Содержание к диссертации
Введение
РАЗДЕЛ 1. Обзор литературы 17
1.1. Современные представления о структуре и этиопатогенезе патологических состояний щитовидной железы, сопровождающихся гипертиреозом 17
1.2. Эндотоксин грамнегативной флоры и его возможная роль в патогенезе гипертиреоза .24
1.3. Эндотоксиннейтрализующие системы организма .32
1.4. Современные представления о полиморфизме CD14 рецепторов моноцитов 38
РАЗДЕЛ 2. Материалы и методы исследования 43
2.1. Протокол исследования: дизайн исследования, критерии включения в исследование, разделение больных на группы, клиническая характеристика групп 43
2.2. Определение ЭТ-связывающего потенциала моноцитов и гранулоцитов периферической крови 46
2.3. Определение уровней антиэндотоксиновых антител классов А, М и G 47
2.4. Определение уровня секреторных антиэндотоксиновых антител класса A .48
2.5. Определение уровней сывороточных иммуноглобулинов классов А, М и .49 2.6 Определение уровня секреторных иммуноглобулинов класса A 50
2.7. Метод изучения C(-159)T полиморфизма гена СD14 рецепторов моноцитов 51
2.8. Определение С-реактивного белка 51
2.9. Методы статистического анализа исследуемых показателей 52
РАЗДЕЛ 3. Клеточные эндотоксинсвязывающие системы у больных с гипертиреозом 55
3.1. Клеточные эндотоксинсвязывающие системы у больных с гипертиреозом различной степени тяжести 55
3.2. Клеточные эндотоксинсвязывающие системы у больных с гипертиреозом различной длительности течения .56
3.3. Клеточные эндотоксинсвязывающие системы у больных с гипертиреозом и патологией сердца 57
3.4. Клеточные эндотоксинсвязывающие системы у больных с гипертиреозом и эндокринной офтальмопатией .57
РАЗДЕЛ 4. Содержание специфических антиэндотоксиновых антител и сывороточных иммуноглобулинов у больных с гипертиреозом 59
4.1. Антительные эндотоксинсвязывающие системы у больных с гипертиреозом различной степени тяжести .59
4.2. Антительные эндотоксинсвязывающие системы у больных с гипертиреозом различной длительности течения 60
4.3. Антительные эндотоксинсвязывающие системы у больных с гипертиреозом и патологией сердца 62
4.4. Антительные эндотоксинсвязывающие системы у больных с гипертиреозом и эндокринной офтальмопатией 4.5. Содержание сывороточных иммуноглобулинов и секреторных иммуноглобулинов класса А у больных с гипертиреозом различной степени тяжести .65
4.6. Содержание сывороточных иммуноглобулинов и секреторных иммуноглобулинов класса А у больных с гипертиреозом различной длительности течения 66
РАЗДЕЛ 5. Содержание секреторных антиэндотоксиновых антител класса а у больных с гипертиреозом
5.1. Содержание секреторных антиэндотоксиновых антител класса А у больных с гипертиреозом различной степени тяжести 69
5.2. Содержание секреторных антиэндотоксиновых антител класса А у больных с гипертиреозом различной длительности течения .70 5.3. Содержание секреторных антиэндотоксиновых антител класса А у больных с гипертиреозом и патологией сердца 70
5.4. Содержание секреторных антиэндотоксиновых антител класса А у больных с гипертиреозом и эндокринной офтальмопатией 71
Раздел 6. C(-159)t полиморфизм гена сd14 рецепторов моноцитов у больных с гипертиреозом 73
Раздел 7. Оценка показателя с-реактивного белка у больных с гипертиреозом 77
Раздел 8. Роль дисбаланса антительных и клеточных эндотоксинсвязывающих систем в развитии рецидива у больных с гипертиреозом 80
8.1 Антительные эндотоксинсвязывающие системы у больных с наличием рецидива тиреотоксикоза .83
8.2. Клеточные эндотоксинсвязывающие системы у больных с наличием рецидива тиреотоксикоза .84
8.3. Дискриминантный анализ показателей антительных и клеточных эндотоксинсвязывающих систем у больных с наличием рецидива тиреотоксикоза 87
Обсуждение результатов 90
Заключение .101
Перечень условных сокращений 104
Список используемой литературы
- Эндотоксин грамнегативной флоры и его возможная роль в патогенезе гипертиреоза
- Определение уровней антиэндотоксиновых антител классов А, М и G
- Клеточные эндотоксинсвязывающие системы у больных с гипертиреозом различной длительности течения
- Антительные эндотоксинсвязывающие системы у больных с гипертиреозом различной длительности течения
Введение к работе
Актуальность темы
Гипертиреоз – это состояние, обусловленное повышенным содержанием тиреоидных гормонов (тироксина (Т4) и трийодтиронина (Т3)) в крови вследствие их избыточного синтеза в самой щитовидной железе (ЩЖ) или в эктопически расположенной тиреоидной ткани. 90 % всех случаев гипертиреоза приходится на болезнь Грейвса, известную также как диффузный токсичный зоб (ДТЗ).
В России заболеваемость ДТЗ в различных регионах страны составляет от 20 до 50 случаев на 100 000 населения. Наиболее высокая заболеваемость в Северо-Западном регионе России, Республике Крым. При этом болеют преимущественно женщины (1:3-1:10) трудоспособного возраста 20-50 лет (Калинин А.П., 2011).
В ближайшие годы специалистами прогнозируется тенденция к увеличению количества патологии ЩЖ, в том числе и ДТЗ (Андреев М.М., 2013).
Учитывая важную роль аутоиммунных механизмов в патогенезе ДТЗ, перед учёными различных специальностей стоит важная задача изучения интегральных факторов формирования и самоподдержания поражения ЩЖ. Ведущая роль в патогенезе ДТЗ принадлежит дисбалансу иммунной системы, который приводит к нарушениям иммунного контроля за формированием аутоантител, что и лежит в основе аутоиммунного поражения клеток ЩЖ (Ванушко В.Э., Фадеев В.В., 2013). Роль триггерного фактора, индуцирующего и поддерживающего аутоиммунный процесс при ДТЗ, по нашему мнению, может выполнять эндотоксин (ЭТ) грамотрицательной флоры. ЭТ по своей химической структуре является липополисахаридом (ЛПС), состоящим из гидрофобного липида А, гидрофильного ядра и полисахарида. В условиях патологии он является мощным индуктором провоспалительных цитокинов. Также известно, что ЭТ является классическим поликлональным активатором В-лимфоцитов и плазматических клеток, синтезирующих широкий спектр аутоантител (Raetz C.R., Whitfield C., 2002). При избыточном поступлении ЭТ во внутреннюю среду организма и недостаточности эндотоксинсвязывающих систем (ЭСС) развивается эндотоксиновая агрессия, которая по своей сути является предболезнью и может классифицироваться как универсальный общепатологический фактор инициации и прогрессирования многих распространенных заболеваний и синдромов (как инфекционного, так и неинфекционного генеза) (Яковлев М.Ю., 2011). Действие ЭТ определяется состоянием клеточных и гуморальных ЭСС, направленных на его нейтрализацию, изучение которых может дать более полное представление о процессах, которые происходят в организме больных ДТЗ.
У больных с гипертиреозом создается ряд условий для избыточного проникновения ЭТ в системный кровоток. Так, по данным Маковийчук А.А. (2002 г.) известно, что у 75 % больных ДТЗ нарушается нормальный состав микрофлоры толстого кишечника. Важным является также факт наличия у больных ДТЗ заболеваний пародонта, в частности пародонтита, частота которого может доходить до 83 %. Важным этиологическим фактором пародонтита являются потенциальные источники ЭТ – грамнегативные микроорганизмы (Actinobacillus actinomycetemcomitans, Bacteroides forsythus, Prevotella intermedia, Prevotella melanogenica, Fusobacterium nucleatum, Veillonella parvula), среди которых особое значение имеет Porphyromonas gingivalis , , 2014; , , 2013; Зангиева М.Э., 2014). Наличие данных бактерий на фоне нарушения местного иммунитета ротовой полости открывает путь к хронической эндотоксемии. Гемодинамические расстройства, возникающие у больных с гипертиреозом вследствие нарушений ритма (в частности фибрилляции предсердий (ФП)), приводят к
нарушению кровоснабжения кишечника, повышению содержания в нем патогенной грамотрицательной микрофлоры и увеличению проницаемости кишечной стенки для ЭТ (Мазур Е.С., Егорова Е.Н., Кинах Т.А. 2012). Факторами, способствующими нарушению ЭСС у больных с гипертиреозом могут быть: нарушения функции печени (при тяжёлой форме болезни развивается т.н. тиреотоксический гепатоз, который наблюдается у 76 % больных ДТЗ (Сулейманова А.С., 2013); стресс, обусловленный адренергическим свойствами тиреоидных гормонов (вызывает дополнительный сброс портальной крови по шунтам минуя печень в общую гемоциркуляцию) (Яковлев М.Ю., 2011); тионамиды, назначаемые больным с гипертиреозом на длительный период времени, обладают иммуносупрессивным действием (Панькив В.И., 2013).
Комплексного изучения ЭСС на системном и мукозальном уровнях, генетического полиморфизма CD14 рецепторов моноцитов, отвечающих за детекцию ЭТ сигнала при гипертиреозе в доступной литературе не найдено.
Учитывая вышеизложенное, научное исследование состояния клеточных и антительных ЭСС при гипертиреозе позволит, по нашему мнению, раскрыть новые механизмы патогенеза аутоиммунного воспаления при данной патологии и оптимизировать при этом лечебные и профилактические рекомендации.
Цель работы
Оптимизировать прогноз рецидива у больных с гипертиреозом на основании изучения особенностей клеточных и антительных эндотоксинсвязывающих систем, генетического C(-159)T полиморфизма CD14 рецептора моноцитов.
Задачи исследования:
-
Изучить ЭТ-связывающий потенциал моноцитов и гранулоцитов периферической крови у больных с гипертиреозом.
-
Изучить показатели специфических антиэндотоксиновых антител и сывороточных иммуноглобулинов у больных с гипертиреозом.
-
Изучить изменения показателей секреторных антиэндотоксиновых антител (анти-ЭТ-sIgА) и секреторных иммуноглобулинов (sIgA) у больных с гипертиреозом.
-
Изучить частоту аллелей и аллельных сочетаний полиморфного участка C(-159)T гена CD14 рецептора моноцитов у больных с гипертиреозом.
-
Изучить уровень СРБ и его взаимосвязь с показателями эндотоксинсвязывающих систем у больных с гипертиреозом.
-
Изучить взаимосвязь изменений клеточных и антительных эндотоксинсвязывающих систем с риском рецидивов у больных с гипертиреозом.
Научная новизна
В работе изучены уровни антиэндотоксиновых антител классов A, G, M (анти-ЭТ-IgG, анти-ЭТ-IgM, анти-ЭТ-IgA), а также ЭТ-связывающий потенциал моно- и полинуклеаров периферической крови при гипертиреозе в зависимости от сроков течения и степени тяжести заболевания. Представлены данные о состоянии антительных и клеточных ЭСС у больных ДТЗ с патологией сердца (дисгормональная кардиомиопатия (ДКМП) с ФП и ИБС) и эндокринной офтальмопатией (ЭОП). В работе получены данные о частоте C(-159)T полиморфизма гена CD14 рецепторов моноцитов у больных ДТЗ в популяции жителей Республики Крым. Также обоснована целесообразность определения у больных ДТЗ C(-159)T полиморфизма гена СD14 рецепторов моноцитов, состояния антительных и клеточных ЭСС для прогноза его течения. На основании выявленных
особенностей ЭСС у больных ДТЗ разработан способ определения вероятности его рецидива.
Практическая значимость работы
Результаты исследований улучшают понимание роли дисбаланса клеточных и антительных ЭСС в формировании аутоиммунного воспаления при ДТЗ, дополняют понимание патогенетической сущности этого заболевания. Использование разработанного способа определения вероятности рецидива гипертиреоза позволяет объективно оценить вероятность такого рецидива и выбрать оптимальную профилактическую и лечебную тактику.
По материалам диссертации оформлен патент Украины на полезную модель «Способ прогнозирования рецидива диффузного токсического зоба» (№ 86808 от 10.01.2014).
Положения, выносимые на защиту
-
У больных с гипертиреозом выявлен дисбаланс клеточных и антительных ЭСС.
-
Снижение уровня секреторных антиэндотоксиновых антител класса А (анти-ЭТ-sIgА) наблюдалось в группе больных с тяжёлым гипертиреозом, с длительностью течения заболевания более 5 лет, у больных с гипертиреозом, патологией сердца и ЭОП.
-
У больных с гипертиреозом, вызванным ДТЗ в крымской популяции выявлена более высокая частота Т аллели и аллельного сочетания ТТ в полиморфном локусе C(-159)T гена CD14 рецепторов моноцитов, чем у здоровых доноров.
-
На основании выявленных с помощью дискриминантного анализа взаимосвязей между показателями ЭСС и риском возникновения рецидива у больных с гипертиреозом, вызванным ДТЗ, разработан метод прогнозирования его рецидива, точность которого составляет 84,4%.
Внедрение результатов работы в практику
Результаты исследования внедрены в лечебно-диагностический процесс терапевтического отделения «Сакского территориального медицинского объединения» (акт внедрения от 11.11.2014 г.), в отделение эндокринно-метаболической и сердечнососудистой патологи «ГУ УНЛК КГМУ им. С.И. Георгиевского» г. Симферополя (акт внедрения от 10.11.2014 г.), в учебно-лечебный процесс кафедры клинической иммунологии и аллергологии с секцией медицинской генетики НМУ имени Богомольца (акт внедрения от 02.04.2014 г.), в учебно-лечебный процесс кафедры клинической, лабораторной иммунологии и аллергологии НМАПО имени П.Л. Щупика (акт внедрения от 02.04.2014 г.), в учебно-лечебный процесс кафедры терапии медицинского института БФУ имени Эммануила Канта (акт внедрения от 13.09.2013 г.).
По результатам проведенных исследований получен патент на полезную модель: Белоглазов В.А. Патент № 86808 Украина, № заявки u2013 08991. Способ прогнозирования рецидива диффузного токсического зоба / В.А. Белоглазов, Ю.Ю. Кулагина, А.И. Гордиенко, М.В. Гаспарян. - 17.07.2013. – Бюл. – 2014.-№ 1.
Апробация работы
Диссертация апробирована на заседании Ученого совета кафедр внутренней
медицины № 1, внутренней медицины № 2, внутренней медицины № 3, пропедевтики внутренней медицины, терапии и семейной медицины ФПО, а также кафедры фтизиатрии и пульмонологии ГУ «Крымский государственный медицинский университет имени С.И. Георгиевского» (протокол № 3 от 15 декабря 2014 г.).
Основные результаты исследований доложены и обсуждены на открытой научно-
практической конференции «Клиническая эндотоксинология: итоги 10-летних
исследований и дальнейшие перспективы» (Симферополь, 2010 г.); 10-ом Украинском
биохимическом съезде (Одесса, 2010 г.); Конгрессе Европейской Академии Аллергологии
и Клинической Иммунологии (Копенгаген, 2014 г.); научно-практической конференции с
международным участием «Медикаментозная аллергия: междисциплинарные подходы к
диагностике, лечению и профилактике» (Евпатория, 2013 г.);II Всероссийском конгрессе с
участием стран СНГ «Инновационные технологии в эндокринологии» (Москва, 2014 г.).
Публикации
По материалам диссертации опубликовано 14 научных работ. Из них в зарегистрированных в ВАК Украины изданиях – 9: научно-медицинских журналах Украины – 6 (в моноавторстве 1), в сборниках научных трудов – 1 (в моноавторстве), в сборниках материалов и тезисов конференций – 2. В изданиях России – 4: научно-медицинских журналах, зарегистрированных в ВАК России –3, в сборниках тезисов конференций – 1.
Структура и объем диссертации
Диссертация изложена на 125 страницах машинописного текста и состоит из вступления, обзора литературы, восьми разделов, которые отображают результаты собственных исследований, выводов, практических рекомендаций и списка литературы на 20 страницах включающий 167 источников: 71 – отечественных, 96 – зарубежных). Работа содержит 23 таблицы и 8 рисунков.
Эндотоксин грамнегативной флоры и его возможная роль в патогенезе гипертиреоза
К предрасполагающим факторам развития ДТЗ относятся: наследственность, инфекция, стресс, роды. При изучении антигенов главного комплекса гистосовместимости было выявлено, что чаще всего ДТЗ сочетается с носительством гена HLA-B8. У больных этот ген встречается в 2 раза чаще, чем у здоровых. Также было доказано, что наличие HLA-Dw3 и HLA-DR3 увеличивает риск этого заболевания в 3,86 и 5,9 раза соответственно по сравнению с геном HLA-B8. Современные исследования также установили частое сочетание ДТЗ с генами HLA – DQA1 0501. Найдена ассоциация ДТЗ с полиморфными маркерами D6S2414 D6S1271, расположенными на 6 хромосоме среди генов главного комплекса гистосовместимости; с полиморфным маркером Ala17Thr гена сериновой эстеразы цитотоксических Т-лимфоцитов и гаплотипом Gm иммуноглобулинового гена; гена, кодирующего белок тирозин фосфатазу -22 (PTPN22), известного также как CD152; гена секреторного утероглобинсвязывающего белка 1 (SCGB3A2); гена кластера дифференцировки лимфоцитов CD40; гена ТГ и рецептора ТТГ. Международный консорциум по генетике патологии ЩЖ после анализа более 700 пар сибсов с аутоиммунными повреждениями ЩЖ не подтвердил значимость связи ни одного из описанных локусов с развитием ДТЗ [46,48,60,87,108,121,152].
Среди провоцирующих ДТЗ факторов внешней среды также подозревают инфекцию. Соединяясь с белками мембраны тироцита, вирусы образуют иммунные комплексы, которые атакуются антителами. Т.о. нарушается структура белка отдельных участков мембраны и, следовательно, изменяются её антигенные свойства. Антигены некоторых вирусов и бактерий обладают сходством с белками организма [104,119,144]. Поэтому антитела против них, могут перекрестно реагировать с собственными белками организма. Сейчас изучается ассоциация энтеровирусов, эритровируса В19 и герпесвируса 7 типа с аутоиммунными заболеваниями ЩЖ [104,119]. Следующий провоцирующий фактор – это стресс. Это объясняется тем, что стресс сопровождается повышенным синтезом кортизола, а глюкокортикоиды подавляют активность регуляторных Т-лимфоцитов. В результате аутореактивные лимфоциты могут в полной мере проявить свою активность [2,26,48,54,60,101]. Важную роль в развитии ДТЗ отводят половым стероидам. Частота ДТЗ у женщин почти в 10 раз выше, чем у мужчин. Прогестерон усиливает продукцию цитокинов Т-хелперами 2-го типа, что активирует синтез аутоантител В-лимфоцитами. Т.о., влияние женских половых гормонов отвергать нельзя, но в механизмах такого влияния многое остаётся не ясно. Также известно, что гипертиреоз часто развивается после родов, и его возникновение коррелирует с увеличением титра тиреостимулирующих аутоантител. Это считается проявлением «феномена отдачи», т.е. усиления иммунных реакций после их длительного подавления во время беременности. Важным фактором, провоцирующим ДТЗ, также является избыток йода. Известно, например, что избыточно йодированный ТГ более иммуногенен. Компенсация дефицита йода часто сопровождается так называемой йодиндуцированной болезнью Грейвса [46,48,60].
Патогенез ДТЗ рассматривается в настоящее время с позиций аутоиммунного заболевания. Впервые иммунный генез этого заболевания установили Адамс и Пурвес в 1956 году. Они установили, что у больных ДТЗ в сыворотке крови содержится так называемый LATS фактор — long-acting thyroid stimulator (тиреоидный стимулятор длительного действия). Было выявлено, что он является иммуноглобулином, наблюдается лишь у 45-50 % больных ДТЗ и не коррелирует с тяжестью тиротоксикоза. Эти данные говорят о том, что не только LATS участвует в развитии ДТЗ [36,48,60,62]. В настоящее время выделяют два вида аутоантител к рецептору ТТГ гипофиза (АТ-рТТГ или TRAb (thyroid receptor antibodies)). Это TSAb - антитела, стимулирующие ЩЖ, и TBAb - антитела, блокирующие ЩЖ. Повышенная функция ЩЖ при ДТЗ объясняется образованием стимулирующих антител к рецептору ТТГ. Эти антитела обладают качеством агонистов ТТГ, т.е. увеличивают выработку тиреоидных гормонов. Сейчас проводятся исследования, направленные на поиск антигена, к которому при ДТЗ образуются тироидстимулирующие антитела. Moshkelgosh и коллеги доказали, что, первичным аутоантигеном в развитии ДТЗ является A субъединица рецептора ТТГ. Для определения уровня АТ-рТТГ используют методы, получившие название TBI (TSH-binding inhibition-ингибирование связывания ТТГ), основанные на конкурентном ингибировании связывания ТТГ, меченного I125, с рТТГ. Антитела, выявляемые с помощью этого метода, обозначаются как TBII (TSH-binding inhibitory immunoglobulins – иммуноглобулины, ингибирующие связывание с ТТГ). Методы 1-го поколения это иммуноферментный анализ (используется свинной рецептор ТТГ и меченный I125 бычий ТТГ) и радиорецепторный анализ (используется свинной рецептор ТТГ и меченный I125 бычий ТТГ). К методам 2-го поколения относится радиорецепторный анализ с использованием человеческого рецептора ТТГ. Этот метод позволяет выявить видоспецифические АТ-рТТГ. TBI-тесты 2-го поколения определяют TBII более чем у 98 % больных с ДТЗ и являются специфическими для этого заболевания. Исходный уровень АТ-рТТГ, определённый с использованием метода 2-го поколения в период манифестации ДТЗ практически исключает возможность развития ремиссии заболевания после курса ТСТ. Ограничение этого метода состоит в его высокой себестоимости [1,33,46,48,60,61,63,74,87,101,108].
Определение уровней антиэндотоксиновых антител классов А, М и G
Наиболее важным представляется взаимодействие ЛПС с клетками миеломоноцитарного ряда - моноцитами и макрофагами. В ходе эволюционного развития, на поверхности этих клеток выработались специфичные для ЭТ белковые генетически-кодируемые рецепторы. Их также называют рецепторами, распознающими «образы» патогенов (pattern recognition receptors). Это рецептор к маннозе, рецепторы комплемента (Р2-интегрины - CD11а/CD18, CD11b/CD18, CD11c/CD18) скавенджер-рецепторы класса А 1-го 2-го типов (SR-A), CD 14, CD54, Toll-like рецепторы [72,63,82,83,89,116,161].
Решающую роль в распознавании ЭТ грамнегативной бактерии играют CD14 рецепторы на клетках моноцитарно-макрофагального ряда. Существуют две формы этого белка. Растворимая форма (sCD14) этого рецептора находится в плазме и обеспечивает взаимодействие ЭТ с эндотелиальными и эпителиальными клетками, а мембраносвязанная форма (mCD14) функционирует как рецептор ЭТ на миелоидных клетках (моноцитах и макрофагах). При этом экспрессия его на моноцитах в 10 раз больше, чем на нейтрофилах. В структуре CD 14 рецептора нет внутриклеточной части, отвечающей за проведения сигнала активации, поэтому его функцией является только связывание ЭТ и формирование высокоаффинного рецепторного комплекса вместе с TLR-4. Без CD14 рецептора высокоаффинный рецепторный комплекс не формируется и распознавание ЭТ нарушается. Кроме того, CD 14 также способен связывать компоненты клеточной стенки грамположительных бактерий (пепти-догликаны и липотейхоевую кислоту) и способствовать их распознаванию TLR-2. Связывание ЭТ с CD14 резко усиливается в присутствии LBP [57,63,83,131].
Toll-like рецепторы входят в суперсемейство интегральных мембранных гликопротеинов I типа, которые экспрессируются на антиген-презентирующих клетках, включая макрофаги и дендритные клетки, и играют решающую роль в распознавании микробных компонентов, называемых патогенно-ассоциированной молекулярной моделью (pathogen-associated molecular patterns). У человека семейство TLR включает 11 индивидуальных рецепторов. В процессе распознавания, TLR могут индуцировать продукцию цитокинов и повышать регуляцию ко-стимуляционных молекул, экспрессируемых на антиген - презентирующих клетках, предоставляя возможность клеткам активировать адаптивный иммунный ответ. TLR4 формирует вместе с CD 14 рецептором и внеклеточным адаптерным гликопротеином MD2 высокоаффинный мембраноассоциированный комплекс для распознавания ЭТ [8,35,56,57,59,63,72].
Рецепторы компонентов комплемента, относящиеся к семейству р2-интегринов также могут связывать ЭТ. Они участвуют в элиминации широкого спектра разнообразных корпускулярных частиц, от опсонизированных комплементом бактерий до апоптотических телец. В связи с этим предполагается, что данные рецепторы прямо не задействованы в механизмах индукции воспалительной реакции не только не патогенных, но и патогенных субстанций [32,63,70].
Ещё одним важным семейством рецепторных белков, участвующих в связывании ЭТ, являются «скэвинджер»-рецепторы макрофагов класса А, представленные двумя типами: SR-A 1-го типа и SR-A 2-го типа. Эти рецепторы способны распознавать достаточно широкий спектр лигандов. Экспрессия SR-A в основном ограничивается макрофагами, включая Купферовские клетки печени, гранулоциты, а также различные виды тканевых макрофагов. Распознавание и связывание ЭТ SR-A обеспечивает эффективное удаление попавшего в организм ЭТ без проявлений клеточной активации и развития воспалительных реакций [32,63].
Кроме вышеперечисленных ЛПС-связывающих рецепторов, определённую роль в ЛПС-опосредованном иммунном ответе могут играть маннозо-специфические рецепторы и Fc-рецепторы. Эти рецепторы могут косвенно участвовать в инициации продукции цитокинов эффекторными клетками, фиксируя патогенные субстанции на клеточной поверхности и облегчая взаимодействие ЭТ с CD14/TLR4 [32,63].
В нейтрализации биологической активности и клиренсе ЭТ грамотрицательных бактерий, попадающих по тем или иным причинам во внутреннюю среду организма человека и животных, также принимают участие различные неантительные компоненты плазмы крови – липопротеиды высокой плотности, трансферрин, альбумин и отдельные белки острой фазы. Образование комплекса ЭТ с липопротеидами высокой удельной плотности наполовину снижает его токсичность и пирогенность в течение нескольких минут после его внутривенного введения. Важная роль в нейтрализации патогенного действия ЭТ отводится гликопротеину с молекулярной массой 60 кДа, получившему обозначение липополисахаридсвязывающий белок (LBP - Lipopolysaccharide Binding Protein). Эта «хелперная» молекула синтезируется гепатоцитами и присутствует в плазме крови здорового человека в концентрации около 2-20 мкг/мл. LBP является острофазным белком и обладает высокой специфичностью и аффинностью к ЛПС. Нейтрализация ЭТ с помощью LBP приводит к активации моноцитов, эндотелиоцитов и других клеток, следствием чего является высвобождение противовоспалительных цитокинов и индукция хронического воспаления [32,63,70,92,139].
Клеточные эндотоксинсвязывающие системы у больных с гипертиреозом различной длительности течения
Наиболее физиологичным в организме человека является механизм нейтрализации ЭТ с помощью специфических антител, тогда как нейтрализация его другими системами приводит к патофизиологическим эффектам, которые способны поддерживать хроническое воспаление.
Антительные эндотоксинсвязывающие системы у больных с гипертиреозом различной степени тяжести В таблице 4.1 представлены данные изучения уровня антиэндотоксиновых антител у больных в зависимости от степени его тяжести. Примечание: р – достоверность различий с нормой; р1 – достоверность различий с аналогичным показателем группы больных лёгкой степени тяжести. Примечание: – достоверность различий с нормой (р 0,05); #– достоверность различий с аналогичным показателем группы больных лёгкой степени тяжести (р 0,01).
Анализируя данные исследования, нами обнаружено, что у больных гипертиреозом средней степени тяжести уровень анти-ЭТ-IgМ достоверно снижен по сравнению с нормой и с больными лёгкой степени тяжести. У больных тяжёлым гипертиреозом достоверно ниже по сравнению с контрольной группой и группой больных лёгкой степени тяжести как уровень анти-ЭТ-IgМ, так и анти-ЭТ-IgG.
Антительные эндотоксинсвязывающие системы у больных с гипертиреозом различной длительности течения В таблице 4.2. представлены данные изучения уровня антиэндотоксиновых антител у больных с гипертиреозом в зависимости от длительности его течения. Таблица 4.2. Уровень антиэндотоксиновых антител у больных с гипертиреозом различной длительности течения
Как видно из приведенной выше таблицы 4.2, при изучении показателя анти-ЭТ-IgA, у больных с длительностью заболевания более 5 лет он достоверно снижен по сравнению с группой контроля и с группой больных, страдающих им в течение 5 лет. Показатель анти-ЭТ-IgМ достоверно снижен во всех группах больных по сравнению с группой контроля. Показатель анти-ЭТ-IgG достоверно снижен у больных, страдающих гипертиреозом в течении 5 лет и более по сравнению с контрольной группой.
Антительные эндотоксинсвязывающие системы у больных с гипертиреозом и патологией сердца Антительные ЭСС у больных с гипертиреозом и патологией сердца представлены в таблице 4.3. Уровень антиэндотоксиновых антител у больных с гипертиреозом в зависимости от наличия патологии сердца При изучении специфических антиэндотоксиновых антител классов А, М и G в периферической крови у больных с гипертиреозом в зависимости от наличия патологии сердца было установлено, что уровень анти-ЭТ-IgМ достоверно (p 0,05) снижен во всех группах больных по сравнению с номой. Уровень анти-ЭТ-IgG достоверно снижен по сравнению с контрольной группой только у больных с патологией сердца. Достоверных различий в уровне сывороточного анти-ЭТ-IgA в группах больных не наблюдается.
Антительные эндотоксинсвязывающие системы у больных с гипертиреозом и эндокринной офтальмопатией Данные о состоянии антительных ЭСС у больных с гипертиреозом и ЭОП представлены в таблице 4.4. Таблица 4.4. Содержание антиэндотоксиновых антител в сыворотке крови больных с гипертиреозом и ЭОП
При изучении специфических антиэндотоксиновых антител классов А, М и G в периферической крови у больных с гипертиреозом в зависимости от наличия ЭОП было установлено, что у больных с ЭОП уровень анти-ЭТ-IgМ и анти-ЭТ-IgG достоверно выше, чем у больных без ЭОП. Также мы видим, что показатели этих антител у больных без ЭОП достоверно снижены по сравнению с нормой. Достоверных межгрупповых различий в уровне анти-ЭТ-IgА выявлено не было. 4.5. Содержание сывороточных иммуноглобулинов и секреторных иммуноглобулинов класса А у больных с гипертиреозом различной степени тяжести
Данные о состоянии антительного неспецифического иммунитета у больных с гипертиреозом в зависимости от степени его тяжести представлены в таблице 4.5. Примечание: p – достоверность различий с нормой; р1 – достоверность различий с аналогичным показателем группы больных гипертиреозом лёгкой степени тяжести.
При определении уровней сывороточных иммуноглобулинов у больных с гипертиреозом в зависимости от степени тяжести заболевания были получены следующие результаты, представленные в таблице 4.5. Так, у больных тяжёлым гипертиреозом выявлено достоверное (р 0,05) увеличение концентраций сывороточного IgА и IgG по сравнению с аналогичными показателями в контрольной группе и группе больных с лёгким гипертиреозом. Уровень IgG в группе больных со средней степенью тяжести заболевания был также достоверно (р 0,05) выше, чем в группе здоровых доноров и группе больных гипертиреозом лёгкой степени. Достоверных межгрупповых различий в уровне сывороточного IgМ и секреторного sIgА выявлено не было.
Содержание сывороточных иммуноглобулинов и секреторных иммуноглобулинов класса А у больных с гипертиреозом различной длительности течения
При определении уровней сывороточных иммуноглобулинов у больных с гипертиреозом в зависимости от длительности его течения были получены следующие результаты, представленные в таблице 4.6. Так, у больных, страдающих гипертиреозом в пределах 5, наблюдалось достоверное (р 0,05) повышение сывороточного IgА по сравнению с группой относительно
Антительные эндотоксинсвязывающие системы у больных с гипертиреозом различной длительности течения
Взаимодействие ЭТ с рецепторами на поверхности клеток является важнейшим фактором, который и определяет результирующий эффект его действия на клеточном уровне. Логично предположить, что даже в портальном кровотоке происходит интенсивное взаимодействие ЭТ и клеточных элементов крови, среди которых особое место занимают нейтрофильные гранулоциты и моноциты.
Именно моноциты и нейтрофилы экспрессируют на своей поверхности основные рецепторы к ЭТ, среди которых можно отметить CD 14 рецептор, р2-интегриновые рецепторы (CD11/CD18), скавенджер-рецепторы и др. [10,20,57,161]. Решающее значение в распознавании ЭТ играют CD14 рецепторы на макрофагальных клетках, которые, не имея внутрицитоплазматического домена, передают сигнал TLR, преимущественно TLR4 типа, последние играют чрезвычайно важную роль во врождённом и приобретенном иммунитете. Взаимодействие TLR и их лигандов инициирует активацию сигнальных путей, что приводит к активации генов ответственных за развитие провоспалительных реакций, таких как ген ФНО-альфа, интерлейкины 1,6,12, NFk и других [70,82,83].
В настоящем исследовании у больных с гипертиреозом мы изучали ЭТ-связывающий потенциал моноцитов и гранулоцитов периферической крови, т.е. ЭТ-связывающие рецепторы (EТ-R), способные непосредственно взаимодействовать с ЭТ, в качестве флуоресцентного зонда применяли коньюгат ЛПС (ЭТ) Escherichia coli K235 с флуоресцеинизитиоцианатом (LPS- Fits). Определяя EТ-R в безсывороточной среде (не содержащей белок, связывающий ЛПС), мы определяли общий пул ЭТ рецепторов, в которые входят р2-интегриновые рецепторы (CD11/CD18), скавенджер-рецепторы (SR-A), лектиновые рецепторы, которые потенциально могут участвовать в клиренсе ЭТ [10,20,57]. При этом распознавание и связывание его SR-A и CD11/CD18 обеспечивает эффективное удаление попавшего в организм ЛПС без проявлений клеточной активации и развития воспалительных реакций [10,20,34].
Таким образом, характер клеточного ответа на ЭТ зависит от соотношения между функциональной активацией рецепторов с провоспалительными свойствами (CD14) и рецепторами со свойствами ЭТ клиренса (антивоспалительный эффект).
При исследовании ЛПС-связывающего потенциала моноцитов и гранулоцитов у больных с гипертиреозом различной степени тяжести и длительности течения было выявлено, что исследуемые показатели не выходили за пределы референсного диапазона нормы (p 0,05). Достоверных различий между группами больных также не наблюдалось. Нормальные уровни экспрессии антиэндотоксиновых рецепторов на клетках в условиях избытка ЭТ (что подтверждает ряд приведённых выше факторов) могут говорить об истощении данного механизма антиэндотоксиновой защиты у исследуемых больных.
Одним из гуморальных факторов нейтрализации ЭТ в организме человека являются специфические антитела. Анти-ЭТ-IgG являются основными антителами в нейтрализации ЭТ, поступившего в кровоток. Имеется прямая корреляционная связь между уровнем анти-ЭТ-IgG антител и выживаемостью при сепсисе. Агглютинирующая и комплементсвязывающая способность анти-ЭТ-IgМ также достаточно велика и превышает таковую способность анти-ЭТ-IgG в 100 раз. Известно, что анти-ЭТ-IgМ имеет прямую корреляционную связь с благоприятным исходом после тяжелых хирургических вмешательств; при нормально протекающей беременности уровень анти-ЭТ-IgM выше, чем у женщин с угрозой выкидыша, его содержание повышается при грамнегативной внегоспитальной пневмонии, в то время как «нормальный» его уровень ассоциируется с высоким риском летального исхода [9,30,39,41, 134]. Как видно из полученных нами данных, показатель анти-ЭТ-IgG и анти ЭТ-IgМ достоверно снижен у больных с тяжёлым гипертиреозом и страдающих им более 5 лет по сравнению с контрольной группой. Низкий уровень данных антител в исследуемых группах, скорее всего, связан с истощением данного звена ЭСС при утяжелении течения и длительности исследуемого заболевания. Из литературы известно, что при многих состояниях, способствующих увеличению поступления ЭТ в кровоток, наблюдается угнетение функций клеточных и антительных ЭСС. В нашем случае это связано с тем, что при усугублении тяжести заболевания, а также при длительном его течении в условиях острого (в первом случае) и хронического (во втором) стресса, дисбиотические процессы в толстом кишечнике становятся более выраженными, что увеличивает количество ЭТ в его просвете, а сопутствующая ФП способствует его повышенной транслокации в системный кровоток. Возможно, снижение данных антител также является следствием иммунодефицита, развивающегося на фоне длительного течения основного заболевания. В результате этого происходит истощение антительных ЭСС, выраженное в снижении синтеза специфического анти-ЭТ-IgG и анти-ЭТ-IgМ.
Нами выявлено достоверное снижение уровня анти-ЭТ-IgА в группе больных с длительностью течения гипертиреоза более 5 лет по сравнению с группой контроля и группой больных с длительностью гипертиреоза до 5 лет. Возможно, такое снижение анти-ЭТ-IgА при длительном сроке болезни также связано с прогрессирующим в течении болезни нарушением обмена веществ – углеводов, белков, холестерина, витаминов и минералов и развитием вследствии этого иммунодефицитного состояния.