Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Литературный обзор 18
1.1. Особенности формирования иммунного ответа к мироорганизмам F. tularensis
1.1.1. Особенности неспецифического иммунного ответа к бактериям F. tularensis 18
1.1.2. Гуморальное звено в формировании противотуляремийного иммунитета 26
1.1.3. Клеточное звено в формировании противотуляремийного иммунитета 28
1.1.4. Моделирование инфекционного и вакцинного процессов туляремии 31
1.1.5. Оценка напряженности противотуляремийного иммунитета 32
1.1.6. Современные методы оценки противотуляремийного иммунитета 36
1.2. Иммунологические аспекты чумы 39
1.2.1. Иммунопатогенез чумы 39
1.2.2. Особенности неспецифического иммунного ответа при чуме 42
1.2.3. Особенности формирования адаптивного иммунного ответа против Y. pestis 48
1.2.4. Современное состояние иммунопрофилактики чумы 51
1.2.5. Поиск маркеров, отражающих наличие протективого противочумногоиммунитета 52
Глава 2. Материалы и методы 56
2.1. Штаммы 56
2.2. Среды и условия культивирования 56
2.3. Антигены микроорганизмов 56
2.4. Лабораторные животные 57
2.5. Схемы иммунизации животных 58
2.6. Выделение иммунокомпетентных клеток 59
2.6.1. Получение спленоцитов 59
2.6.2. Выделение лимфоцитарной массы на градиенте плотности
2.7. Стимуляция лимфоцитов 60
2.8. Цитометрический анализ 61
2.8.1. Окрашивание поверхностных маркеров 61
2.8.2. Окрашивание внутриклеточных цитокинов 61
2.8.3. Цитометрический анализ экспрессии поверхностных маркеров и синтеза цитокинов 61
2.8.4. Определение пролиферативной активности лимфоцитов методом цитофлюориметрии с использованием CFSE (карбоксифлуоресцеин сукцимидиловый эфир) красителя 63
2.8.5. СВА анализ 65
2.9. Определение титра антител к антигенам чумного микроба 65
2.10. Определение антител к антигенам F. tularensis 66
2.11. Определение напряженности иммунитета 66
2.12. Постановка реакции лейкоцитолиза с тулярином 67
2.13. Реакция бластгрансформации лимфоцитов (РБТЛ) 68
2.14. Статистический анализ 69
Глава 3. Оценка противотуляремийного клеточного и гуморального иммунитета у мышей линии balb/c после ммунизации препаратами против туляремии 70
3.1. Выявление антител к антигенам F. tularensis в сыворотке крови иммунизированных против туляремии мышей 72
3.2. Оценка перестройки поверхностных маркеров лимфоцитов под влиянием антигенов F. tularensis 73
3.3. Оценка клеточного противотуляремийного иммунитета по активации синтеза ИФН-у, ФНО-а и ИЛ-17 в ответ на рестимуляцию лимфоцитов in vitro тулярином и KHKF. tularensis 15 НИИЭГ 78
3.4. Изменение активности синтеза ИФН-у и ФНО-а лимфоцитами под влиянием антигенов F. tularensis 80
3.5. Оценка специфичности тулярина 82
3.6. Оценка специфичности КНК F.tularensis 86 3.7. Разработка методов in vitro для оценки эффективности иммунологической перестройки у мышей, иммунизированных разными дозами F. tularensis 15 НИИЭГ 89
3.8. Оценка напряженности иммунитета к туляремии у мышей через разные сроки после иммунизации F. tularensis 15 НИИЭГ и показателями противотуляремийного иммунитета в системе in vitro 99
3.9. Выявление иммунологических маркеров, коррелирующих с защитой от заражения туляремией мышей, иммунизированных разными препаратами против туляремии 104
Обсуждение 108
Глава 4. Оценка клеточного и гуморального противотуляремийного иммунитета у людей, вакцинированных живой туляремийной вакциной 121
4.1. Оценка гуморального противотуляремийного иммунитета 121
4.1.1. Выявление антител к антигенам F.tularensis в сыворотке крови людей 121
4.1.2. Анализ изменений экспрессии маркеров в присутствии антигенов F. tularensis на поверхности В лимфоцитов, полученных от невакцинированных и иммунизированных живой туляремийной вакциной людей 122
4.1.2.1. Сравнительная оценка изменений экспрессии CD69 рецепторной молекулы на поверхности В лимфоцитов 122
4.1.2.2. Сравнительная оценка изменений экспрессии CD138 рецепторной молекулы на поверхности лимфоцитов и моноцитов 125
4.1.2.3. Сравнительная оценка изменений экспрессии CD86 рецепторной молекулы на поверхности В лимфоцитов 126
4.2. Оценка результатов реакции лейкоцитолиза с тулярином 127
4.3. Сравнительная оценка изменений экспрессии поверхностных маркеров
Т лимфоцитов, полученных от невакцинированных и иммунизированных живой
туляремийной вакциной людей, под влиянием тулярина 129
4.3.1. Сравнительная оценка изменений активации и численности CD45RO+
субпопуляции Т лимфоцитов под влиянием антигенов F. tularensis 129 4.3.2. Сравнительная оценка изменений экспрессии CD69 и HLA-DR рецепторных молекул на поверхности субпопуляций Т лимфоцитов 132
4.3.3. Сравнительная оценка изменений экспрессии CD107b и CD95 рецепторных молекул на поверхности субпопуляций Т-лимфоцитов 135
4.3.4. Сравнительная оценка изменений экспрессии CD154, CD28 и CD25
рецептора на поверхности Т лимфоцитов 137
4.4. Оценка пролиферативной активности лимфоцитов 138
4.4.1. Оценка пролиферативной активности лимфоцитов в реакции
бласттрансформации 138
4.4.1. Оценка пролиферативной активности лимфоцитов методом цитометрии. 139
4.5. Оценка эффекторной активности лимфоцитов 139
4.5.1. Оценка синтеза цитокинов лейкоцитами крови людей, иммунизированных живой туляремийной вакциной, в ответ на стимуляцию клеток антигенами F. tularensis в реакциях in vitro 139
4.5.2. Уровень синтеза ИФН-у и ФНО-а Т лимфоцитами крови людей, иммунизированных живой туляремийной вакциной, в ответ на стимуляцию клеток антигенами F. tularensis в реакциях in vitro 140
Обсуждение 142
Глава 5. Оценка клеточного и гуморального иммунитета у мышей линии balb/c после иммунизации коммерческой живой или экспериментальными чумными вакцинами 152
5.1. Изменение экспрессии TLR-2 и TLR-9 рецепторов на поверхности Т-лимфоцитов под влиянием антигенов F1 и V 154
5.2. Оценка перестройки маркера ранней активации CD69 на поверхности лимфоцитов под влиянием антигенов Y. pestis 157
5.3. Оценка пролиферативной активности лимфоцитов мышей в ответ на активацию клеток антигенами чумного микроба 159
5.4. Изменение активности синтеза ИФН-у, ФНО-а и ИЛ-4 лимфоцитами под влиянием антигенов Y. pestis 162 5.5. Изменение цитокиновой активности спленоцитов под влиянием антигенов Y. pestis 163
5.6. Изменения экспрессии ко-стимулирующих молекул CD28 и CD154 на поверхности Т лимфоцитов под влиянием антигенов F1 и V 166
5.7. Изменение экспрессии CD69 и CD86 рецепторов на поверхности CD 19+ CD22+ В лимфоцитов под влиянием антигенов F1 и V 167
5.8. Выявление антител к F1 и V антигенам Y. pestis в сыворотках крови иммунизированных мышей 168
5.9. Выявление корреляций между напряженностью иммунитета к чуме у мышей и изменением экспрессии поверхностных маркеров и синтеза цитокинов под
влиянием антигенов чумного микроба в системе in vitro 170
Обсуждение 173
Глава 6. Оценка иммунного ответа у людей после иммунизации живой чумной вакциной 184
6.1. Выявление антител в сыворотках крови доноров к антигенам Y. pestis 186
6.2. Изменение экспрессии рецепторных молекул в присутствии антигенов Y. pestis на поверхности В лимфоцитов, полученных от невакцинированных и иммунизированных живой чумной вакциной людей, под влиянием антигенов чумного микроба 188
6.2.1. Изменение экспрессии CD69 рецепторной молекулы на поверхности В-лимфоцитов 188
6.2.2. Изменение экспрессии CD138 рецепторной молекулы на поверхности В лимфоцитов 190
6.2.3. Изменение экспрессии CD86 и CD80 рецепторных молекул на поверхности В-лимфоцитов 191
6.3. Изменение экспрессии поверхностных маркеров Т лимфоцитов, полученных от невакцинированных и иммунизированных живой чумной вакциной людей, под влиянием антигенов Y. pestis 193
6.3.1. Изменение экспрессии CD69 рецептора на поверхности Т-лимфоцитов 193 6.3.2. Изменение экспрессии CD95 рецептора на поверхности субпопуляций Т лимфоцитов 195
6.3.3. Изменение экспрессии CD107b рецептора на поверхности субпопуляций Т лимфоцитов 197
6.3.4. Изменение экспрессии CD45RO рецептора на поверхности HLA-DR+ субпопуляции Т лимфоцитов 197
6.4. Изменение активности синтеза цитокинов иммунокомпетентными клетками, полученными от невакцинированных и иммунизированных живой чумной вакциной людей, под влиянием антигенов чумного микроба 201
6.4.1. Изменение активности синтеза цитокинов ИФН-у и ФНО-а субпопуляциями Т лимфоцитов под влиянием антигенов чумного микроба 201
6.4.2. Изменение активности синтеза цитокинов иммунокомпетеными клетками крови под влиянием антигенов чумного микроба 203
Обсуждение 205
Глава 7. Оценка специфического клеточного иммунного ответа после иммунизации против сибирской язвы 213
Глава 8. Оценка иммунного статуса людей постоянно прививающихся против особо опасных инфекций 219
Выводы 221
Заключение 224
Перечень сокращений, условных обозначений, символов,
Единиц и терминов 226
Список литературы
- Моделирование инфекционного и вакцинного процессов туляремии
- Оценка перестройки поверхностных маркеров лимфоцитов под влиянием антигенов F. tularensis
- Анализ изменений экспрессии маркеров в присутствии антигенов F. tularensis на поверхности В лимфоцитов, полученных от невакцинированных и иммунизированных живой туляремийной вакциной людей
- Изменение экспрессии CD86 и CD80 рецепторных молекул на поверхности В-лимфоцитов
Введение к работе
Актуальность темы исследования и степень ее разработанности
Крупные вспышки и спорадические случаи туляремии и чумы, относящиеся к особо опасным возвращающимся инфекционным заболеваниям, периодически регистрируются во многих странах мира, в том числе, и в России [Балахонов СВ., 2013; Мокриевич А.Н., 2013; Попов Н.В., 2014]. Сохранение эпизоотически активных природных очагов, вероятность применения Francisella tularensis и Yersinia pestis при биотеррористических актах, сложность постановки клинического диагноза обусловливают необходимость разработки новых средств вакцинопрофилактики. В тоже время серьёзным препятствием в создании новых вакцин является отсутствие объективных критериев для оценки эффективности и продолжительности иммунитета.
Разработка методов оценки поствакцинального клеточного противочумного и противотуляремийного иммунитета является актуальным направлением, решение которого особенно необходимо для осуществления индивидуального подхода к ревакцинации; выбора антигенов, активирующих клеточное звено иммунитета, при конструировании вакцин; для заключения о наличии напряженного иммунитета, особенно против аэрозольного заражения инфекциями.
В нашей стране и странах СНГ для профилактики чумы и туляремии используются живые вакцины. Живая чумная вакцина и туляремийная вакцина обеспечивают защиту на один год и пять лет, соответственно, и требуют периодической ревакцинации. В случае ревакцинации живой вакциной человека, имеющего специфический иммунитет к инфекции, вакцинопрофилактика будет не эффективной. Это связано с активацией клеток памяти и синтезом антител и активацией клеточных реакций, которые приведут к элиминации бактерий вакцинного штамма до формирования иммунитета.
О наличии противочумного или противотуляремийного иммунитета судят по наличию антител в крови к F1 антигену Y. pestis и липополисахариду
4 F. tularensis, соответственно. В то же время при формировании противочумного и противотуляремийного иммунитета большая роль отводится обоим звеньям иммунной системы: гуморальному и клеточному. После вакцинации и заболевания туляремией или чумой появляются специфические антитела, которые играют определенную роль в защите от повторного заражения, но, тем не менее, не всегда коррелируют с защитой организма от инфекции [Ehrenkranz N.J., 1955; Burke D.S., 1977; Tarnvik А., 1989; Parent М.А., 2005]. Поэтому для оценки напряженности противочумного/противотуляремийного иммунитета необходимо выявлять как специфические антитела, так и оценивать специфические клеточные реакции.
Поиску методов, позволяющих выявить наличие клеточного противочумного и противотуляремийного иммунитета, посвящено множество работ [Витязева СМ., 2013; Аронова Н.В., 2014; Karttunen R., 1985; Kim E.J., 2008; Salerno-Goncalves R., 2009]. В 70-е годы оценку напряженности Т-клеточного иммунитета против туляремии и чумы проводили, используя накожную или внутрикожную аллергическую пробу с тулярином или пестином, соответственно. Однако широкого распространения эти методы не нашли в связи с побочными реакциями, проявляющимися в ухудшении состояния вакцинированного/больного (как проявление общей реакции организма), а в некоторых случаях развитием некроза (как проявление местной реакции). В дальнейшем для выявления специфического клеточного иммунитета предлагались реакции in vitro: реакция лейкоцитолиза с тулярином для оценки клеточного противотуляремийного иммунитета и показатель повреждения нейтрофилов в тесте с пестином - для оценки клеточного противочумного иммунитета. С появлением современных методов исследований наличие клеточного протиовотуляремииного и противочумного иммунитета пытались оценивать на основании подсчета эффекторных клеток памяти CD45RA"/+, CD62" [Salerno-Goncalves R., 2009], по усилению пролиферативной активности лимфоцитов [Витязева СМ., 2013], усилению синтеза клетками ИФН-у [Waag D.M., 1995; El Sahly Н. М., 2009], ИЛ-2 и ФНО-у [Eneslatt К., 2012] в ответ на рестимуляцию
5 клеток in vitro антигенами туляремийного или чумного микроба. Тем не менее, вопрос о методах оценки клеточного протиовотуляремийного и противочумного иммунитета остается открытым.
Цель исследования - разработать алгоритм оценки напряженности поствакцинального иммунитета к чуме и туляремии в реакциях in vitro.
Задачи исследования:
-
Проанализировать наличие корреляции между изменением экспрессии маркеров лимфоцитов, их пролиферативной активностью, цитокиновой активностью в реакциях in vitro под влиянием тулярина, кислото-нерастворимого комплекса, рекомбинантного белка 1696, ультразвукового дезинтеграта F. tularensis и напряженностью иммунитета к туляремии у мышей.
-
Выявить различия в ключевых показателях специфической активации лимфоцитов под влиянием тулярина и кислото-нерастворимого комплекса F. tularensis, коррелирующие с защитой мышей от заражения бактериями туляремии различной вирулентности.
-
Оценить длительность протективного иммунитета к туляремии и длительность проявления специфических клеточных реакций в ответ на реактивацию лимфоцитов антигенами F. tularensis у мышей, иммунизированных живой туляремийной вакциной.
-
Изучить влияние степени воспаления, индуцированного разными дозами F. tularensis 15 НИИЭГ на формирование клеточного и гуморального противотуляремийного иммунитета.
-
Предложить методы оценки иммунитета к туляремии у людей.
-
Изучить изменение функциональной активности лимфоцитов под влиянием F1, V, Р1а антигенов и ультразвукового дезинтеграта Y. pestis в реакциях in vitro и выявить маркеры, отражающие наличие клеточного противочумного иммунитета.
-
Выявить различия в механизмах активации В и Т лимфоцитов под влиянием антигенов F. tularensis и Y. pestis в клеточных реакциях in vitro у вакцинированных и невакцинированных против туляремии и чумы.
-
Предложить методы оценки иммунитета к чуме у людей.
-
Оценить иммунный статус у постоянно вакцинирующихся против чумы, туляремии, сибирской язвы людей.
-
Изучить возможность использования предложенных методов для комплексной оценки специфического иммунитета при других инфекциях.
Научная новизна
Впервые показано, что защита мышей против заражения F. tularensis 503 (subsp. holarcticd) коррелирует с усилением экспрессии CD69 рецептора на поверхности Т хелперов, синтезом ИФН-у и ИЛ-17 спленоцитами в ответ на активацию клеток кислото-нерастворимым комплексом. О наличии протективного иммунитета при заражении штаммом Schu F. tularensis subsp. tularensis - наиболее вирулентным штаммом туляремийного микроба - косвенно свидетельствуют не только уровень антител к липополисахариду и кислото-нерастворимому комплексу F. tularensis, способность лимфоцитов синтезировать ИФН-у, ИЛ-17 и активировать Т хелперы под влиянием кислото-нерастворимого комплекса, но также и способность цитотоксических лимфоцитов активироваться под влиянием кислото-нерастворимого комплекса.
Впервые показано, что у вакцинированных против туляремии доноров под влиянием антигенов F. tularensis отмечается специфическое усиление экспрессии маркера ранней активации CD69 на поверхности Т хелперов и цитотоксических лимфоцитов, и маркера поздней активации HLA-DR на поверхности Т-клеток памяти (CD3+CD4+CD45RO+).
Выявлены разные пути активации Т лимфоцитов под влиянием тулярина или кислото-нерастворимого комплекса у невакцинированных и вакцинированных против туляремии доноров. Под влиянием тулярина или кислото-нерастворимого комплекса лимфоциты вакцинированных доноров активировались через CD28 и CD154 рецепторные молекулы. Лимфоциты неиммунных доноров активировались без участия CD 154, что свидетельствовало об отсутствии активации ТЫ иммунного ответа.
Впервые показано, что в отличие от невакцинированных доноров у иммунизированных живой чумной вакциной людей, под влиянием F1 антигена на поверхности В лимфоцитов происходило усиление экспрессии CD86, что отражает активацию не только гуморального, но и клеточного звена иммунитета.
Выявлены разные механизмы межклеточной активации Т и В лимфоцитов, полученных от интактных и иммунных мышей под влиянием F1 антигена. Активация клеток у иммунных животных происходила по С028-независимому пути за счет взаимодействия рецепторов В лимфоцитов CD40L с индуцибельной мембранной молекулой CD154, способствующей развитию иммунного ответа по ТЫ пути.
Впервые показано, что маркер поздней активации HLA-DR, под влиянием F1 антигена Y. pestis специфически появляется и на поверхности CD45RO Т хелперов и на поверхности CD45RO цитотоксических лимфоцитов, полученных от иммунизированных живой чумной вакциной доноров.
Теоретическая и практическая значимость
Результаты настоящего исследования вносят новые знания о механизмах активации Т и В лимфоцитов иммунного и неиммунного организма под влиянием специфических антигенов Y. pestis и F. tularensis. Научно обосновано и подтверждено в экспериментах на животных, что способность лимфоцитов изменять экспрессию поверхностных маркеров и активность синтеза цитокинов под влиянием антигенов Y. pestis и F. tularensis in vitro отражает наличие специфического клеточного иммунитета, достаточного для защиты от заражения туляремией и чумой. Расширены представления об иммунологических механизмах обеспечения протективного иммунитета против бактерий F. tularensis разной вирулентности.
В результате проведенной работы предложен комплекс иммунологических показателей, отражающих наличие клеточного противотуляремийного и противочумного иммунитета, что важно для оценки иммунобиологических свойств антигенов и штаммов - кандидатов в вакцинные, а также для выявления специфического иммунитета у людей после вакцинации.
8 Результаты проведенных исследований послужили основой при составлении ниже перечисленных документов:
«Методические указания. Основные требования к вакцинным штаммам туляремийного микроба» (утверждены и введены в действие Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 12.02.2007 г.) МУ 3.3.1.2161-07;
«Методические рекомендации. Оценка воздействия наноматериалов на функцию иммунитета» (утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г.Онищенко 29.12.2011 г.) MP 1.2.0052-11;
«Методические рекомендации. Оценка напряженности специфического клеточного иммунитета у людей к возбудителю туляремии in vitro» (одобрены Ученым советом ФБУН ГНЦ ПМБ и утверждены директором ФБУН ГНЦ ПМБ, протокол Ученого совета ФБУН ГНЦ ПМБ № 8 от 07.10.2011 г.).
Разработанные документы используются в ФБУН ГНЦ ПМБ, ФКУЗ РНИПЧИ «Микроб» для отбора и предварительной оценки иммунобиологических свойств потенциальных вакцинных штаммов F. tularensis, изучения свойств потенциальных кандидатов в вакцинные штаммы против туляремии и чумы, повышения эффективности оценки противочумного и противотуляремийного поствакцинального иммунитета у людей.
Данные экспериментальных исследований диссертационной работы
используются при чтении лекций на курсах по магистерской образовательной
программе «Нанобиобезопасность» Пущинского государственного
естественнонаучного института (ПущГЕНИ) и по программе курсов повышения
квалификации «Микробиология. Основы и особенности работы с
биологическими агентами I-IV групп патогенности в научно-исследовательских лабораториях».
9 Методология и методы исследования
Методология исследования спланирована с учетом современных принципов научного познания и организована адекватно поставленной цели. Объектами исследования являлись экспериментальные животные и доноры, периодически вакцинируемые против чумы, туляремии и сибирской язвы. Предметом исследования являлось изучение особенностей формирования специфических клеточных реакций против возбудителей особо опасных инфекций.
Планирование и проведение исследований, направленных на решение
поставленных задач, осуществлялось на основе общенаучных и специфических
методов: биологических, микробиологических, микроскопических,
иммунологических, цитометрических, оценки физиологического состояния животных, методов статистической обработки результатов.
Биологические методы исследования включали проведение экспериментальных исследований на мышах, термометрирование и определение веса животных, оценку внешнего вида и общего состояния.
Микробиологические методы исследований применяли для выявления обсемененности бактериями органов животных, а также в целях получения бактериальных культур Y. pestis, F. tularensis, В. anthracis для иммунизации животных.
Для оценки жизнеспособности иммунокомпетентных клеток, морфологии бактерий, подсчета клеток применяли микроскопические методы исследований.
Цитометрические методы исследований использовали для иммунофенотипирования лимфоцитов, оценки изменения пролиферативной активности лимфоцитов под влиянием специфических антигенов и митогенов, определения активности синтеза внутриклеточных цитокинов субпопуляциями лимфоцитов, проведения СВА-анализа, позволяющего в небольшом объеме сыворотки или супернатанта выявлять концентрации 10-12 цитокинов одновременно.
Иммунологические методы исследований включали в себя получение спленоцитов, лимфоцитов, культивирование иммунокомпетентных клеток,
10 определение титра антител к возбудителям туляремии и чумы методом твердофазного иммуноферментного анализа, постановку реакции лейкоцитолиза, реакцию бастгрансформации лимфоцитов.
При выполнении работы использовались информационные средства: отечественные и международные научные компьютерные базы данных и информационные ресурсы PubMed, Medline, Wiley Online Library, e-library, материалы российских и зарубежных научных журналов, российских и международных конференций.
Личный вклад соискателя
Диссертационная работа выполнена лично автором, а также в сотрудничестве с коллегами: отдела иммунобиохимии ФБУН ГНЦ ПМБ, зав. отделом к.б.н. С.Ф.Бикетов; отдела особо опасных инфекций ФБУН ГНЦ ПМБ, зав. отделом к.м.н. А.Н.Мокриевич; лаборатории биологических испытаний ФБУН ГНЦ ПМБ, зав. лабораторией к.м.н. А.И.Борзилов; лаборатории биологической безопасности ФБУН ГНЦ ПМБ, зав. лабораторией к.м.н. А.Е.Тюрин.
Положения, выносимые на защиту:
-
Усиление экспрессии CD69 рецептора на поверхности Т лимфоцитов, синтеза ИФН-у и ИЛ-17 спленоцитами в ответ на реактивацию кислото-нерастворимым комплексом, а также наличие антител к липополисахариду и кислото-нерастворимому комплексу F. tularensis коррелируют с наличием протективного противотуляремийного иммунитета у мышей.
-
По изменению количества клеток, экспрессирующих CD69 рецептор на поверхности Т хелперов и HLA-DR маркер на поверхности CD3+CD4+CD45RO+ клеток, под влиянием тулярина можно судить о наличии противотуялермииного клеточного иммунитета у людей.
-
Активация Т лимфоцитов под влиянием тулярина или кислото-нерастворимого комплекса у вакцинированных против туляремии доноров инициируется через CD28 и CD154 рецепторную молекулы. Лимфоциты
11 неиммунных доноров активируюся без участия CD 154, что свидетельствует о ингибировании ТЫ иммунного ответа.
-
В крови, полученной от доноров, иммунизированных живой чумной вакциной, под влиянием F1 антигена на поверхности В лимфоцитов происходит усиление экспрессии CD86, что способствует активации Т лимфоцитов.
-
По увеличению экспрессии маркера поздней активации HLA-DR, под влиянием F1 антигена Y. pestis на поверхности CD45RO лимфоцитов можно судить о наличии противочумного клеточного иммунитета у людей.
Степень достоверности и апробация результатов исследования
О достоверности результатов работы свидетельствует использование современных автоматизированных и сертифицированных методов исследования, поддерживающихся программными обеспечениями для анализа и статистической обработки результатов. Использование адекватных методов исследования позволило количественно оценить способность Т и В лимфоцитов к специфической активации под влиянием антигенов, а также выявить маркеры отражающие наличие клеточного противочумного и противотуляремийного иммунитета.
Диссертация апробирована на заседании Ученого совета ФБУН ГНЦ ПМБ (протокол № 42 от 24 декабря 2014).
Материалы диссертации доложены и обсуждены на ряде научных форумов:
Всероссийской научно-практической конференции «Дни иммунологии в Санкт-
Петербурге» (Санкт-Петербург, 2009); Научно-практической конференции
молодых ученых и специалистов научно-исследовательских учреждений
Роспотребнадзора «Биологическая безопасность в современном мире» (Оболенск,
2009); XVII Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва,
2010); Международной конференции «Развитие научных исследований и надзор
за инфекционными заболеваниями» (Санкт-Петербург, 2010);
10-м интернациональном симпозиуме «Yersinia 2010» (Бразилия, Ресиф, 2010); 6-ой международной конференции по зоонозам (Мексика, Канкун, 2011); 1-ой Международной конференции по инфекционным заболеваниям и
12 наномедицине (Непал, Катманду, 2012); Международном симпозиуме по опасным заболеваниям (Австрия, Вена, 2014).
Предложенный метод оценки клеточного противтуляремийного иммунитета используется для оценки поствакцинального иммунитета у сотрудников ФБУН ГНЦ ПМБ, а также в учебном процессе Пущинского государственного естественнонаучного института (ПущГЕНИ) и курсах повышения квалификации при ГНЦ ПМБ.
Публикации
Основное содержание работы отражено в 35 научных публикациях, в том числе в 13 статьях в журналах из списка изданий, рекомендованных Высшей аттестационной комиссией Министерства образования и науки Российской Федерации для публикации основных результатов диссертаций на соискание ученой степени доктора биологических наук, одном руководстве и одной монографии.
Объем и структура диссертации
Моделирование инфекционного и вакцинного процессов туляремии
F. tularensis - высоковирулентный патогенный вид грамм-отрицательных внутриклеточных бактерий, вызывающих развитие туляремийной инфекции. Род Francisella - единственный представитель семейства Francisellaceae, принадлежащего к у-подклассу Proteobacteria [166]. На основании результатов ДНК/ДНК гибридизации в роде Francisella предложено различать несколько видов микроорганизмов: F. tularensis, F. philomiragia и F. novicida, хотя некоторые F. novicida относят к подвиду F. tularensis. Вид F. tularensis включает три подвида: F. tularensis subsp tularensis, F. tularensis subsp. palaearctica, F. tularensis subsp. mediasiatica and F. tularensis subsp. novicida, которые различаются по степени вирулентности и географическому распространению. Наиболее вирулентными для человека являются микроорганизмы F. tularensis subsp nearctica (F. tularensis subsp tularensis, тип A.I в соответствии с зарубежной классификацией) [341].
Клинические проявления туляремии зависят от путей проникновения бактерий. Возбудитель туляремии может проникать в организм аэрогенным, алиментарным или трансимиссивным путями. В случае отсутствия лечения смертность для людей составляет 5 %. Наиболее опасным путем проникновения F. tularensis считается аэрозольный - при котором смертность составляет около 60 % в случае отсутствия лечения.
Инфекция не передается от человека к человеку. Инкубационный период заболевания составляет от 1 до 21 дня. Для развития туляремийной инфекции достаточно попадания всего 10 бактерий в организм человека [325, 326]. После проникновения в организм хозяина бактерии мигрируют в лимфатические узлы, а затем в селезенку, печень, легкие, почки, толстый кишечник, нервную ткань и костный мозг [181]. Через несколько дней после начала заболевания основными резервуарами F. tularensis являются печень и селезенка, в меньшей степени костный мозг и легкие. Со стороны периферической крови наблюдается небольшое увеличение в количества лейкоцитов [413].
Защита организма от возбудителей туляремии, как от любых других бактерий, осуществляется за счет врожденных и приобретенных иммунологических реакций. В начале инфицирования иммунокомптентные клетки макроорганизма за счет механизмов врожденного иммунитета распознают консервативные для микроорганизмов и отсутствующие у позвоночных, патоген-ассоциированные молекулярные структуры. Эти структуры распознаются специальными рецепторами - паттерн- или образ-распознающими рецепторами (pattern recognition receptors - PRR). Паттерн-распознающие рецепторы включают мембран-ассоциироованные толл-подобные рецепторы (TLR) и цитозольные NOD-подобные (NLR) [228].
В связи с тем, что Francisella вначале находится в фагосоме, а затем высвобождается в цитоплазму, бактерии могут взаимодействовать как с мембранными, так и с цитопламатическими паттерн-распознающими рецепторами. Сигналы TLR и NLR стимулируют продукцию определенных цитокинов, определяющих формирование типа адаптивного иммунного ответа [118].
Изучение микробных лигандов F. tularensis, ответственных за взаимодействие с TLR показали, что липопротеины активируют гетеродимеры TLR-2/TLR-1 или TLR-2/TLR-6 [370]. Ключевыми медиаторами формирования воспалительного ответа на микробы F. tularensis являются TLR-2 и MyD88. TLR-2 способствует активации NF-кВ дендритными клетками, которые начинают синтезировать ФНО-а и экпрессировать маркеры созревания [217] и индуцировать выработку широкого ряда провоспалительных цитокинов перитонеальными макрофагами в ответ на активацию их бактериями вакцинного штамма F. tularensis [103, 47]. Связавшись с мембранным TLR-2 микробы вакцинного штамма локализуются внутриклеточно в фагосоме, содержащей TLR-2/MyD88 [103].
Как и другие грам-отрицательные микроорганизмы в структуру F. tularensis входят липополисахариды (ЛПС). Распознавание TLR4 структуры ЛПС играет важнейшую роль в активации врожденного иммунитета против грамм-отрицательных бактерий. Однако ЛПС F. tularensis различных подвидов имеет измененную структуру, которая слабо распознается ЛПС-связывающими белками TLR4 и TLR-2 [136, 370]. Таким образом, ЛПС F. tularensis не принимает участия в формировании воспалительных реакций. По всей видимости, одними из компонентов, участвующими в активации синтеза провоспалительных цитокинов иммунокомпетентными клетками, являются два липопротеина F. tularensis TUL4 и FTT1103, которые способны связываться с TLR-2 и запускать формирование иммунного ответа [370].
В зависимости от вирулентности штамма ЛПС F. tularensis характеризуется различной способностью активировать экспрессию TLR2 и TLR4. Вакцинный штамм F. tularensis 15 НИИЭГ голарктического подвида уже через 4 ч вызывает повышение экспрессии спленоцитами как TLR2, так и TLR4. Препараты протективного антигенного комплекса, полученные из вирулентного штамма голарктического (F. tularensis 503/840) и среднеазиатского (F. tularensis А179) подвидов, индуцируют усиление экспрессии только TLR2. Препарат протективного антигенного комплекса из штамма F. tularensis В399 A Cole неарктического подвида, не вызывает изменений экспрессии исследуемых типов толл-подобных рецепторов [40, 46]. Тем не менее, эксперименты, проведенные на TLR-4 дефицитных мышах, не показали усиления чувствительности к бактериям F. tularensis, что свидетельствует об отсутствии ключевого значения TLR-4 в защите организма от инфекции [95].
Оценка перестройки поверхностных маркеров лимфоцитов под влиянием антигенов F. tularensis
Вероятно, при введении мышам 135КОЕ/мышь F. tularensis 15 НИИЭГ, в организме животных развиваются выраженные воспалительные реакции, которые приводят к иммуносупрессии.
У лимфоцитов, имеющих специфические рецепторы, при контакте с антигенами возбудителя инфекции происходит стимуляция TCR/BCR рецептора, а затем экспрессия CD69 маркера на поверхности клетки [99]. В спленоцитах, полученных от иммунизированных мышей в отличие от интактных, процентное содержание CD 19 CD69 субпопуляции В-клеток в присутствии КНК достоверно увеличивалось по сравнению с популяцией лимфоцитов не активированных КНК (таблица 5). Максимальная активация В-клеток отмечалась у мышей, иммунизированных в дозах 15 и 45 КОЕ/мышь, хотя максимальные тиры антител к КНК наблюдали после иммунизации животных 135 КОЕ/мышь.
В спленоцитах, полученных от мышей, иммунизированных подкожно или внутрикожно F. tularensis 15 НИИЭГ в дозах 5 или 15 КОЕ/мышь, в присутствии КНК наблюдали увеличение субпопуляции Т-хелперов, экспрессирующих CD69 рецептор (табл. 5). При увеличении иммунизирующей дозы бактерий уровень клеток с CD69 рецептором не увеличивался.
КНК F. tularensis индуцировал некоторое усиление экспрессии CD69 рецептора на поверхности цитотоксических лимфоцитов в группах интактных мышей (таблица 5). Однако активация КНК спленоцитов иммунных мышей приводила к еще более выраженному и достоверному повышению количества CD3 CD8 CD69 лимфоцитов вне зависимости от дозы препарата, по сравнению с интактными животными. Максимальную активацию цитотоксических лимфоцитов наблюдали в группах мышей, иммунизированных дозами 15-45 КОЕ/мышь.
На рисунке 15 отображено количество бактерий F. tularensis 15 НИИЭГ, высеваемых из селезенки мышей, через разные промежутки времени после подкожного или внутрикожного заражения разными дозами F. tularensis 15 НИИЭГ. 104 КОЕ
Из полученных данных можно заключить, что при одинаковых дозах введения бактерий F. tularensis 15 НИИЭГ количество высеваемых бактерий на третьи и седьмые сутки иммуногенеза меньше после внутрикожнои иммунизации. Иммунизация мышей F. tularensis 15 НИИЭГ в дозе 5 КОЕ/мышь внутрикожно приводила к увеличению селезенки, истощению тимуса начиная с 11 суток, и не влияла на изменения морфологии и размеров печени и лимфатических узлов. При подкожном введении мышам F. tularensis 15 НИИЭГ в той же дозе селезенка увеличивалась, а тимус истощался, начиная с седьмых суток при сохранении нормальной морфологии и размеров печени и лимфатических узлов. При более высоких дозах иммунизации морфологические изменения в органах при подкожном и внутрикожном введении были идентичными. К седьмым суткам после иммунизации отмечалось увеличение селезенки, печени и лимфоузлов на фоне истощения тимуса.
Таким образом, после внутрикожной иммунизации мышей F. tularensis 15 НИИЭГ в дозе 5 КОЕ/мышь не обнаруживались антитела к КНК в крови животных, но выявлялся клеточный ответ на стимуляцию спленоцитов КНК в реакциях in vitro (усиление пролиферативной активности, синтез ИЛ-17, появление CD69 рецептора на поверхности Т и В лимфоцитов). Сформированный специфический клеточный иммунитет был способен защитить животных от заражения вирулентным штаммом F. tularensis 503.
При низких дозах иммунизации у мышей возникает популяция специфических В лимфоцитов, активирующихся в присутствии КНК, но не синтезирующих антитела против КНК. В зависимости от степени воспаления, регистрируемого по уровню падения веса и изменению цитокиновой активности, у мышей наблюдается усиление (при низких дозах иммунизации) или подавление (при дозе 135 КОЕ/мышь) клеточных реакций in vitro на КНК, а уровень гуморального ответа - усиливается по мере увеличения иммунизирующей дозы. 3.8. Оценка напряженности иммунитета к туляремии у мышей через разные сроки после иммунизации F. tularensis 15 НИИЭГ и показателями противотуляремийного иммунитета в системе in vitro
Задачи исследования - оценить длительность проявления гуморального и клеточного противотуляремийного иммунитета у мышей после иммунизации животных вакцинным штаммом F. tularensis 15 НИИЭГ.
На протяжении эксперимента (с 30 по 180 дни после иммунизации живой туляремийной вакциной) у мышей в сыворотке крови выявляли антитела к туляремийным антигенам (рисунок 16). Концентрация специфических антител практически не изменялась в течение всего времени наблюдения.
КНК индуцировал выраженное усиление экспрессии CD69 маркера на поверхности CD 19 В лимфоцитов, выделенных от иммунных мышей, как в ранние, так и в отдаленные сроки исследований после иммунизации животных F. tularensis 15 (таблица 6). КНК также способствовал активации В лимфоцитов интактных мышей, но усиление экспрессии CD69 рецептора на их поверхности было достоверно менее выраженным по сравнению с В лимфоцитами, полученными от иммунных животных.
У иммунных мышей на поверхности Т хелперов во все сроки исследований наблюдали специфическое усиление экспрессии CD69 рецептора в присутствии КНК.
На поверхности цитотоксических лимфоцитов CD69 рецептор усиливал экспрессию как на клетках, полученных от иммунных, так и от интактных животных. Анализ цитокиновой активности спленоцитов, полученных от иммунных мышей, показал специфическое усиление синтеза ИЛ-17 и ИФН-у под влиянием КНК даже у животных иммунизированных пол года назад (рисунок 17). ИЛ-17 Значительно усиливается в первые 2-3 месяца после иммунизации животных, а затем падает, но не ниже 200 пкг/мл, что выше значений у интактных животных (5,3 пкг/мл). Отмечали усиление синтеза ИЛ-10 спленоцитами мышей под влиянием КНК в первые два месяца после иммунизации животных, а также усиление синтеза ИЛ-12 через 30, 60, 90 и 120 дней после иммунизации. КНК не изменял уровень активности синтез ИЛ-4 спленоцитами экспериментальных животных.
Анализ изменений экспрессии маркеров в присутствии антигенов F. tularensis на поверхности В лимфоцитов, полученных от невакцинированных и иммунизированных живой туляремийной вакциной людей
В нашей работе впервые было показано, что иммунокомпетентные клетки, выделенные от мышей, вакцинированных против чумы, в отличие от иммунокомпетентных клеток интактных мышей, под влиянием V антигена усиливают экспрессию TLR-9 на поверхности моноцитов и лимфоцитов. F1 антиген чумного микроба также способствовал усилению экспрессии TLR-9 на поверхности иммунных моноцитов и лимфоцитов, но менее выраженно.
Исследования по влиянию антигенов чумного микроба на экспрессию TLR-9 на поверхности иммунокомпетентных клеток практически отсутствуют. Полученные результаты противоречивы [130, 215]. В работе KamalU. [215] показано, что под влиянием Y. pestis на поверхности моноцитов и В лимфоцитов крови людей происходит усиление экспрессии TLR-9. По данным работы Ivo Ricardo de Seabra Rodrigues Dias [130] под влиянием Fl антигена в клеточной моноцитарной линии отмечалось снижение экспрессии TLR-9 на поверхности клеток в течение 24 ч инкубирования. Разноречивость результатов может быть связана с особенностями условий экспериментов. В частности, если через 1 час после взаимодействия с F1 антигеном происходит снижение экспрессии TLR-9 на поверхности иммунокомпетентных клеток, то через 24 ч уровень экспрессии TLR-9 возвращается к показателям контроля [130].
Усиление экспрессии TLR на поверхности антиген-презентирующих клеток и взаимодействие с лигандами лимфоцитов для TLR-2 и TLR-9 приводит к активации В лимфоцитов [78] и CD4 Т лимфоцитов [180], что проявляется в усилении их пролиферативной активности, дифференцировке и повышенной выживаемостью за счет увеличения на их поверхности ко-экспрессирующих молекул, а также усиления синтеза ими провоспалительных цитокинов.
На следующем этапе исследований мы сравнили активацию лимфоцитов, полученных от иммунных и интактных животных, под влиянием антигенов чумного микроба.
Одним из ранних маркеров активации лимфоцитов является CD69 рецептор, который появляется на поверхности антиген- или аллерген-специфически активированных in vitro лимфоцитов [64]. Экспрессируясь на поверхности клетки рецептор CD69 действует как ко-стимулирующая молекула Т-клеточной активации и пролиферации [380]. Появление CD69 рецептора на поверхности лимфоцитов коррелирует с активацией клетки и усилением пролиферативной активности [305].
Выявление усиления экспрессии раннего маркера активации CD69 на лимфоцитарной субпопуляции Т хелперов в ответ на активацию их туберкулином используют для диагностики острых форм туберкулеза и для прогноза течения заболевания [265]. По аналогии мы оценивали изменение экспрессии CD69 маркера на поверхности Т хелперов и цитотоксических лимфоцитов под влиянием антигенов чумного микроба. Мы сравнивали изменение содержания СВ69-позитивных Т хелперов и цитотоксических лимфоцитов, полученных от интактных и иммунизированных против чумы мышей, под влиянием антигенов чумного микроба.
В результате наших исследований мы впервые обнаружили, что под влиянием Fl Y. pestis на поверхности CD8 Т лимфоцитов, полученных от мышей, иммунизированных Y. pestis EV НИИЭГ; препаратом, содержащим F1 и V антигены, адсорбированных на гидроокиси алюминия; или препаратом, содержащим F1 антиген, адсорбированным на гидроокиси алюминия, специфически усиливалась экспрессия CD69 рецептора.
В формировании иммунного ответа большая роль принадлежит лимфоцитам, которые образуют специфический клон клеток, синтезирующих антитела и осуществляющих клеточные реакции. Для обеспечения напряженного иммунитета количество специализированных клеток должно быть достаточным для элиминации возбудителя. После завершения вакцинального процесса количество антиген-специфических клеток невелико и при проникновении возбудителя в организм клон специфических клеток должен увеличиться за счет усиления пролиферации лимфоцитов.
Наши исследования показали, что лимфоциты мышей, иммунизированных Y. pestis EV НИИЭГ, в ответ на активацию антигеном F1 чумного микроба, усиливали пролиферативную активность лимфоцитов как за счет В субпопуляции, так и за счет Т субпопуляции. Лимфоциты, полученные от мышей, иммунизированных препаратом, содержащим F1 и V антигены, адсорбированные на гидроокиси алюминия, в присутствии F1 увеличивали пролиферативную активность за счет только В лимфоцитов. Полученные данные отражают разные механизмы формирования противочумного иммунитета после иммунизации живой чумной вакциной и химической на основе F1 и V антигенов. После иммунизации живой чумной вакциной кроме гуморального иммунитета активируется клеточное звено иммунитета, о чем свидетельствует пролиферация В и Т лимфоцитов в ответ на рестимуляцию лимфоцитов чумным антигеном.
Клеточно-опосредованный противочумный иммунный ответ основывается на развитии иммунного ответа по ТЫ пути, который характеризуется появлением патоген-специфических Т лимфоцитов, синтезирующих ИФН-у, ФНО-а [132, 291]. В процессе инфекционного процесса Y. pestis способны оказывать супрессирующее действие на развитие адаптивного иммунитета препятствуя активации Т и В лимфоцитов и синтезу ими цитокинов [382]. В ряде исследований показано, что нейтрализация ИФН-у и ФНО-а приводит к значительному усилению бактериальной инфекции [421, 246]. Одной из главных стратегий патогенности Y. pestis является ингибирование синтеза ИФН-у и ФНО-а [55]. Можно предположить, что в иммунном организме появляются защитные механизмы противодействующие ингибированию синтеза ИФН-у и ФНО-а.
Мы оценили количество CD4 и CD8 Т лимфоцитов, продуцирующих ИФН-у и ФНО-а, в ответ на активацию клеток in vitro антигенами чумного микроба. В наших экспериментах мы показали, что в культуре спленоцитов, полученных только от мышей, иммунизированных Y. pestis EV НИИЭГ или препаратом, содержащим F1 и V антигены, адсорбированные на гидроокиси алюминия, в присутствии антигенов чумного микроба происходило специфическое усиление синтеза ИФН-у CD8 лимфоцитами. CD8 лимфоциты интактных мышей не усиливали синтез ИФН-у под влиянием антигенов УЗД, F1 или V. По данным Szaba F.M. [359], Parent М.А. [285], Amedeo Amedei [55] активация именно субпопуляции CD8 лимфоцитов и синтез ими цитокинов ИФН-у и ФНО-а необходимы для формирования протективного иммунитета против заражения чумой.
Большая роль в усилении бактерицидной активности макрофагов кроме ИФН-у, ФНО-а [252] принадлежит ИЛ-17 [247, 275]. Ил-17 играет особо важную роль при формировании мукозального противочумного иммунитета. В работе Jr-Shiuan Lin [245], показано, что синтез ИЛ-17 необходим для защиты от заражения чумой аэрозольным путем. Даже при высоких титрах антител к антигенам Y. pestis, но при низкой активности синтеза цитокинов ИФН-у, ФНО-а, ИЛ-17 в ответ на заражение вирулентным штаммом чумы мыши погибали [147, 285].
В наших исследованиях показано, что спленоциты, полученные от мышей, иммунизированных против чумы, в отличие от интактных животных в присутствии антигенов Y. pestis значительно усиливали синтез ИФН-у и ИЛ-17. Причем концентрация ИФН-у и ИЛ-17 была выше в 2-4 раза в супернатанте культуры активированных антигенами спленоцитов, полученных от мышей, иммунизированных Y. pestis EV НИИЭГ, по сравнению с количеством этих цитокинов в культуральнои жидкости, активированных спленоцитов, полученных от мышей, иммунизированных препаратом на основе F1 и V антигенов чумного микроба, содержащим гидроксил алюминия.
Добавление в среду культивирования антигенов Y. pestis приводило к усилению синтеза провоспалительных цитокинов ИЛ-6, ФНО-а в культурах спленоцитов, выделенных и от интактных и от иммунизированных против чумы мышей. Усиление синтеза ИЛ-10 - противовоспалительного цитокина спленоцитами интактных и иммунизированных животных отмечали только в ответ на стимуляцию клеток УЗД или F1 антигеном Y. pestis, но не V антигеном. Уровень синтеза ИЛ-4 в присутствии антигенов чумного микроба достоверно не изменялся.
Изменение экспрессии CD86 и CD80 рецепторных молекул на поверхности В-лимфоцитов
Каждая из ДНК-гистограмм отражает распределение лейкоцитов по относительному содержанию ДНК на клетку (по клеточному циклу) в условных единицах (каналах от 0 до 512) интенсивности зеленой флуоресценции (по оси абсцисс). По оси ординат - число клеток на единицу измерения (канал). На гистограмме, характерной для лейкоцитов крови интактных животных, видно фактическое отсутствие повреждающего эффекта антигена - подавляющее число клеток регистрируется в диплоидном пике с одинаковым (ровно 2С) содержанием ДНК. В крови мышей, иммунизированных В. anthracis СТИ-1, антраксин индуцировал появление окло 30 % поврежденных лейкоцитов, несущих менее 2С ДНК на клетку (в апоптозе). На гистограмме пик поврежденных клеток расположен слева от диплоидного пика.
В крови основная масса клеток находилась в покоящемся состоянии и детектировалась в «диплоидном» Gl-пике (83,41±3,82). Величина гиподиплоидных лейкоцитов составила (9,16±2,51) % от общей популяции. Инкубирование лейкоцитов в среде в течение 2 ч достоверно не изменяла (Р 0,05) процентного соотношения гиподиплоидных ((14,04±4,35) %), диплоидных ((78±7,91) %) и пролиферирующих ((7,96±4,14) %) клеток. Присутствие в среде с лейкоцитами, полученными от интактных животных, антраксина не влияло на изменение пролиферативной активности ((13,01 ±3,42) %) и повреждение генетического аппарата (количество гиподиплоидных клеток (16,22±1,77)%).
Под влиянием антраксина относительное содержание поврежденных лейкоцитов, несущих ДНК на стадии деградации (менее 2С ДНК на клетку), достоверно увеличивалось до (29,01 ±2,69) %, Р 0,01 только в клеточной культуре, выделенной от иммунизированных В. anthracis СТИ-1, что наглядно демонстрирует ДНК гистограмма на рисунке 47 С.
Полученные результаты, свидетельствующие о повышении повреждающего эффекта антраксина на лейкоциты крови, полученной от иммунизированных В. anthracis СТИ-1 животных согласуются с результатами других исследователей [1,44].
После выполнения физиологической функции, активированные лейкоциты (нейтрофилы) подвергаются гибели по типу апоптоза [27]. Различная интенсивность повреждения лейкоцитов антигеном косвенно свидетельствовала о различной степени функциональной активации лейкоцитов крови у интактных животных и у животных с приобретенным противосибиреязвенным иммунитетом.
Повышение функциональной активации лейкоцитов сопровождается усилением синтеза в них РНК. Данные цитофлуориметрии показали выраженное усиление синтеза РНК под влиянием антраксина только в культуре клеток, полученных от вакцинированных животных (рисунок 48).
Гистограммы на рисунке 48 отражают распределение лейкоцитов по интенсивности красной флуоресценции цитоплазмы (по относительному содержанию РНК на клетку) в условных единицах от 0 до 512 (каналах). По оси ординат указано количество клеток на канал. РНК-гистограмма (Б) отражает низкий уровень содержания РНК в лейкоцитах крови интактных животных спустя 2 ч контакта клеток с антигеном, а также однородность лейкоцитарной популяции по количеству РНК. На РНК гистограмме (В) видно, что в популяции лейкоцитов животных иммунизированных В. anthracis СТИ-1 появляются активированные клетки, несущие повышенное содержание РНК на клетку.
Выраженное окрашивание клеточной цитоплазмы красителем акридиновым оранжевым отразило целостность лейкоцитарной цитоплазматической мембраны [125]. Это свидетельствовало о том, что антраксин индуцировал гибель (деградацию ДНК) лейкоцитов крови животных по типу апоптоза, а не по типу некроза.
Таким образом, через 2 ч инкубирования с антракисном клеток, полученных от иммунных мышей, не происходило лизиса лейокцитов. Исследования состояния ядерного хроматина и содержания азурофильных лизосомальных гранул, несущих активноть эластазы и миелопероксидазы, выявили, что у мышей иммунизированных В. anthracis СТИ-1 отмечалось специфическое увеличение гиподиплоидных клеток и активация РНК под влиянием антраксина.
Использование данного метода на лимфоцитах, полученных от вакцинированных против сибирской язвы доноров, позволил выявить положительные реакции не у всех людей. Попытка оценить клеточный иммунитет против сибирской язвы с использованием антраксина или протективного антигена по усилению экспрессии CD69 рецептора на поверхности Т лимфоцитов не показал достоверных различий между вакцинированными против сибирской язвы людей и неиммунными донорами. Уровень изменения экспрессии CD69 рецептора на поверхности Т лимфоцитов, синтеза РНК, количества гиподиплоидных клеток под влиянием антраксина или протективного антигена характеризовались индивидуальными различиями между донорами не зависимо от наличия специфического иммунитета.