «сухой химии», 0 проб методом ПГК. Значения содержания общего белка в моче беременных выше диагностического уровня были получены для 8 проб (6,2%) методом ССК, 24 проб (18,6%) методом «сухой химии», 62 проб (48,0%) методом ПГК. В группе женщин с диагнозом преэклампсия ІІІ триместра беременности значения ниже порога чувствительности метода были получены для 27 проб (58,6%) методом ССК, 15 проб (32,6%) методом «сухой химии». Значения содержания белка в моче беременных выше диагностического уровня были получены для 10 проб (21,7%) методом ССК, 29 проб (63,0%) методом «сухой химии», 46 проб (100%) методом ПГК.
Анализ полученных данных показал, что заключение об уровне протеинурии беременных существенно отличается в зависимости от использованного метода определения. ПГК-метод позволяет выявить протеинурию у всех беременных с диагнозом преэклампсия, тогда как тест-полоски недооценивают степень протеинурии в 20-30% случаев, а метод ССК – в 50-60% случаев. Вместе с тем специфичность метода ПГК с привлечением пороговых значений, указанных производителем, оказалась достаточно низка. Так в первом триместре беременности доля ложноположительных заключений составляет - 20%, а во втором и третьем - 60-80%.
Оценка влияния матрицы раствора на результат определения содержания цистатина С в образце
Определение общего белка в моче – один из основных скрининговых лабораторных тестов, используемых для диагностики почечной патологии. Поскольку этот вид лабораторных исследований имеет массовый характер, он должен быть простым по технологии, дешевым и поддающимся автоматизации. При всем многообразии известных методов определения общего белка в клинической практике используется ограниченное количество рутинных фотометрических методов. К сожалению, общий белок мочи представляет собой группу разнородных веществ, следовательно, индивидуальные белки обладают различной способностью связывать органические красители. Поэтому белковый состав анализируемой пробы может в определенной степени влиять на результаты определения общего белка.
Дополнительную сложность создает очень выраженный полиморфизм белков, поэтому выбор качественного, чувствительного колориметрического метода и подбор адекватного многокомпонентного калибратора мог бы помочь решить проблему правильности определения общего белка в моче.
Следует уделить особое внимание проблеме клинической интерпретации результатов определения общего белка в моче. До настоящего времени в литературных источниках нет четких и однозначных значений уровня протеинурии здорового человека, в том числе и для контингента беременных.
Уровень протеинурии является одним из основных критериев для постановки диагноза преэклампсия и оценки степени её тяжести. Актуальность данной проблемы обусловлена тем, что преэклампсия остается одним из самых тяжелых осложнений беременности. Преэклампсия встречается у 6–8% беременных в развитых странах и превышает 20% в развивающихся. В России, несмотря на наблюдающееся в последнее десятилетие снижение абсолютного числа родов, частота преэклампсии из года в год увеличивается и достигает 16 -21%. По данным отечественных авторов, преэклампсия занимает 3-е место в структуре летальности беременных, на его долю приходится 15 - 25% случаев материнской смертности. Преждевременные роды при преэклампсии имеют место в 20 - 30% случаев, перинатальная заболеваемость составляет 56%, а перинатальная смертность в 3 - 4 раза превышает популяционную, достигая 12%.
Очевидно, что в настоящее время определение содержания общего белка в моче для диагностики патологии почек, в том числе и у беременных, является недостаточным. Большое внимание в современной лабораторной практике уделяется отдельным белкам-маркерам ренальной патологии.
В связи с этим мы сочли актуальным проведение процедуры валидации наиболее часто используемых методов определения общего белка в моче с установлением диагностически значимых порогов протеинурии для беременных, а также исследование белкового спектра мочи и отдельных белков для оценки риска развития преэклампсии. Нами была проведена работа по изучению особенностей белкового спектра мочи беременных, экскреции с мочой таких белков, как цистатин С и NAG.
Нами была проведена клинико-аналитическая валидация методов определения общего белка в моче с использованием ССК и ПГК, в результате которой были установлены аналитические характеристики данных методов. Оказалось, что рассчитанный согласно рекомендациям ГОСТ-Р-ИСО-11843-2-2007 и IСH предел обнаружения для ССК-метода оказался выше значения 0,033 г/л, на которое указывают как на диагностический порог. Тогда как для ПГК-метода верхняя граница референтного интервала (0,120 г/л согласно рекомендациям производителя) кратно выше предела обнаружения вне зависимости от способа оценки показателя, что позволяет использовать его для определения низких концентраций общего белка в моче. Кроме того данный метод обладает определёнными технологическими преимуществами перед ССК-методом: легко автоматизируем, рабочий реактив заводского производства не требует приготовления, мутность и цвет мочи не влияют на результат определения. В ходе экспериментов мы сравнили результаты определения общего белка в моче при использовании калибраторов с различной представленностью альбуминов и глобулинов. Анализ полученных данных показал, что соотношение между пациентами с различными стадиями нефропатии существенно отличается в зависимости от варианта калибратора. Это приводит к перераспределению между пациентами, отнесенными к группам «норма» и «микропротеинурия»: Alb/G – 40/60 – 37,5% «норма» и 49,2% «микропротеинурия»; Alb/G – 70/30 – 19,5% «норма» и 65,6% «микропротеинурия» соответственно. Вместе с тем изменение состава калибратора не влияет на отнесение пациентов к группе «протеинурия» (13,2% Alb/G – 40/60 и 14,8% Alb/G – 70/30). Очевидно, что полученные результаты можно объяснить высоким сродством к альбумину красителя пирогаллолового красного.
Таким образом, результаты данного исследования указывают на существенную зависимость абсолютных значений результатов измерений от состава калибратора. Следовательно, также можно ожидать и наличие зависимости результатов от качественного состава мочи конкретного пациента. Однако эти различия могут заметным образом влиять на распределение пациентов между группами с нормальным содержанием общего белка и микропротеинурией.
В ходе работы мы сравнили взаимозависимость результатов определения общего белка в моче беременных методами ПГК, ССК, тест-полосок. Регрессионный анализ показал, что взаимосвязь между результатами анализа, выполненного тремя методами, весьма низка. Что находило отражение в рассогласовании отнесения женщин к той или иной категории протеинурии при использовании разных методов.