Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Обзор литературы 12
Глава 2. Материалы и методы 31
2.1 Организация исследования 31
2.2 Дизайн исследования 35
2.3 Клиническая характеристика групп пациентов 37
2.4 Материалы исследования 40
2.4.1 Сыворотки крови 40
2.4.2 Мокрота 40
2.4.3 Вакцинный препарат 40
2.5 Методы исследования 41
2.5.1 Клинические методы исследования 41
2.5.2 Микробиологические методы исследования 44
2.5.3 Иммунологические методы исследования 45
2.5.4 Инструментальные методы исследования 46
2.5.5 Статистические методы 47
Глава 3. Результаты собственных исследований 49
3.1 Течение поствакцинального периода, лабораторные и микробиологические показатели у детей с муковисцидозом и врожденными пороками развития бронхов, привитых против синегнойной инфекции 49
3.1.1 Течение поствакцинального периода 49
3.1.2 Характеристика лабораторных показателей до и после вакцинации 55
3.1.3 Микробиценоз мокроты у детей с нарушением мукоцилиарного клиренса до и после вакцинации 59
3.2 Клинический эффект вакцинации против синегнойной инфекции у детей с муковисцидозом и врожденными пороками развития бронхов 72
3.2.1 Изучение нутритивного статуса и показателей функции внешнего дыхания до и после вакцинации 72
3.2.2 Оценка количества эпизодов острых респираторных инфекций, числа обострений основного заболевания и дополнительных курсов антибактериальных препаратов до и после вакцинации 75
3.3 Особенности поствакцинального иммунного ответа у детей с муковисцидозом и врожденными пороками развития бронхов, инфицированных и неинфицированных P.aeruginosa 78
3.3.1 Уровни IgG-, IgG2- и IgG4-антител к P.aeruginosa у пациентов с нарушением мукоцилиарного клиренса, инфицированных и неинфицированных синегнойной палочкой, до и после вакцинации 80
3.3.2 Поствакцинальный иммунный ответ у детей с муковисцидозом и врожденными пороками развития бронхов 89
3.4 Клинико-иммунологические критерии оценки эффективности вакцинации против синегнойной инфекции у детей с муковисцидозом и врожденными пороками развития бронхов 102
3.4.1 Влияние исходного уровня IgG-, IgG2-, IgG4-антител к P.aeruginosa на их концентрацию и клинические показали после вакцинации у пациентов с нарушением мукоцилиарного клиренса 102
3.4.2 Взаимосвязь генотипа CFTR с концентрацией IgG-, IgG2-, IgG4-антител и клиническими показателями после вакцинации у пациентов с муковисцидозом 106
Обсуждение полученных результатов 111
Выводы 125
Практические рекомендации 127
Список литературы 130
- Организация исследования
- Течение поствакцинального периода
- Уровни IgG-, IgG2- и IgG4-антител к P.aeruginosa у пациентов с нарушением мукоцилиарного клиренса, инфицированных и неинфицированных синегнойной палочкой, до и после вакцинации
- Взаимосвязь генотипа CFTR с концентрацией IgG-, IgG2-, IgG4-антител и клиническими показателями после вакцинации у пациентов с муковисцидозом
Организация исследования
Исследование проводилось в 2013 г. - 2016 г. на базах Федерального государственного бюджетного научного учреждения «Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова» (директор - академик РАН Зверев В.В.) и Федерального государственного автономного учреждения «Национальный научно-практический центр здоровья детей» Министерства здравоохранения Российской Федерации (директор - академик РАН Баранов А.А.).
Тема диссертации утверждена на заседании Учёного Совета ФГБНУ НИИВС им. И.И. Мечникова (г. Москва) 19 ноября 2013 г. протокол №7.
Исследование проводилось согласно протоколу, утвержденному локальным этическим комитетом ФГАУ «ННПЦЗД» Минздрава России, (протокол № 2 от 22 ноября 2013 г.) в соответствии с национальным стандартом Российской Федерации ГОСТ 52379-2005 «Надлежащая клиническая практика» [53]. Вакцинация детей выполнялась с соблюдением этических норм и рекомендаций ВОЗ и Министерства здравоохранения РФ, а также согласно инструкции по применению вакцинного препарата [20].
Исследование являлось одноцентровым, проспективным, рандомизированным, открытым, сравнительным на параллельных группах детей.
Группы пациентов, участвовавших в исследовании, формировались во время прохождения лечения в отделении пульмонологии и аллергологии ФГАУ «ННПЦЗД» Минздрава России (заведующая отделением д.м.н., проф. Симонова О.И.).
Все кандидаты на участие в программе исследования предварительно оценивались согласно критериям включения/невключения.
Критерии включения пациентов в исследование:
возраст от 7 лет до 17 лет 11месяцев 29 дней;
наличие врожденного порока развития бронхов или муковисцидоза;
согласие пациента или его законного представителя на участие в исследовании;
отсутствие острых инфекций с лихорадкой, не вызванных бактериями P.aeruginosa;
отсутствие обострения или декомпенсации хронического заболевания.
Критерии невключения пациента в исследование:
гиперчувствительность к компонентам вакцинного препарата;
отказ пациента или его законного представителя от дальнейшего участия в исследовании (отзыв информированного согласия);
развитие у пациента серьезного нежелательного явления;
выявление у пациента нового сопутствующего заболевания;
необходимость лечения препаратами, способными влиять на действие вакцины и течение поствакцинального периода;
нарушение требований протокола исследования;
решение лечащего врача о прекращении участия пациента в исследовании.
Включение ребенка в исследование проводилось только после подписания информированного согласия его родителем или законным представителем (самим ребенком, в случае достижения им возраста 14 лет).
Наблюдение за пациентами, в том числе до и после проведения вакцинации, осуществлялось исследователем и врачами-пульмонологами отделения пульмонологии и аллергологии ФГАУ «ННПЦЗД» Минздрава России.
Исследование проводилось согласно алгоритму, указанному на рис. 1.
Сбор данных предусматривал:
первичное обследование пациента сразу после включения в исследование;
ведение пациентом дневника самонаблюдения, который выдавался при выписке ребенка из стационара. В дневнике в течение полугода отражалось самочувствие пациента, эпизоды заболевания острой респираторной инфекцией, обострения хронического заболевания, используемые медикаментозные препараты (помимо базисной терапии), в том числе антибактериальные. У невакцинированных детей (группа сравнения) сбор данных проводили на основании изучения медицинской документации;
Оценка течения поствакцинального периода (по результатам общеклинических и лабораторных исследований).
Течение поствакцинального периода
Клиническая переносимость вакцинного препарата характеризуется частотой возникновения местных реакций (боль, гиперемия, отек в месте введения), а также развития системных (общих) реакций. Данные показатели были проанализированы в сроки, предусмотренные дизайном исследования.
Местные реакции
В ходе исследования сильные реакции (3 балла) не были зарегистрированы ни у одного из вакцинированных пациентов. Боль
Боль в месте инъекции регистрировали у детей после 1 (74,5%) и 2 (76,6%) введений (р 0,05) (рис. 3).
После 1 и 2 введения вакцины у детей чаще регистрировали слабовыраженную боль, что достоверно при сравнении с 3, 4 и 5 введениями препарата (р 0,05) (рис. 4).
При оценке болевого синдрома суммарно за все 5 введений препарата выявлено, что боль появлялась у 74,5% пациентов преимущественно через 2 ч; у 80,9% – через 24 ч после введения препарата. Данные различия статистически значимы при сравнении с 5 мин, 30 мин и 48 ч после иммунизации (р 0,05) (рис. 5).
Боль интенсивностью в 1 балл чаще возникала через 30 мин - 23,0%, 2 ч - 36,6% и 24 ч – 22, 6% после вакцинации, что статистически значимо при сравнении с 5 мин и 48 ч после инъекции (р 0,05). Боль в 2 балла чаще регистрировалась через 24 ч после введения препарата – в 11,1% случаев, что достоверно при сравнении с 5 мин, 30 мин, 48 ч после вакцинации (p 0,05) (рис. 6).
Отек мягких тканей в месте инъекции после 1 введения вакцины отмечали у 57% пациентов, а после 2 введения у всех (100%) пациентов. При последующих инъекциях его регистрировали в 29,4% случаев после 5 введения препарата (p 0,05) (рис. 7).
По результатам 5 введений у 10% вакцинированных детей отек мягких тканей в месте введения вакцины появлялся через 5 мин; далее наблюдалась тенденция к нарастанию, и через 2 ч она регистрировалась у всех детей. Затем отмечено снижение частоты появления отека; через 48 ч после введения вакцинного препарата он отмечался только у 20% пациентов (р 0,05) (рис. 9).
У большинства пациентов (90,1%) отек не превышал 25 мм в диаметре (1 балл) (p 0,05). Реакция в 1 балл преобладала над реакцией в 2 балла через 30 мин, 2 ч и 24 ч (p 0,05) после введения вакцины (рис. 10).
Гиперемия
После введения вакцины регистрировали гиперемию интенсивностью 1 балл. Более выраженной реакции не выявлено. Гиперемия кожных покровов в месте инъекции чаще (29,5%) регистрировали после второго введения препарата, однако значимые различия были получены только при сравнении с реакцией после 5 введения вакцины (p 0,05) (рис. 11).
У 29,8% пациентов гиперемия появлялась через 2 ч после инъекции, что достоверно чаще в сравнении с реакцией, возникающей через 5 мин после введения вакцины (p 0,05) (рис. 12).
При сравнении степени выраженности гиперемии, возникающей в месте инъекции, в зависимости от кратности введения препарата и времени наблюдения, достоверных различий не выявлено (p 0,05).
При сравнении переносимости вакцинации у детей с хронической синегнойной инфекцией и без нее, частота выявления местных реакций у данных групп пациентов статистически не различалась.
Системные (общие) реакции
Температурная реакция
У 11 (23,4%) вакцинированных детей через 2 часа после введения вакцины отмечали подъем температуры до 37,50С, и у 4,3% (2 ребенка) отмечали температурную реакцию 380С и 38,50С, соответственно. Во всех случаях длительность подъема температуры не превышала 24 ч и не требовала применения жаропонижающих средств.
Общие симптоматические реакции
В ходе исследования были отмечены реакции в виде головокружения и головной боли у 2 (4,3%) пациентов, получивших первую дозу препарата. Через 8–10 ч данные реакции исчезли без применения медикаментозных средств. Лишь у одного ребенка было отмечено учащение сухого кашля через 4–6 ч после каждого введения вакцины. Длительность наблюдаемых симптомов составила 12 ч.
Уровни IgG-, IgG2- и IgG4-антител к P.aeruginosa у пациентов с нарушением мукоцилиарного клиренса, инфицированных и неинфицированных синегнойной палочкой, до и после вакцинации
Ведущее значение в инфицировании бронхиального дерева различными патогенными микроорганизмами, в том числе P.aeruginosa, у больных МВ и ВПРБ имеет развитие мукостаза вследствие нарушения мукоцилиарного клиренса. Учитывая эту особенность, пациенты с данными заболеваниями внутри группы вакцинированных и группы сравнения были объединены и рассматривались в целом как группа с нарушением мукоцилиарного клиренса.
Уровни IgG-, IgG2-, IgG4-антител к P.aeruginosa у детей с нарушением мукоцилиарного клиренса, вакцинированных и группы сравнения
При анализе исходных уровней IgG-, IgG2-, IgG4-антитела у пациентов без ХСИ I (вакцинированных) и II (сравнения) группы статистически значимых различий не выявлено (р 0,05), (табл. 27).
У пациентов I группы без ХСИ отмечали увеличение уровня IgG-антител через 6 (102,70 у.е.) и 12 (117,87 у.е.) мес., IgG2 (56,44 у.е.) – через 6 мес., что превышало значения аналогичных показателей во II группе (р 0,05). Достоверных различий концентраций IgG4-антител через 6 и 12 мес. как внутри, так и между группами не выявлено (р 0,05) (табл. 27).
При первичном обследовании детей с ХСИ в I группе уровень IgG-антител был выше (181,9 у.е.), чем у пациентов в группе сравнения (71,42 у.е.) (р 0,05) (табл. 28).
Через 6 и 12 мес. после вакцинации в I группе с ХСИ выявлено увеличение уровня IgG-антител до 203,72 у.е. и 222,24 у.е., соответственно (р 0,05). Во II группе с ХСИ значимого изменения исследуемого показателя в указанные сроки не выявлено (р 0,05), его значения были ниже аналогичных в группе вакцинированных детей (р 0,05).
При сравнении исходных уровней IgG2-антител установлено что у пациентов с ХСИ в I группе концентрация данного субкласса антител (170,16 у.е.) была выше, чем во II группе (39,02 у.е.) (р 0,05) и нарастала через 6 и 12 мес. до 209,25 у.е. и 232,5 у.е., соответственно (р 0,05) (табл. 29).
В группе сравнения у пациентов с ХСИ концентрация IgG2-антител в динамике наблюдения не изменялась. Через 6 и 12 мес. значение показателей в группе сравнения были ниже аналогичных в группе привитых детей, составляя 59,58 у.е. и 63,41 у.е. соответственно (р 0,05).
IgG4-антитела при первичном обследовании у больных с ХСИ I группы определяли в концентрации выше (95,58 у.е.), чем у пациентов II группы (34,20 у.е.) (p 0,05) (табл. 30). Через 6 и 12 мес. данный показатель значимо повышался (138,23 у.е. и 175,7 у.е.) по сравнению с исходным (р 0,05).
У детей группы сравнения с ХСИ уровни IgG4-антител не претерпели изменений в динамике наблюдения и регистрировались в значениях ниже, чем в группе привитых через 6 мес. – 36,83 у.е. и через 12 мес. – 72,98 у.е., соответственно (р 0,05).
Уровни IgG-, IgG2- и IgG4-антител к P.aeruginosa у детей с нарушением мукоцилиарного клиренса в зависимости от длительности течения хронической синегнойной инфекции
Согласно литературным данным, у детей с МВ и ВПРБ частота выявления P.aeruginosa увеличивается с возрастом [28, 70, 71]. Следовательно, справедливо предположить, что интенсивность иммунного ответа и образования антител к синегнойной палочке может зависеть от длительности инфицирования указанным патогеном.
Для подтверждения данного предположения у всех детей были определены исходные уровни IgG-, IgG2-, IgG4-антител к смеси антигенов вакцины. Для проведения анализа пациенты с нарушением мукоцилиарного клиренса I и II групп были разделены в зависимости от наличия и длительности хронической синегнойной инфекции (ХСИ) на: неинфицированных P.aeruginosa (без ХСИ) и инфицированных (с ХСИ) от 6 мес. до 1 года, от 1 года до 3 лет и более 3 лет.
Выявлено, что в I группе исходный уровень IgG-антител у пациентов без ХСИ составил 23,41 у.е., что ниже, чем у детей с ХСИ длительностью от 6 мес. до 1 года (133,73 у.е.) и от 1 до 3 лет (194,46 у.е.) (р 0,05) (табл. 31). Аналогичные закономерности были выявлены для концентрации IgG2-антител (30,88 у.е., 55,92 у.е., 139,70 у.е.) и IgG4-антител (30,55 у.е., 122,40 у.е., 144,93 у.е.) (р 0,05) (табл. 31).
Взаимосвязь генотипа CFTR с концентрацией IgG-, IgG2-, IgG4-антител и клиническими показателями после вакцинации у пациентов с муковисцидозом
Учитывая важность влияния генетического фактора у пациентов с МВ на тяжесть клинических проявлений и функциональные особенности иммунной системы, было решено определить зависимость поствакцинальных клинико-иммунологических показателей от генотипа CFTR [21, 135, 155, 158, 159].
Все вакцинированные дети в зависимости от типа мутаций в гене CFTR были разделены на 4 группы:
Группа 1 - гомозиготные по мутации F508del (п=9);
Группа 2 - гетерозиготные по мутации F508del (п=14);
Группа 3 - гетерозиготных по другим мутациям (п=4);
Группа 4 - с неустановленными типами мутаций (п=8).
У пациентов гомозиготных по мутации F508del изменений уровней IgG-, IgG2-, -антител к P.aeruginosa через 6 и 12 мес. после вакцинации по сравнению с исходными не выявлено (р 0,05) (табл. 48).
У детей гетерозиготных по мутации F508del анализ уровней IgG-, IgG2-и IgG4-антител к P.aeruginosa выявил увеличение всех исследуемых показателей через 6 мес. (217,65 у.е., 230,88 у.е., 165,96у.е.), и IgG2-антител (242,50 у.е.) – через 12 мес. (р 0,05) (табл. 50).
Выявленные изменения уровня антител к комплексу антигенов вакцины у пациентов гетерозиготных по мутации F508del сопровождались снижением количества обострений и курсов применяемых антибактериальных препаратов в течение года с 2,17 до 0,67 и с 1,92 до 0,62, соответственно (р 0,05) (табл. 49).
Изучение IgG-, IgG2-, IgG4-антител у пациентов гетерозиготных по другим мутациям показало увеличение концентрации всех исследуемых субклассов иммуноглобулинов через 6 (211,36 у.е., 426,63 у.е., 218,05 у.е., соответственно) и 12 (223,64 у.е., 436,63 у.е., 236,76 у.е., соответственно) мес. после вакцинации (р 0,05) (табл. 51).
Изменений клинических показателей через 12 мес. в данной группе пациентов не зарегистрировано (р 0,05) (табл. 49).
При определении уровней IgG-, IgG2-, IgG4-антител к P.aeruginosa у детей с неустановленным типом мутаций было выявлено повышение только IgG2-антител через 6 (241,46 у.е.) и 12 (220,95 у.е.) мес. после иммунизации (р 0,05) (табл. 52, рис. 45).
Через 12 мес. после вакцинации у пациентов данной группы отмечено снижение количества эпизодов ОРИ с 4,75±1,04 до 2,50±0,59 (p 0,05) (табл. 49).
На современном этапе болезни органов дыхания у детей являются одной из наиболее актуальных проблем педиатрии [3]. В структуре хронических неспецифических заболеваний легких в особую группу можно выделить врожденные пороки развития бронхов и муковисцидоз. В основе патогенеза данных заболеваний лежит мукостаз и снижение функциональной активности бронхов вследствие дефектов развития бронхолегочной системы. Указанные процессы приводят к раннему и интенсивному инфицированию респираторного тракта больных различными возбудителями, накопление которых играет ключевую роль в развитии обострения хронического бронхолегочного процесса [17, 25, 27, 42, 109, 118, 119, 139]. В силу отсутствия этиотропной терапии муковисцидоза и врожденных пороков развития легких основными принципами их лечения являются улучшение мукоцилиарного клиренса и подавление прогрессирования инфекции антибактериальными химиопрепаратами. Однако даже рационально подобранная терапия не всегда позволяет добиться элиминации возбудителей и часто приводит к развитию антибиотикорезистентности микроорганизмов [21, 30, 74, 92, 109]. Сложности, возникающие в ходе лечения болезней органов дыхания, требуют осуществления постоянного поиска новых способов решения данной проблемы.
В последнее время разработаны и успешно применяются на практике иммунобиологические препараты (вакцины), позволяющие усилить эффект антибактериальной терапии и добиться элиминации патогенных микроорганизмов. В работах Рыжова А.А., Краковской А.В., Протасова А.Д. было показано, что применение вакцин против S.pneumoniae и H.influenzae типа b у пациентов с хроническими заболеваниями легких сопровождается элиминацией указанных возбудителей в 71,42%–88,0% и 100% случаев, соответственно [42, 58, 67, 124, 144, 145, 146, 149,]. Таким образом, есть основания предполагать, что вакцинотерапия с использованием препаратов, созданных на основе антигенов других бактерий, например P.aeruginosa, также позволит добиться положительного эффекта в лечении хронической инфекции легких [34, 35, 38, 40, 57].