Содержание к диссертации
Введение
Глава 1 Обзор литературы 15
1.1 Общая характеристика и эпидемиология воспалительных заболеваний кишечника 15
1.2 Спорные вопросы этиологии и патогенеза болезни Крона и язвенного колита 17
1.2.1 Нарушения микрофлоры кишечника 17
1.2.2 Нарушения кишечного барьера 20
1.2.3 Нарушения врожденного иммунитета 21
1.2.4 Нарушения адаптивного иммунитета 23
1.3 Диагностическая и прогностическая значимость нуклеотидных полиморфизмов генов, ассоциированных с воспалительными заболеваниями кишечника 27
1.3.1 Полиморфизмы гена CARD15 28
1.3.1.1 Распространенность полиморфизмов G2722С и 3020insC гена CARD15 31
1.3.1.2 Диагностическая и прогностическая значимость полиморфизмов G2722С и 3020insC гена CARD15 при воспалительных заболеваниях кишечника 32
1.3.2 Полиморфизмы гена TNF- 35
1.3.2.1 Распространенность полиморфизма G308A гена TNF- 36
1.3.2.2 Диагностическая и прогностическая значимость полиморфизма G308A гена TNF- при воспалительных заболеваниях кишечника 37
1.3.3 Частота встречаемости, диагностическая и прогностическая значимость полиморфизма BsmI гена VDR при воспалительных заболеваниях кишечника 39
1.4 Диагностическая и прогностическая значимость индивидуально средовых факторов, ассоциированных с воспалительными заболеваниями кишечника 42
1.4.1 Курение 42
1.4.2 Глистные и паразитарные инвазии 43
1.4.3 Операции на органах брюшной полости 45
1.4.4 Питание 47
1.4.5 Психологические факторы 49
1.5 Современное состояние диагностики и прогнозирования болезни Крона и язвенного колита 50
Глава 2 Материал и методы исследования 56
2.1 Материал исследования 56
2.1.1 Клиническая характеристика обследованных пациентов 57
2.2 Методы исследования 60
2.2.1 Молекулярно-генетическое исследование 60
2.2.1.1 Забор материала и выделение ДНК 60
2.2.1.2 ПЦР-анализ 61
2.2.1.3 Детекция продуктов амплификации 62
2.2.2 Анкетирование 63
2.2.3 Статистический анализ 71
Глава 3 Результаты исследований и их обсуждение 74
3.1 Диагностическая и прогностическая значимость нуклеотидных полиморфизмов генов CARD15, TNF- и VDR при болезни Крона и язвенном колите 74
3.1.1 Диагностическая и прогностическая значимость полиморфизма 3020insC гена CARD15 при болезни Крона и язвенном колите 75
3.1.2 Диагностическая и прогностическая значимость полиморфизма G2722C гена CARD15 при болезни Крона и язвенном колите 81
3.1.3 Диагностическая и прогностическая значимость полиморфизма G308A гена TNF- при болезни Крона и язвенном колите 83
3.1.4 Диагностическая и прогностическая значимость полиморфизма BsmI гена VDR при болезни Крона и язвенном колите 89
3.2 Диагностическая и прогностическая значимость индивидуально средовых факторов при воспалительных заболеваниях кишечника 95
3.3 Индивидуально-средовые особенности клинико-патогенетической реализации генетических факторов при болезни Крона и язвенном колите 101
3.4 Вклад генетических и индивидуально-средовых факторов в инициацию болезни Крона и язвенного колита 103
Заключение 114
Выводы 118
Практические рекомендации 120
Список сокращений 121
Список литературы 122
- Нарушения адаптивного иммунитета
- Современное состояние диагностики и прогнозирования болезни Крона и язвенного колита
- Диагностическая и прогностическая значимость полиморфизма 3020insC гена CARD15 при болезни Крона и язвенном колите
- Вклад генетических и индивидуально-средовых факторов в инициацию болезни Крона и язвенного колита
Введение к работе
Актуальность исследования
Воспалительные заболевания кишечника (ВЗК), а именно, болезнь Крона (БК) и язвенный колит (ЯК), несмотря на разработку современных, высокотехнологичных методов диагностики и лечения, практически во всех странах сохраняют или приобретают тенденцию к увеличению распространенности и заболеваемости, особенно, среди лиц молодого и трудоспособного возраста (Kaplan G.G., 2015; Ng S.C. et al., 2018). При этом отсутствие однозначного представления о причинах и механизмах развития ВЗК затрудняет своевременное установление диагноза БК или ЯК, что, в ряде случаев, приводит к развитию тяжелых осложнений, требующих оперативного вмешательства, и неблагоприятному медико-социальному прогнозу (Zhang Y.Z. et al., 2014; de Lange K.M. et al., 2015). Кроме того, сходство клинических, эндоскопических и лабораторных признаков БК и ЯК обуславливает сложность проведения их дифференциальной диагностики, а также индивидуального прогнозирования клинического течения заболеваний и правильного выбора лечебной тактики (Dulai P.S. et al., 2018). Это, в свою очередь, определяет потребность в совершенствовании традиционных диагностических алгоритмов ВЗК с использованием лабораторных биомаркеров, обладающих клинико-патогенетической, диагностической и прогностической значимостью при БК и ЯК.
Определенные перспективы в повышении эффективности диагностики и прогнозирования риска развития ВЗК появились после расшифровки генома человека. Были выявлены полиморфизмы генов, ассоциированные с клинической реализацией ключевых звеньев патогенеза БК и ЯК, в частности, нарушений врожденного и адаптивного иммунитета, дифференцировки Th17-лимфоцитов, слизистого и эпителиального барьеров кишечника и аутофагии (Zhang J.X. et al., 2014; Aamann L. et al., 2014; Cheng Y. et al., 2015).
Однако имеющиеся данные об особенностях клинической реализации генетических факторов, ассоциированных с развитием ВЗК, полученные в разных странах и даже в разных регионах в пределах одной страны, весьма противоречивы (Lee G.H. et al., 2005; Валуйских Е.Ю., 2008; Chua K.H. et al., 2009; Шумилов П.В., 2010; Насыхова Ю.А. и др., 2010; Liu J.Z. et al., 2015), что препятствует внедрению в клиническую практику молекулярно-генетических методов диагностики БК и ЯК. Возможно, это обусловлено различной распространенностью изучаемых полиморфизмов, а также особенностями их клинической реализации при различных сочетаниях с индивидуально-средовыми факторами.
Степень научной разработанности темы
Первые генетические факторы, ассоциированные с развитием ВЗК, были выявлены в конце XX века, когда у представителей Северной и Западной Европы обнаружили ассоциацию БК с локусом на 16 хромосоме, названного IBD1, а ЯК – с генами HLA (Hugot J.P. et al., 1996; Satsangi J. et al., 1996).
В 2001 году у евреев ашкенази была показана ассоциация полиморфизмов C2104T, G2722С и 3020insC гена CARD15 с нарушениями врожденного иммунитета у пациентов с БК (Hugot J.P. et al., 2001; Ogura Y. et al., 2001). В дальнейшем были выявлены ассоциации полиморфизмов генов IL23R, CARD9, TNFSF15, PTPN2, IL-12B, TNF-, ATG16L1, IRGM с нарушениями адаптивного иммунитета и аутофагии при БК (Duerr R.H. et al., 2006; Rioux
J.D. et al., 2007; Van Limbergen J. et al., 2009), а генов HNF4A, CDH1, LAMB1 – с нарушениями эпителиального барьера при ЯК (UK IBD Genetics Consortium et al., 2009).
В настоящее время благодаря широкомасштабным ассоциативным исследованиям генома человека GWAS и крупным международным проектам в области изучения ВЗК (Prometheus Laboratories Inc., Molecular Genetics Service, UK10K, GENDIA) установлено более 1500 нуклеотидных полиморфизмов, ассоциированных с различными патогенетическими звеньями БК и ЯК (Jostins L. et al., 2012; Liu J.Z. et al., 2015). При этом были выявлены особенности распространенности, диагностической и прогностической значимости большинства полиморфизмов в европейских, американских, восточноазиатских странах, а также в отдельных регионах Российской Федерации (Chua K.H. et al., 2009; Шумилов П.В., 2010; Насыхова Ю.А. и др., 2010; Liu J.Z. et al., 2015). Эти особенности, по мнению некоторых авторов, обусловлены тем, что для развития БК или ЯК недостаточно только наличия соответствующих нуклеотидных полиморфизмов, необходима их фенотипическая реализация, которая возможна при определенных сочетаниях генетических факторов с индивидуально-средовыми (Zhang Y.Z. et al., 2014; de Lange K.M. et al., 2015).
Таким образом, имеющиеся литературные данные убедительно свидетельствуют об ассоциации определенных нуклеотидных полиморфизмов с развитием БК и ЯК. Однако повышению объективности и информативности диагностики ВЗК на основе применения молекулярно-генетических методов препятствуют противоречивые данные, как о распространенности, так и о клинико-диагностической значимости нуклеотидных полиморфизмов, ассоциированных с фенотипической реализацией различных патогенетических звеньев БК и ЯК.
Цель исследования
Установить клинико-лабораторные ассоциации и прогностическую значимость определения нуклеотидных полиморфизмов генов CARD15 (rs5743293, rs2066845), TNF- (rs1800629), VDR (rs1544410) и индивидуально-средовых факторов для оценки риска развития и особенностей клинического течения болезни Крона и язвенного колита.
Задачи исследования
1. Оценить распространенность нуклеотидных полиморфизмов 3020insC и G2722C
гена CARD15, G308A гена TNF- и BsmI гена VDR у пациентов с болезнью Крона и
язвенным колитом.
2. Установить клинико-лабораторные корреляции носительства полиморфизмов
генов CARD15, TNF- и VDR с риском развития и особенностями клинического течения
болезни Крона и язвенного колита.
-
Выявить роль индивидуально-средовых факторов в фенотипической реализации полиморфизмов генов CARD15, TNF- и VDR при воспалительных заболеваниях кишечника.
-
Определить комплексный вклад нуклеотидных полиморфизмов генов CARD15, TNF-, VDR и индивидуально-средовых факторов в прогнозирование риска развития и особенностей клинического течения болезни Крона и язвенного колита.
Научная новизна исследования
Впервые установлены особенности распределения частот аллелей и генотипов нуклеотидных полиморфизмов 3020insC и G2722C гена CARD15, G308A гена TNF- и BsmI гена VDR, ассоциированных с ключевыми звеньями патогенеза воспалительных заболеваний
кишечника, у пациентов с болезнью Крона и язвенным колитом, проживающих на территории Кемеровской области РФ.
Подтверждена клинико-лабораторная корреляция носительства аллеля 3020insC гена CARD15 с повышенным риском развития, тяжелым течением, осложненными фенотипическими вариантами болезни Крона, требующими проведения хирургического лечения. Для язвенного колита данных корреляций не выявлено, так же, как и не подтверждена ассоциация носительства аллеля 2722С гена CARD15 с развитием болезни Крона и язвенного колита.
Впервые показано, что наличие аллеля 308A гена TNF- ассоциировано с более поздним возрастом дебюта болезни Крона и язвенного колита – 44 и 43 года соответственно, тогда как у носителей аллеля G308 – 30 и 34 года соответственно.
Впервые установлена клинико-лабораторная корреляция носительства аллеля В полиморфизма BsmI гена VDR с повышенным риском развития язвенного колита, а также поздним возрастом дебюта и установления окончательного диагноза, тогда как гомозиготное носительство аллеля b обладает протективным эффектом в отношении развития язвенного колита. При болезни Крона носительство аллеля В полиморфизма BsmI показало ассоциацию с локализацией патологического процесса в виде колита (L2).
Впервые установлено, что перенесенные кишечные инфекции, глистные и паразитарные инвазии независимо от носительства аллелей 3020insC гена CARD15, 308A гена TNF- и В полиморфизма BsmI гена VDR не влияют на фенотипическую реализацию болезни Крона и язвенного колита, тогда как курение, при отсутствии ассоциации с данными нуклеотидными полиморфизмами, служит неблагоприятным фактором развития тяжелого течения, осложненных фенотипических вариантов и проведения иммуносупрессивной терапии болезни Крона.
Впервые показано значение комплексной оценки нуклеотидных полиморфизмов генов и индивидуально-средовых факторов, ассоциированных с болезнью Крона и язвенным колитом, в прогнозировании риска развития и особенностей клинического течения данных нозологических форм.
Теоретическая и практическая значимость
Расширено представление о роли нуклеотидных полиморфизмов, ассоциированных с нарушениями врожденного иммунитета – 3020insC и 2722С гена CARD15, вторичного иммунного ответа – G308A гена TNF- и чувствительности рецептора витамина D – BsmI гена VDR в развитии ВЗК. Определены распространенность, клинико-диагностическая и прогностическая значимость полиморфизмов генов CARD15, TNF- и VDR при ВЗК, а также индивидуально-средовые особенности их фенотипической реализации у пациентов с БК и ЯК, проживающих на территории Кемеровской области.
Полученные результаты являются теоретическими предпосылками для разработки способов повышения объективности и информативности клинико-лабораторной диагностики и прогнозирования клинического течения БК и ЯК с использованием молекулярно-генетических технологий.
Внедрение полученных результатов молекулярно-генетических методов диагностики воспалительных заболеваний кишечника в клиническую практику позволит использовать определение нуклеотидных полиморфизмов 3020insC гена CARD15, G308A гена TNF- и BsmI гена VDR в качестве как дополнительных малоинвазивных маркеров верификации БК
и ЯК, так и прогностических факторов риска развития и особенностей клинического течения данных заболеваний.
Положения, выносимые на защиту
-
Носительство аллеля 3020insC гена CARD15, 308A гена TNF- и B полиморфизма BsmI гена VDR ассоциировано с риском развития и особенностями клинического течения болезни Крона и язвенного колита у пациентов, проживающих на территории Кемеровской области.
-
Курение, перенесенные кишечные инфекции, глистные и паразитарные инвазии не ассоциированы с фенотипической реализацией нуклеотидных полиморфизмов 3020insC гена CARD15, G308A гена TNF- и BsmI гена VDR при болезни Крона и язвенном колите у пациентов, проживающих на территории Кемеровской области.
-
Сочетанное определение носительства аллеля 3020insC гена CARD15, аллеля В полиморфизма BsmI гена VDR, курения и наличия перенесенных операций на органах брюшной полости (аппендэктомия, резекции различных отделов кишечника, операции по поводу кишечных свищей и абсцессов) служат неблагоприятными прогностическими факторами риска развития и осложненного фенотипа болезни Крона, тогда как носительство аллеля В полиморфизма BsmI гена VDR – риска развития язвенного колита.
Методология и методы исследования
Методологической основой диссертационного исследования послужили научные труды отечественных и зарубежных авторов в области изучения БК и ЯК, роли генетических и индивидуально-средовых факторов в их развитии. Объект исследования – клиническая лабораторная диагностика и прогнозирование развития ВЗК. Предмет исследования – индивидуально-средовые особенности диагностической и прогностической значимости генетических факторов у пациентов с БК и ЯК, проживающих на территории Кемеровской области.
Методы исследования включали в себя: ретроспективный анализ историй болезней, анкетирование. Молекулярно-генетические исследования были выполнены с использованием высокотехнологичного оборудования.
Степень достоверности и апробация результатов исследования
Степень достоверности результатов исследования определяется достаточно представительной выборкой (231 пациент), адекватными поставленным задачам методами исследования и корректными методами статистической обработки.
Результаты диссертационной работы доложены и обсуждены на межрегиональной научно-практической конференции, посвященной 70-летнему юбилею ГАУЗ КО «Кемеровская областная клиническая больница» (Кемерово, 2014); на III межрегиональной научно-практической конференции «Актуальные вопросы абдоминальной хирургии и онкологии» (Томск, 2014); на межрегиональной научно-практической конференции «Современная лабораторная диагностика: состояние и перспективы», посвященная 60-летнему юбилею ГБОУ ВПО «Кемеровская государственная медицинская академия» (Кемерово, 2015); на межрегиональной научно-практической конференции «Воспалительные заболевания толстой кишки» (Кемерово, 2015); на XXII объединенной Российской гастроэнтерологической неделе (Москва, 2016); на научно-образовательном семинаре Российской гастроэнтерологической ассоциации «Воспалительные заболевания кишечника: школа клинициста» (Кемерово, 2016); на 25-й объединенной Европейской
гастроэнтерологической неделе (Barcelona, 2017); на первом Российском гастроэнтерологическом конгрессе с международным участием «Гастроэнтерология России с рождения до старости (неонатологические, педиатрические, терапевтические, хирургические и медико-социальные аспекты)» (Санкт-Петербург, 2018).
Внедрение результатов исследования в практику
Основные результаты исследования внедрены в клиническую практику гастроэнтерологического отделения ГАУЗ КОКБ Минздрава РФ, научную работу ЦНИЛ и кафедры патологической физиологии, медицинской и клинической биохимии ФГБОУ ВО «КемГМУ» Минздрава РФ и практику учебной работы кафедры клинической лабораторной диагностики с курсом молекулярной медицины ФГБОУ ВО «ПСПбГМУ им. И.П. Павлова» Минздрава РФ.
Личный вклад автора в исследование
Личное участие автора осуществлялось на всех этапах планирования и проведения научной работы. Автором лично разработаны дизайн исследования и научная гипотеза, определена методология исследования, выполнен анализ данных отечественной и зарубежной литературы, медико-биологических и генетических баз данных, анализ историй болезни, анкетирование пациентов, забор материала для проведения молекулярно-генетических исследований, выделение ДНК, полимеразная цепная реакция, электрофоретическая детекция продуктов амплификации, статистическая обработка и анализ полученных данных, а также написание научных статей и самого текста диссертации.
Публикации результатов исследования
По материалам диссертации опубликовано 11 печатных работ, в том числе 4 статьи в журналах, рекомендованных ВАК при Минобрнауки России для публикации материалов диссертаций на соискание ученой степени кандидата медицинских наук.
Объем и структура диссертации
Диссертация изложена на 145 страницах машинописного текста. Состоит из введения, трех глав (аналитического обзора литературы, описания материала и методов исследования, результатов собственных исследований и их обсуждения), заключения, выводов, практических рекомендаций, списка сокращений и списка литературы. Иллюстративный материал представлен 6 рисунками, 35 таблицами. Библиографический указатель включает 228 источников, из них 213 зарубежных.
Нарушения адаптивного иммунитета
Нарушения адаптивного иммунитета при ВЗК обусловлены активностью CD4+ T-лимфоцитов (Th1, Th2, Th17), которыми значительно инфильтрирована слизистая оболочка кишечника [7]. Установлено, что с развитием БК связаны Th1-лимфоциты, характеризующиеся продукцией большого количества IFN-, IL-12p40, IL-18, IL-2, IL-1, IL-6 и TNF-, тогда как с развитием ЯК – Th2-лимфоциты с повышенным образованием IL-4 и IL-13 [7]. При этом несколькими авторами показано, что увеличение количества IL-13, участвующего в активации NKT-клеток микрофлорой слизистой оболочки кишечника, приводит к цитолизу эпителиальных клеток и образованию язв, что определяет длительность течения ЯК [20, 164, 7]. Отмечено, что увеличение продукции IL-13 при ЯК в определенной степени обусловлено носительством полиморфизма С1055T гена IL-13 [209].
Показана клинико-патогенетическая значимость Th17-лимфоцитов, продуцирующих большое количество IL-17А, IL-17F, IL-23, IL-6, IL-21, TNF- при ВЗК [7]. Установлено, что при ЯК Th17-лимфоциты распределяются в собственной пластинке слизистой оболочки кишечника, в то время как при БК – в слизистой, подслизистой и мышечных оболочках, активно поддерживая в каждом из них течение воспалительного процесса [75]. При этом обнаружено, что особенности клинической реализации БК и ЯК обусловлены различными полиморфизмами генов IL-6, IL-1, IL-23A, STAT3, CCR6 и CCL20, ассоциированными с нарушениями дифференцировки и активации Th17-лимфоцитов при ВЗК [37].
В развитии ВЗК отмечена роль IL-21, который увеличивает продукцию воспалительного белка макрофагов (MIP-3, macrophage inflammatory protein) эпителиальными клетками кишечника, усиливающего миграцию CD3+ T-лимфоцитов из крови в пораженную слизистую оболочку; стимулирует секрецию фибробластами большого количества металлопротеиназ MMP-1, -2, -3 и -9 (MMP, metalloproteinases), которые расщепляют компоненты внеклеточного матрикса с развитием деструкции слизистой оболочки и нарушением ее восстановления, что, по мнению некоторых исследователей, приводит к развитию БК и ЯК [217, 163]. Кроме того, стимуляция IL-21 миофибробластов и фибробластов сопровождается увеличением продукции коллагена и других фибротических компонентов, что при глубоком поражении стенки кишечника ведет к их избыточному отложению и образованию стриктур [97, 7].
Нарушения противовоспалительной функции кишечного эпителия при ВЗК связаны со снижением активности регуляторных T-лимфоцитов (Treg, regulatory T cells) и образованием соответствующих цитокинов – TGF-1, IL-10, IL-22, IL-11, IL-35 [192, 151]. При этом генетические факторы, ассоциированные с нарушениями экспрессии этих цитокинов, определяют выраженность клинической реализации ВЗК [25, 127]. В экспериментах на мышах было показано, что отсутствие гена TGF-1 или блокада его рецепторов на Т-лимфоцитах приводит к спонтанному колиту [84]. Однако результаты молекулярно-генетических исследований полиморфизмов гена TGF-1 у человека и их ассоциаций с БК и ЯК у представителей различных стран неоднозначны и противоречивы [195, 125].
Таким образом, механизм развития ВЗК представляет собой сложный, многогранный процесс, в котором задействовано множество этиопатогенетических факторов, перекрывающих и взаимодополняющих друг друга, что схематично можно представить следующим образом: сочетание определенных генетических и индивидуально-средовых факторов приводит к повышению проницаемости кишечного барьера, проникновению бактериальных патогенов в стенку кишки и запуску характерного для БК и ЯК патологического иммунного ответа, и, в конечном итоге, к деструкции слизистой оболочки и развитию осложнений, что еще больше усиливает проницаемость кишечного барьера (Рисунок 1).
При этом каждый фактор патогенеза может выступать как причиной ВЗК, так и следствием нарушений при данных заболеваниях. Это, в свою очередь, не позволяет однозначно определить или исключить какой-либо из этиопатогенетических факторов ВЗК, так как все они взаимосвязаны между собой. Однако, скорее всего, клиническая реализация БК и ЯК является результатом взаимодействия определенных генетических и индивидуально-средовых факторов, ассоциированных с различными звеньями патогенеза ВЗК. При этом, как показано большинством исследователей, клинико-патогенетическая, диагностическая и прогностическая значимость генетических и индивидуально-средовых факторов, ассоциированных с ВЗК, имеет значимые региональные различия у представителей разных стран и даже в пределах одной страны, что препятствует разработке и внедрению молекулярно-генетических методов диагностики, прогноза риска развития и клинического течения БК и ЯК в этих странах и регионах.
Современное состояние диагностики и прогнозирования болезни Крона и язвенного колита
Согласно международным и отечественным клиническим рекомендациям по диагностике и лечению ВЗК, диагноз БК и ЯК устанавливается на основании всесторонней оценки клинической картины заболеваний, данных эндоскопических, гистологических, лучевых и лабораторных методов исследований [5, 6, 137, 83]. При этом однозначные диагностические критерии ВЗК по-прежнему отсутствуют [83, 134]. Клиническая картина ВЗК достаточно неспецифична и включает в себя кишечные симптомы, системные внекишечные проявления и осложнения, симптомы эндотоксемии и метаболические расстройства. При этом для БК кишечные симптомы проявляются болью в животе (77%) – преимущественно в правой подвздошной области и нижних отделах живота в виде колик, диареей (73%), кишечными кровотечениями (22%), свищами и инфильтратами (16%). Перианальные поражения могут встречаться при БК, предшествуя развитию болезни [13].
Частота встречаемости кишечных симптомов при ЯК имеет несколько иной характер: кишечные кровотечения встречаются в 80% случаев, диарея – в 52%, боль в животе – в 47% случаев, с преимущественной локализацией в левой подвздошной области, усиливающаяся перед дефекацией, и анальные трещины – в 4% случаев [13].
Такие симптомы как лихорадка, слабость, снижение массы тела, анемия, тромбоцитоз и лейкоцитоз, в подавляющем большинстве случаев сопровождают манифестацию ВЗК. Анемия у пациентов с ВЗК носит мультифакторный характер и в значительной мере обусловлена кровопотерей [13].
У пациентов с БК и ЯК отмечаются многочисленные симптомы, которые могут быть отражением внекишечных проявлений, осложнений и последствий основного заболевания, а также результатом побочных действий лекарственных средств или манифестацией других сопутствующих заболеваний [13]. Внекишечные проявления при БК и ЯК представлены аутоиммунными проявлениями, связанными и не связанными с активностью заболевания, а также обусловленными длительным воспалением и метаболическими нарушениями [83, 137]. При этом внекишечные проявления ВЗК имеют большую практическую значимость для ранней диагностики и прогнозирования БК и ЯК, так как могут выходить на первый план клинической картины, когда остальные симптомы, в том числе и кишечные, могут либо отсутствовать, либо протекать субклинически, что, в свою очередь, приводит к неадекватному лечению и определяет неблагоприятный прогноз ВЗК [13].
При проведении дифференциальной диагностики ВЗК лабораторные и инструментальные методы обследования часто не могут дать четкого подтверждения или исключения диагноза, что еще дальше отодвигает время его окончательного установления, что приводит к развитию тяжелых осложнений, требующих оперативного вмешательства, а также необходимости проведения длительной, часто пожизненной, дорогостоящей терапии и неблагоприятному медико-социальному прогнозу [65]. Около 15% каждых новых случаев ВЗК имеют диагноз «недифференцированное воспалительное заболевание кишечника», а также почти у 14% пациентов с течением времени происходит смена первоначально установленного диагноза ЯК на БК и наоборот, что, в конечном итоге, приводит к назначению недостаточно корректной и эффективной лечебной тактики [161].
Традиционно используемые клинические, эндоскопические, гистологические и рентгенологические методы диагностики ВЗК, несомненно, обладают определенной диагностической значимостью, позволяют, как правило, подтвердить или отвергнуть диагноз, определить степень активности, локализацию и распространенность воспалительного процесса, осуществлять контроль за течением заболевания и эффективностью проводимого лечения. Однако в большинстве случаев эти методы являются достаточно объективными и информативными только на стадии развития выраженной клинико-морфологической картины заболевания, когда многие профилактические и терапевтические мероприятия оказываются малоэффективными и часто требуется оперативное лечение [138, 119].
Применение таких современных диагностических методов, как ультразвуковое исследование, компьютерная и магнитно-резонансная томография, также оказывается малоэффективным, когда идет речь о ранней диагностике, дифференциальной диагностике или прогнозировании развития ВЗК [200].
Лабораторные методы диагностики ВЗК играют вспомогательную роль при установлении диагноза, оценке активности, прогнозировании клинического течения и эффективности терапии БК и ЯК. В частности, определение C-реактивного белка дает возможность оценить активность ВЗК и эффективность ответа на терапию, но при этом является неинформативным показателем при проведении дифференциальной диагностики БК и ЯК. Выявление фекальных биомаркеров, таких как кальпротектин, лактоферрин, PMN-эластаза, неоптерин и S100A12 позволяет исключить функциональные нарушения кишечника, оценить наличие и степень активности воспаления слизистой кишки, контролировать эффективность терапии и частично определять сроки проведения эндоскопического контроля, однако, ни один из них не позволяет проводить дифференциальную диагностику БК и ЯК [200].
Определенный оптимизм появился в последние годы при внедрении в клиническую практику методов определения серологических биомаркеров, в частности, перинуклеарных антинейтрофильных цитоплазматических антител (pANCA, perinuclear anti-neutrophil cytoplasmic antibodies) и антител к пекарским дрожжам Saccharomyces cerevisiae (ASCA, anti-saccharomyces cerevisiae antibodies), обладающих достаточно высокой чувствительностью и специфичностью [146]. Однако их использование для ранней диагностики и прогнозирования развития ВЗК пока весьма проблематично и имеет в основном вспомогательный характер. Это обусловлено тем, что, хотя pANCA и определяются при ЯК и БК в 50-70% и 10-25% случаев соответственно, в первую очередь их определение было разработано и показано для диагностики различных геморрагических васкулитов и других аутоиммунных заболеваний, также, как и определение ASCA, которые встречаются при БК и ЯК в 55-70% и 10-15% случаев соответственно, а в 1-2% случаев – у здоровых лиц [184, 146].
Поэтому внедрение этих методов в клиническую практику гастроэнтерологических отделений пока не позволило сколько-нибудь значимо повысить эффективность ранней диагностики БК и ЯК и прогнозирования особенностей их клинического течения.
Принципиально новый подход к разработке методов ранней диагностики и прогнозирования развития ВЗК наметился после расшифровки генома человека и последовавшего за этим бурного развития функциональной и клинической геномики. Были выявлены сотни нуклеотидных полиморфизмов, ассоциированных с повышенным риском развития ВЗК в целом, а также с отдельными ведущими патогенетическими факторами БК или ЯК, особенностями их клинического течения и эффективностью лечебно-профилактических мероприятий [66].
Однако повсеместное внедрение в клиническую практику методов генотипирования ВЗК остается проблематичным, что может быть связано с различной распространенностью, диагностической и прогностической значимостью нуклеотидных полиморфизмов генов в разных странах вследствие популяционных особенностей влияния индивидуально-средовых факторов на клиническую реализацию этих полиморфизмов при развитии ВЗК.
Таким образом, анализ литературных данных позволяет заключить, что ясное представление об этиологии и патогенезе ВЗК по-прежнему отсутствует. Это, в свою очередь, препятствует разработке патогенетически обоснованных методов диагностики и прогнозирования риска развития и особенностей клинического течения БК и ЯК. Однако, скорее всего, механизмы развития БК и ЯК обусловлены наличием определенных нуклеотидных полиморфизмов генов, связанных с ключевыми патогенетическими факторами и клинически реализуемые при определенном сочетании их со средовыми факторами. При этом особенности диагностической и прогностической значимости генетических и индивидуально-средовых факторов, ассоциированных с риском развития, клиническим течением и эффективностью терапии ВЗК, имеют значимые различия у представителей разных стран и регионов, что, в свою очередь, препятствует адекватной оценке результатов молекулярно генетического тестирования при проведении диагностики и прогнозирования ВЗК.
Диагностическая и прогностическая значимость полиморфизма 3020insC гена CARD15 при болезни Крона и язвенном колите
Изучение частоты встречаемости аллелей и генотипов нуклеотидного полиморфизма 3020ins гена CARD15 было выполнено у 64 пациентов с БК, 77 пациентов с ЯК и 90 пациентов контрольной группы, проживающих на территории Кемеровской области.
Проведенный сравнительный анализ распространенности полиморфизма 3020insC показал, что частота встречаемости аллеля 3020insC у пациентов с БК была достоверно выше по сравнению с контрольной группой (p 0,001) и пациентами с ЯК (p 0,001) в 4,75 и 6,3 раз соответственно, тогда как у пациентов с ЯК практически не отличалась от таковой в контрольной группе – 3% и 4% соответственно. Носительство аллеля 3020insC более чем в 5,5 раз повышало риск развития БК (ОШ=5,62; 95% ДИ: 1,84-17,22), тогда как не было ассоциировано с риском развития ЯК (ОШ=0,8; 95% ДИ: 0,18-3,66) (таблица 9).
Полученные результаты подтверждают клинико-патогенетическую значимость носительства аллеля 3020insC в развитии БК, при котором снижается эффективность распознавания рецептором NOD2 бактериальных патогенов, что влечет за собой снижение внутриклеточной бактерицидности, возникновение хронической внутриклеточной инфекции и, в конечном итоге, как показано J.P. Hugot и Y. Ogura с соавторами, развитие БК [99, 162].
Показано, что имеются гендерные особенности клинико-патогенетической значимости аллеля 3020insC при развитии БК, но не ЯК – у женщин отмечалась тенденция к более высокой частоте встречаемости данного аллеля по сравнению мужчинами (67% и 33% соответственно, p=0,06) (таблица 10).
Показано, что носительство аллеля 3020insC гена CARD15 ассоциировано со степенью тяжести клинических проявлений БК, а именно, у пациентов-носителей аллеля 3020insC тяжелая атака БК встречалась в 1,85 раз достоверно чаще по сравнению с пациентами, не имеющими данный аллель – 55,5% и 30% соответственно, что в 2,8 раз увеличивало риск развития тяжелой степени клинических проявлений БК (ОШ=2,85; 95% ДИ: 1,59-5,1; p=0,005) (таблица 12).
Показано, что аллель 3020insC гена CARD15 ассоциирован с различными фенотипическими вариантами БК. Частота аллеля 3020insC была в 5 раз достоверно выше в объединенной группе пациентов с осложненными формами БК – пенетрирующими и стенозирующими (p=0,04) по сравнению с пациентами с люминальными (воспалительно-инфильтративными) формами (таблица 12).
Носительство аллеля 3020insC гена CARD15, особенно среди женщин, в 3,8 раза увеличивало риск развития осложненных вариантов течения БК по сравнению с пациентами, не имеющими данный аллель (ОШ=3,8; 95% ДИ: 1,99-7,4). При этом у гомозиготных носителей аллеля были только осложненные варианты БК (р=0,3), тогда как у гетерозиготных – осложненные и неосложненные формы встречались в соотношении 3:1 (рисунок 2).
Полученные результаты свидетельствуют, с одной стороны, о клинико-патогенетической, диагностической и прогностической значимости аллеля 3020insC гена CARD15 в развитии, по крайней мере, некоторых вариантов БК, а с другой – о генетической гетерогенности фенотипических вариантов БК.
У пациентов с ЯК достоверно значимые различия между носительством аллеля 3020insC гена CARD15 и особенностями клинического течения заболевания отсутствовали.
Достоверно значимых различий между носительством аллеля 3020insC гена CARD15 и необходимостью проведения гормональной (преднизолон) и иммуносупрессивной терапии (азатиоприн) у пациентов с БК и ЯК установлено не было. Обнаружено, что носительство аллеля 3020insC гена CARD15 ассоциировано с необходимостью проведения хирургического лечения при БК. У пациентов-носителей аллеля 3020insC оперативное вмешательство проводилось в 2 раза чаще по сравнению с пациентами, не имеющими данный аллель – 83% и 43,5% соответственно (р=0,008) (таблица 12). При этом носительство аллеля 3020insC в 6,5 раз увеличивало риск проведения хирургического лечения по сравнению с пациентами, не имеющими данный аллель, особенно у женщин (ОШ=6,48; 95% ДИ: 3,36-12,5), тогда как мужчины-носители в 100 % случаев имели оперативное вмешательство по сравнению с мужчинами, не имеющими аллель 3020insC (р=0,04).
Полученные результаты клинико-лабораторных корреляций носительства аллеля 3020insC гена CARD15 с развитием осложненных (пенетрирующих и стенозирующих) фенотипических вариантов и необходимостью проведения оперативного вмешательства БК дополнительно подтверждаются тем, что аллель 3020insC показал тенденцию к наличию ассоциации с перенесенными операциями на органах брюшной полости (включая аппендэктомию, резекции различных отделов кишечника, операции по поводу кишечных свищей и абсцессов) в сроки от шести и более месяцев до установления окончательного диагноза. Пациенты-носители аллеля 3020insC гена CARD15 в 1,6 раз чаще имели в анамнезе операции на органах брюшной полости до установления окончательного диагноза БК по сравнению с пациентами, не имеющими данный аллель – 61% и 37% соответственно (р=0,07) (таблица 12).
У пациентов с ЯК не было выявлено достоверно значимых различий между носительством аллеля 3020insC гена CARD15 и необходимостью проведения оперативного вмешательства.
Результаты клинико-диагностической и прогностической значимости полиморфизма 3020insC гена CARD15 при БК и ЯК у пациентов, проживающих на территории Кемеровской области существенно отличаются от восточноазиатских стран (Японии, Кореи и Китая), где данный аллель отсутствует вне зависимости от наличия БК и ЯК, тогда как совпадают с большинством европейских стран (Бельгия, Шотландия, Ирландия, Финляндия, Греция) и другими регионами Российской Федерации, включая СевероЗападный регион и Московскую область, где аллель 3020insC также ассоциирован с риском развития, осложненными фенотипическими вариантами и оперативным лечением БК и не ассоциирован с риском развития, особенностями клинического течения и необходимостью проведения хирургического вмешательства ЯК (таблица 13).
Вклад генетических и индивидуально-средовых факторов в инициацию болезни Крона и язвенного колита
Для оценки комплексного вклада генетических и индивидуально-средовых факторов в развитие БК и ЯК, а также определения клинико-диагностической и прогностической значимости данных факторов при ВЗК нами был использован метод логистического регрессионного анализа. Используя метод пошагового включения предикторов и расчета отношения правдоподобия были оценены сочетания аллелей генов-кандидатов, ассоциированных с нарушениями врожденного иммунитета – 3020insC гена CARD15, вторичного иммунного ответа – 308A гена TNF- и чувствительности рецептора витамина D – В полиморфизма BsmI гена VDR, ассоциированных с БК и ЯК, а также индивидуально-средовых факторов, включая пол, возраст, возраст дебюта заболевания, курение, отягощенный наследственный анамнез по ВЗК, перенесенные кишечные инфекции (сальмонеллез, эшерихиоз, дизентерия и пищевые токсикоинфекции), глистные и паразитарные инвазии (описторхоз, аскаридоз, токсокароз и жиардиаз), а также операции на органах брюшной полости (аппендэктомия, резекции различных отделов кишечника, операции по поводу кишечных свищей и абсцессов). При этом были выбраны три наиболее значимые регрессионные модели, две из которых предсказывают риск развития БК и ЯК, и модель, прогнозирующая развитие осложненных фенотипических вариантов БК.
В состав модели прогноза развития БК были включены наиболее значимые предикторы – носительство аллелей 3020insC гена CARD15, В полиморфизма BsmI гена VDR и перенесенные операции на органах брюшной полости, развития ЯК – носительство аллеля В полиморфизма BsmI гена VDR, возраст пациента и перенесенные операции на органах брюшной полости (таблица 34).
Общие характеристики полученной прогностической модели развития БК свидетельствуют о ее эффективности: значение 2 Пирсона составило 29,2 (p=0,002), диагностическая чувствительность – 66%, диагностическая специфичность – 65%, диагностическая эффективность теста – 71,7%, площадь под ROC-кривой AUC – 0,72 [0,64–0,81], что соответствует уровню хорошего классификатора (рисунок 3А).
Общие характеристики полученной прогностической модели развития ЯК свидетельствуют о ее эффективности: значение 2 Пирсона составило 17,6 (p=0,001), диагностическая чувствительность – 63%, диагностическая специфичность – 68%, диагностическая эффективность теста – 64%, площадь под ROC-кривой AUC – 0,70 [0,60–0,76], что соответствует уровню хорошего классификатора (рисунок 3Б).
Кроме того, сочетание носительства аллеля В полиморфизма BsmI гена VDR, перенесенных операции на органах брюшной полости, глистных и паразитарных инвазий показало прямую зависимость с возрастом пациента (рисунок 4), тогда как при его отсутствии – данной корреляции не отмечается (значения Y2 0,47) (рисунок 5).
В состав модели прогноза развития осложненных фенотипических вариантов БК было включено носительство аллеля 3020insC гена CARD15, 308А гена TNF-a, наличие перенесенных операций на органах брюшной полости и курение (таблица 35).
Таким образом, применение метода логистического регрессионного анализа с целью установления роли генетических и индивидуально-средовых факторов в прогнозировании риска развития и особенностей клинического течения ВЗК еще раз подтвердило значение аллеля 3020insC гена CARD15 и перенесенных операций на органах брюшной полости в развитии БК. Кроме того, полученная модель комплексного вклада нуклеотидных полиморфизмов генов и индивидуально-средовых факторов, ассоциированных с развитием БК, показала достоверно значимую ассоциацию носительства аллеля В полиморфизма BsmI гена VDR с развитием БК (OШ=2,57; 95% ДИ: 1,17-5,46), что, скорее всего, отражает клинико-патогенетическую значимость ген-средового, а также ген-генного взаимодействия при развитии БК. Полученная модель прогнозирования риска развития осложненного течения БК показала значимость только индивидуально-средовых факторов, а именно, перенесенных операций на органах брюшной полости и курения, тогда как носительство аллеля 3020insC гена CARD15, в сочетании с данными средовыми факторами, не обладает значимой предсказательной ценностью в оценке клинического течения БК.
Для ЯК наиболее значимыми предикторами развития заболевания послужили носительство аллеля В полиморфизма BsmI гена VDR и возраст пациента, тогда как перенесенные операции на органах брюшной полости продемонстрировали протективный эффект в развитии заболевания.
Клинический пример 1.
Пациентка С., 41 год, пол – женский.
Диагноз – болезнь Крона с поражением тонкой кишки и илеоцекальной области, хроническое рецидивирующее течение, тяжелая форма, осложненная множественными стенозами тонкой кишки. Состояние после оперативного лечения – резекции сегмента подвздошной кишки от 2009 года, стеноз илеотрансверзоанастомоза, срединная лапаротомия с иссечением спаек от мая 2015 года, релапаротомия, адгезиолизис от сентября 2015 года, резекция сегмента подвздошной кишки, наложение концевой илеостомы от ноября 2015 года.
Возраст первых клинических проявлений заболевания – 35 лет, время между дебютом заболевания и установлением окончательного диагноза БК составило 6 лет. В 2009 году по поводу выраженного болевого синдрома в правой подвздошной области была экстренно госпитализирована в хирургическое отделение с диагнозом острый аппендицит, взята на операцию. В процессе операции в правой подвздошной области было обнаружено опухолевидное образование – выполнена правосторонняя гемиколэктомия с резекцией большого сальника, наложен илеотрансверзоанастомоз. Клинически не исключен рак слепой кишки. По результатам патоморфологического исследования: гистологическая картина соответствует хроническому язвенному колиту с абсцессами и рубцовыми изменениями в стенке и брыжейке кишки. Вторичный аппендицит. В лимфатических узлах брыжейки и мезоаортальных лимфатических узлах иммунный ответ по смешанному типу.
Затем пациентка была выписана с диагнозом язвенный колит, принимала сульфасалазин 3 г/сут курсами 2 раза в год при появлении симптомов кишечной диспепсии, на фоне приема состояние улучшалось. В конце марта 2015 года обратилась к проктологу с жалобами на появление слизи в кале. Выполнена ирригоскопия: состояние после правосторонней гемиколэктомии с наложением илеотрансверзоанастомоза, хронический колит, подозрение на объемное образование правой половины брюшной полости.
В апреле 2015 года пациентка была доставлена в стационар с выраженным болевым абдоминальным синдромом и подозрением на острую кишечную непроходимость, получала консервативное лечение, выписана с улучшениями. В мае 2015 года вновь усиление болевого абдоминального синдрома, доставлена в хирургический стационар с диагнозом острая спаечная кишечная непроходимость. Выполнена срединная лапаротомия с иссечением спаек. Была выписана с подозрением на болезнь Крона и обтурационную кишечную непроходимость. Консультирована колопроктологом в июле 2015 года – выставлен диагноз болезнь Крона, назначен сульфасалазин 2 г/сут.
Последнее ухудшение в сентябре 2015 года: вновь с выраженным болевым синдромом была госпитализирована с диагнозом острая спаечная тонкокишечная непроходимость, по поводу чего была проведена лапаротомия, адгезиолизис и дренирование брюшной полости трубкой. Через месяц вновь появилась схваткообразная боль в области эпигастрии и по правому фланку живота, жидкий стул и потеря массы тела. По результатам фиброколоноскопии: состояние после правосторонней гемиколэктомии, наложения илеотрансверзоанастомоза, язвенный анастомозит, подозрение на болезнь Крона с поражением тонкой кишки. По результатам патоморфологического исследования выявлен хронический эрозивный колит умеренной степени выраженности, рентгенологического исследования пассажа бария по кишечнику – стеноз дистальных отделов подвздошной кишки и зоны анастомоза с признаками интермиттирующей тонкокишечной непроходимости, ультразвукового исследования органов брюшной полости – деформация желчного пузыря, признаки, соответствующие проявлениям воспалительного характера в петлях кишечника. В связи с неэффективностью проводимой консервативной терапии пациентке было выполнено оперативное лечение в объеме резекции сегмента подвздошной кишки, наложения концевой илеостомы.