Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Матриксные металлопротеиназы и их тканевые ингибиторы у больных опухолями костей (обзор литературы) 13
1.1. Матриксные металлопротеиназы и их тканевые ингибиторы. Классификация, общая характеристика, функции 13
1.2. Роль матриксных металлопротеиназ и их тканевых ингибиторов в канцерогенезе 18
1.3. Матриксные металлопротеиназы и их тканевые ингибиторы у больных с опухолями различной локализации 27
1.4. Матриксные металлопротеиназы и их тканевые ингибиторы у больных с опухолями костей 31
Глава II. Материалы и методы исследования 39
2.1. Характеристика больных опухолями костей 39
2.2. Специальные лабораторные методы исследования 45
2.3. Определение содержания исследуемых маркеров 46
2.4. Статистические методы анализа 48
Глава III. Собственные исследования 50
3.1. Содержание ММП-7 в сыворотке больных опухолями костей и в контроле 50
3.2. Содержание ММП-2 в сыворотке больных опухолями костей и в контроле 58
3.3. Содержание ММП-9 в сыворотке больных опухолями костей и в контроле 67
3.4. Содержание ТИМП-1 в сыворотке больных опухолями костей и в контроле 75
3.5. Содержание ТИМП-2 в сыворотке больных опухолями костей и в контроле 83
3.6. Взаимозависимости между концентрациями белков ММП-2, 7, 9 и ТИМП-1, 2, в сыворотке крови больных опухолями костей 90
Глава IV. Выживаемость больных опухолями костей с учетом содержания ММП и ТИМП в крови 93
4.1. Общая и безрецидивная выживаемость больных ЗОК 93
4.2. Выживаемость больных ЗОК в зависимости от гистологического строения опухоли 94
4.2.1. Выживаемость больных ОС в зависимости от основных клинических факторов 94
4.2.2. Выживаемость больных ХС в зависимости от основных клинических факторов 101
4.2.3. Выживаемость больных СЮ в зависимости от основных клинических факторов 103
4.3. Показатели выживаемости больных ЗОК в зависимости от уровней ММП 2, 7, 9 и ТИМП-1, 2 в сыворотке крови 104
4.3.1. Выживаемость больных ЗОК в зависимости от содержания ММП-2 в сыворотке крови 104
4.3.2. Выживаемость больных ЗОК в зависимости от содержания ММП-7 в сыворотке крови 109
4.3.3. Выживаемость больных ЗОК в зависимости от содержания ММП-9 в сыворотке крови 113
4.3.4. Выживаемость больных ЗОК и ГКО в зависимости от содержания ТИМП-1 в сыворотке крови 114
4.3.5. Выживаемость больных ЗОК в зависимости от содержания ТИМП-2 в сыворотке крови 116
4.4. Многофакторный анализ связи отдаленных результатов лечения больных ЗОК с основными клиническими факторами и уровнями маркеров ММП-2, 7, 9 и ТИМП-1, 2 118
Обсуждение полученных результатов 121
Выводы 128
Практические рекомендации 129
Список условных сокращений 130
Список использованной литературы 131
- Матриксные металлопротеиназы и их тканевые ингибиторы. Классификация, общая характеристика, функции
- Содержание ММП-7 в сыворотке больных опухолями костей и в контроле
- Выживаемость больных ОС в зависимости от основных клинических факторов
- Многофакторный анализ связи отдаленных результатов лечения больных ЗОК с основными клиническими факторами и уровнями маркеров ММП-2, 7, 9 и ТИМП-1, 2
Матриксные металлопротеиназы и их тканевые ингибиторы. Классификация, общая характеристика, функции
Семейство ММП (общее название матриксины) представляет собой более 20 секретируемых или связанных с поверхностью клетки цинк-зависимых эндопептидаз, которые способны к деградации практически всех компонентов ВКМ [123, 183].
Впервые активность ММП была обнаружена в коллагеназе хвоста головастика, подвергшегося метаморфозе.
В структуре всех ММП выделяют пропептидный и каталитический домены, регулирующие протеолитическую активность пептидаз. У ряда ММП, помимо вышеназванных общих зон, в молекуле имеются гемопексин-подобный, фибронектин-связывающий, трансмембранный и другие домены, совокупность которых определяет субстратную специфичность связывания пептидазы с компонентами ВКМ, клеточными поверхностями и ингибиторами ММП [40]. ММП классифицируются в зависимости от структурно-функциональных особенностей и субстратной специфичности. Основными подсемействами ММП являются коллагеназы широкого спектра действия, желатиназы/специфические коллагеназы коллагена IV типа, стромелизины, матрилизины (ММП-7, ММП-26), ММП мембранного типа, а также другие ММП [196, 199].
Коллагеназы широкого спектра действия включают: ММП-1, -8, -13, - 18. Ключевая особенность этих ферментов - их способность разрывать промежуточные коллагены I, II и III на определенном участке в три четверти от N-окончания. Коллагеназы могут также переработать множество других молекул типа КМ и ВКМ.
Желатиназы/специфические коллагеназы коллагена IV типа (желатиназа А - ММП-2 и желатина В - ММП-9). Эти ферменты легко перерабатывают денатурированные коллагены, желатины [27]. ММП-2 перерабатывают тип I, II и III коллагенов [158]. Изменения в организме человека, вызванные отсутствием активного ММП-2 связаны с автосомальной удаляющейся формой мультицентрического остеолизиса, редкое генетическое нарушение, которое вызывает разрушение и растворение костей [126]. Это позволяет предположить, что у людей ММП-2 важен для остеогенеза.
Стромелизины (ММП-3 и ММП-10) оба имеют схожие особенности субстрата, но у ММП-3 протеолитическая эффективность выше, чем у ММП- 10. Помимо переработки компонентов ВКМ, ММП-3 активизирует большое количество проММП.
Матрилизины (матрилизин 1 - ММП-7 и матрилизин 2 - ММП-26) характеризуются отсутствием гемопексиновой области. Матрилизин 1 (ММП-7) и матрилизин 2 (ММП-26) [192] также называют эндометазами [155].
ММП мембранного типа. Существует шесть мембранных типов ММП (МТ-ММП): четыре типа I трансмембранные белки (ММП-14, ММП-15, ММП-16, ММП-24) и два - гликозилфосфатидилинозитол (GPI) якорные белки (ММП-17 и ММП-25) [196, 199]. За исключением МТ4-ММП они все способны к активации проММП-2. Эти ферменты могут также преобразовать множество молекул ВКМ, а МТ1-ММП проявляют коллагенолитическую активность на коллагены типа I, II и III [150]. МТ1-ММП также играет важную роль в ангиогенезе [161]. МТ5-ММП - специфичен для мозга, и главным образом выявлен в мозжечке [176]. МТ6-ММП (MMП-25) находится почти исключительно в периферических лейкоцитах крови и в анапластических астроцитомах и глобацитомах, но не в менингомах [194].
Другие ММП. К этой группе относят семь ММП, которые не относятся ни к одной из выше названных категорий. Металлоэластаза (ММП-12) главным образом находится в макрофагах [177] и играет важную роль в их перемещении [178]. Кроме того, эластин обрабатывает множество других белков. ММП-19 был идентифицирован при помощи cDNA, клонированием из печени [160] и как аутоантиген Т-клеток у пациентов с ревматоидном артритом [105]. Энамелизин (ММП-20), который обрабатывает амелогенин, прежде всего, находится в пределах недавно сформированной эмали зуба. Несовершенный амелогенин, генетическое расстройство, вызванное формированием дефектной эмали, происходит из-за мутаций гена ММП-20 на участках раскола [112]. ММП-22 был сначала клонирован из фибробластов цыпленка [206], а затем был выявлен его гомолог у человека.
ММП-23 главным образом экспрессируется в репродуктивных тканях [194]. У этого фермента нет выключателя цистеина. Этот фермент принято считать мембранным белком типа II, защищающим трансмембранную область в N-терминальной части пропептида. Поскольку он имеет механизм распознавания фурина в пропептиде, он расщепляется в Гольджи в виде активного фермента во внеклеточное пространство [159].
Последнее дополнение к семейству ММП - эпилизин, или ММП-28, главным образом продуцируется в кератиноцитах. Его образцы, найденные в неповрежденной и поврежденной коже, дают возможность сделать предположение, что ММП-28 возможно функционирует в гемостазе ткани и при заживлении ран [119, 125].
Протеолитическая активность ММП может регулироваться на разных уровнях: экспрессия генов, компартментализация, превращение из зимогена в активный фермент и, наконец, с помощью специфических ингибиторов.
ММП могут быть активированы протеиназами или in vitro различными химическими агентами [138], такими как тиол-модифицирующие агенты (ацетат 4-аминофенилмеркурата, HgCl2, и N-этилмалеимид), окисленный глутатион, кислород связывающие агенты. Низкий рН-фактор и термообработка также могут привести к активации ММП. Эти агенты с большой вероятностью действуют через цинк-цистеиновое взаимодействие цистеинового окончания [41]. Исследования активации проММП-3 при помощи соединений ртути показали, что первичный разрыв происходит внутри пропептида, и что эта реакция является скорее внутримолекулярной, чем межмолекулярный. Последующее удаление остальной части пропептида происходит из-за межмолекулярной реакции сформировавшихся промежуточных звеньев [151]. Исследования Z.Gu et al. (2002) показали, что NO активизирует проММП-9 при мозговой ишемии, реагируя с тиол-группой цистеинового окончания и формирует S-нитролизованную производную, что является демонстрацией химической активации проММП в живых организмах [75].
Протеолитическая активация ММП во многих случаях является пошаговой [138]. Начальная протеолитическая атака происходит на выставленную область петли между первой и второй спиралью пропептида. Специфика разрыва в области приманки продиктована последовательностью, найденной в каждом ММП. Удаление части пропептида, вероятно, дестабилизирует оставшийся пропептид, включая притяжение цинк-окончания цистеина, которое позволяет осуществить межмолекулярную обработку частично активизированного интермедиата ММП или других активных ММП [137]. Таким образом, заключительный шаг в активации производится ММП.
Ключевым этапом в регулировании активности MMП является превращение профермента в активный протеолитический фермент путем протеолитического удаления про-домена. Существует несколько протеиназ, которые опосредуют активацию MMП, такие как плазмин, фурин или активные MMП [183]. После активации MMП-2, -3, -7, -9 и -12 могут запускать сигнал отрицательной обратной связи, например, путем разрушения плазминогена и, таким образом, воздействуя на преобразование плазминогена в активный плазмин. Эта сложная регуляция активности ММП необходима, учитывая, что протеиназная активность, высвобождаемая из воспалительных клеток, может привести к повреждению тканей и сохранению воспалительного ответа при хронических воспалительных заболеваниях и онкологических заболеваниях [156]. Также ММП могут запускать аутокринную обратную связь, деградируя несколько физиологических ингибиторов протеиназ, которые ингибируют протеолитическое превращение ММП, включая 1-химотрипсин, 1-протеиназы ингибитор и 2-антиплазмин. Некоторые pro-MMП также могут быть преобразованы другими MMП. Другой физиологический ингибитор 2-макроглобулин, как правило, ингибирует активность MMП, но также может быть деградирован несколькими MMП, что продлевает функцию MMП.
Функция ММП in vivo зависит от локального баланса между ними и их физиологическими ингибиторами. Значительные энергетические ресурсы человеческого организма затрачиваются для предотвращения нерегулируемого внеклеточного протеолиза ММП и других протеиназ. Например, высокие концентрации универсального ингибитора протеаз 2-макроглобулина, 1-протеиназы ингибитора и 1-химотрипсина продуцируются в печени и высвобождаются в плазму, где эти молекулы эффективно связываются с активным участком различных протеиназ [200]. Полученные комплексы ингибиторов протеиназ затем распознаются рецептором-поглотителем и быстро поглощаются макрофагами. Наиболее важными физиологическими ингибиторами функции ММП являются ТИМП, которые также могут экспрессироваться в опухоли [51]. ТИМП-1, 2, 3, 4 образуют 1:1 стехиометрические комплексы с активными ММП, что приводит к ингибированию протеолитической активности [134]. ТИМП участвуют в управлении локальной активностью ММП в тканях, причем ТИМП ингибируют весь спектр ММП.
Содержание ММП-7 в сыворотке больных опухолями костей и в контроле
Исследовали концентрации ММП-7 в сыворотке крови больных опухолями костей (n=128) и в контроле (n=28) (таблица 7).
Концентрации ММП-7 в сыворотке крови больных опухолями костей не отражали характер опухолевого процесса.
За пороговое значение нами принято содержание ММП-7, равное верхнему квартилю показателя маркера в группе контроля (2,7 нг/мл). Частота повышенных относительно контроля уровней ММП-7 равнялась 80% (16 из 20) - у больных ГКО и 75% (81 из 108) - у больных ЗОК.
Исследовали связь уровней ММП-7 в контроле и у больных опухолями костей с возрастом обследованных. Не установлена зависимость между уровнями ММП-7 в крови с возрастом в контроле (rs=0,32; p=0,1) и при ГКО (rs=0,27; p=0,3), но она была статистически значимой у больных ЗОК (rs=0,39; p=0,0001).
В таблице 8 представлены уровни ММП-7 в сыворотке крови больных и в контроле с учетом возраста. В контрольной группе наименьшие уровни ММП-7 выявлены у доноров до 40 лет (1,4 нг/мл), а наибольшие – в группе 50-59 лет (2,4 нг/мл), различия не достоверны. В группе больных ЗОК старше 40 лет выявлены значимо большие концентрации ММП-7.
У больных ЗОК до 18 лет частота обнаружения повышенных концентраций ММП-7 была наименьшей и составила 64,1% (25 из 39), как и в возрасте 18-29 лет (64%, 16 из 25), повышалась до 80% у больных в возрасте от 30 до 39 лет (8 из 10) и также была высокой у пациентов более старшего возраста (94,1%; 32 из 34). У больных ГКО число повышенных уровней ММП-7 было наименьшим в возрасте до 30 лет (62,5%; 5 из 8), равнялась 83,3% (5 из 6) – у пациентов 30-39 лет и 100% - у более старших пациентов. Таким образом, у больных ГКО и ЗОК старше 40 лет чаще выявляли повышенные относительно контроля значения ММП-7.
Установили достоверно большее содержание ММП-7 у взрослых мужчин (медиана 3,5 нг/мл), по сравнению с детьми мужского пола (медиана 2,8 нг/мл) (таблица 9). Многофакторный анализ уровней ММП-7 в группе ЗОК показал значимую связь показателя только с возрастом пациентов (р=0,0001).
Выявлена достоверная связь уровней ММП-7 в крови больных опухолями костей с их гистологическим строением (таблица 10): наименьшие значения маркера обнаружены при саркоме Юинга (2,8 нг/мл), а наибольшие – при ГКО (3,9 нг/мл).
Изучили концентрации ММП-7 в сыворотке крови больных опухолями костей в зависимости от гистологического строения опухоли в разных возрастных группах (таблица 11). Многофакторный анализ обнаружил, что уровни ММП-7 в сыворотке крови больных опухолями костей статистические достоверно связаны как с возрастом (р=0,0002), так и с гистологическим типом опухоли (p 0,0001).
В группе больных ЗОК достоверно меньшая концентрация ММП-7 обнаружена у больных с опухолью в малоберцовой кости (1,9 нг/мл), по сравнению с локализацией опухоли в бедренной (3,6 нг/мл) и плечевой (3,6 нг/мл) костях, в крестце (3,7 нг/мл) (таблица 12). Таким образом, нами обнаружены различия в уровнях ММП-7 в сыворотке крови больных ЗОК, которые достоверно связаны с локализацией опухоли в костях скелета.
Не обнаружено достоверных различий в содержании сывороточной ММП-7 при анализе типа пораженной опухолью кости в обеих группах (таблица 13).
Более высокие концентрации ММП-7 характерны для больных с поражением губчатой кости при всех гистологических вариантах строения опухоли (таблица 14).
Многофакторный анализ показал, что концентрации ММП-7 в сыворотке крови статистически достоверно (р=0,028) зависели от гистологического строения опухоли и не зависели от такого фактора как тип пораженной кости (р=0,3).
Анализировали связь уровней ММП-7 в крови больных ЗОК с учетом клинико-рентгенологической стадии процесса и критериев системы TNM (таблица 15).
Не установлено значимой связи концентраций сывороточного ММП-7 от стадии опухолевого процесса у больных ЗОК (табл. 15). Таблица 15. Содержание ММП-7 в сыворотке крови больных ЗОК в зависимости от стадии заболевания
Рассчитали концентрации ММП-7 в сыворотке крови больных ЗОК в зависимости от стадии и гистологического строения опухоли (таблица 16). Все наблюдаемые различия в группах были статистически незначимы.
Многофакторный анализ показал, что возраст пациентов в большей степени оказывал влияние на концентрации сывороточной ММП-7 (р=0,02), чем гистологическое строение опухоли (р=0,5) и стадия заболевания (р=0,97).
Не установлено корреляционной зависимости между концентрацией ММП-7 и наибольшим размером опухоли как в группе больных ГКО (r=-0,18; p 0,05), так и в группе больных ЗОК (r=-0,13; p 0,05).
При ХС выявлена обратная зависимость между наибольшим размером опухоли и концентрацией сывороточной ММП-7 (r=-0,77; p 0,016). У больных СЮ зависимость была прямой, но не достоверной (r=0,34; p 0,05). В группе больных ОС кости связь между размером опухоли и концентрацией сывороточной ММП-7 отсутствовала.
Исследовали связь концентраций ММП-7 в сыворотке крови в зависимости от степени дифференцировки опухоли. Значимых различий в уровне маркера ММП-7 между группами не выявлено (G1 - 3,6 нг/мл, G2 - 3,4 нг/мл, G3-G4 - 3,4 нг/мл).
Многофакторный анализ показал, что возраст наибольшим образом оказывал влияние на концентрацию сывороточной ММП-7 у больных ЗОК (р=0,02), тогда как остальные факторы были незначимо связаны с уровнями маркера (p 0,05).
Подводя итоги анализа содержания ММП-7 в сыворотке крови больных ГКО и ЗОК следует отметить, что:
достоверно большие концентрации сывороточного ММП-7 выявлены у больных как ГКО, так и ЗОК по сравнению с контролем (медианы 3,7, 3,4 и 2,1 нг/мл соответственно); установлено незначимое повышение медиан концентраций ММП-7 в сыворотке крови здоровых доноров при увеличении их возраста (с 2,1 по 2,5 нг/мл). Аналогичная зависимость выявлена и у больных ЗОК с 2,9 до 7,4 нг/мл;
наименьшая медиана содержания ММП-7 выявлена в группе больных СЮ (2,8 нг/мл), а наибольшая - у больных ГКО (3,9 нг/мл);
значимо меньшая медиана ММП-7 установлена при злокачественном поражении малоберцовой кости (1,9 нг/мл);
уровни ММП-7 в сыворотке крови не зависели от стадии заболевания, степени дифференцировки опухоли, а также гистологического типа пораженной кости у больных ЗОК;
многофакторный анализ показал, что концентрации ММП-7 в сыворотке крови достоверно зависели от возраста больных ЗОК (р=0,02).
Выживаемость больных ОС в зависимости от основных клинических факторов
В таблице 52 представлены показатели общей и безрецидивной выживаемости больных ЗОК в зависимости от гистологического строения опухоли.
Как следует из данных, приведенных в таблице 52, наилучшие результаты лечения больных ЗОК отмечены в группе больных ХС – все 28 больных были живы в момент проведения исследования при наибольшем сроке наблюдения 114 мес. Наихудшие отдаленные результаты лечения отмечены в группе больных СЮ с медианой срока жизни 44,8 мес, 10-летняя общая выживаемость равнялась 29,7±22,4%. В группе больных ОС медиана срока жизни равнялась 126 мес, а 10-летняя общая выживаемость составила 68,0±10,5%. Различия статистически значимы (р=0,021). Группы больных недифференцированной плеоморфной саркомой кости и хордомой были малочисленны и не были включены в сравнительный анализ по показателям отдаленных результатов лечения.
Безрецидивная выживаемость больных ЗОК также значимо зависела от морфологического строения опухоли (р=0,032). Так, если у больных ХС медиана безрецидивной выживаемости не была достигнута на всем сроке наблюдения, то у больных ОС она составила 26,5 месяцев. Наименьшие показатели отметили у больных саркомой Юинга – 19,0 месяцев.
Показатели 10-летней безрецидивной выживаемости в указанных группах составили: 59,2±18,3%, 28,5±10,1% и 0% соответственно (рисунок 7).
Таким образом, гистологическое строение опухоли значимо определяло показатели отдаленных результатов лечения 105 прослеженных больных ЗОК, вошедших в данное исследование. Однако сопоставление частоты выявления разных стадий в группах больных ЗОК, сгруппированных по диагнозу, показало высокозначимые различия (р 0,001) (рисунок 8). Так, половина прослеженных больных ХС были с I стадией опухолевого процесса, тогда как в группах больных ОС и СЮ I стадия выявлена только в 3,5% и 7,1% наблюдений соответственно.
Рассчитанная 5-летняя общая выживаемость 17 больных ЗОК в общей группе равнялась при I стадии 92,3±7,4%, снижалась до 81,7±6,0% - при II стадии (n=72) и до 59,7±15,9% - при IV стадии (n=15) (р=0,08; рисунок 9). Показатели 5-летней безрецидивной выживаемости в общей группе больных ЗОК составили при I стадии - 60,8±12,7%, при II стадии – 40,5±8,6% с медианой длительности ремиссии 50,7 мес, а при IV стадии – 0% c медианой длительности ремиссии всего 14,1 мес (р=0,15).
Степень дифференцировки опухоли также была значимо связана с отдаленными результатами лечения больных ЗОК. Так, в группе из 31 больных с G1-G2 5-летняя общая выживаемость составила 100%, но снижалась до 38,5±27,7% в группе 77 больных с G3-G4 (р=0,035). Показатели 5-летней безрецидивной выживаемости равнялась в указанных группах 78,1±10,3% и 25,8±19% соответственно (р=0,009).
Многофакторный анализ связи общей выживаемости с диагнозом, стадией заболевания и степенью дифференцировки опухоли у больных ЗОК в общей группе показал, что длительность жизни значимо определяла только стадия (р=0,047) и степень дифференцировки опухоли (р=0,013). В то же время вклад всех факторов в длительность ремиссии больных ЗОК был незначим при учете степени дифференцировки опухоли (p=0,09), стадии процесса (р=0,1) и морфологического строения диагноз (р=0,49).
В дальнейшем анализ связи общей и безрецидивной выживаемости с клиническими факторами проводили отдельно в группах больных ОС, ХС СЮ. Следует отметить, что 3 больных с НПС кости и 3 больных хордомой были в IIb стадии, анализ связи результатов их лечения с клиническими факторами не проводили.
Многофакторный анализ связи отдаленных результатов лечения больных ЗОК с основными клиническими факторами и уровнями маркеров ММП-2, 7, 9 и ТИМП-1, 2
Многофакторный анализ с включением в модель только уровней изучаемых маркеров, измеренных в сыворотке крови больных ЗОК, показал, что снижение общей выживаемости пациентов в наибольшей степени определяли повышенные сывороточные концентрации ТИМП-2 (р=0,05) и ТИМП-1 (р=0,063) и в меньшей степени повышенные значения ММП-7 (р=0,17) и сниженные значения ММП-2 (р=0,24) (таблица 72).
Многофакторный анализ с включением в модель только уровней изучаемых белков показал, что снижение безрецидивной выживаемости больных ЗОК в наибольшей степени определяли повышенные уровни ТИМП-1 (р=0,059) и ММП-7 (р=0,12) (таблица 73).
При включении в модель основного прогностического фактора при саркомах костей - стадии заболевания и морфологического варианта строения опухоли - закономерности, определенные для белков ТИМП-1, 2 в прогнозе заболевания были значимы и сопоставимы с таковыми для стадии заболевания (р=0,011) (таблица 74).
В то же время указанные факторы слабее отражали прогноз безрецидивной выживаемости при многофакторном анализе (таблица 75).
Таким образом, при ведении больных ЗОК определение белков ММП-2, 7 ,9 и ТИМП-1, 2 в сыворотке крови до начала лечения может служить дополнительным фактором в оценке прогноза заболевания. Все изучаемые белки в той или иной степени имеют прогностическое значение, при этом выявленные закономерности были различны для общей и безрецидивной выживаемости при разных вариантах гистологического строения опухолей костей.